Name: Model ex vivo ataku limfocytów T kierowanego przez oligodendrocyty w ostrych wycinkach mózgu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 36 s
Description: Poznaj model ex vivo ataku limfocytów T CD8+ na oligodendrocyty w ostrych wycinkach mózgu myszy. Ta metoda umożliwia szczegółowe badanie demielinizacji i apoptozy neuronów w kontrolowanych warunkach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Interdyscyplinarne Centrum Badań Klinicznych (IZKF) Münster (SEED 03/12, SB), Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB TR128, TP B6 do S.G.M. ME3283/2-1 do S.G.M.) oraz przez Innovative Medizinische Forschung, Münster (I-BI111316, SB i SGM).

Wszystkie eksperymenty na myszach powinny być przeprowadzane zgodnie z wytycznymi odpowiedniego instytucjonalnego komitetu ds. opieki i użytkowania zwierząt.
1. Ogólne uwagi do eksperymentów na myszach
<ol>
	<li>Trzymaj myszy w warunkach wolnych od patogenów i umożliwiaj im dostęp do pożywienia i wody ad libitum. 
	UWAGA: Ważne jest, aby używać myszy dopasowanych pod względem wieku i płci w grupach eksperymentalnych, ponieważ wzorce immunologiczne mogą się różnić w zależności od wieku i płci.</li>
</ol>
2. Przygotowanie i aktywacja specyficznych dla OVA limfocytów T CD8+ (OT-I)
<ol>
	<li>Wykonaj stymulację limfocytów T OT-I zgodnie z poniższym opisem 5 dni przed przygotowaniem plastrów mózgu. 
	UWAGA: 5 x 105 aktywowanych efektorów CD8 + OT-I Limfocyty T (limfocyty T CD8 + myszy transgenicznych rozpoznających tylko peptyd OVA257-264 w kontekście cząsteczek MHC-I) są potrzebne na plasterek Stężenie 5 x 105 zostało wybrane eksperymentalnie jako optymalne, aby sprzyjać dobrej interakcji komórka-komórka, gdy komórki zaczną migrować do wycinka i, Jednocześnie ilość komórek nie jest zbyt duża, aby wywołać nadmierną reakcję, co pozwala na policzeniepojedynczych komórek 8,18.</li>
	<li>Przygotuj pożywkę do hodowli limfocytów T OT-I. Suplement 500 ml DMEM z 5% płodową surowicą cielęcą (FCS), 10 mM HEPES, 2 mM L-glutaminą, 50 μM 2-merkaptoetanolem, 1% aminokwasami endogennymi i 25 μg/ml gentamycyny. Przechowywać pożywkę w temperaturze 4 °C do czasu użycia.</li>
	<li>Usuń śledzionę myszy transgenicznych OT-I zgodnie z odniesieniem16. Przełóż je do przygotowanego podłoża.</li>
	<li>Wytwarzać zawiesinę jednokomórkową przez rozcieranie śledziony przez sitko o średnicy 70 μm i odwirować zawiesinę w temperaturze 300 x g przez 5 minut, 4 °C.</li>
	<li>Zawiesinę komórek inkubować z 5 ml buforu chlorku amonu i potasu (ACK) (150 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0,1 mM EDTA, pH 7,3) przez 5 minut w celu lizy czerwonych krwinek.</li>
	<li>Przerwać inkubację z 10 ml pożywki i ponownie odwirować, jak opisano powyżej.</li>
	<li>Rozcieńczyć zawiesinę komórek w pożywce i obliczyć liczby. Płytki komórek o gęstości 3 x 107 komórek/basenik na 12-dołkowej płytce i zagruntować je przez inkubację z OVA257–264 (SIINFEKL; 1 nM) i interleukiną 2 (IL-2) (500 j.m./ml) przez 5 dni.</li>
	<li>Po 4 dniach ponownie dodać IL-2 w stężeniu 500 j.m./ml.</li>
	<li>Po stymulacji oczyść limfocyty T OT-I z zawiesiny komórkowej za pomocą zestawu do izolacji mysich limfocytów T CD8 + opartego na selekcji negatywnej, postępując zgodnie z instrukcjami producenta. Oczyszczanie opiera się na wyczerpaniu wszystkich komórek innych niż CD8 + przy użyciu koktajlu przeciwciał przeciwko CD4, CD11b, CD11c, CD19, CD45R (B220), CD49b (DX5), CD105, MHC klasy II, Ter-119 i TCRγ / δ które są następnie odrzucane za pomocą kolumn magnetycznych do elucji oczyszczonych limfocytów T CD8 +. 
	UWAGA: Krytyczne etapy tej procedury są wskazane przez producentów: ważne jest, aby reakcja obejmowała tylko pojedyncze komórki, ponieważ obecność grudek może zablokować kolumnę podczas etapu elucji; Zliczanie komórek przed dodaniem koktajlu Byotin jest ważne dla stopnia czystości próbki, a procedura powinna być wykonywana na lodzie, aby zminimalizować niespecyficzne wiązania przeciwciał.</li>
</ol>
3. Przygotowanie ostrych wycinków mózgu i kokultura z limfocytami T OT-I
<ol>
	<li>Przed przygotowaniem ostrych wycinków mózgu19 należy przygotować lodowaty roztwór soli fizjologicznej placedine placedine przy użyciu 200 mM sacharozy, 20 mM RUR, 2,5 mM KCL, 1,25 mM NaH2PO4, 10 mMMgSO4, 0,5 CaCl 2 i 10 mM dekstrozy oraz sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (ACSF) przy użyciu 125 mM NaCl, 2,5 KCl, 1,25 NaH2PO4, 24 mM NaHCO3, 2 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 10 mM dekstroza. Dostosuj pH każdego roztworu do 7,35 za pomocą NaOH. Przed dostosowaniem pH ACSF roztwór należy przepłukać mieszaniną 95%O2 i 5% CO2 .</li>
	<li>Wstępnie schłodzić roztwory.</li>
	<li>Znieczulenie należy znieczulać myszy w wieku 8 - 10 tygodni (np. C57Bl/6 jako kontrolne lub transgeniczne myszy ODC-OVA17 z inhalacją przy użyciu 5,0% izofluranu, 5,0% halotanu lub wstrzyknąć 100 mg/kg ketaminy i 10 mg/kg masy ciała ksylazyny za pomocą ip. Poczekaj na znieczulenie i użyj szczypania palca u nogi, aby ocenić poziom znieczulenia i natychmiast odciąć im głowę. Eutanazja myszy zgodnie z kryteriami instytucjonalnego komitetu ds. opieki nad zwierzętami i wykorzystania do eutanazji.</li>
	<li>Ustaw mysz w pozycji brzusznej. Zdezynfekuj i wytnij strzałkowo skórę głowy. Otwórz kość czaszki strzałkowo, szybko usuń mózg za pomocą miarki i przymocuj go do płytki wibratomu za pomocą kleju.</li>
	<li>Napełnij talerz przygotowanym lodowatym roztworem soli fizjologicznej placedine.</li>
	<li>Wytnij plastry koronalne o grubości 300 μm za pomocą wibratomu. 
	UWAGA: Wiadomo, że ta procedura pozwala uzyskać żywe nienaruszone próbki tkanek odpowiednie do funkcjonalnych badań komórkowych w przedziale czasu co najmniej 8 godzin19-21. Rzeczywiście, po tym czasie, już rozpoczynającym się po 6 godzinach, preparat wykazuje obniżoną jakość, a mianowicie zmiany w podstawowych i funkcjonalnych właściwościach, takich jak generowanie potencjału czynnościowego i propagacja.</li>
	<li>Po podziale na sekcje natychmiast przenieś jedną kromkę do każdego dołka 12-dołkowej płytki wypełnionej ACSF.</li>
	<li>Dodaj ostrożnie 5 x 105 komórek T OT-I na plasterek.</li>
	<li>Plastry inkubować do 8 godzin w inkubatorze (37 °C, 5% CO2 ).</li>
	<li>Po okresie inkubacji zbierz plastry i osadź je za pomocą tka tkankowego związku OCT i zamroź je w ciekłym azocie. Przechowywać je w temperaturze -20 °C do dalszych badań histologicznych, np. w celu oceny struktury neuronalnej (np. przy użyciu przeciwciał anty-MAPII lub anty-synaptofizyny) lub apoptozy (np. przy użyciu przeciwciał anty-kaspazy-3 i przeciwciał anty-NeuN) zgodnie ze standardowymi procedurami.</li>
</ol>

<ol><li>Moll, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+demyelination+in+PML+and+MS%3A+Similarities+and+differences%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Cortical demyelination in PML and MS: Similarities and differences.</a> Neurology. 70 (5), 336-343 (2008).</li>
<li>Peterson, J. W., Bo, L., Mork, S., Chang, A., Trapp, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transected+neurites%2C+apoptotic+neurons%2C+and+reduced+inflammation+in+cortical+multiple+sclerosis+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">Transected neurites, apoptotic neurons, and reduced inflammation in cortical multiple sclerosis lesions.</a> Ann Neurol. 50 (3), 389-400 (2001).</li>
<li>Bo, L., Vedeler, C. A., Nyland, H. I., Trapp, B. D., Mork, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subpial+demyelination+in+the+cerebral+cortex+of+multiple+sclerosis+patients%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuropathol+Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Subpial demyelination in the cerebral cortex of multiple sclerosis patients.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 62 (7), 723-732 (2003).</li>
<li>Babbe, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+expansions+of+CD8%28%2B%29+T+cells+dominate+the+T+cell+infiltrate+in+active+multiple+sclerosis+lesions+as+shown+by+micromanipulation+and+single+cell+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Clonal expansions of CD8(+) T cells dominate the T cell infiltrate in active multiple sclerosis lesions as shown by micromanipulation and single cell polymerase chain reaction.</a> J Exp Med. 192 (3), 393-404 (2000).</li>
<li>Junker, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+sclerosis%3A+T-cell+receptor+expression+in+distinct+brain+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Multiple sclerosis: T-cell receptor expression in distinct brain regions.</a> Brain. 130 (11), 2789-2799 (2007).</li>
<li>Skulina, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+sclerosis%3A+brain-infiltrating+CD8%2B+T+cells+persist+as+clonal+expansions+in+the+cerebrospinal+fluid+and+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Multiple sclerosis: brain-infiltrating CD8+ T cells persist as clonal expansions in the cerebrospinal fluid and blood.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (8), 2428-2433 (2004).</li>
<li>Friese, M. A., Fugger, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoreactive+CD8%2B+T+cells+in+multiple+sclerosis%3A+a+new+target+for+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Autoreactive CD8+ T cells in multiple sclerosis: a new target for therapy.</a> Brain. 128 (8), 1747-1763 (2005).</li>
<li>Melzer, N., Meuth, S. G., Wiendl, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD8%2B+T+cells+and+neuronal+damage%3A+direct+and+collateral+mechanisms+of+cytotoxicity+and+impaired+electrical+excitability%29%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">CD8+ T cells and neuronal damage: direct and collateral mechanisms of cytotoxicity and impaired electrical excitability).</a> FASEB J. 23 (11), 3659-3673 (2009).</li>
<li>Booss, J., Esiri, M. M., Tourtellotte, W. W., Mason, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistological+analysis+of+T+lymphocyte+subsets+in+the+central+nervous+system+in+chronic+progressive+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurol+Sci%22%5BJournal%5D)">Immunohistological analysis of T lymphocyte subsets in the central nervous system in chronic progressive multiple sclerosis.</a> J Neurol Sci. 62 (1-3), 219-232 (1983).</li>
<li>Hauser, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+analysis+of+the+cellular+infiltrate+in+multiple+sclerosis+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical analysis of the cellular infiltrate in multiple sclerosis lesions.</a> Ann Neurol. 19 (6), 578-587 (1986).</li>
<li>Hoftberger, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+major+histocompatibility+complex+class+I+molecules+on+the+different+cell+types+in+multiple+sclerosis+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Pathol%22%5BJournal%5D)">Expression of major histocompatibility complex class I molecules on the different cell types in multiple sclerosis lesions.</a> Brain Pathol. 14 (1), 43-50 (2004).</li>
<li>Göbel, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collateral+neuronal+apoptosis+in+CNS+gray+matter+during+an+oligodendrocyte-directed+CD8%28%2B%29+T+cell+attack%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Collateral neuronal apoptosis in CNS gray matter during an oligodendrocyte-directed CD8(+) T cell attack.</a> Glia. 58, 469-480 (2010).</li>
<li>Melzer, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excitotoxic+neuronal+cell+death+during+an+oligodendrocyte-directed+CD8%2B+T+cell+attack+in+the+CNS+gray+matter%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Excitotoxic neuronal cell death during an oligodendrocyte-directed CD8+ T cell attack in the CNS gray matter.</a> J Neuroinflammation. 10, 121(2013).</li>
<li>Huseby, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pathogenic+role+for+myelin-specific+CD8%28%2B%29+T+cells+in+a+model+for+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">A pathogenic role for myelin-specific CD8(+) T cells in a model for multiple sclerosis.</a> J Exp Med. 194 (5), 669-676 (2001).</li>
<li>McPherson, S. W., Heuss, N. D., Roehrich, H., Gregerson, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bystander+killing+of+neurons+by+cytotoxic+T+cells+specific+for+a+glial+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Bystander killing of neurons by cytotoxic T cells specific for a glial antigen.</a> Glia. 53 (5), 457-466 (2006).</li>
<li>Hogquist, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+receptor+antagonist+peptides+induce+positive+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">T cell receptor antagonist peptides induce positive selection.</a> Cell. 76 (1), 17-27 (1994).</li>
<li>Cao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+in+transgenic+mice+expressing+ovalbumin+in+oligodendrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Induction of experimental autoimmune encephalomyelitis in transgenic mice expressing ovalbumin in oligodendrocytes.</a> Eur J Immunol. 36 (1), 207-215 (2006).</li>
<li>Göbel, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD4%28%2B%29+CD25%28%2B%29+FoxP3%28%2B%29+regulatory+T+cells+suppress+cytotoxicity+of+CD8%28%2B%29+effector+T+cells%3A+implications+for+their+capacity+to+limit+inflammatory+central+nervous+system+damage+at+the+parenchymal+level%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">CD4(+) CD25(+) FoxP3(+) regulatory T cells suppress cytotoxicity of CD8(+) effector T cells: implications for their capacity to limit inflammatory central nervous system damage at the parenchymal level.</a> J Neuroinflammation. 9, 41(2012).</li>
<li>Edwards, F. A., Konnerth, A., Sakmann, B., Takahashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+thin+slice+preparation+for+patch+clamp+recordings+from+neurones+of+the+mammalian+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">A thin slice preparation for patch clamp recordings from neurones of the mammalian central nervous system.</a> Pflugers Arch. 414 (5), 600-612 (1989).</li>
<li>Meuth, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+TWIK-related+acid-sensitive+K%2B+channel+1+%28TASK1%29+and+TASK3+channels+to+the+control+of+activity+modes+in+thalamocortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Contribution of TWIK-related acid-sensitive K+ channel 1 (TASK1) and TASK3 channels to the control of activity modes in thalamocortical neurons.</a> J Neurosci. 23 (16), 6460-6469 (2003).</li>
<li>Misgeld, U., Frotscher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dependence+of+the+viability+of+neurons+in+hippocampal+slices+on+oxygen+supply%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Bull%22%5BJournal%5D)">Dependence of the viability of neurons in hippocampal slices on oxygen supply.</a> Brain Res Bull. 8 (1), 95-100 (1982).</li>
<li>Ling, C., Verbny, Y. I., Banks, M. I., Sandor, M., Fabry, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+activation+of+antigen-specific+CD8%2B+T+cells+in+the+presence+of+antigen+in+organotypic+brain+slices%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">In situ activation of antigen-specific CD8+ T cells in the presence of antigen in organotypic brain slices.</a> J Immunol. 180, 8393-8399 (2008).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

W ciągu ostatnich dziesięcioleci opisano różne modele zwierzęce w celu zbadania patologicznych cech zapalnych zaburzeń demielinizacyjnych, takich jak stwardnienie rozsiane. Modele in vivo myszy i szczurów są szeroko stosowane do naśladowania patofizjologicznych cech choroby, a mianowicie analizy konsekwencji procesów demielinizacji i remielinizacji oraz mieszających się epizodów zapalenia i neurodegeneracji. Niemniej jednak tylko podejście ex vivo pozwala na dokładne przeanalizowanie mechanizmów leżącyc...

Śmierć oligodendrocytów i zniszczenie osłonki mielinowej, któremu towarzyszy utrata neuronów i aksonów, są typowymi patologicznymi objawami zmian w istocie szarej u osób cierpiących na stwardnienie rozsiane (MS)1,2. Zmiany korowe można do tej pory podzielić na trzy różne podtypy2: zmiany subpialne, wewnątrzkorowe i leukokorowe. W porównaniu z blaszkami istoty białej, nacieki charakteryzują się przewagą limfocytów T CD8+, co sugeruje ich możliwą decydującą rolę w zapaleniu istoty szarej3. Ponadto ekspansje oligoklonalne we krwi, płynie mózgowo-rdzeniowym (CSF) i w zmianach zapalnych można znaleźć dla samych limfocytów T CD8 + 4-6. 
Zgodnie z tym, zakłada się, że limfocyty T CD8+ mogą być specyficzne dla różnych białek mielinowych7,8. Rzeczywiście, limfocyty T CD8 + znajdują się w pobliżu oligodendrocytów i osłonek mielinowych9,10, które wykazują ekspresję MHC I11 i dlatego mogą być odpowiedzialne za utratę osłonki mielinowej. Proces ten jest często obserwowany wraz z rozległym "ubocznym" uszkodzeniem neuronów i aksonów w istocie szarej ośrodkowego układu nerwowego (OUN)1,2. W rzeczywistości bezpośrednia i pośrednia śmierć oligodendrocytów i neuronów jest indukowana przez limfocyty T CD8 + za pomocą dwóch różnych mechanizmów: (i) obrzęku i pęknięcia błony komórkowej z powodu tworzenia się granulek cytotoksycznych po uwolnieniu perforyn i granzymów oraz (ii) podwiązania do receptorów Fas lub ekspozycji FasL na ich powierzchni8,12,13.
Różne typy modeli zwierzęcych są tworzone w celu zbadania mechanizmu leżącego u podstaw wspomnianych procesów. W związku z tym zaszczepione limfocyty T CD8 + specyficzne dla autoantygenów z indukowaną ekspresją w komórkach glejowych OUN, takich jak oligodendrocyty lub astrocyty, mogą być adoptywnie przenoszone w celu analizy "pobocznej" śmierci neuronów i aksonów w istocie szarej14,15. Przeprowadzenie takich eksperymentów in vivo jest bardzo pomocne w naśladowaniu niektórych patofizjologicznych aspektów stwardnienia rozsianego, jednak podejście to nie jest odpowiednie do rozwiązania mechanizmu i kinetyki leżącej u podstaw uszkodzenia aksonów i apoptozy neuronów.
Aby przezwyciężyć te ograniczenia, stworzono podejście ex vivo do badania mechanizmów i przebiegu czasowego śmierci komórek neuronalnych po ataku limfocytów T CD8+ kierowanym przez oligondendrocyty. Ponieważ tylko oligodendrocyty, a tym samym produkcja osłonki mielinowej, powinny być celem komórek odpornościowych, stosuje się limfocyty T OT-I z ograniczeniami MHC klasy I, reaktywnymi albuminą jaja kurzego (OVA)16. Komórki te są następnie przenoszone do wycinków mózgu uzyskanych od myszy selektywnie eksprymujących OVA w oligodendrocytach (myszy ODC-OVA)17.

<table><tbody><tr><td>Płytka 12-dołkowa</td><td>Corning</td><td>3513</td><td></td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol</td><td>Gibco</td><td>31350-010</td><td></td></tr><tr><td>2-metylobutan</td><td>Roth</td><td>3927.1</td><td></td></tr><tr><td>70 &mikro; m filtr siatkowy</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Merck</td><td>1.02382.0500</td><td>chlorek wapnia</td></tr><tr><td>CD8+-zestaw izolacyjny</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-090-859</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-glukoza</td><td>Merck</td><td>1.08337.1000</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>31966-021</td><td>ciepły w 37 stopniach; C kąpiel wodna przed użyciem</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>PAA Laboratories</td><td>A15-151</td><td>płodowa surowica cielęca</td></tr><tr><td>Gentamycyna</td><td>Gibco</td><td>15750-060</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 1 M</td><td>Gibco</td><td>15630-050</td><td></td></tr><tr><td>IL-2</td><td>Peprotech</td><td>212-12</td><td></td></tr><tr><td>Isofluran</td><td>Abbott</td><td>05260-05</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Merck</td><td>1.04933.0500</td><td>chlorek potasu</td></tr><tr><td>KHCO3</td><td>Sigma</td><td>P9144</td><td>wodorowęglan potasu</td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Gibco</td><td>35050-038</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Merck</td><td>1.05886.0500</td><td>siarczan magnezu</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>31434</td><td>chlorek</td></tr> <tr><td>soduNaH2PO4 * H2O</td><td>Merck</td><td>1.06346.0500</td><td>wodorofosforan sodu</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Merck</td><td>1.06329.0500</td><td>wodorowęglan sodu</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Merck</td><td>1.09137.1000</td><td>wodorotlenek sodu</td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>Sigma</td><td>213330</td><td>chlorek amonu</td></tr><tr><td>Aminokwas endogenny</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>OVA (257-264)</td><td>Genscript</td><td>RP10611</td><td>albumina jaja kurzego</td></tr><tr><td>RURY</td><td>Sigma</td><td>P6757</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Merck</td><td>1.07687.1000</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek OCT</td><td>Sakura</td><td>4583</td><td></td></tr></tbody></table>

model ex vivo ataku limfocytów t kierowanego przez oligodendrocyty w ostrych wycinkach mózgu

An Ex vivo Model of an Oligodendrocyte-directed T-Cell Attack in Acute Brain Slices

Śmierć oligodendrocytów, której towarzyszy zniszczenie neuronów i aksonów, to typowe wyniki histopatologiczne w korowych i podkorowych zmianach istoty szarej w zapalnych zaburzeniach demielinizacyjnych, takich jak stwardnienie rozsiane (SM). W tych zaburzeniach stwierdza się głównie limfocyty T CD8 + o przypuszczalnej swoistości dla antygenów związanych z mieliną i oligodendrocytami, tak że apoptoza neuronów w zmianach istoty szarej może być efektem ubocznym tych komórek. Stworzono różne typy modeli zwierzęcych w celu zbadania mechanizmów leżących u podstaw wspomnianych procesów patofizjologicznych. Jednak, mimo że naśladują one niektóre aspekty stwardnienia rozsianego, niemożliwe jest dokładne przeanalizowanie mechanizmu i przebiegu w czasie "ubocznej" śmierci komórek neuronalnych. Aby zająć się tym kursem, tutaj pokazujemy protokół do badania mechanizmów i reakcji czasowej uszkodzenia neuronów po ataku limfocytów T CD8 + kierowanym przez oligodendrocyty. Aby celować tylko w osłonkę mielinową i oligodendrocyty, aktywowane in vitro limfocyty T CD8 + specyficzne dla oligodendrocytów są przenoszone do ostro izolowanych wycinków mózgu. Po określonym okresie inkubacji można analizować uszkodzenia mieliny i neuronów w różnych obszarach zainteresowania. Omówione zostaną potencjalne zastosowania i ograniczenia tego modelu.

Po inkubacji skrawków mózgu z limfocytami T CD8+ skierowanymi przeciwko oligodendrocytom, zarówno oligodendrocyty, jak i neurony ulegają apoptozie (Ryc. 2A i 1C, odpowiednio). Histologiczne oznaki apoptozy (np. kaspaza-3, Tunel) mogą zostać wykryte najwcześniej po 3 h inkubacji. Okres inkubacji nie powinien przekraczać 8 h, aby zapewnić dobrą jakość preparatu i powtarzalne wyniki. Komórki apoptotyczne można znaleźć w całym skrawku, z przewagą w obszarach zmielinizowanych. Przykładowe ...

Aby zająć się mechanizmami demielinizacji i apoptozy neuronów w uszkodzeniach korowych zapalnych zaburzeń demielinizacyjnych, używane są różne modele zwierzęce. Opisujemy tutaj podejście ex vivo polegające na użyciu limfocytów T CD8 + specyficznych dla oligodendrocytów na wycinkach mózgu, co powoduje śmierć oligodendroglialną i neuronalną. Omówiono potencjalne zastosowania i ograniczenia modelu.

Model ex vivo ataku limfocytów T kierowanego przez oligodendrocyty w ostrych wycinkach mózgu

Death of oligodendrocytes accompanied by destruction of neurons and axons are typical histopathological findings in cortical and subcortical grey matter ...

Ogólnym celem tej procedury jest zbadanie kierowanego przez oligodendrocyty ataku limfocytów T CD ośmiu ex vivo. Osiąga się to poprzez najpierw wyizolowanie ośmiu limfocytów T CD ze śledziony myszy. Drugim krokiem jest przygotowanie ostrych wycinków mózgu.Następnie wycinki mózgu są inkubowane z aktywowanymi limfocytami T CD przez okres do sześciu godzin, po czym następuje kriokonserwacja i badania histologiczne. Ostatecznie mikroskopia immunofluorescencyjna może być wykorzystana do badania lokalizacji limfocytów T, a także apoptozy oligodendrocytów. Główną przewagą tej metody nad istniejącymi technikami, takimi jak eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia kręgowego, zwierzęcy model łagodnego stwardnienia rozsianego, jest uszkodzenie neuronów.Po ataku oligodendrocytów za pośrednictwem CD eight można szczegółowo zbadać. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu neuroimmunologii, takie jak transport komórek odpornościowych w tkankach, czy degeneracja neuronów i oligodendrocytów. Procedurę zademonstruje Alexander Hamman, doktorant z mojego laboratorium. Pięć dni przed przygotowaniem wycinków mózgu stymulują limfocyty T OT one do aktywacji komórek.Po pierwsze, postępuj zgodnie z protokołem dla osób widzących, aby usunąć śledziony kilku myszy transgenicznych O OT one. Zbierz śledziony w świeżo przygotowanym, uzupełnionym podłożu. Następnie utwórz zawiesinę jednokomórkową, rozgniatając śledziony przez sitko o wielkości 70 mikronów, a następnie odwiruj zawiesinę w temperaturze 300 G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Po odwirowaniu odlać supernatant i ponownie zawiesić komórki w pięciu mililitrach buforu potasowego chlorku amonu. Pozwól komórkom inkubować w tym buforze przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby zmylić czerwone krwinki. Następnie zakończ reakcję, dodając 10 mililitrów uzupełnionej pożywki w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Następnie ponownie zbierz komórki, obracając je w dół jak poprzednio. Następnie zbierz granulowane komórki, zreusuj je, zawieś w pożywce i policz, gdy znana jest ich gęstość. Przenieś komórki na płytkę 12-dołkową przy 30 milionach komórek na studzienkę.Następnie dodaj pożywkę z OVA i interleukiną dwa i inkubuj komórki przez cztery dni. Po czterech dniach dodaj więcej interleukiny dwa w stężeniu 500 jednostek na mililitr. Następnie inkubuj komórki przez kolejny dzień.Teraz za pomocą zestawu do izolacji limfocytów T z dodatnim wynikiem CD oczyść limfocyty T O OT z hodowanych komórek. Krótko. Osiem komórek dodatnich innych niż CD jest wybychanych za pomocą koktajlu przeciwciał i rozdzielanych za pomocą kolumny magnetycznej. W tym celu należy przygotować próbkę na lodzie i upewnić się, że reakcja obejmuje tylko pojedyncze komórki, aby kolumna nie była zablokowana.Następnie policz komórki. Na potrzeby tego eksperymentu. Miej od ośmiu do 10 tygodni transgenicznych, O-D-C-O-V-A, myszy oraz dopasowane do wieku i płci C 57 czarne sześć kontrol.Jak zwykle, trzymaj myszy w środowisku wolnym od patogenów ze swobodnym dostępem do pożywienia i wody. Po znieczuleniu myszy użyj szczypania tylnej łapy, aby ocenić poziom znieczulenia, a następnie natychmiast poddaj ją eutanazji. Teraz ustaw mysz brzusznie i zdezynfekuj skórę głowy i odetnij jej głowę.Następnie szybko przetnij skórę głowy, otwórz czaszkę i zgarnij mózg. Zamocuj mózg na miejscu za pomocą kleju i przenieś go na płytkę wibrańską. Następnie napełnij talerz lodowatym roztworem soli fizjologicznej.Po przygotowaniu pokrój plastry o grubości 300 mikronów. Przenieś plastry do pojedynczych dołków na 12- lub 24-dołkowej płytce wypełnionej płynem mózgowo-rdzeniowym. Następnie ostrożnie dodaj pół miliona komórek T OT do każdego plasterka.Pół miliona aktywowanych komórek Spersonalizowane zapewnia dobrą interakcję z komórkami. Po komórkach komórki zaczynają migrować do wycinka. Jednocześnie liczba komórek nie jest zbyt duża, aby wywołać nadmierną reakcję, więc zliczanie pojedynczych komórek jest wykonalne.Po załadowaniu wszystkich studzienek inkubuj kokulturę do ośmiu godzin po inkubacji, zbierz plastry i zanurz je w związku OCT. Następnie zamroź osadzone plastry w ciekłym azocie i przechowuj je w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza do dalszych badań histologicznych. Po inkubacji wycinków mózgu z oligodendrocytami skierowanymi przez oligodendrocyty CD osiem dodatnich limfocytów T, oligodendrocyty uległy apoptozie.Neurony również uległy apoptozie. Najwcześniejsze oznaki apoptozy zaobserwowano po trzech godzinach inkubacji i utrzymywały się one przez osiem godzin. Apoptoza była bardziej zauważalna w komórkach O-D-C-O-V-A wystawionych na działanie limfocytów T OT one niż w jakimkolwiek innym stanie.Po tej procedurze można zastosować dodatkowe metody, aby odpowiedzieć na pytania dotyczące zachowania migracyjnego komórek T lub udziału kanałów jonowych w opadaniu powieki we własnym laboratorium. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przygotować ostre wycinki mózgu i jak hodować je wspólnie z limfocytami T.

an-ex-vivo-model-an-oligodendrocyte-directed-t-cell-attack-acute

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Ten film demonstruje technikę ex vivo do wywoływania śmierci komórek mózgowych, w której pośredniczą cytotoksyczne limfocyty T CD8+. Po uzyskaniu wycinków mózgu, aktywowane limfocyty T CD8 + skierowane do oligodendrocytów są przenoszone na wycinki, aby celować w osłonkę mielinową i oligodendrocyty. Po inkubacji uszkodzenie mieliny i śmierć neuronów można ocenić histologicznie w obszarach zainteresowania.

Technika ex vivo indukowania śmierci neuronów za pomocą limfocytów T CD8+ specyficznych dla oligodendrocytów

Źródło: Kennedy, L. H., et. al. Wizualizacja i obrazowanie na żywo organelli oligodendrocytów w organotypowych wycinkach mózgu przy użyciu wirusa związanego z adenowirusem i mikroskopii konfokalnej. J. Vis. Exp. (2017)Ten film pokazuje obrazowanie mitochondriów oligodendrocytów w organotypowych wycinkach mózgu myszy. Plaster umieszcza się w komorze kąpielowej z ciągłą cyrkulacją płynu i kontrolowaną temperaturą. Po ustawieniu różnych parametrów mikroskopu konfokalnego wykonywane są obrazy...

Obrazowanie konfokalne ruchu mitochondriów w oligodendrocytach w organotypowych kulturach wycinków mózgu

Opisano technikę badania komórek NG2 i oligodendrocytów za pomocą systemu hodowli plasterkowej w przodomózgowiu i móżdżku.  Metoda ta pozwala na badanie dynamiki proliferacji i różnicowania komórek w obrębie linii oligodendrocytów, w której można łatwo manipulować środowiskiem zewnątrzkomórkowym przy zachowaniu cytoarchitektury tkanek.

Organotypowe kultury warstwowe do badania dynamiki oligodendrocytów i mielinizacji

Komórki globoidalne są charakterystyczną cechą patologiczną choroby Krabbego, leukodystrofii, która obecnie nie ma skutecznej długoterminowej terapii. Opracowaliśmy model hodowli komórkowej w celu zbadania wrodzonej biologii i potencjału chorobotwórczego aktywowanego mikrogleju oraz jego transformacji w komórki globoidalne.

Model in vitro do badania patofizjologii komórkowej w leukodystrofii komórek globoidalnych

Organotypowe kultury plastrów hipokampa (OHSC) reprezentują model in vitro, który bardzo dobrze symuluje sytuację in vivo. W tym miejscu opisujemy ulepszony protokół krojenia oparty na wibratomie w celu uzyskania wysokiej jakości plastrów do wykorzystania w ocenie potencjału neuroprotekcyjnego nowych substancji lub biologicznego zachowania komórek nowotworowych.

Organotypowe kultury warstwowe hipokampa jako model do badania neuroprotekcji i inwazyjności komórek nowotworowych

Oligodendrocyty mielinizujące sprzyjają szybkiemu rozprzestrzenianiu potencjału czynnościowego i przetrwaniu neuronów. Opisano tutaj protokół specyficznej dla oligodendrocytów ekspresji białek fluorescencyjnych w organotypowych wycinkach mózgu z późniejszym obrazowaniem poklatkowym. Ponadto przedstawiono prostą procedurę wizualizacji niebarwionej mieliny.

Wizualizacja i obrazowanie na żywo organelli oligodendrocytów w organotypowych wycinkach mózgu przy użyciu wirusa związanego z adenowirusem i mikroskopii konfokalnej

Prezentujemy metodę, która może dostarczyć dalszych informacji na temat wczesnych zdarzeń leżących u podstaw neurodegeneracji i opiera się na uznanej technice mózgu ex-vivo, łącząc zalety eksperymentów in vivo i in vitro. Co więcej, jest to wyjątkowa okazja do bezpośredniego porównania grupy leczonej i nieleczonej na tej samej płaszczyźnie anatomicznej.

Alternatywne podejście do badania pierwotnych zdarzeń w neurodegeneracji przy użyciu wycinków mózgu szczurów ex vivo

Mikroglej, komórki odpornościowe rezydujące w mózgu, szybko reagują zmianami morfologicznymi na modyfikacje swojego środowiska. Protokół ten opisuje, w jaki sposób wykorzystać mikroskopię dwufotonową do badania przyciągania procesów mikrogleju w kierunku serotoniny lub ATP w ostrych wycinkach mózgu myszy.

Dwufotonowe obrazowanie przyciągania procesów mikroglejowych do ATP lub serotoniny w ostrych wycinkach mózgu

Tutaj prezentujemy metodę przygotowania organotypowych kultur warstwowych z barwienia móżdżku myszy i osłonki mielinowej za pomocą immunohistochemii, odpowiednią do badania mechanizmów mielinizacji i remielinizacji w ośrodkowym układzie nerwowym.

Przygotowanie i barwienie immunologiczne mielinizujących organotypowych kultur warstwowych móżdżku

Ten protokół demonstruje prostą i solidną metodę badania dynamiki wzrostu aksonów in situ i stożka wzrostu. Opisano w nim, w jaki sposób przygotować ex vivo fizjologicznie istotne ostre wycinki mózgu i przedstawiono przyjazny dla użytkownika potok analizy.

In Situ Wizualizacja wzrostu aksonów i dynamiki stożków wzrostu w ostrych kulturach embrionalnych wycinków mózgu ex vivo

Poznaj model ex vivo ataku limfocytów T CD8+ na oligodendrocyty w ostrych wycinkach mózgu myszy. Ta metoda umożliwia szczegółowe badanie demielinizacji i apoptozy neuronów w kontrolowanych warunkach.

Model ex vivo ataku limfocytów T kierowanego przez oligodendrocyty w ostrych wycinkach mózgu

Przeglądaj więcej filmów