Name: Zautomatyzowany pomiar rozedmy płuc i przebudowy małych dróg oddechowych u myszy narażonych na dym papierosowy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 37 s
Description: Poznaj zautomatyzowane metody pomiaru rozedmy płuc i przebudowy dróg oddechowych u myszy narażonych na dym papierosowy. Protokół obejmuje testy czynnościowe i analizę morfometryczną.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Pragniemy podziękować Francesce Polverino, doktorowi naukowemu w Brigham and Women's Hospital za jej wkład w ten artykuł, a także Monice Yao, BS i Kate Rydell, BS za pomoc w hodowli myszy i wystawieniu myszy na dym papierosowy. 
Ta praca była wspierana przez Public Health Service, National Heart, Lung, and Blood Institute Grants HL111835, HL105339, HL114501, Flight Attendants Medical Research Institute Grant #CIA123046, Brigham and Women's Hospital-Lovelace Respiratory Research Institute oraz Cambridge NIHR Biomedical Research Centre.

<ol><li>Murray, C. J., Lopez, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+the+global+burden+of+disease%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J+Med%22%5BJournal%5D)">Measuring the global burden of disease.</a> N. Engl. J Med. 369, 448-457 (2013).</li>
<li>Wright, J. L., Cosio, M., Churg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+chronic+obstructive+pulmonary+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J+Physiol+Lung+Cell+Mol.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Animal models of chronic obstructive pulmonary disease.</a> Am. J Physiol Lung Cell Mol. Physiol. 295, 1-15 (2008).</li>
<li>Hautamaki, R. D., Kobayashi, D. K., Senior, R. M., Shapiro, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+for+macrophage+elastase+for+cigarette+smoke-induced+emphysema+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Requirement for macrophage elastase for cigarette smoke-induced emphysema in mice.</a> Science. 277, 2002-2004 (1997).</li>
<li>Churg, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Late+intervention+with+a+myeloperoxidase+inhibitor+stops+progression+of+experimental+chronic+obstructive+pulmonary+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Respir.+Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Late intervention with a myeloperoxidase inhibitor stops progression of experimental chronic obstructive pulmonary disease.</a> Am. J. Respir. Crit Care Med. 185, 34-43 (2012).</li>
<li>Churg, A., Zhou, S., Wang, X., Wang, R., Wright, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+interleukin-1beta+in+murine+cigarette+smoke-induced+emphysema+and+small+airway+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir.+Cell+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The role of interleukin-1beta in murine cigarette smoke-induced emphysema and small airway remodeling.</a> Am J Respir. Cell Mol. Biol. 40, 482-490 (2009).</li>
<li>Hogg, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nature+of+small-airway+obstruction+in+chronic+obstructive+pulmonary+disease%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">The nature of small-airway obstruction in chronic obstructive pulmonary disease.</a> N. Engl. J. Med. 350, 2645-2653 (2004).</li>
<li>Paigen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+miracle+enough%3A+the+power+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">A miracle enough: the power of mice.</a> Nat. Med. 1, 215-220 (1995).</li>
<li>Vlahos, R., Bozinovski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+pre-clinical+mouse+models+of+COPD%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Sci.+%28Lond%29%22%5BJournal%5D)">Recent advances in pre-clinical mouse models of COPD.</a> Clin. Sci. (Lond). 126, 253-265 (2014).</li>
<li>Churg, A., Tai, H., Coulthard, T., Wang, R., Wright, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cigarette+smoke+drives+small+airway+remodeling+by+induction+of+growth+factors+in+the+airway+wall%29%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Respir.+Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Cigarette smoke drives small airway remodeling by induction of growth factors in the airway wall).</a> Am. J. Respir. Crit Care Med. 174, 1327-1334 (2006).</li>
<li>Guerassimov, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+emphysema+in+cigarette+smoke-exposed+mice+is+strain+dependent%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Respir.+Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">The development of emphysema in cigarette smoke-exposed mice is strain dependent.</a> Am. J. Respir. Crit Care Med. 170, 974-980 (2004).</li>
<li>van Eijl, S., van Oorschot, R., Olivier, B., Nijkamp , F. P., Bloksma, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+and+hypothermia+in+mice+in+a+nose-only+cigarette+smoke+exposure+system%5BTitle%5D)+AND+%22Inhal.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Stress and hypothermia in mice in a nose-only cigarette smoke exposure system.</a> Inhal. Toxicol. 18, 911-918 (2006).</li>
<li>Mauderly, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+3+methods+of+exposing+rats+to+cigarette+smoke%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Comparison of 3 methods of exposing rats to cigarette smoke.</a> Exp. Pathol. 37, 194-197 (1989).</li>
<li>Yao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+superoxide+dismutase+protects+against+pulmonary+emphysema+by+attenuating+oxidative+fragmentation+of+ECM%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Extracellular superoxide dismutase protects against pulmonary emphysema by attenuating oxidative fragmentation of ECM.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 15571-15576 (2010).</li>
<li>Crane-Godreau, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+the+influence+of+vitamin+D+deficiency+on+cigarette+smoke-induced+emphysema%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Physiol%22%5BJournal%5D)">Modeling the influence of vitamin D deficiency on cigarette smoke-induced emphysema.</a> Front Physiol. 4, 132(2013).</li>
<li>McGovern, T. K., Robichaud, A., Fereydoonzad, L., Schuessler, T. F., Martin, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+respiratory+system+mechanics+in+mice+using+the+forced+oscillation+technique%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Evaluation of respiratory system mechanics in mice using the forced oscillation technique.</a> J Vis. Exp. , e50172(2013).</li>
<li>De Vleeschauwer, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repeated+invasive+lung+function+measurements+in+intubated+mice%3A+an+approach+for+longitudinal+lung+research%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Anim%22%5BJournal%5D)">Repeated invasive lung function measurements in intubated mice: an approach for longitudinal lung research.</a> Lab Anim. 45, 81-89 (2011).</li>
<li>Dunnill, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+methods+in+the+study+of+pulmonary+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Thorax%22%5BJournal%5D)">Quantitative methods in the study of pulmonary pathology.</a> Thorax. 17, 320-328 (1962).</li>
<li>Saetta, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Destructive+index%3A+a+measurement+of+lung+parenchymal+destruction+in+smokers%5BTitle%5D)+AND+%22Am+Rev.+Respir.+Dis%22%5BJournal%5D)">Destructive index: a measurement of lung parenchymal destruction in smokers.</a> Am Rev. Respir. Dis. 131, 764-769 (1985).</li>
<li>Saito, K., Cagle, P., Berend, N., Thurlbeck, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+%27destructive+index%27+in+nonemphysematous+and+emphysematous+lungs.+Morphologic+observations+and+correlation+with+function%5BTitle%5D)+AND+%22Am+Rev.+Respir.+Dis%22%5BJournal%5D)">The 'destructive index' in nonemphysematous and emphysematous lungs. Morphologic observations and correlation with function.</a> Am Rev. Respir. Dis. 139, 308-312 (1989).</li>
<li>Robbesom, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+quantification+of+emphysema+in+small+human+lung+specimens%3A+comparison+of+methods+and+relation+with+clinical+data%5BTitle%5D)+AND+%22Mod.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Morphological quantification of emphysema in small human lung specimens: comparison of methods and relation with clinical data.</a> Mod. Pathol. 16, 1-7 (2003).</li>
<li>Moghadaszadeh, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selenoprotein+N+deficiency+in+mice+is+associated+with+abnormal+lung+development%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Selenoprotein N deficiency in mice is associated with abnormal lung development.</a> FASEB J. 4, 1585-1599 (2013).</li>
<li>Churg, A., Sin, D. D., Wright, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Everything+prevents+emphysema%3A+are+animal+models+of+cigarette+smoke-induced+chronic+obstructive+pulmonary+disease+any+use%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir.+Cell+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Everything prevents emphysema: are animal models of cigarette smoke-induced chronic obstructive pulmonary disease any use.</a> Am J Respir. Cell Mol. Biol. 45, 1111-1115 (2011).</li>
<li>McComb, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CX3CL1+up-regulation+is+associated+with+recruitment+of+CX3CR1%2B+mononuclear+phagocytes+and+T+lymphocytes+in+the+lungs+during+cigarette+smoke-induced+emphysema%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">CX3CL1 up-regulation is associated with recruitment of CX3CR1+ mononuclear phagocytes and T lymphocytes in the lungs during cigarette smoke-induced emphysema.</a> Am. J. Pathol. 173, 949-961 (2008).</li>
<li>Mizumura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitophagy-dependent+necroptosis+contributes+to+the+pathogenesis+of+COPD%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Mitophagy-dependent necroptosis contributes to the pathogenesis of COPD.</a> J. Clin. Invest. 124, 3987-4003 (2014).</li>
</ol>

Nie mamy żadnych konfliktów interesów, które moglibyśmy ujawnić.

Większość badaczy wykorzystuje myszy do modelowania głównych przewlekłych patologii płuc i nieprawidłowej fizjologii płuc w POChP (powiększenie przestrzeni powietrznej, SAR i wzrost podatności płuc) występujących w chorobie ludzkiej. Kompleksowe podejście do oceny wpływu interesujących cząsteczek zarówno na rozwój rozedmy płuc, jak i SAR jest potrzebne u myszy, aby kompleksowo ocenić aktywność cząsteczek będących przedmiotem zainteresowania w tych przewlekłych procesach chorobowych. 
W tym pr...

Wykorzystanie modeli zwierzęcych do badania POChP jest wyzwaniem, ponieważ żaden model nie jest w stanie idealnie odtworzyć wszystkich cech ludzkiej choroby(2). Większość badaczy używa myszy do modelowania POChP ze względu na podobieństwa między myszami a ludźmi w ich fizjologii płuc, patologii, genetyce i metabolitach. Ponadto myszy są stosunkowo niedrogie w badaniu, a zarówno rozedma płuc, jak i przebudowa małych dróg oddechowych rozwijają się w ciągu 6 miesięcy od ekspozycji na CS (5,7-9).
POChP wywołana dymem papierosowym: Kilka metod może wywołać POChP u myszy. Większość badaczy naraża myszy na CS, który jest głównym czynnikiem etiologicznym POChP u ludzi. Ekspozycja na CS przez 6 miesięcy powoduje rozwój rozedmy płuc i przebudowy małych dróg oddechowych (SAR) u myszy, ale nasilenie wywoływanej choroby różni się w zależności od badanego szczepu myszy. Na przykład myszy NZWLacZ są odporne na rozwój rozedmy płuc wywołanej przez CS, podczas gdy myszy AKR/J są niezwykle wrażliwe (10). Większość badaczy bada myszy szczepu C57BL / 6 w modelu ekspozycji CS, ponieważ wiele myszy ukierunkowanych na gen jest dostępnych w tym szczepie. Po 6 miesiącach ekspozycji na CS rozedma płuc i zwłóknienie małych dróg oddechowych rozwijają się u myszy C57BL / 6 typu dzikiego (WT), a obie zmiany są stosunkowo łagodne pod względem nasilenia (5,10). Naukowcy stosują dwa rodzaje ekspozycji na CS: ekspozycję tylko na nos i ekspozycję na całe ciało. Główne wady techniki naświetlania tylko przez nos to, że: 1) jest to metoda bardziej pracochłonna; oraz 2) myszy muszą być trzymane w małych komorach, co może wywołać reakcję stresową i hipertermię u zwierząt [11]. Główną wadą ekspozycji na całe ciało (opisaną w niniejszym dokumencie) jest to, że zwierzęta mogą spożywać (a także wdychać) produkty nikotynowe i smoliste podczas czyszczenia sierści. Myszy narażone na CS całego ciała mają również niższy poziom karboksyhemoglobiny i zmniejszoną utratę masy ciała w porównaniu ze zwierzętami narażonymi na CS tylko przez nos (12).
Test czynnościowy płuc (PFT): Miary podatności płuc i elastancji są zwykle podobne u myszy C57BL/6 typu dzikiego (WT) wystawionych na działanie powietrza lub CS przez 6 miesięcy ze względu na stosunkowo łagodną rozedmę płuc, która rozwija się, gdy ten szczep jest narażony na CS(10). Jednakże, gdy zniszczenie rozedmy płuc jest poważniejsze, można wykryć wzrost podatności płuc i przesunięcia w lewo w pętlach przepływu ciśnienie-objętość (PV). To ostatnie można zaobserwować, na przykład, u szczepów mysich, które są bardziej podatne na działanie CS (10), u myszy z genem C57BL / 6 narażonych na CS, które mają cięższy typ rozedmy płuc niż myszy C57BL / 6 WT (13) lub u myszy narażonych na CS poddanych zmianom środowiskowym, które czynią je bardziej podatnymi na działanie CS (14). Protokół ten wykorzystuje respirator dla małych zwierząt do pomiaru zmniejszenia elastycznego odrzutu płuc (wzrost quasistatycznej podatności płuc [Cst] i zmniejszenie elastyczności tkanek [H]), pętle przepływu PV oraz zmiany w oporze dróg oddechowych i tkanek u znieczulonych myszy (15,16).
Pomiary rozedmy płuc: Analiza rozwoju rozedmy płuc u myszy ze szczepem C56BL/6 narażonym na CS jest trudna, ponieważ jej rozkład jest przestrzennie niejednorodny. Kilka różnych metod określa ilościowo powiększenie przestrzeni powietrznej u myszy. Pierwszą zastosowaną metodą było średnie przecięcie liniowe (Lm) [17]. Metoda Lm jest jednak powolnym, ręcznym procesem, który może nie uchwycić niejednorodności choroby (chyba że wszystkie odcinki płuc są losowo pobierane próbki), a zatem jej stosowanie może wprowadzić do analizy stronniczość obserwatora. Wskaźnik destrukcyjny [DI,(18)] określa również ilościowo powiększenie przestrzeni powietrznej za pomocą przezroczystego arkusza z 50 równomiernie rozmieszczonymi punktami umieszczonymi na wydrukowanym cyfrowym obrazie wycinka płuc zabarwionego hematoksyliną i eozyną. Metoda PI ocenia obszar otaczający każdy punkt w zależności od stopnia, w jakim przewody pęcherzykowe i ściany wyrostka zębodołowego w tym obszarze są zniszczone. Główną wadą metody DI jest to, że jest czasochłonna i nie jest dokładniejsza niż inne metody (19,20).
Ten protokół mierzy średnią długość cięciwy zębodołowej i obszar wyrostka zębodołowego na zatopionych w parafinie odcinkach płuc zabarwionych barwnikiem Gilla. Oprogramowanie morfometryczne konwertuje obrazy przekrojów płuc na obrazy binarne (w których tkanka jest biała, a przestrzeń powietrzna), a następnie nakłada jednolitą siatkę poziomych i pionowych linii (cięciw), a następnie oprogramowanie określa ilościowo długość każdej cięciwy w obszarach zidentyfikowanych przez oprogramowanie jako przestrzeń powietrzna. Za pomocą tej metody możliwe jest zmierzenie wielkości pęcherzyków płucnych we wszystkich częściach płuc w sposób znormalizowany i stosunkowo zautomatyzowany (21).
Przebudowa małych dróg oddechowych (SAR): Zwiększone odkładanie się białek ECM (zwłaszcza kolagenów śródmiąższowych) wokół małych dróg oddechowych występuje u zwierząt narażonych na CS i przyczynia się do niedrożności przepływu powietrza. Naukowcy nie badają SAR w zwierzęcych modelach POChP tak często, jak rozwój rozedmy płuc (22). Aby określić ilościowo SAR u myszy narażonych na CS, protokół ten wykorzystuje oprogramowanie do analizy obrazu do pomiaru grubości warstwy białek ECM, która osadza się wokół małych dróg oddechowych (drogi oddechowe o średniej średnicy od 300 do 899 m) w zatopionych w parafinie odcinkach płuc wybarwionych barwieniem trychromowym Massona.

<table><tbody><tr><td>Urządzenie do ekspozycji na dym tytoniowy całego ciała</td><td>Teague Enterprise</td><td>TE-10z</td><td>Narażenie na przewlekły dym w celu wywołania przewlekłej choroby płuc u myszy</td></tr><tr><td>Papieros badawczy</td><td>University of Kentucky</td><td>Papierosy referencyjne 3R4F Pallflex</td><td></td></tr><tr><td>&reg; Filtry do monitorowania powietrza, Emfab Filters TX40HI20WW, 25 mm</td><td>Pall Corporation</td><td>7219</td><td>Do pomiaru TPM</td></tr><tr><td>Uchwyt filtra 25 mm</td><td>Pall Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Próbnik filtrów</td><td>Intermatic</td><td>Metal T100</td><td></td></tr><tr><td>Gazomierz</td><td>AEM</td><td>Gazomierze G1.6; G2.5; G4</td><td></td></tr><tr><td>Kaniula tchawicy dla myszy 18 gauge</td><td>Labinvention</td><td></td><td>Analiza funkcji płuc</td></tr><tr><td>Wentylator mechaniczny</td><td>Scireq</td><td>FlexiVent</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór hematoksyliny Gilla&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>GSH316</td><td>Do barwienia skrzeli pracuj pod wyciągiem</td></tr><tr><td>Roztwór hematoksyliny, zmodyfikowany przez Harrisa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HHS16</td><td></td></tr><tr><td>Cytoseal-60</td><td>Thermo Scientific</td><td>8310-16</td><td></td></tr><tr><td>Micro-Slide-Field-Finder</td><td>Andwin Scientific INC</td><td>50-949-582</td><td>Do analizy rozedmy płuc</td></tr><tr><td>Scion Image Program</td><td>Scion Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Barwienie trichromowe Masona</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT15</td><td>Do analizy zwłóknienia małych dróg oddechowych</td></tr><tr><td>MetaMorp Offline wersja 7.0</td><td>Molecullar Devices LLC</td><td>31032</td><td></td></tr></tbody></table>

zautomatyzowany pomiar rozedmy płuc i przebudowy małych dróg oddechowych u myszy narażonych na dym papierosowy

Automated Measurement of Pulmonary Emphysema and Small Airway Remodeling in Cigarette Smoke-exposed Mice

Przewiduje się, że POChP będzie trzecią najczęstszą przyczyną śmiertelności na świecie do 2020 roku(1). Modele zwierzęce POChP są wykorzystywane do identyfikacji cząsteczek, które przyczyniają się do procesu chorobowego oraz do testowania skuteczności nowych terapii POChP. Naukowcy wykorzystują szereg modeli POChP z wykorzystaniem różnych gatunków, w tym gryzoni, świnek morskich, królików i psów(2). Jednak najczęściej stosowanym modelem jest ten, w którym myszy są narażone na dym papierosowy. Myszy są szczególnie użytecznym gatunkiem do modelowania POChP, ponieważ ich genomem można łatwo manipulować w celu uzyskania zwierząt, które mają niedobór lub nadmierną ekspresję pojedynczych białek. Badania myszy ukierunkowanych na geny, które były narażone na dym papierosowy, dostarczyły cennych informacji na temat udziału poszczególnych cząsteczek w różnych patologiach płuc w POChP (3-5). Większość badań koncentrowała się na szlakach zaangażowanych w rozwój rozedmy płuc, która przyczynia się do niedrożności przepływu powietrza, która jest charakterystyczna dla POChP. Jednak małe zwłóknienie dróg oddechowych również znacząco przyczynia się do niedrożności przepływu powietrza u pacjentów z POChP (6), ale znacznie mniej wiadomo na temat patogenezy tej zmiany u zwierząt narażonych na dym tytoniowy. Aby wypełnić tę lukę w wiedzy, protokół ten określa ilościowo zarówno rozwój rozedmy płuc, jak i zwłóknienie małych dróg oddechowych u myszy narażonych na dym tytoniowy. Protokół ten wystawia myszy na działanie CS przy użyciu techniki ekspozycji całego ciała, a następnie mierzy mechanikę oddechową u myszy, napełnia płuca myszy do standardowego ciśnienia i mocuje płuca w formalinie. Następnie badacz barwi skrawki płuc barwnikiem Gilla, aby zmierzyć średnią długość struny wyrostka zębodołowego (jako odczyt ciężkości rozedmy płuc), lub barwnikiem trichromowym Massona, aby zmierzyć odkładanie się białek macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) wokół małych dróg oddechowych (jako odczyt zwłóknienia małych dróg oddechowych). Badania nad wpływem szlaków molekularnych na obie te patologie płuc doprowadzą do lepszego zrozumienia patogenezy POChP.

Niniejszy protokół rozpoczyna się od ekspozycji całego ciała myszy na dym papierosowy (CS). Odpowiedni nadzór i konserwacja urządzenia oraz monitorowanie liczby TPM zapewniają spójność ekspozycji na dym (Rysunek 1). Ważne jest, aby badacz przećwiczył technikę zapawania płuc przy użyciu urządzenia do inflacji
Protokół rozpoczyna się od ekspozycji całego ciała myszy na dym papierosowy (CS). Odpowiedni nadzór i konserwacja urządzenia oraz monitorowanie liczby cząstek TPM zapewnia...

Celem tego protokołu jest dostarczenie zautomatyzowanych metod ilościowego określania przewlekłych patologii płuc w mysim modelu POChP. Protokół obejmuje wystawienie myszy na dym papierosowy (CS), pomiar czynności płuc, napompowanie płuc oraz zastosowanie metod morfometrycznych do pomiaru rozedmy płuc i przebudowy małych dróg oddechowych u myszy.

Zautomatyzowany pomiar rozedmy płuc i przebudowy małych dróg oddechowych u myszy narażonych na dym papierosowy

COPD is projected to be the third most common cause of mortality world-wide by 2020(1).  Animal models of COPD are used to identify molecules that ...

Celem tej procedury jest ilościowe określenie POChP, podobnie jak przewlekłe patologie płuc w płucach myszy narażonych na dym papierosowy. Osiąga się to poprzez wystawienie myszy na działanie dymu papierosowego lub powietrza przez sześć miesięcy. Następnie przeprowadza się badanie czynności płuc na myszach za pomocą respiratora dla gryzoni.Następnie płuca są napompowane do ustalonego ciśnienia, usuwane i utrwalane w 10% formalinie. Wreszcie, bardziej pouczające oprogramowanie służy do pomiaru wielkości przestrzeni powietrznej na skrzelowych odcinkach płuc i małej macierzy zewnątrzkomórkowej dróg oddechowych, grubości warstwy białka lub barwionych włoskami Masona odcinkach płuc. Ostatecznie pomiar powiększenia przestrzeni powietrznej w płucach myszy narażonych na dym papierosowy jest wykonywany w sposób ustandaryzowany, bezstronny i zautomatyzowany.Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak średni liniowy pomiar przechwycenia lub indeks destrukcyjny, jest to, że protokół ten jest mniej czasochłonny do wykonania, mniej podatny na stronniczość obserwatora i bardziej skuteczny w uchwyceniu heterogenicznej natury patologii u myszy, ponieważ może analizować chorobę w całych LOB i / lub obu płucach. Po wystawieniu myszy na działanie dymu papierosowego i znieczuleniu ich zgodnie z protokołem tekstowym, należy ogolić skórę przed tchawicą i użyć roztworu na bazie jodu, a następnie etanolu, aby zdezynfekować obszar za pomocą nożyczek z klazurą. Wykonaj nacięcie w linii środkowej przez skórę i tkankę podskórną przed tchawicą i użyj kleszczy, aby oddzielić mięśnie tarczycy mostka.Aby odsłonić tchawicę, przełóż dwucalowy jedwabny szew z tyłu do tchawicy, nadukuj nożyczki tchawicze, aby wykonać tracheostomię na przedniej stronie tchawicy. Następnie włóż kaniulę o rozmiarze 18 do tracheostomii. Wywołaj szew, aby zabezpieczyć go na miejscu za pomocą kaniuli tchawicy.Podłącz mysz do rurki Y adaptera wentylatora mechanicznego i rozpocznij wentylację mechaniczną przy użyciu objętości oddechowej 10 mililitrów na kilogram i częstości oddechów 150 oddechów na minutę. Następnie napompuj płuca do całkowitej pojemności płuc lub TLC trzy razy na historię objętości. Aby zmierzyć pojemność wdechową lub ic i zmniejszyć ektazę płuc, wykonaj oscylację wymuszoną o pojedynczej częstotliwości, manewruj i oceń opór dynamiczny, RRS, elastynę ERS i zgodność CRS układu oddechowego.Następnie wykonaj częstotliwość szerokopasmową, wymuszoną oscylację, manewr i zmierz opór centralnych dróg oddechowych, opór tkankowy RN, tkankę G, elastynę H i stosunek G do H. Na koniec zarejestruj quasi-statyczną zgodność CST podczas manewrów przepływu ciśnienia objętościowego. Powtórz każdy z tych manewrów pięć razy, aż do uzyskania spójnych odczytów. Pompowanie do TL C3 razy między każdą powtarzaną serią.Zapisz średnią wartość dla każdego parametru dla każdej myszy. Wyjmij mysz z respiratora i po uśmierceniu ją zgodnie z protokołem tekstowym. Przetnij przeponę, otwórz klatkę piersiową w linii środkowej i usuń przednie żebra, aby odsłonić płuca.Rozetnij skórę i tkankę podskórną wokół tchawicy i przełóż dwa jedwabne szwy o długości dwóch cali za tchawicą. Po ilościowym określeniu napełnienia płuc poprzez wykonanie płukania oskrzelowo-pęcherzykowego i wypłukaniu powietrza z zestawu do podawania do napełniania płuc, podłącz zestaw do podawania dożylnego do kaniuli tchawicy. Otwórz zawór i pozwól, aby PBS przepływał do płuc grawitacyjnie, aż płuca całkowicie się napełnią.Wykonaj węzeł ze szwem dystalnym do kaniuli tchawicy. Użyj kleszczy, aby podnieść tchawicę i przeciąć ją proksymalnie do węzła. Następnie wypreparuj tkankę łączną za tchawicą i płucami.Ostrożnie wyjmij płuca i umieść je w probówce zawierającej 10% soli fizjologicznej. Buforowana formuła w. Napraw płuca w temperaturze pokojowej przez noc przed użyciem PBS do ich dwukrotnego umycia.Zanurz płuca w parafinie i wytnij pięć grubych odcinków mikroprzebiegu. Następnie użyj plamy skrzelowej, aby zabarwić sekcje i zobrazować je zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Aby przygotować obrazy do analizy obrazu Scion, uruchom obraz Scion i załaduj makra zgodnie ze wskazaniami w dodatkowej części protokołu tekstowego, wybierz jedno makro otwartego obrazu w jasnym polu, aby wybrać i otworzyć plik TIFF.Użyj narzędzi do edycji obrazu, aby przygotować obraz. Do analizy wybierz kolor pędzla, klikając lub biały u dołu okna LUT. Następnie kliknij narzędzie pędzla, aby zmienić rozmiar pędzla.Kliknij dwukrotnie narzędzie pędzla i wprowadź odpowiedni rozmiar pędzla. Użyj narzędzia Pędzel, aby wymusić traktowanie obszarów, które nie są przestrzenią powietrzną lub ścianami wyrostków płucnych, jako przestrzeni powietrznej lub tkanki, malując oskrzela i naczynia na czarno, tak aby były analizowane jako tkanka. Aby zmierzyć średnią długość przewodu w przestrzeni powietrznej, wybierz makro długość przewodu powietrze dwa.Ten krok powoduje przekonwertowanie obrazu w skali szarości na obraz binarny z progiem tylko czarnych lub białych pikseli. Obraz binarny, klikając w pobliżu środka obrazu i przeciągając mysz w górę lub w dół. Aby dostosować wartość progową, kliknij myszą po raz drugi, aby zaakceptować wartość.Dostosuj próg, aby ścianki wyrostka zębodołowego miały taką samą grubość, jak na oryginalnych obrazach. Bardzo ważne jest, aby nie zaniknąć pod progiem, a tym samym nie tworzyć przerw w ściankach wyrostka zębodołowego, które nie występują na oryginalnym obrazie, co spowoduje sztucznie zawyżone wartości długości przewodu. Obserwuj okno, które monituje o ponowne progowanie obrazu binarnego i kontynuuj lub anuluj makro do progu.Ponownie odpowiedz na pytanie dlaczego i wybierz przycisk OK. Obserwuj wygenerowane przez makro okno siatki poziomej i pionowej z liniami oddalonymi od siebie o pięć pikseli. Program mierzy długości poziomych linii pionowych, które nakładają się na przestrzeń powietrzną.Zapisz plik w dowolnym folderze przy użyciu nazwy domyślnej. Obejmuje to format pliku, do którego dołączany jest C LA TXT dla długości przewodu w przestrzeni powietrznej. Umożliwi to makrom raportu programu Excel znalezienie pliku.Aby przeanalizować raporty, otwórz raport X Excel TWENTYX XLS. Wybierz makro CL m multi, aby raportować pomiary długości przewodu wyrostka zębodołowego dla wielu folderów odpowiadających obrazom z wielu myszy z okna pliku. Wybierz jeden folder na raz, podświetlając folder, a następnie wybierając, OK.Po wybraniu każdego folderu obserwuj jego arkusz, który pokazuje statystyki dla każdego pliku CL txt. Następnie statystyki dotyczące danych o długości przewodu połączonych ze wszystkich plików, otwórz plik wszystkie CL, aby wyświetlić dane ze wszystkich arkuszy. Na koniec zmień nazwę i zapisz arkusz kalkulacyjny.Domyślna nazwa pliku to nazwa folderu nadrzędnego dołączona do c xls. Pokazany jest tutaj fragment dobrze napompowanego płuca. Makrofagi w przestrzeniach pęcherzyków płucnych są pomalowane na biało, a naczynia i oskrzela są pomalowane na czarno.Następnie obraz jest konwertowany na obraz binarny poddawany progowaniu przy użyciu oryginalnego obrazu, a następnie odwracany tak, że wszystkie piksele w przestrzeni pęcherzykowej są czarne i/lub piksele w obszarach płuc, które nie są pęcherzykami płucnymi, są białe. Na tych rysunkach pokazano pionowe i poziome długości przewodów wyrostka zębodołowego generowane przez makro oprogramowania. Eksperyment ten ilustruje, że sześć czarnych myszy typu dzikiego C 57 narażonych na dym ma 23% wzrost rozmiaru pęcherzyków płucnych w porównaniu z myszami typu dzikiego narażonymi na kontakt z powietrzem w zależności od wieku i płci.Testy czynnościowe płuc wykazują niewielkie przesunięcia w lewo w pętlach objętości ciśnienia, odzwierciedlające niewielką utratę elastycznego odrzutu płuc, zgodne z łagodną rozedmą płuc, która rozwija się u C 37 czarnych myszy typu dzikiego narażonych na dym papierosowy. Pokazane tutaj sześć miesięcy to obrazy masywnych poplamionych chromem odcinków płuc od C 57 czarnych myszy typu dzikiego wystawionych na działanie powietrza lub dymu papierosowego przez sześć miesięcy, ilustrujące wzrost odkładania się białek macierzy zewnątrzkomórkowej wokół małych dróg oddechowych w papierosach, zwierzęta narażone na dym podczas próby tej procedury. Ważne jest, aby pamiętać, aby uważać, aby nie naciąć płuc podczas wyjmowania ich z klatki piersiowej myszy po jej rozwoju.Technika ta utorowała drogę do poszukiwań w dziedzinie chorób płuc w celu zbadania szlaków, które przyczyniają się do patogenezy przewlekłych proobturacyjnych chorób płuc u myszy oraz oceny skuteczności nowych terapii POChP w przedklinicznym systemie modelowym.

automated-measurement-pulmonary-emphysema-small-airway-remodeling

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Komórki nabłonka płuc można wyizolować z dróg oddechowych myszy i hodować na granicy fazy powietrze-ciecz jako model zróżnicowanego nabłonka oddechowego. Opisano protokół izolacji, hodowli i narażania tych komórek na dym papierosowy z głównego strumienia w celu zbadania odpowiedzi molekularnych na tę toksynę środowiskową.

Izolacja komórek nabłonka dróg oddechowych myszy i ekspozycja na eksperymentalny dym tytoniowy w układzie interfejsu powietrze-ciecz

Eksperymentalne modele mysie astmy alergicznej oferują nowe możliwości badania patogenezy choroby oraz opracowywania nowych terapii. Modele te są odpowiednie do pomiaru czynników kontrolujących alergiczną odpowiedź immunologiczną, zapalenie dróg oddechowych i patofizjologię płuc.

Mysi model astmy indukowanej alergenem

Niniejszy protokół zawiera szczegółowy opis krok po kroku procedur wymaganych do wykonania pomiarów mechaniki układu oddechowego, jak również oceny reakcji dróg oddechowych na wdychaną metacholinę u myszy przy użyciu techniki wymuszonej oscylacji (flexiVent; SCIREQ Inc, Montreal, Qc, Kanada).

Ocena mechaniki układu oddechowego u myszy przy użyciu techniki wymuszonej oscylacji

Tutaj prezentujemy protokół prostego i wiarygodnego pomiaru krzywej ciśnienia i objętości płuc u myszy, pokazując, że jest ona wystarczająco czuła, aby wykryć fenotypowe zmiany miąższowe w dwóch powszechnych patologiach płuc, zwłóknieniu płuc i rozedmie płuc. Ta metryka zapewnia sposób na ilościowe określenie zmian strukturalnych płuc wraz z rozwijającą się patologią.

Pomiar krzywej ciśnienie-objętość w płucach myszy

To badanie opisuje udane wygenerowanie nowego modelu zwierzęcego przewlekłej obturacyjnej choroby płuc (POChP) poprzez wielokrotne wystawianie myszy na działanie wysokich stężeń ozonu.

Generowanie modelu przewlekłej obturacyjnej choroby płuc u myszy poprzez powtarzającą się ekspozycję na ozon

Opisujemy nieinwazyjne podejście do obrazowania multimodalnego oparte na Micro-CT i fluorescencyjnej tomografii molekularnej do podłużnej oceny modelu zwłóknienia płuc myszy wywołanego podwójnym wkropleniem dotchawiczym bleomycyny.

Multimodalne podejście do obrazowania oparte na mikrotomografii komputerowej i fluorescencyjnej tomografii molekularnej do podłużnej oceny zwłóknienia płuc wywołanego bleomycyną u myszy

Prezentowany tutaj jest użyteczny protokół do unieruchomienia płuc, który tworzy stabilne warunki do oceny histologicznej próbek płuc z mysiego modelu rozedmy płuc. Główną zaletą tego modelu jest to, że może naprawić wiele płuc przy tym samym stałym ciśnieniu bez zapadania się płuc lub opróżniania.

Unieruchomienie płuc pod stałym ciśnieniem w celu oceny rozedmy płuc u myszy

Ten protokół demonstruje badanie patofizjologicznych skutków dymu papierosowego (CS) za pomocą systemu ekspozycji na inhalację całego ciała (WBI) (WBIS) zbudowanego we własnym zakresie. System ten może wystawiać zwierzęta na działanie CS w kontrolowanych, powtarzalnych warunkach w celu zbadania wpływu CS na rozedmę płuc i hematopoezę.

Narażenie na dym papierosowy u myszy korzystających z systemu inhalacji całego ciała

Tutaj opisujemy model in vitro do izolowania i różnicowania mysich komórek nabłonka dróg oddechowych, skupiając się na ich aklimatyzacji do przewlekłego ekstraktu z dymu papierosowego (CSE). Model może zostać wykorzystany do kompleksowego scharakteryzowania multiomicznego wpływu CSE, co może dostarczyć informacji na temat reakcji komórkowych na przewlekłe narażenie na dym tytoniowy.

Model in vitro do badania różnicowania i zmian multiomiki na mysich komórkach nabłonka dróg oddechowych stymulowanych ekstraktem z dymu papierosowego

W tym miejscu przedstawiamy protokół wykorzystania mikrotomografii komputerowej (mikro-CT) do ilościowego oznaczania wentylowanych regionów w jednostronnym modelu zwłóknienia płuc wywołanego bleomycyną poprzez wkroplenie dotchawicze po stronie zmiany.

Jednostronna analiza objętości płuc za pomocą mikrotomografii komputerowej w celu lepszej oceny zwłóknienia płuc w modelach przedklinicznych

Przedstawiamy protokół modelowania włóknienia płuc u myszy z wykorzystaniem aerozozolizowanej bleomycyny podanej przez tchawicę. Ta zoptymalizowana metoda umożliwia jednolite, ilościowe i precyzyjne podanie bez nacięcia chirurgicznego, zwiększając powtarzalność i wiarygodność włóknienia wywołanego bleomycyną.

Udoskonalona metoda podawania bleomycyny wewnątrztchawicowej oparta na aerozoli dla powtarzalnych i minimalnie inwazyjnych modeli myszy z włóknieniem płuc

Poznaj zautomatyzowane metody pomiaru rozedmy płuc i przebudowy dróg oddechowych u myszy narażonych na dym papierosowy. Protokół obejmuje testy czynnościowe i analizę morfometryczną.

Zautomatyzowany pomiar rozedmy płuc i przebudowy małych dróg oddechowych u myszy narażonych na dym papierosowy

Przeglądaj więcej filmów