Name: Pomiar szybkości rozpadu mRNA u Saccharomyces cerevisiae przy użyciu szczepów rpb1-1 (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 21 s
Description: Poznaj metodę pomiaru szybkości rozpadu mRNA w drożdżach Saccharomyces cerevisiae przy użyciu szczepu rpb1-1. Technika ta pozwala analizować stabilność transkryptów i regulację ekspresji genów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badania w laboratorium autora są wspierane przez Texas Higher Education Coordination Board's Norman Hackerman Advanced Research Program oraz fundusze start-up z Baylor University.

1. Wzrost komórek drożdży
<ol>
	<li>Wybierz odpowiednie szczepy drożdży, które zostaną wykorzystane do pomiarów szybkości rozpadu mRNA. Aby zahamować transkrypcję przy użyciu wrażliwego na temperaturę allelu polimerazy II RNA, należy użyć szczepów drożdży zawierających mutację rpb1-1 1. Zdobądź ten szczep drożdży z laboratorium, które już je posiada, lub wygeneruj go w laboratorium przy użyciu standardowych technik, jeśli wymagane jest określone tło genetyczne9.</li>
	<li>Stosując sterylną technikę, przygotuj pożywkę drożdżową przy użyciu standardowych procedur 10. Jeśli wybór nie jest wymagany, przygotuj multimedia, takie jak YPD. Alternatywnie, przygotuj selektywne podłoża, jeśli komórki drożdży są przekształcane za pomocą plazmidów i wymagana jest selekcja. Autoklaw pożywki.</li>
	<li>Hoduj komórki drożdży w temperaturze 28 °C, która jest temperaturą dopuszczalną dla tego szczepu drożdży. Zrób to w dwóch krokach:
	<ol>
		<li>W przypadku pierwszego O/N hoduj komórki drożdży w 5 ml pożywki wzrostowej do nasycenia.</li>
		<li>Ustaw drugi O/N pod koniec drugiego dnia. W przypadku drugiego O/N należy zaszczepić różne ilości komórek drożdży z pierwszego O/N w 100 do 150 ml pożywki wzrostowej (w zakresie od 100 μl do 1 ml, 2 ml lub więcej, w zależności od tego, kiedy komórki drożdży muszą zostać zebrane następnego dnia). Wykonaj ten krok, aby upewnić się, że następnego dnia jedna z kultur ma prawidłowy OD600.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Zbierz komórki drożdży
<ol>
	<li>Przygotuj się do zebrania komórek drożdży. Czas na ten krok ma kluczowe znaczenie; Oznacz wszystkie wymagane probówki i zbierz cały wymagany sprzęt i materiały w jednym miejscu. Podgrzać łaźnię wodną do temperatury 39 °C i podgrzać dwie 15 ml probówki z podłożem wzrostowym w temperaturze 28 °C i 60 °C. 
	UWAGA: Objętość pożywki wzrostowej wynoszącą 15 ml można zmieniać w zależności od liczby punktów czasowych, w których komórki mają zostać pobrane.</li>
	<li>Zbierz komórki drożdży, gdy osiągną OD600 od 0,4 do 0,7. Przenieś komórki do 4 - 6 sterylnych butelek z zakrętką o pojemności 50 ml. Wirować przy 7 500 x g w wirówce szybkoobrotowej przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osady w 15 ml pożywce wzrostowej, która równoważyła się w temperaturze 28 °C. Zebrać komórki drożdży w jednej sterylnej kolbie o pojemności 250 ml i równoważyć je przez ~5 minut w temperaturze wzrostu 28 °C.</li>
	<li>Po osiągnięciu przez komórki drożdży równowagi w temperaturze wzrostu, natychmiast dodać 15 ml pożywki wzrostowej o temperaturze 60 °C w celu podniesienia temperatury do 39 °C (temperatura niedopuszczalna) i natychmiast umieścić kolbę w łaźni wodnej o temperaturze 39 °C. Upewnij się, że pożywka hodowlana pozostaje w łaźni wodnej o temperaturze 39 °C przez cały pozostały etap pobierania komórek, aby upewnić się, że transkrypcja jest wyłączona.</li>
	<li>Zebrać komórki w różnym czasie po umieszczeniu kolby w łaźni wodnej o temperaturze 39 °C. Po raz pierwszy pobrać komórki natychmiast po umieszczeniu kolby w temperaturze 39 °C. Zebrać 3 ml porcji i rozprowadzić 3 ml do dwóch probówek do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml. Osadzać komórki przez 10 sekund w mini wirówce lub picofuge z szybkim zwalnianiem i wylać supernatant.</li>
	<li>Natychmiast zamrozić granulki w kąpieli suchego lodu/etanolu lub w ciekłym azocie. Wyznacz pierwszy punkt czasowy, w którym komórki są zbierane, jako punkt czasu zerowego.</li>
	<li>Eksperymentalnie określ punkty czasowe, w których komórki są następnie zbierane w eksperymencie pilotażowym, w zależności od interesujących mRNA. Zwykle zbieraj komórki drożdży w następujących punktach czasowych: 0, 3, 6, 9, 12, 18, 25 i 35 minut (ryc. 2B). Jeśli nie można określić okresu półtrwania mRNA za pomocą wyżej wymienionych punktów czasowych, dostosuj te punkty czasowe. Na przykład w przypadku mRNA z przewidywanymi krótkimi okresami półtrwania należy stosować krótsze punkty czasowe (tj. 0, 1, 2, 3, 4, 6, 9, 12 i 18 minut), a w przypadku mRNA z przewidywanymi długimi okresami półtrwania należy wydłużyć punkty czasowe.</li>
	<li>Po pobraniu komórek należy je przechowywać w zamrażarce w temperaturze -80 °C do czasu przeprowadzenia ekstrakcji RNA.</li>
</ol>
3. Ekstrakcja RNA z komórek drożdży
<ol>
	<li>W przypadku części protokołu dotyczącej ekstrakcji RNA należy użyć technik wolnych od RNaz, aby zapobiec degradacji RNA przez RNazy. Przygotować roztwory wolne od RNaz, szkło i wyroby z tworzyw sztucznych do użycia w ekstrakcji RNA.</li>
	<li>Wyodrębnij RNA z komórek drożdży zgodnie ze standardowymi protokołami. Zazwyczaj stosuje się metodę gorącego fenolu 12. Alternatywnie użyj zestawów, które można użyć do ekstrakcji RNA z komórek drożdży.</li>
	<li>Określić ilość i czystość RNA, zwykle mierząc absorbancję 2 μl RNA przy A260 i A280 za pomocą Nanodrop. Określ stężenie RNA z A260. W oparciu o stężenie rozcieńczyć RNA do 1 μg/μl za pomocą wody uzdatnionej DEPC. 
	UWAGA: Stosunek A260/A280 dostarcza informacji o czystości RNA. Próbka RNA jest czysta, jeśli stosunek A260/A280 wynosi 2,0 ± 0,1.</li>
</ol>
4. Analiza Northern Blot
UWAGA: Użyj northern blot, aby określić ilościowo poziomy mRNA i uzyskać informacje na temat wielkości transkryptów. Ponadto użyj northern blot do wykrycia mRNA, które wytwarzają wiele izoform tego samego mRNA.
<ol>
	<li>Przygotuj 1,0% żel agarozowo-formaldehydowy. Uruchomić równe ilości próbki RNA na żelu agarozowo-formaldehydowym za pomocą elektroforezy zgodnie ze standardowymi protokołami 12. Uruchom drabinkę RNA obok próbek RNA i użyj jej do określenia rozmiarów RNA, które są wykrywane na northern blot. Przed przeniesieniem RNA oddzielonego na żelu agarozowo-formaldehydowym do membrany, należy odciąć pas z drabinką RNA od żelu i uwidocznić za pomocą bromku etydyny. 
	UWAGA: Alternatywnie, cały żel można zabarwić bromkiem etydyny przed przeniesieniem RNA.</li>
	<li>Po tym, jak próbki RNA przeniosą się na odpowiednią odległość na żelu, przenieś RNA do błony przy użyciu technik wolnych od RNazy. Użyj jednego z kilku dostępnych protokołów, aby przenieść RNA do błon 12-13. Aby przenieść RNA do błony, przytnij błonę do mniej więcej tego samego rozmiaru co żel. Przenieś RNA zgodnie ze standardowymi protokołami 12.</li>
	<li>Sieciowanie UV RNA z membraną za pomocą środka sieciującego UV zgodnie z instrukcjami producenta. Alternatywnie piecz membranę w piekarniku nastawionym na 80 °C przez 1 godzinę. Przechowywać membranę w temperaturze -20 °C w plastikowej torbie przez czas nieokreślony, aż zostanie zhybrydyzowana z określonymi sondami. 
	UWAGA: Sucha membrana może być również przechowywana w temperaturze pokojowej między bibułami filtracyjnymi.</li>
</ol>
5. Hybrydyzacja sond komplementarnych do RNA interesującego błonę
UWAGA: Jednym ze sposobów wykrywania mRNA na błonie jest hybrydyzacja 32sond DNA znakowanych P. UWAGA: Badacze pracujący z 32P muszą stosować procedury ochronne, aby zapobiec zanieczyszczeniu. Postępuj zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi dotyczącymi stosowania materiałów promieniotwórczych.
<ol>
	<li>Przygotuj sondę DNA, znakując 25 - 50 ng DNA, które ma być zhybrydyzowane z błoną, zgodnie ze standardowymi protokołami 12. Wygeneruj fragment DNA przez PCR lub trawienie plazmidowe. Określić specyficzną aktywność sondy DNA, zliczając 1 μl znakowanej radioaktywnie sondy DNA po usunięciu nieinkorporowanych nukleotydów 12.</li>
	<li>Podgrzej bufor prehybrydyzacyjny/hybrydyzacyjny w temperaturze 42 °C. Użyj ~10 ml buforu prehybrydyzacji/hybrydyzacji na 100cm2 membrany 12.</li>
	<li>Hybrydyzować 1 - 5 x 106 cpm znakowanej radioaktywnie sondy DNA na ml buforu hybrydyzacyjnego do błony O / N w piecu do hybrydyzacji w celu wykrycia mRNA zainteresowania 12. Upewnij się, że podczas hybrydyzacji obrót pieca do hybrydyzacji odbywa się w kierunku, który powoduje, że cała membrana jest wystawiona na działanie roztworu hybrydyzacyjnego, aby zapewnić prawidłową hybrydyzację.</li>
	<li>Przemyć membranę dwa razy w temperaturze pokojowej przez 15 minut 50 ml 2x SSPE i jeden raz w temperaturze 65 °C 50 ml 2x SSPE/2% SDS przez 15 minut 12. Owiń membranę w folię spożywczą, aby upewnić się, że nie wyschnie ani nie zanieczyści ekranu fosforowego.</li>
	<li>Korzystając z licznika Geigera, oszacuj intensywność radioaktywności na membranie. 
	UWAGA: To oszacowanie zapewnia, że membrana jest wystawiona na działanie ekranu fosforowego przez odpowiedni czas. Dłuższe czasy ekspozycji należy stosować w przypadku membran o niskiej radioaktywności.</li>
	<li>W przypadku plam północnych użyj kontroli obciążenia, aby potwierdzić, że w każdym miejscu załadowane są równe ilości RNA. Aby to zrobić, zdejmij błonę i ponownie sonduj ją RNA, na który badany proces nie ma wpływu. Zdjąć membranę, umieszczając ją w szklanej tacce zawierającej 200 ml wrzącego roztworu do odpędzania (0,1% SDS/0,01 X SSC) na 2 minuty. Wylej roztwór do usuwania i powtórz procedurę pięć razy 12, 
	UWAGA: Przykładem RNA używanego jako kontrola obciążenia jest SCR1. SCR1 to transkrypt polimerazy III RNA, który jest stabilny i obfity. Zobacz materiał SCR1 Liczebność RNA nie powinna ulec znaczącej zmianie podczas krótkich okresów hamowania polimerazy II RNA.</li>
</ol>
6. Określ ilościowo RNA, które jest związane z błoną
UWAGA: Aby określić ilościowo ilość radioaktywności na membranie, wystaw membranę na działanie ekranu fosforowego. Po upływie odpowiedniego czasu naświetlania zeskanuj ekran luminoforowy za pomocą luminowizatora.
<ol>
	<li>Zeskanuj ekran luminoforowy, postępując zgodnie z instrukcjami dostarczonymi przez producenta luminoforu.</li>
	<li>Określ ilościowo mRNA w każdym punkcie czasowym. Określ ilościowo poziomy mRNA za pomocą oprogramowania ImageQuant lub oprogramowania pokrewnego. Normalizuj mRNA w każdym punkcie czasowym do kontroli obciążenia. Jeśli SCR1 został użyty jako kontrola obciążenia, znormalizuj okres półtrwania północnych do SCR1.</li>
	<li>Okres półtrwania mRNA oblicza się, dzieląc ilość mRNA pozostałą w każdym punkcie czasowym przez ilość mRNA obecnego w punkcie czasowym 0 (początkowy punkt czasowy). Wykres procentowy pozostałego mRNA w funkcji czasu na wykresie półlogarytmicznym (Figura 2C). Oblicz okresy półtrwania mRNA za pomocą następującego równania: 
	t1/2 = -0,693/k (minus 0,693)</li>
	<li>k to nachylenie linii najlepszego dopasowania, a t1/2 to okres półtrwania mRNA.</li>
</ol>

<ol><li>Nonet, M., Scafe, C., Sexton, J., Young, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eukaryotic+RNA+polymerase+conditional+mutant+that+rapidly+ceases+mRNA+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Eukaryotic RNA polymerase conditional mutant that rapidly ceases mRNA synthesis.</a> Mol. Cell. Biol. 7, 1602-1616 (1987).</li>
<li>Santiago, T. C., Purvis, I. J., Bethany, A. J., Brown, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relationship+between+mRNA+stability+and+length+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The relationship between mRNA stability and length in Saccharomyces cerevisiae.</a> Nucleic Acids Res. 14 (21), 8347-8360 (1986).</li>
<li>Jimenez, A., Tipper, D. J., Davies, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mode+of+action+of+thiolutin%2C+an+inhibitor+of+macromolecular+synthesis+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Mode of action of thiolutin, an inhibitor of macromolecular synthesis in Saccharomyces cerevisiae.</a> Antimicrob Agents Chemother. 3 (6), 729-738 Forthcoming.</li>
<li>Herrick, D., Parker, R., Jacobson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+Comparison+of+stable+and+unstable+mRNAs+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Identification and Comparison of stable and unstable mRNAs in Saccharomyces cerevisiae.</a> Mol Cell Biol. 10 (5), 2269-2284 Forthcoming.</li>
<li>Grigull, J., Mnaimneh, S., Pootoolal, J., Robinson, M. D., Hughes, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+Analysis+of+mRNA+Stability+Using+Transcription+Inhibitors+and+Microarrays+Reveals+Postranscriptional+Control+of+Ribosome+Biogenesis+Factors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Genome-wide Analysis of mRNA Stability Using Transcription Inhibitors and Microarrays Reveals Postranscriptional Control of Ribosome Biogenesis Factors.</a> Mol Cell Biol. 24 (12), 5534-5547 (2004).</li>
<li>Tani, H., Akimitsu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+technology+for+determining+RNA+stability+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biology%22%5BJournal%5D)">Genome-wide technology for determining RNA stability in mammalian cells.</a> RNA Biology. 9 (10), 1233-1238 (2012).</li>
<li>Pelechano, V., Perez-Ortin, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcriptional+inhibitor+thiolutin+blocks+mRNA+degradation+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">The transcriptional inhibitor thiolutin blocks mRNA degradation in yeast.</a> Yeast. 25, 85-92 (2008).</li>
<li>Kervestin, S., Jacobson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMD%3A+a+multifaceted+response+to+premature+translational+termination%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">NMD: a multifaceted response to premature translational termination.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 13, 700-712 (2012).</li>
<li>Kolodziej, P. A., Woychik, N., Liao, S. M., Young, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+Polymerase+II+subunit+composition%2C+stoichiometry+and+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">RNA Polymerase II subunit composition, stoichiometry and phosphorylation.</a> Mol Cell Biol. 10 (5), 1270-1275 (1990).</li>
<li>Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Seidman, J. G., Smith, J. A., Struhl, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAusubel%2C+FM+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22">Current Protocols in Molecular Biology</a>. , John Wiley and Sons, Inc.. (1998).</li>
<li>Kebaara, B. W., Nazarenus, T., Taylor, R., Atkin, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+background+affects+relative+nonsense+mRNA+accumulation+in+wild-type+and+upf+mutant+yeast+strains+Current+Genetics%29%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Genetic background affects relative nonsense mRNA accumulation in wild-type and upf mutant yeast strains Current Genetics).</a> 43, 171-177 (2003).</li>
<li>Kebaara, B. W., Baker, K. E., Patefield, K. D., Atkin, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Nonsense-Mediated+mRNA+Decay+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Analysis of Nonsense-Mediated mRNA Decay in Saccharomyces cerevisiae.</a> Current Protocols in Cell Biology. 27 (27.3), 27.3.1-27.3.39 (2012).</li>
<li>Hu, W., Coller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+measuring+mRNA+Decay+Rate+in+Saccharomycescerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Methods for measuring mRNA Decay Rate in Saccharomycescerevisiae.</a> Methods in Enzymology. 530, 137-155 (2013).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnego interesu finansowego.

Hamowanie syntezy mRNA i monitorowanie obrotu mRNA w przypadku braku nowej syntezy jest metodą często stosowaną do pomiaru szybkości rozpadu mRNA. U S. cerevisiae jedną z najczęściej stosowanych metod jest pomiar szybkości rozpadu mRNA poprzez hamowanie transkrypcji za pomocą wrażliwego na temperaturę allelu polimerazy RNA II. Ta metoda specyficznie hamuje polimerazę RNA II. Najbardziej krytyczne etapy określania szybkości rozpadu mRNA przy użyciu tej techniki to: 1) Przed pobraniem komórek drożdży upewnij się, ...

Transkrypcja i rozpad specyficznego mRNA są kluczowymi determinantami ekspresji genów. Szybkość syntezy i rozpadu określonych mRNA określa poziom w stanie stacjonarnym tego konkretnego mRNA. Poziomy mRNA w stanie stacjonarnym regulują obfitość mRNA i określają, ile każdego mRNA jest dostępne do syntezy białek. Pomiary okresów półtrwania mRNA są szeroko stosowane do określania szybkości rozpadu mRNA. Specyficzne mRNA rozpadają się w różnym tempie, co jest związane z cechami mRNA, funkcją białka kodowanego przez mRNA i warunkami środowiskowymi. W zależności od techniki zastosowanej do określenia szybkości rozpadu mRNA, pomiary szybkości rozpadu można określić globalnie lub dla poszczególnych transkryptów. W drożdżach S. cerevisiae techniki, które są najczęściej stosowane do pomiaru globalnego tempa rozpadu mRNA, obejmują wykorzystanie szczepu drożdży zawierającego wrażliwy na temperaturę allel polimerazy RNA II i chemicznych inhibitorów transkrypcji, takich jak tiolutyna i 1,10-fenantrolina 1-5. Metody te mogą być również wykorzystywane do pomiaru szybkości rozpadu poszczególnych mRNA 4. Inne metody mogą być również wykorzystane do pomiaru szybkości rozpadu mRNA. Metody te obejmują podejście do znakowania w stanie ustalonym lub wykorzystania cząsteczek mRNA, które są wyrażane z regulowanego promotora, który ulega ekspresji tylko w wybranych warunkach. Każda z tych technik ma pewne zalety i ograniczenia. Opisana tutaj technika wykorzystuje wrażliwy na temperaturę allel polimerazy RNA II. Metoda ta wykorzystuje S. cerevisiae jako model, ale może być modyfikowana i wykorzystywana w innych systemach przy użyciu specyficznych technik hamowania transkrypcji 6.
 pomiary okresu półtrwania mRNA przy użyciu wrażliwego na temperaturę allelu polimerazy RNA II są szeroko stosowane zarówno do pomiarów całego genomu, jak i indywidualnych pomiarów rozpadu mRNA 4-5. Technika ta wymaga użycia specyficznego szczepu drożdży, który zawiera wrażliwy na temperaturę allel polimerazy RNA II, rpb1-11. Uzasadnieniem dla tej techniki jest to, że wystawienie wrażliwego na temperaturę szczepu drożdży na niedopuszczalną temperaturę hamuje syntezę mRNA. Następnie rozpad istniejącego wcześniej mRNA jest monitorowany w różnych punktach czasowych po zahamowaniu transkrypcji. Zniknięcie istniejącego wcześniej mRNA jest monitorowane poprzez ekstrakcję RNA z komórek drożdży w różnych punktach czasowych po wyłączeniu transkrypcji. Punkty czasowe, w których zbierane są komórki drożdży, są z góry określone w eksperymencie pilotażowym i zależą od badanych transkryptów i systemu. Szybsze punkty czasowe są używane w przypadku krótkotrwałych transkrypcji, podczas gdy dłuższe punkty czasowe są używane w przypadku dłuższych żyjących transkryptów. Następnie rozpad mRNA jest monitorowany za pomocą analizy northern blot, ilościowego PCR lub RNAseq.
Pomiar okresów półtrwania mRNA przy użyciu wrażliwego na temperaturę allelu polimerazy RNA II ma swoje zalety. Po pierwsze, ta technika jest łatwa i prosta. Po drugie, po pozyskaniu lub wytworzeniu szczepu drożdży w laboratorium, pomiary okresu półtrwania mRNA można określić w różnych warunkach wzrostu; umożliwiające określenie wpływu środowiska na rozpad mRNA. Po trzecie, tempo rozpadu mRNA można monitorować w całym genomie. Stosowanie innych technik hamowania transkrypcji ma również zalety i ograniczenia. Na przykład użycie indukowalnego promotora wymaga subklonowania w celu wytworzenia mRNA, które jest pod kontrolą regulowanego promotora. Tiolutyna nie jest łatwo dostępna i jest droga, gdy jest dostępna. Ponadto sposób działania tiolutyny nie jest w pełni zrozumiały i doniesiono, że wpływa ona na inne procesy komórkowe, w tym hamowanie rozpadu mRNA 7. Alternatywnie, 1,10-fenantrolina, jest łatwiej dostępny. Co więcej, wszystkie techniki stosowane do hamowania transkrypcji mogą zaburzać funkcje komórkowe i mogą wpływać na różne mRNA w różny sposób. Badacz musi określić najbardziej odpowiednią metodę do zastosowania w warunkach eksperymentalnych, aby uzyskać najbardziej wiarygodne wyniki. Aby określić, która metoda jest najbardziej odpowiednia do ich zastosowania, badacz musi zidentyfikować transkrypty i funkcję białek kodowanych przez badane transkrypty. Najbardziej wiarygodne pomiary szybkości rozpadu mRNA to te, które są określane przy użyciu wielu technik i wykazują tę samą szybkość rozpadu. Żadna pojedyncza technika nie jest zawsze najlepsza, a najbardziej odpowiednia technika zależy od konkretnej sytuacji.
Liczne badania nad S. cerevisiae mierzyły tempo rozpadu mRNA w różnych warunkach i tłach genetycznych. Warunki, w których mierzy się szybkość rozpadu mRNA, zależą od konkretnego badanego eksperymentu. Pomiar szybkości rozpadu mRNA w różnych środowiskach komórkowych określa, czy badane warunki preferencyjnie wpływają na szybkość rozpadu określonych mRNA. Szybkość rozpadu mRNA może się również różnić w zależności od użytego szczepu drożdży. Na przykład tempo rozpadu mRNA można określić w komórkach drożdży typu dzikiego i komórkach drożdży z niefunkcjonalnym szlakiem degradacji mRNA za pośrednictwem nonsensu (NMD). Ten szlak degradacji mRNA znajduje się we wszystkich organizmach eukariotycznych, które zostały do tej pory zbadane i wyzwala degradację mRNA, które przedwcześnie kończą translację 8. NMD został początkowo zidentyfikowany jako szlak, który degraduje mRNA za pomocą kodonów przedwczesnej terminacji lub kodonów nonsensownych, ale obecnie jest uznawany za szlak, który reguluje również ekspresję nonsensownych mRNA zawierających naturalne mRNA. mRNA, które są celami szlaku, są szybko degradowane w komórkach drożdży z funkcjonalnym szlakiem NMD i stabilizowane w komórkach drożdży z niefunkcjonalnym szlakiem NMD. W związku z tym okresy półtrwania mRNA, które są bezpośrednimi celami tego szlaku, są krótsze w komórkach drożdży typu dzikiego w porównaniu z komórkami drożdży z niefunkcjonalnym szlakiem NMD.

<table><tbody><tr><td>Wirówka szybkoobrotowa</td><td>Eppendorf</td><td>22628169</td><td></td></tr><tr><td>Mini wirówka</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-090-100</td><td></td></tr><tr><td>Membrana Genescreen Plus</td><td>PerkinElmer</td><td>50-905-0169</td><td></td></tr><tr><td>Piec do hybrydyzacji</td><td>Fisher Scientific</td><td>95-0030-01</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometr Nanodrop</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-8000</td><td></td></tr><tr><td>Ekran fosforowy</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>28-9564-78</td><td></td></tr><tr><td>Phosphorimager Typhoon</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>29004080</td><td></td></tr><tr><td>Sieciownik UV</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>80-6222-31</td><td>Alternatywnie membranę można piec w piekarniku ustawionym na 80&deg; przez 1 godzinę</td></tr><tr><td>Bufor prehybrydyzacyjny/hybrydyzacyjny NorthernMax&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>AM8677</td><td></td></tr><tr><td>Szczepy drożdży z mutacją</td><td></td> rpb1-1 <td>Szczepy drożdży można uzyskać z laboratorium lub stworzyć na określonym tle</td><td></td></tr></tbody></table>

pomiar szybkości rozpadu mrna u saccharomyces cerevisiae przy użyciu szczepów rpb1-1

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

poziomy mRNA w stanie stacjonarnym różnią się w zależności od warunków środowiskowych. Regulacja poziomów akumulacji mRNA w stanie stacjonarnym zapewnia syntezę odpowiedniej ilości białka dla określonych warunków wzrostu komórki. Jednym z podejść do pomiaru szybkości rozpadu mRNA jest hamowanie transkrypcji, a następnie monitorowanie zaniku już obecnego mRNA. Szybkość rozpadu mRNA można następnie określić ilościowo, a dokładny okres półtrwania można określić za pomocą kilku technik. W przypadku S. cerevisiae opracowano protokoły mierzące okres półtrwania mRNA i obejmują hamowanie transkrypcji mRNA przy użyciu szczepów, które zawierają wrażliwy na temperaturę allel polimerazy RNA II, rpb1-1. Inne techniki pomiaru okresów półtrwania mRNA obejmują hamowanie transkrypcji za pomocą inhibitorów transkrypcji, takich jak tiolutyna lub 1,10-fenantrolina, lub alternatywnie, poprzez wykorzystanie mRNA, które są pod kontrolą regulowanego promotora, takiego jak promotor indukowany galaktozą i system TET-off. W tym miejscu opisujemy pomiar szybkości rozpadu mRNA S. cerevisiae przy użyciu wrażliwego na temperaturę allelu polimerazy RNA II. Technika ta może być stosowana do pomiaru szybkości rozpadu mRNA poszczególnych mRNA lub w całym genomie.

Zdolność tego protokołu do dokładnego pomiaru szybkości rozpadu mRNA zależy od zahamowania transkrypcji, zbioru komórek drożdży w odpowiednich punktach czasowych oraz stosowania technik wolnych od RNaz podczas ekstrakcji RNA i analizy northern blotting. Wykrywanie dwóch kontrolnych mRNA, z których jedno jest znane jako niestabilne, a drugie jako stabilne, daje pewność co do poprawności przeprowadzenia eksperymentu. Można to na przykład osiągnąć, stosując sondę wykrywającą zarówno pre-mRNA, jak i mRNA CYH2. <stro...

Poziom w stanie stacjonarnym określonych mRNA jest określany przez szybkość syntezy i rozpadu mRNA. Tempo degradacji mRNA w całym genomie lub tempo rozpadu określonych mRNA można zmierzyć, określając okresy półtrwania mRNA. Protokół ten koncentruje się na pomiarze szybkości rozpadu mRNA u Saccharomyces cerevisiae.

Pomiar szybkości rozpadu mRNA u Saccharomyces cerevisiae przy użyciu szczepów rpb1-1

mRNA steady state levels vary depending on environmental conditions. Regulation of the steady state accumulation levels of an mRNA ensures that the ...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest zmierzenie tempa rozpadu mRNA u drożdży Saccharomyces visi. Osiąga się to poprzez pierwszy wzrost komórek drożdży do fazy logarytmicznej w temperaturze dopuszczalnej. Następnie komórki są przenoszone do wyższej temperatury, w której całkowita synteza mRNA jest hamowana.Próbki drożdży są następnie zbierane w określonych punktach czasowych dla każdej próbki. Całkowite RNA jest ekstrahowane, rozdzielane przez elektroforezę żelową i przenoszone do membrany. Na koniec przeprowadza się hybrydyzację północną w celu ustalenia wszelkich zmian poziomów mRNA w funkcji czasu.Ostatecznie protokół ten może być wykorzystany do pomiaru szybkości rozpadu mRNA poszczególnych mRNA lub całego genomu w różnych warunkach wzrostu. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie rozpadu RNA, takie jak tempo rozpadu DO RNA różni się w różnych warunkach komórkowych i tłach genetycznych. Tę procedurę zademonstruje Megan Pelli, doktorantka z mojego laboratorium.Aby rozpocząć, należy przygotować kulturę starterową poprzez zaszczepienie pojedynczej kolonii drożdży w pięciu mililitrach odpowiedniej selektywnej pożywki dla rozważanego szczepu. Jeśli sz

measurement-mrna-decay-rates-saccharomyces-cerevisiae-using-rpb1-1

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Pomiar szybkości rozpadu mRNA w Saccharomyces cerevisiae przy użyciu szczepów rpb1-1

Całkowite komórkowe RNA stanowi kiepski szablon do badania krótkoterminowych zmian w syntezie i rozpadzie RNA, jak również kinetyki przetwarzania RNA. W tym miejscu opisujemy znakowanie metaboliczne nowo transkrybowanego RNA za pomocą 4-tiourydyny, a następnie biotynylację specyficzną dla tiolu i oczyszczanie nowo transkrybowanego RNA, co pozwala przezwyciężyć te ograniczenia.

Znakowanie metaboliczne nowo transkrybowanego RNA w celu profilowania ekspresji genów w wysokiej rozdzielczości syntezy, przetwarzania i rozpadu RNA w hodowli komórkowej

Szybkość mutacji w młodych komórkach Saccharomyces cerevisiae mierzona za pomocą testów fluktuacyjnych służy do przewidywania częstości mutacji dla komórek macierzystych w różnym wieku replikacji. Sortowanie magnetyczne i cytometria przepływowa są następnie wykorzystywane do pomiaru rzeczywistej częstości mutacji i wieku komórek macierzystych w celu zidentyfikowania wszelkich odchyleń od przewidywanych częstości mutacji.

Połączenie sortowania magnetycznego komórek macierzystych i testów fluktuacji w celu analizy niestabilności genomu podczas starzenia się komórek mitotycznych u Saccharomyces cerevisiae

Tutaj opisujemy solidny test biologiczny do ilościowego określania względnego tempa proteolizy przez układ ubikwityna-proteasom. Odczyt testu to tempo wzrostu drożdży w płynnej kulturze, które zależy od poziomów komórkowych białka reporterowego składającego się z sygnału degradacji połączonego z niezbędnym markerem metabolicznym.

Test wzrostu oparty na reporterze do systematycznej analizy degradacji białek

Ten artykuł opisuje test oparty na wzroście drożdży do określania wymagań genetycznych dla degradacji białek. Zademonstrowano również metodę szybkiej ekstrakcji białek drożdży, nadającą się do western blot w celu biochemicznego potwierdzenia wymagań degradacji. Techniki te można dostosować do monitorowania degradacji różnych białek.

Oznaczanie na podstawie wzrostu i biochemiczne potwierdzenie wymagań genetycznych dotyczących degradacji białek u Saccharomyces cerevisiae

Tutaj prezentujemy protokół wykorzystujący sekwencję RNA do monitorowania poziomów mRNA w czasie podczas niedotlenienia komórek S. cerevisiae. Metodę tę można dostosować do analizy ekspresji genów podczas dowolnej odpowiedzi komórkowej.

Pomiar poziomu mRNA w czasie podczas odpowiedzi niedotlenienia drożdży S. cerevisiae

Opisujemy protokół generowania proliferujących i spokojnych pierwotnych ludzkich fibroblastów skórnych, monitorowania tempa zaniku transkryptu i identyfikacji genów rozkładających się w różny sposób.

Określanie szybkości zaniku transkryptów w całym genomie w proliferujących i spoczynkowych ludzkich fibroblastach

Opisany tutaj protokół opiera się na kwantyfikacji całego genomu nowo zsyntetyzowanych mRNA oczyszczonych z komórek drożdży znakowanych 4-tiouracylem. Metoda ta pozwala na pomiar syntezy mRNA niesprzężonej z rozpadem mRNA, a tym samym zapewnia dokładny pomiar transkrypcji polimerazy II RNA.

Saccharomyces cerevisiae (Saccharomyces cerevisiae) Znakowanie metaboliczne za pomocą 4-tiouracylu i kwantyfikacja nowo zsyntetyzowanego mRNA jako wskaźnika aktywności polimerazy II RNA

Rybonukleotydy są jednymi z najliczniejszych niekanonicznych nukleotydów włączonych do genomu podczas replikacji eukariotycznego jądrowego DNA. Jeśli rybonukleotydy nie zostaną prawidłowo usunięte, mogą powodować uszkodzenie DNA i mutagenezę. W tym miejscu przedstawiamy dwa podejścia eksperymentalne, które są stosowane do oceny obfitości inkorporacji rybonukleotydów w DNA i ich skutków mutagennych.

Badanie inkorporacji rybonukleotydów: wykrywanie rybonukleotydów specyficznych dla nici w genomie drożdży i pomiar mutagenezy indukowanej rybonukleotydami

Kinetyczne sieciowanie i analiza cDNA to metoda, która pozwala badać dynamikę interakcji białko-RNA w żywych komórkach w wysokiej rozdzielczości czasowej. Tutaj protokół jest szczegółowo opisany, w tym wzrost komórek drożdży, sieciowanie UV, zbieranie, oczyszczanie białek i etapy przygotowania biblioteki sekwencjonowania nowej generacji.

Monitorowanie dynamiki interakcji białko-RNA in vivo w wysokiej rozdzielczości czasowej przy użyciu χCRAC

Tutaj przedstawiamy i opisujemy nieradioaktywną i nieinwazyjną metodę oceny syntezy białek de novo in vivo, wykorzystując nicienie Caenorhabditis elegans i odzyskiwanie fluorescencji po fotowybielaniu (FRAP). Metodę tę można połączyć z genetycznymi i/lub farmakologicznymi badaniami przesiewowymi w celu zidentyfikowania nowych modulatorów syntezy białek.

Ocena szybkości syntezy białek de novo w Caenorhabditis elegans

Protokół ten ilościowo mierzy stabilność i okres półtrwania intergenowych i intragenowych RNA wzmacniających w embrionalnych komórkach macierzystych myszy za pomocą leczenia aktinomycyną D, RT-qPCR oraz analizy regresji nieliniowej. Stosuje się strategie normalizacji specyficzne dla pozycji, aby dokładnie modelować dynamikę rozpadu eRNA w sposób zależny od kontekstu.

Zoptymalizowana ilościowa ocena stabilności RNA wzmacniającego w embrionalnych komórkach macierzystych myszy

Poznaj metodę pomiaru szybkości rozpadu mRNA w drożdżach Saccharomyces cerevisiae przy użyciu szczepu rpb1-1. Technika ta pozwala analizować stabilność transkryptów i regulację ekspresji genów.

Pomiar szybkości rozpadu mRNA u Saccharomyces cerevisiae przy użyciu szczepów rpb1-1

Przeglądaj więcej filmów