Wykonywanie iniekcji podsiatkówkowych u gryzoni w celu dostarczenia komórek nabłonka barwnikowego siatkówki w zawiesinie

Ogólnym celem tej procedury jest wstrzyknięcie pigmentu siatkówki, nabłonka lub komórek RPE do przestrzeni podsiatkówkowej gryzoni przy jednoczesnej minimalizacji urazu. Osiąga się to, najpierw używając ostrej igły, aby zrobić dziurę w oku statecznego zwierzęcia. Następnie komórki są wstrzykiwane do przestrzeni podsiatkówkowej za pomocą igły.

W ostatnim kroku oko jest pokryte kremem nawilżającym, aby utrzymać je nawilżone. Ostatecznie histologia i metody obrazowania in vivo mogą być wykorzystane do monitorowania skuteczności wstrzyknięcia. Podczas gdy metoda, którą pokazaliśmy dzisiaj, została specjalnie dostosowana do dostarczania komórek RPE do przestrzeni podsiatkówkowej, sama technika ma szerokie zastosowanie do dostarczania wielu innych typów komórek i substancji chemicznych do przestrzeni podsiatkówkowej, które mają być stosowane w różnych badaniach przedklinicznych.

Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowe w tej metodzie, będą walczyć, ponieważ trudno jest zobaczyć, jak dobrze wykonano wstrzyknięcie. Wizualne demonstracje tej metody mają kluczowe znaczenie, ponieważ etapy wstrzykiwania są trudne do nauczenia się bez zobaczenia ich wykonywania. Osobiście.

Na około godzinę przed wstrzyknięciem podgrzej roztwór do dysocjacji komórek bez trypsyny, sterylny PBS i pożywkę hodowlaną do 37 stopni Celsjusza, zdemontuj i umieść elementy strzykawki z igłą o rozmiarze 33 we wrzącej wodzie. Następnie odłącz komórki RPE w roztworze dysocjacji komórek na pięć do ośmiu minut. W temperaturze 37 stopni Celsjusza, delikatnie zeskrobując, aby uwolnić wszelkie komórki, które są nadal przyczepione, a następnie rozcieńczyć komórki w 15 mililitrach pożywki hodowlanej w celu dezaktywacji enzymu, przenieś zdysocjowane komórki do 15-mililitrowej probówki, a następnie po zliczeniu odwiruj komórki i ponownie zawieś osad dwa razy od 10 do piątych komórek na mikrolitr w sterylnym podgrzaniu.

PBS następnie przenosi komórki do 1,5-mililitrowej mikroprobówki wirówkowej i ładuje wysterylizowaną strzykawkę 0,5 mikrolitra komórek do natychmiastowego wstrzyknięcia w celu wstrzyknięcia komórek Po potwierdzeniu sedacji palcem u nogi, uszczypnij, umieść znieczulonego gryzonia na boku tak, aby oko, które zostanie wstrzyknięte, było skierowane do góry. Następnie pod mikroskopem preparacyjnym chwyć głowę zwierzęcia dwoma palcami tuż nad uchem i za szczękę i delikatnie rozciągnij skórę równolegle do powiek, tak aby oko lekko wysunęło się z oczodołu. Następnie trzymając go pod kątem.

Aby uniknąć dotykania soczewki i uważać, aby uniknąć jakichkolwiek naczyń krwionośnych, użyj ostrej igły o rozmiarze 30, aby zrobić otwór bezpośrednio pod wstrzyknięciami rąbka. Lepiej pracować z dwiema osobami, tak aby jedna osoba mogła podać wstrzykiwacz, igłę i strzykawkę, co pozwala wstrzykiwaczowi utrzymać ostrość na oku myszy. Teraz wycofaj jednorazową ostrą igłę z oka, utrzymując uchwyt na głowie.

Należy pamiętać dokładnie, gdzie znajduje się otwór i zamontować wstępnie załadowaną strzykawkę. Wyposażony w igłę na mikromanipulatorze, włóż końcówkę igły przez otwór. Ponownie uważaj, aby nie dotknąć soczewki i delikatnie przepchnąć igłę przez oko, aż poczujesz opór.

Ograniczenie wszelkich ruchów do minimum. Ostrożnie wstrzyknij powoli komórki RPE do przestrzeni podsiatkówkowej. Dojdzie do odwarstwienia siatkówki RPE.

Jednak czystszy zastrzyk minimalizuje odwarstwienie i znacznie zwiększa szanse na ponowne przyczepienie, a następnie powoli wycofaj strzykawkę i nałóż krople nawilżające do oczu, aby utrzymać nawilżenie oka, monitorując zwierzę aż do całkowitego wyzdrowienia. Komórki RPE mogą być dostarczane do przestrzeni podsiatkówkowej gryzoni szybko i konsekwentnie. Za pomocą tej techniki.

Chociaż nie jest to wymagane, urazy można znacznie zminimalizować za pomocą mikromanipulatora. Dzięki tej konfiguracji, gdy jest wykonywana czysto, fluorescencja z oznakowanych komórek RPE może być wykryta za pomocą konfokalnego oftalmoskopu skaningowego, a indukowane odwarstwienie siatkówki można zobrazować za pomocą systemu optycznej koherentnej tomografii. Skaning konfokalny Oftalmoskopia została wykorzystana do uchwycenia tych obrazów wokół całego miejsca wstrzyknięcia bezpośrednio po wstrzyknięciu podsiatkówkowym.

Zwróć uwagę, że oderwanie, które jest najgłębsze, ale nie poważne w środkowych obrazach Po opanowaniu, właściwe wstrzyknięcie można wykonać w ciągu pięciu minut, jeśli zostanie wykonane prawidłowo Podczas tej procedury ważne jest, aby pracować ostrożnie i ograniczyć niepotrzebne ruchy do minimum. Mamy nadzieję, że po obejrzeniu tego filmu dobrze zrozumiesz i docenisz technikę wstrzykiwania gryzoniom do siatkówki. Mamy nadzieję, że będzie to skuteczny sposób dostarczania komórek, jednocześnie minimalizujący dyskomfort i uraz oka gryzoni