Name: Pomiar funkcji mięśni gładkich w izolowanej kąpieli tkankowej - zastosowania do badań farmakologicznych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 5 s
Description: Poznaj pomiar napięcia mięśni gładkich w izolowanej kąpieli tkankowej z aorty szczura. Ta metoda umożliwia badanie funkcji receptorów i reaktywności mięśniowej w farmakologii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Laboratorium Wattsa przez lata, oraz dr Marlene Cohen i Kathy Schenck za nauczenie nas tego testu ponad dwie dekady temu. NIGMS R25GM074119 wspierał rozwój tego modułu dydaktycznego dla krótkiego kursu farmakologii integracyjnej i systemowej, który odbywał się na kampusie MSU w latach 2005-2013.

UWAGA: Wszystkie procedury opisane w tym artykule są wykonywane zgodnie z wytycznymi ustalonymi przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Stanowego Michigan.
1. Przygotowanie i konfiguracja systemu
<ol>
	<li>Przygotować 5 l roztworu soli fizjologicznej (PSS), co jest ilością potrzebną do eksperymentu skurczu w kąpieli tkankowej, w którym wykorzystuje się do 50 ml kąpieli tkankowych; patrz Tabela 2 dla przepisu PSS. Obliczyć całkowitą wymaganą objętość, mnożąc liczbę kąpieli tkanek przez objętość kąpieli, a następnie mnożąc przez liczbę wymaganych płukań tkanek.
	<ol>
		<li>Użyj Tabeli 2 jako przewodnika do tworzenia PSS. Rozpuść sole w około 4 litrach wody. UWAGA: HPLC – zalecana jest woda typu I</li>
		<li>Dodać 8 ml 1 M roztworu CaCl2 (147 g/l w przypadku stosowania soli dwuwodzianowej) do roztworu, tak aby roztwór końcowy wynosił 1,6 mM wapnia.</li>
		<li>Quantum sufficit roztwór PSS do 5 L.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozgrzej system kąpieli tkankowej do 37 °C, włączając podgrzewaną łaźnię wodną z recyrkulacją. Krok krytyczny: Każdy element systemu jest pokryty płaszczem wodnym, upewnij się, że są one połączone szeregowo ze sobą. Kierunek przepływu ma kluczowe znaczenie – upewnij się, że woda wpływa do każdego elementu na najniższym połączeniu kolczastym i wychodzi na najwyższym połączeniu kolczastym.</li>
	<li>Włącz system akwizycji danych. Włącz przetworniki siły co najmniej 15 minut przed eksperymentem, aby zrównoważyć temperaturę. 
	UWAGA: Większość przetworników siły wykorzystuje tensometry, które są wrażliwe na zmiany temperatury i początkowo wykazują dryft termiczny po włączeniu zasilania.</li>
	<li>Uruchom oprogramowanie do akwizycji danych i zapewnij połączenie z systemem akwizycji danych. Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta, aby włączyć rejestrację danych.</li>
	<li>Upewnij się, że przetworniki siły są skalibrowane przed umieszczeniem tkanki w kąpieli tkankowej i przed rozpoczęciem zapisu danych; postępuj zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi kalibracji.</li>
	<li>Podłącz system kąpieli tkankowej do butli z gazem medycznym o stężeniu 95%O2 / 5% CO2 i sprawdź, czy nie ma wycieków gazu, a następnie zwiększ ciśnienie w systemie.</li>
	<li>Napełnij zbiorniki kąpieli tkankowej PSS i poczekaj, aż roztwór osiągnie optymalną temperaturę. Zalać system i usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza z systemu i przewodów.</li>
	<li>Sprawdź aeratory do kąpieli tkankowej, aby zapewnić stałe napowietrzanie roztworu, które natlenia bufor PSS i zapewnia ruch Browna w celu rozprowadzenia leków, które zostaną wprowadzone do kąpieli tkankowej podczas eksperymentu. Upewnij się, że napowietrzanie/pęcherzyki nie powodują ruchu tkanek, co zakłóci zapisy danych; W razie potrzeby zmniejsz przepływ gazu. 
	UWAGA: Kąpiel tkankowa i system akwizycji danych są teraz gotowe do rozpoczęcia eksperymentu.</li>
</ol>
2. Przygotowanie tkanek
<ol>
	<li>Najlepiej wypreparować tkanki zwierzęcia bezpośrednio przed użyciem i umieścić je bezpośrednio w PSS. 
	UWAGA: Niektóre tkanki można przechowywać w PSS przez noc w temperaturze 4 °C, ale należy przeprowadzić odpowiednie kontrole w celu potwierdzenia funkcji tkanek po dłuższym przechowywaniu; patrz punkt 6.</li>
	<li>Użyj aorty piersiowej jako tkanki w tym ćwiczeniu.</li>
	<li>Znieczulij szczura zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi i połóż szczura grzbietem do dołu. Potwierdź znieczulenie poprzez uszczypnięcie palca u nogi i utratę odruchowej reakcji na ten bolesny bodziec. 
	UWAGA: W tym protokole wykorzystuje się 70 mg/kg pentobarbitalu podawanego we wstrzyknięciu dootrzewnowym. Wytyczne instytucjonalne dotyczące znieczulenia gryzoni mogą się różnić.</li>
	<li>Utwórz odmę opłucnową, wykonując nacięcie nożyczkami wzdłuż przepony na dnie klatki piersiowej. Następnie kontynuuj nacięcie od dołu klatki piersiowej do mostka i przetnij na pół.</li>
	<li>Wypreparuj lub odłóż na bok te narządy, które znajdują się na szczycie kręgosłupa i zlokalizuj aortę, która leży bezpośrednio wzdłuż kręgosłupa. 
	UWAGA: Ten krok zapewnia wolną przestrzeń roboczą do wypreparowania aorty.</li>
	<li>Odetnij wszystkie połączenia z aortą, od przełyku, płuca itp. i przetnij aortę prostopadle do kręgosłupa na poziomie przepony.</li>
	<li>Delikatnie przytrzymaj aortę kleszczami i użyj nożyczek, aby wypreparować aortę od kręgosłupa. Rozpocznij sekcję w dolnej części przepony przylegającej do kręgosłupa i pracuj w kierunku serca. Upewnij się, że podejmujesz dodatkowe środki ostrożności, aby nie ciągnąć ani nie ciągnąć za tkankę aorty, co może spowodować jej uszkodzenie.</li>
	<li>Natychmiast umieścić aortę w przygotowanym naczyniu separacyjnym zawierającym PSS. 
	UWAGA: Sekcję aorty na pierścienie najlepiej wykonać w naczyniu preparacyjnym, które ma czarną podstawę silastyczną . Pozwala to na użycie drutów, które mogą być używane do kaniulacji aorty i mogą być przymocowane do naczynia, zapewniając stabilność podczas przebywania w naczyniu preparacyjnym. Czarne tło zapewnia kontrast, który ułatwia rozwarstwianie. Należy zachować ostrożność przy stosowaniu drutów kaniulujących, ponieważ warstwę komórek śródbłonka można usunąć przy nadmiernym tarciu drutu o światło naczynia.</li>
	<li>Weź drut i zrób mały kąt 90° na jednym końcu i wepchnij kątowy koniec w fundament silastyczny, aby zakotwiczyć drut doprowadzający. Umieść całą aortę w naczyniu preparacyjnym.</li>
	<li>Przytrzymaj koniec drutu doprowadzającego kleszczami, a następnie delikatnie wkręć drut w światło aorty.</li>
	<li>Użyj kleszczyków i wsuń aortę na drut. Gdy wolny koniec drutu prowadzącego jest widoczny, delikatnie wyginij drut i umieść wolny koniec w silastycznym fundamencie naczynia, aby ustabilizować tkankę.</li>
	<li>Za pomocą małych nożyczek i kleszczy vannas usuń okołonaczyniową tkankę tłuszczową i wszystkie inne obce tkanki, skrzepy krwi itp., aż aorta piersiowa stanie się biała i nieco włóknista.</li>
	<li>Usuń oczyszczoną aortę z drutu i nożyczkami przetnij aortę w pierścienie o szerokości około 3-5 mm.</li>
	<li>Umieść pierścień aortalny na jednym z haczyków na tkanki, przytrzymując haczyk i delikatnie wsuwając pierścień na haczyk za pomocą kleszczy. Powtórz ten proces z drugim hakiem. Uważaj, aby haczyki się nie plątały; patrz rysunek 3.</li>
	<li>Sprawdź, czy każdy haczyk ma przymocowany inny jedwabny szew. Sprawdź, czy jeden haczyk ma małą zawiązaną pętlę z jedwabiu, która umożliwia przymocowanie do pręta szklanego lub ze stali nierdzewnej, podczas gdy drugi to szew o długości 10-4 cm, który zostanie ręcznie przywiązany do przetwornika siły; patrz rysunek 3. 
	UWAGA: Po przymocowaniu aorty do haczyków, tkanka jest gotowa do zamontowania w kąpieli tkankowej; patrz rysunek 3.</li>
	<li>Powtórz kroki 2.14-2.15, aby zamontować drugi pierścień aortalny w drugiej komorze kąpieli tkankowej.</li>
</ol>
3. Umieszczanie tkanek w kąpieli
<ol>
	<li>Należy pamiętać, że w tym systemie same kąpiele tkankowe są nieruchome. W tym czasie napełnij kąpiele tkankowe podgrzanym, napowietrzonym PSS i pozwól, aby roztwór osiągnął temperaturę.</li>
	<li>Za pomocą jedwabnego szwu przywiąż jeden z haczyków na preparacie tkankowym do kołka na pręcie ze stali nierdzewnej. Umieść ten koniec w komorze kąpieli tkankowej. Podłącz pręt do stojaka pierścieniowego i umieść drugi koniec w naczyniu do barwienia wypełnionym PSS, aby utrzymać tkankę zanurzoną w buforze; patrz rysunek 3.
	<ol>
		<li>Umieść pręt i tkankę w komorze do kąpieli tkanek i upewnij się, że tkanka jest całkowicie zanurzona w PSS, a pręt jest zabezpieczony; patrz rysunek 3.</li>
		<li>Przywiąż drugi szew do przetwornika siły i upewnij się, że pozostał luz w szwie między tkanką a przetwornikiem siły. 
		UWAGA: Ten luz zostanie usunięty poprzez regulację mikrometru; patrz rysunek 3.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Powtórz te czynności dla drugiego pierścienia aortalnego i komory kąpieli tkankowej.</li>
</ol>
4. Ustawianie napięcia pasywnego
UWAGA: Każda tkanka ma długość (Lo), na którą komórki mięśni gładkich reagują optymalnie. Wstępne eksperymenty w celu określenia optymalnego napięcia rozciągającego, które pozwala osiągnąć tę długość, muszą być przeprowadzone dla każdego indywidualnego typu tkanki, która ma być zbadana. Aorta piersiowa szczura ma optymalne bierne napięcie rozciągające wynoszące 4 g.
<ol>
	<li>Użyj mikrometru/zębatki, aby zwiększyć napięcie do 2 g i poczekaj, aż tkanka osiągnie plateau. Po osiągnięciu plateau zwiększ napięcie o kolejne 2 g i poczekaj, aż tkanka się ustabilizuje. 
	UWAGA: W pierścieniach aortalnych, po ustabilizowaniu początkowego napięcia 2 g i osiągnięciu plateau, tkanka powinna następnie rozluźnić się do ~1,6 g. Drugie zastosowanie 2 g spowoduje, że tkanka osiągnie ~3,6 g, z czego tkanka ponownie się rozluźni, a napięcie zmniejszy się. Tak więc, po dodaniu 4 g całkowitego napięcia, oprogramowanie powinno wskazać około 3,2 g naprężenia.</li>
	<li>Powtórz te czynności dla drugiego pierścienia aortalnego i komory kąpieli tkankowej.</li>
</ol>
5. Równowaga i produkcja narkotyków
<ol>
	<li>Równoważ tkankę przez 60 minut po przyłożeniu biernego napięcia do tkanki.</li>
	<li>W fazie równowagi należy myć tkankę co 15-20 minut. Odcedzić kąpiel tkankową i zastąpić PSS PSS z podgrzanego zbiornika. 
	UWAGA: W tym czasie tkanka rozluźni się, na co wskazuje utrata napięcia biernego.</li>
	<li>W tym czasie przygotuj leki do eksperymentu, które muszą być co najmniej 1,000 razy bardziej skoncentrowane niż rzeczywiste stężenie w kąpieli, więc do osiągnięcia pożądanego stężenia potrzebna jest tylko niewielka objętość zapasu leku.</li>
</ol>
6. Początkowe wyzwanie
<ol>
	<li>Pod koniec okresu równowagi umyj tkankę po raz ostatni, zapisz dane i ponownie wyzeruj wszystkie dane wejściowe.</li>
	<li>Wybierz agonistę (związek, który spowoduje aktywny skurcz), na który tkanka reaguje. 
	UWAGA: W aorcie piersiowej szczura mięśnie gładkie tętnic będą aktywnie kurczyć się do agonisty receptora alfa adrenergicznego z powodu unerwienia tkanki przez współczulny układ nerwowy. Agonista receptorów adrenergicznych nie byłby przydatny w tkankach jelitowych, biorąc pod uwagę, że agoniści receptorów adrenergicznych powodują rozluźnienie. W takim przypadku można zastosować agonistę receptora, takiego jak acetylocholina (receptor cholinergiczny). Alternatywą zarówno dla fenylefryny, jak i acetylocholiny jest zastosowanie agonisty niebędącego receptorem, takiego jak wysoki poziom potasu (K) jako pierwszego wyzwania. W mięśniach gładkich wysoki poziom potasu działa pośrednio na otwarcie kanałów wapniowych i dlatego jest postrzegany jako ogólny wskaźnik integralności mięśni gładkich.
	<ol>
		<li>Wykonaj pierwsze wyzwanie lub wyzwanie budzenia, dodając 10-5 M fenylefryny do kąpieli tkankowej. Aby osiągnąć to stężenie w 50 ml kąpieli tkankowej, dodać 50 μl 10-2 M roztworu fenylefryny. 
		UWAGA: 50 μl w 50 ml PSS to rozcieńczenie 1/1000, więc końcowe stężenie jest 1000 razy mniejsze niż w przypadku produktu podstawowego, czyli 10-5 M. Wiedza na temat objętości i konsekwentne utrzymywanie objętości w komorze kąpieli tkankowej ma kluczowe znaczenie dla określenia końcowego stężenia leku.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodaj 10-5 M fenylefryny do kąpieli tkankowej i pozwól, aby skurcz osiągnął szczyt, a następnie ustabilizował się, gdy nachylenie danych spadnie do zera. Upewnij się, że rejestrujesz każde zdarzenie eksperymentalne, aby ułatwić analizę poeksperymentalną.</li>
	<li>Po ustabilizowaniu należy dokładnie wypłukać agonistę, opróżniając i ponownie napełniając komorę kąpieli tkankowej nowym PSS. Upewnij się, że te zdarzenia również zostały zarejestrowane. 
	UWAGA: Ogólna zasada jest taka, że stężenie agonisty w kąpieli zmniejsza się 10-krotnie przy każdym myciu. Chociaż może być konieczne więcej niż 3-4 prania, aby przywrócić tkankę do równowagi wyjściowego tonu (napięcia).</li>
	<li>Pozwól tkance odpocząć w tonie wyjściowym przez ~10 minut przed kontynuowaniem.</li>
</ol>
7. Eksperyment
UWAGA: Prazosyna, antagonista receptora alfa adrenergicznego, zostanie wprowadzony do komory kąpieli tkankowej, aby przesunąć krzywą odpowiedzi na stężenie do fenylefryny (PE); jest to wyraźny antagonizm.
<ol>
	<li>Do jednej kąpieli dodać nośnik (H2O), w którym rozpuszczono prazosynę. Do innego dodaj odpowiednie stężenie prazosyny. W takim przypadku dodać 25 μl nośnika do jednej kąpieli i 25 μl 10-5 M stężenia prazosyny do drugiej, aby uzyskać stężenie 5 x 10-9 M lub 5 nM w kąpieli. 
	UWAGA: Chociaż dodanie nośnika wydaje się niepotrzebne w tym przykładzie, konieczne jest to w przypadku korzystania z innych pojazdów, które mogą być wazoaktywne (np. DMSO, etanol, octan). Należy dodać odpowiedni nośnik, nawet jeśli istnieje niewiele dowodów na to, że jest on wazoaktywny.</li>
	<li>Pozostawić nośnik/prazosynę w kąpieli i nie myć chusteczki przez 1 godzinę.
	<ol>
		<li>Podczas gdy tkanki się równoważą, przygotuj wiele stężeń agonisty (PE). Obejmują szeroki zakres stężeń, od stężeń wywołujących brak odpowiedzi (np. 10-9 M PE) do stężeń przekraczających maksymalną odpowiedź (np. 10-4 M PE). Ponieważ krzywe stężenie-odpowiedź mają charakter logarytmiczny, należy przygotować sześć oddzielnych roztworów podstawowych PE (10-6-10-1 M) przez seryjne rozcieńczenia z 10-1 M roztworu podstawowego. Upewnij się, że objętość potrzebna dla każdego stężenia jest nieco większa niż trzykrotność całkowitej objętości potrzebnej dla wszystkich kąpieli (tj. >300 μl).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przystąpić do dodawania agonisty, jak opisano w Tabeli 1. 
	UWAGA: Ten eksperyment wygeneruje krzywą skumulowanego stężenia-odpowiedzi na PE; Każda iteracja uwzględnia ilość substancji już dodanej do kąpieli. Dodawanie następuje do momentu, gdy przestaną zwiększać skurcz lub cała krzywa ustabilizuje się.
	<ol>
		<li>Dodawać każde stężenie leku indywidualnie, aż do osiągnięcia progu tkankowego.</li>
		<li>Jeżeli nie nastąpi żadna zmiana, dodać następne stężenie w szeregu; patrz tabela 2. 
		UWAGA: Czas tych dodatków zależy od zastosowanego agonisty. Na przykład skurcz noradrenaliny i fenylefryny rozwija się szybko i powinien ustabilizować się w ciągu kilku minut. Natomiast skurcz endoteliny-1 rozwija się powoli i może nie ustabilizować się przez blisko 45 minut. Inne eksperymenty można przeprowadzić na tkance po skonstruowaniu krzywej takiej jak ta, o ile (1) substancja zostanie wypłukana; oraz (2) można wykazać, że tkanka powraca do normalnego zachowania skurczowego i nie ma na nią wpływu poprzednie stymulacje.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
8. Analiza danych
<ol>
	<li>Pamiętaj, aby zapisać dane bezpośrednio przed i po interwencji (np. wybudzeniu lub pełnej krzywej).</li>
	<li>Znajdź i ustaw linię bazową tkanek dla każdej komory kąpieli tkankowej/kanału wejściowego, co pomoże w analizie danych.</li>
	<li>Po ustaleniu linii podstawowej znajdź maksymalną odpowiedź dla każdego stężenia i zapisz zmianę w stosunku do wartości wyjściowej. Sekwencyjnie przechodź przez każde ze stężeń i zapisuj przesunięcie linii podstawowej.</li>
	<li>Wykres danych wynikowych. Zrób to w dowolnym programie graficznym. 
	UWAGA: Graph Pad Prism jest przeznaczony dla farmakologów i jest idealny do rodzaju prezentowanego tutaj eksperymentu.</li>
</ol>

<ol><li>Kenakin, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+classification+of+drugs+and+drug+receptors+in+isolated+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol.+Rev%22%5BJournal%5D)">The classification of drugs and drug receptors in isolated tissues.</a> Pharmacol. Rev. 36, 165-222 (1984).</li>
<li>Scheindlin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+brief+history+of+modern+pharmacology%5BTitle%5D)+AND+%22Modern+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">A brief history of modern pharmacology.</a> Modern Drug Discovery. 4, 87-88 (2001).</li>
<li>Christopoulos, A., El-Fakahany, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Qualitative+and+quantitative+assessment+of+relative+agonist+efficacy%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Qualitative and quantitative assessment of relative agonist efficacy.</a> Biochem. Pharmacol. 58, 735-748 (1999).</li>
<li>Arunlakshana, O., Schild, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Some+quantitative+uses+of+drug+antagonists%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Pharmacol.+Chemother%22%5BJournal%5D)">Some quantitative uses of drug antagonists.</a> Br. J. Pharmacol. Chemother. 14, 48-58 (1959).</li>
<li>Christopoulos, A., Kenakin, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((protein-coupled+receptor+allosterism+and+complexing%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol.+Rev%22%5BJournal%5D)">protein-coupled receptor allosterism and complexing.</a> Pharmacol. Rev. 54, 323-374 (2002).</li>
<li>Braverman, A. S., Kohn, I. J., Luthin, G. R., Ruggieri, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prejunctional+M1+facilitory+and+M2+inhibitory+muscarinic+receptors+mediate+rat+bladder+contractility%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Prejunctional M1 facilitory and M2 inhibitory muscarinic receptors mediate rat bladder contractility.</a> Am. J. Physiol. 274, R517-523 (1998).</li>
<li>Singh, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoglobulins+from+scleroderma+patients+inhibit+the+muscarinic+receptor+activation+in+internal+anal+sphincter+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Gastrointest.+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Immunoglobulins from scleroderma patients inhibit the muscarinic receptor activation in internal anal sphincter smooth muscle cells.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 297, G1206-1213 (2009).</li>
<li>Goadsby, P. J., Adner, M., Edvinsson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+endothelin+receptors+in+the+cerebral+vasculature+and+their+lack+of+effect+on+spreading+depression%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cereb.+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Characterization of endothelin receptors in the cerebral vasculature and their lack of effect on spreading depression.</a> J. Cereb. Blood Flow Metab. 16, 698-704 (1996).</li>
<li>Colquhoun, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agonist-activated+ion+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Agonist-activated ion channels.</a> Br. J. Pharmacol. 147, Suppl 1. S17-26 (2006).</li>
<li>Wyllie, D. J., Chen, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taking+the+time+to+study+competitive+antagonism%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Taking the time to study competitive antagonism.</a> Br. J. Pharmacol. 150, 541-551 (2007).</li>
<li>Schild, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pA%2C+a+new+scale+for+the+measurement+of+drug+antagonism.+1947%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">pA, a new scale for the measurement of drug antagonism. 1947.</a> Br. J. Pharmacol. 120 (4), 29-46 (1997).</li>
<li>Oshita, M., Kigoshi, S., Muramatsu, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+characterization+of+two+distinct+alpha+1-adrenoceptor+subtypes+in+rabbit+thoracic+aorta%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Pharmacological characterization of two distinct alpha 1-adrenoceptor subtypes in rabbit thoracic aorta.</a> Br. J. Pharmacol. 108, 1071-1076 (1993).</li>
<li>Hiraoka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+and+functional+characterization+of+alpha1-adrenoceptor+subtypes+in+the+rat+prostate%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Binding and functional characterization of alpha1-adrenoceptor subtypes in the rat prostate.</a> Eur. J. Pharmacol. 366, 119-126 (1999).</li>
<li>Cooke, P. H., Fay, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+between+fiber+length%2C+ultrastructure%2C+and+the+length-tension+relationship+of+mammalian+smooth+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Correlation between fiber length, ultrastructure, and the length-tension relationship of mammalian smooth muscle.</a> J. Cell Biol. 52, 105-116 (1972).</li>
<li>Davis, M. J., Gore, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Length-tension+relationship+of+vascular+smooth+muscle+in+single+arterioles%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Length-tension relationship of vascular smooth muscle in single arterioles.</a> Am. J. Physiol. 256, H630-H640 (1989).</li>
<li>Davis, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-month+serotonin+infusion+results+in+a+prolonged+fall+in+blood+pressure+in+the+deoxycorticosterone+acetate+%28DOCA%29+salt+hypertensive+rat%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">One-month serotonin infusion results in a prolonged fall in blood pressure in the deoxycorticosterone acetate (DOCA) salt hypertensive rat.</a> ACS Chem. Neurosci. 4, 141-148 (2013).</li>
<li>Heppner, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nerve-evoked+purinergic+signalling+suppresses+action+potentials%2C+Ca2%2B+flashes+and+contractility+evoked+by+muscarinic+receptor+activation+in+mouse+urinary+bladder+smooth+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Nerve-evoked purinergic signalling suppresses action potentials, Ca2+ flashes and contractility evoked by muscarinic receptor activation in mouse urinary bladder smooth muscle.</a> J. Physiol. 587, 5275-5288 (2009).</li>
<li>Burdyga, T. V., Wray, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+mechanisms+whereby+temperature+affects+excitation-contraction+coupling+in+smooth+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Physiol%22%5BJournal%5D)">On the mechanisms whereby temperature affects excitation-contraction coupling in smooth muscle.</a> J. Gen. Physiol. 119, 93-104 (2002).</li>
<li>Hyvelin, J. M., O'Connor, C., McLoughlin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+changes+in+pH+on+wall+tension+in+isolated+rat+pulmonary+artery%3A+role+of+the+RhoA%2FRho-kinase+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Lung+Cell+Mol.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effect of changes in pH on wall tension in isolated rat pulmonary artery: role of the RhoA/Rho-kinase pathway.</a> Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 287, L673-L684 (2004).</li>
<li>Tykocki, N. R., Thompson, J. M., Jackson, W. F., Watts, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ryanodine+receptors+are+uncoupled+from+contraction+in+rat+vena+cava%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Ryanodine receptors are uncoupled from contraction in rat vena cava.</a> Cell Calcium. 53, 112-119 (2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Pomiar siły izometrycznej jako narzędzie badawcze ma ponad 150 lat, ale nadal jest prototypową techniką charakterystyki receptorów w tkankach kurczliwych2. Siła tej techniki tkwi w jej prostocie i wszechstronności: rejestrując reakcje wywołane rosnącym stężeniem agonisty w obecności lub bez antagonisty, można uzyskać niezliczone informacje na temat charakterystyki farmakologicznej każdego leku i receptora, z którym się wiąże3-5. Eksperymenty tego typu zbierają również informacje na temat konkurencyjnego i niekonkurencyjnego charakteru zastosowanych antagonistów, a także heterogeniczności receptorów i nieswoistego działania leków6-8. W ten sposób, dzięki prostym permutacjom tego izolowanego eksperymentu z kąpielą tkankową, można wygenerować stosunkowo kompletny profil farmakologiczny receptorów, które pośredniczą w skurczu mięśni wywołanym przez agonistę.
Jeśli chodzi o agonizm, można obliczyć względną skuteczność (EMAX) i siłę działania (EC50) agonisty w danej tkance i porównać je z odpowiedziami innych agonistów w tej samej tkance1. W naszym eksperymencie aortę piersiową szczura inkubowano z nośnikiem lub antagonistą receptora adrenergicznego α1 prazosyną (5 nM) przez jedną godzinę przed dodaniem agonisty adrenergicznego α1 fenylefryny do kąpieli tkankowej i wywołaniem skurczu. Rysunek 2 przedstawia zmodyfikowane wyniki rysunku 1. Zielone reakcje zostały oznaczone maksymalnym skurczem osiągniętym przez PE oznaczonym jako maksimum, maksymalnym skurczem 1/2 oznaczonym jako taki, a następnie powiązanym ze stężeniem PE, które spowodowało tę reakcję. Identyfikacja tych wartości polega na określeniu skutecznego stężenia agonisty, który osiąga połowę maksymalnej (50%) odpowiedzi lub wartość EC50 .
Niestety, stosowanie samych parametrów zależnych od agonisty do określenia charakterystyki wiązania receptora może być skomplikowane9. Idealnie byłoby, gdyby dodatkowe eksperymenty z wykorzystaniem antagonistów receptorów pozwoliły na obliczenie dwóch ważnych parametrów, które są kluczowe dla zdefiniowania interakcji między lekiem a receptorem: -log10 stałej dysocjacji antagonisty (pKB) i -log10 stężenia molowego antagonisty niezbędnego do wywołania dwukrotnego przesunięcia w prawo w krzywej stężenie-odpowiedź (pA2)10. Zarówno K, B, jak i pA2 zyskują swoją użyteczność dzięki temu, że są wartościami niezależnymi od agonistów i pozostają stałe nawet między różnymi tkankami11. Na podstawie danych przedstawionych na rysunku 2 pKB można obliczyć za pomocą następującego równania i na podstawie wartości EC50 obliczonych w innym miejscu:
EC50 przy braku prazosyny = 2 x 10-8 M EC50 w obecności prazosyny = 7 x 10-6 M
Rozwiąż dla KB w następującym równaniu: 
log (dr-1) = log [B] - log KB Gdzie: [B] = stężenie antagonisty, czyli 5 x 10-9 M. log (5 x 10-9 M) = -8,3 dr = stosunek dawki o wartości EC50 w obecności antagonisty/EC50 w przypadku nieobecności. Jeśli występuje przesunięcie w prawo, wartość ta będzie większa niż jeden. Więc: dr = 7 x 10-6 M/2 x 10-8 M lub 700 x 10-8 M/2 x 10-8 M = 700/2 = 350 Podstawiając za [B] i dr: 
log (350-1) = -8 - log KB 
2,54 = -8 - log KB 
pKB = 10,54
Ta wartość dla prazosyny jest zgodna z wartościami uzyskanymi, gdy prazosyna oddziałuje z receptorem adrenergicznym α112,13, co sugeruje, że receptor adrenergiczny pośredniczący w skurczu fenylefryny jest receptorem adrenergicznym α1.
Dla powodzenia tych eksperymentów kluczowe znaczenie ma kilka etapów. Tkanki muszą pozostać w PSS po rozbiorze, aby zapobiec utracie żywotności tkanek. Każdy izometryczny preparat mięśniowy ma optymalną zależność długość-napięcie, która generuje maksymalną siłę przeciwko napięciu biernemu14,15. W eksperymencie opisanym w tym protokole optymalne napięcie bierne zostało wcześniej określone przez krótkie dodanie przyrostów 0,5 g napięcia biernego do tkanki. Tkanka powinna rozpocząć się bez tonu, a następnie po 30 minutach równowagi tkanka została poddana prowokacji maksymalnym stężeniem KCl (80 mM), co wygenerowało aktywny ton. Następnie tkankę przemyto i pozostawiono do powrotu do tonu wyjściowego. Po 15 minutach na linii bazowej umieszczono kolejne 0,5 g napięcia pasywnego i proces ten powtarzano aż do osiągnięcia plateau napięcia aktywnego z dodatkowym napięciem pasywnym. We wstępnych eksperymentach określono całkowite napięcie bierne 4 g w celu osiągnięcia maksymalnego generowania napięcia czynnego w pierścieniach aortalnych, a zatem ta całkowita ilość napięcia jest wywierana na pierścienie przed zrównoważeniem. Proceduralnie najlepiej jest wyzerować wcześniejsze pasywne zastosowanie napięcia, ale można to zrobić w dowolnym momencie przed eksperymentem. Nadmierne rozciąganie tkanek, w dowolnym momencie eksperymentu lub sekcji, negatywnie wpłynie na żywotność tkanek i wyniki eksperymentu. Jest to najbardziej konieczne przy umieszczaniu tkanek w wannie, ponieważ ten krok wiąże się z największym prawdopodobieństwem nadmiernego rozciągnięcia. Aby uzyskać powtarzalne efekty, wymagane jest odpowiednie mycie, pod względem liczby i czasu trwania. Drugie prowokację zbyt wcześnie po początkowym prowokacji lub zanim tkanki powrócą do napięcia wyjściowego, spowoduje nieprawidłowe reakcje. W przypadku badań nad odwracalnymi antagonistami/inhibitorami, nie należy myć tkanek przed dodaniem agonisty, ponieważ stężenie inhibitora zostanie zmniejszone.
Istnieją znaczące zalety i wady izolowanych testów w kąpieli tkankowej.
Niedogodności: Tkanki mogą ulec różnym uszkodzeniom podczas chirurgicznego usuwania lub zakładania pierścieni na haczyki. Ponieważ komórka śródbłonka jest wewnętrzną wyściółką pierścienia aortalnego, należy zachować ostrożność przy umieszczaniu pierścienia na haczykach, aby nie uszkodzić tej warstwy komórek. Tkanki mogą również mieć wyraźnie różną długość czasu, w którym są żywotne w kąpieli tkankowej, i należy to ustalić; Nie wszystkie tkanki są takie same. W związku z tym tkanki mogą zmieniać swoją reakcję w ciągu dnia, tak że kontrola czasu staje się niezbędną kontrolą dla każdego eksperymentu. Dobrym tego przykładem jest tchawica świnki morskiej, która poprawia kurczliwość maksymalnie o 100% podczas typowego 8-godzinnego eksperymentu. Leki, które są słabo rozpuszczalne w wodzie, mogą wytrącać się w PSS. Wreszcie, kumulatywne i niekumulatywne dodawanie leku, który jest agonistą, może skutkować różnymi wynikami, jeśli nastąpi odczulenie receptora na agonistę; angiotensyna II jest jednym z takich leków, który wykazuje szybką tachyfilaksję.
Zalety: Jedną z głównych zalet eksperymentów z kąpielą tkankową jest to, że odbywa się ona w czasie rzeczywistym; Można obserwować przebieg eksperymentu w miarę jego rozwoju i szybko wyciągać wnioski i planować kolejne kroki, a także rozwiązywać problemy podczas eksperymentu. Eksperyment trwa jeden dzień. Z jednego zwierzęcia można zazwyczaj przygotować wiele tkanek, tak że zwierzę może służyć jako samodzielna kontrola, a to dodaje siły eksperymentowi. Można również odizolować tkankę od innych czynników, aby przetestować względnie czystą reakcję tkanki na lek. Eksperymenty in vitro , takie jak system kąpieli tkankowej, pozwalają również na użycie niewielkiej ilości leku w porównaniu z eksperymentem in vivo .
Opisany tu podstawowy schemat eksperymentu może być w znacznym stopniu modyfikowany, aby umożliwić rejestrację dodatkowych parametrów lub wprowadzenie innych bodźców zewnętrznych. Na przykład dodanie elektrod pozwala na stymulację nerwów unerwionychpolem elektrycznym 16,17. Po dodaniu sond termicznych lub pH można również zmierzyć wpływ temperatury i pH na reakcje skurczowe18,19. Podobnie, tlen można częściowo lub całkowicie zastąpićN2 w celu oceny efektów wywołanych hipoksją. Co więcej, te same podstawowe zasady izometrycznego pomiaru kurczliwości, które są używane w tym filmie, mogą być wykorzystane do opracowania systemów, które umożliwiają jednoczesny pomiar rozwoju napięcia izometrycznego i zmian wewnątrzkomórkowego wapnia20. Transdukcja sygnału jest również łatwo badana, ponieważ istnieją systemy, które mogą szybko zamrozić próbkę tkanki podczas odpowiedzi, tak że aktywność systemu szlaku transdukcji sygnału można zweryfikować biochemicznie.
Różnorodność sprzętu, który można do tego wykorzystać, jest ogromna. Cały ten system, zarówno ręcznie zbudowany, jak i zautomatyzowany, można kupić w wielu różnych firmach. Kąpiele tkankowe i uchwyty na tkanki używane w tym protokole były ręcznie dmuchane (kąpiele tkankowe) i ręcznie konstruowane (uchwyty) przez wewnętrzne warsztaty mechaniczne Uniwersytetu Stanowego Michigan.

Dyscyplina farmakologii używa systemu kąpieli tkankowej od ponad 150 lat. Wszechstronność tego systemu pozwoliła naukowcom na całym świecie scharakteryzować receptory i transdukcję sygnału receptorowego, a wiedza ta stanowi podstawę terapii, które leczyły miliony osób z chorobami lub zaburzeniami, takimi jak nadciśnienie, niewydolność serca, cukrzyca, choroby przewodu pokarmowego, dysfunkcja pęcherza moczowego, astma i zaburzenia połykania, by wymienić tylko kilka. Do dnia dzisiejszego kąpiel w izolowanych tkankach pozostaje ważnym aspektem opracowywania leków i badań podstawowych, ponieważ pozwala tkance funkcjonować jako tkanka. W tej lekcji JoVE udostępniono formalny protokół, aby zademonstrować wizualny i wirtualny eksperyment wykorzystujący dane z eksperymentu z izolowaną kąpielą tkankową, który mierzy skurcz izometryczny, co pozwala na charakterystykę receptora.
Główną zaletą tej techniki jest to, że tkanka jest żywa i funkcjonuje jako cała tkanka, z fizjologicznym wynikiem (skurczem lub rozluźnieniem), który jest istotny dla organizmu. Jest to synteza etapów (interakcja lek-receptor, transdukcja sygnału, generacja drugiego przekaźnika, zmiana pobudliwości mięśni gładkich i zmiana funkcji tkanek). Podczas gdy inne techniki pozwalają na badanie każdego z tych etapów (np. wiązanie radioligandu w celu uzyskania powinowactwa do leków, pomiar drugich przekaźników), technika izolowanej kąpieli tkankowej pozwala na integrację wszystkich tych etapów1. Kolejną zaletą jest to, że zachowanie funkcji tkanki pozwala na obliczenie ważnych zmiennych farmakologicznych, które są bardziej znaczące w tkance niż w otoczeniu komórkowym; Jest to bliższe temu, jak badane leki działałyby w organizmie jako całości.

<table><tbody><tr><td>Oprogramowanie LabChart</td><td>ADInstruments</td><td></td><td>7.2</td></tr><tr><td>PowerLab (4 kanały)&nbsp;</td><td>ADInstruments</td><td>ML760</td><td></td></tr><tr><td>QuadBridge (4 kanały)</td><td>ADInstruments</td><td>ML112</td><td>ML112</td></tr><tr><td>adaptera trawy</td><td>ADInstruments</td><td>MLAC11</td><td>MLAC11</td></tr><tr><td>Przetwornik siły przemieszczenia trawy</td><td>Grass Instrument Co</td><td>FT03</td><td>FT03</td></tr><tr><td>przetwornika trawy</td><td>Grass Instrument Co</td><td>TAC-7 REV-1</td><td></td></tr><tr><td></td> <td>BNC do BNCADInstruments</td><td>MLAC01</td><td></td></tr><tr><td>IsoTemp 2100</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>IC-2100</td></tr><tr><td>Kąpiel tkankowa</td><td>Wiele źródeł&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fizjologiczny roztwór</td><td></td><td></td> soli <td>PSS</td></tr><tr><td>Pleciony jedwabny szew</td><td>Aparat Harvard</td><td>51-7615</td><td>SP104</td></tr><tr><td>Stojak na pierścionki</td><td>Humboldt MFG Co</td><td>H-2122 7</td><td></td></tr><tr><td>Naczynia preparacyjne</td><td>Ręcznie robione z silikonową</td><td></td><td></td></tr><tr><td>rurką Tygon</td><td>Zaciski do węży VWR Scientific</td><td>63010-100</td><td>R-3603</td></tr><tr><td></td><td>Cole-Parmer Instrument Co</td><td>06832-08</td><td>SNP-8</td></tr><tr><td>50 ml Kąpiel mięśniowa</td><td>Eberhartglass</td><td>Niestandardowe</td><td></td></tr><tr><td>komory grzewcze 250 ml</td><td>Eberhartglass Blowing</td><td>Niestandardowa</td><td></td></tr><tr><td>rurka dyspersyjna</td> gazu <td>Ace Glass</td><td>7202-06</td><td>7202-02</td></tr><tr><td>Niestandardowe stojaki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td> mikrometryczne <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zaciski trójbolcowe</td><td>Złącze S VWR International</td><td></td><td>Talon</td></tr> Haczyki na tkanki <tr><td></td><td>VWR International</td><td></td><td>Talon</td></tr><tr><td></td><td>Ręcznie robione w domu</td><td>Niestandardowe</td><td></td></tr><tr><td>rozwarstwianie</td><td></td><td></td><td></td>tkanek</tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy Leica MZ6</td><td>Mikroskop Leica</td><td></td><td>10447254</td></tr><tr><td>Stereomaster Światłowodowe źródło światła</td><td>Fisher Scientific</td><td>12562-36</td><td>12562-36</td></tr><tr><td>Kultura Petriego</td><td>Pyrex</td><td></td><td>7740 Szklany</td></tr><tr><td>elastomer silikonowy</td><td>Sylgard Dow Corning</td><td></td><td>Sylgard 170 Zestaw</td></tr><tr><td>Vannas Nożyczki</td><td>George Tiemann & Co</td><td>160-150</td><td>160-150</td></tr><tr><td>Drzazga & Kleszcze mocujące</td><td>George Tiemann & Co</td><td>160-55</td><td>160-55</td></tr></tbody></table>

pomiar funkcji mięśni gładkich w izolowanej kąpieli tkankowej - zastosowania do badań farmakologicznych

Measurement of Smooth Muscle Function in the Isolated Tissue Bath-applications to Pharmacology Research

Izolowane testy kąpielowe są klasycznym narzędziem farmakologicznym do oceny zależności stężenie-odpowiedź w niezliczonych tkankach kurczliwych. Chociaż technika ta jest stosowana od ponad 100 lat, wszechstronność, prostota i powtarzalność tego testu sprawiają, że pozostaje ona niezbędnym narzędziem zarówno dla farmakologów, jak i fizjologów. Systemy kąpieli tkankowych są dostępne w szerokiej gamie kształtów i rozmiarów, co pozwala naukowcom na ocenę próbek tak małych, jak mysie tętnice krezkowe i tak dużych jak jelito kręte świń – jeśli nie większych. Kluczowe znaczenie dla testu izolowanej kąpieli tkankowej ma możliwość pomiaru zależnych od stężenia zmian skurczu izometrycznego oraz sposób, w jaki można manipulować skutecznością i siłą działania agonistów kurczliwych poprzez zwiększanie stężeń antagonistów lub inhibitorów. Mimo że ogólne zasady pozostają stosunkowo podobne, najnowsze osiągnięcia technologiczne pozwalają na jeszcze większą wszechstronność oznaczania kąpieli tkankowej dzięki zastosowaniu komputerowego oprogramowania do rejestracji i analizy danych. W tym filmie zademonstrujemy funkcję izolowanej kąpieli tkankowej do pomiaru izometrycznego skurczu izolowanego mięśnia gładkiego (w tym przypadku pierścieni aorty piersiowej szczura) oraz podzielimy się rodzajami wiedzy, którą można uzyskać za pomocą tej techniki. Zawiera szczegółowe opisy rozwarstwiania i przygotowania tkanki aorty, umieszczania pierścieni aorty w kąpieli tkankowej i prawidłowej równowagi tkanek przed eksperymentami, testów żywotności tkanek, projektu i wdrożenia eksperymentu oraz oceny ilościowej danych. Aorta zostanie podłączona do izometrycznych przetworników siły, z których dane będą rejestrowane za pomocą dostępnego na rynku przetwornika analogowo-cyfrowego i wzmacniacza mostkowego specjalnie zaprojektowanego do wykorzystania w tych eksperymentach. Oprogramowanie towarzyszące temu systemowi zostanie wykorzystane do wizualizacji eksperymentu i analizy przechwyconych danych.

W odniesieniu do agonizmu, względną skuteczność (EMAX) i siłę działania (EC50) agonisty w danej tkance można obliczyć i porównać z odpowiedziami innych agonistów w tej samej tkance1. W naszym eksperymencie aortę klatki piersiowej szczura inkubowano z nośnikiem lub antagonistą receptora α1 adrenergicznymi prazosinem (5 nM) przez jedną godzinę przed dodaniem do kąpieli tkankowej agonisty α1 adrenergicznymi fenylefryny w celu wywołania skurczu (Rysunek 1).&nbsp;
Rysunek 2 przedstawia zmodyfikowane wyniki z Rysunku 1. Zielone odpowiedzi zaznaczają maksymalny skurcz osiągnięty przez PE, oznaczony jako max, oraz połowę maksymalnego skurczu, oznaczoną w ten sposób i powiązaną z koncentracją PE, która wywołała tę odpowiedź. Wyznaczenie tych wartości pozwala na określenie efektywnego stężenia agonisty, które osiąga połowę maksymalnej (50%) odpowiedzi, czyli wartości EC50. W tym przykładzie zostało to wykonane graficznie. Do dopasowania krzywej i obliczenia wartości EC50 można wykorzystać oprogramowanie komputerowe stosujące funkcje logistyczne dla krzywych sigmoidalnych.
Podczas generowania i interpretowania tych wyników ważne jest zastosowanie zarówno niskich, jak i wysokich stężeń agonisty w celu stworzenia krzywej zależności dawka-odpowiedź. Bez wystarczającej liczby punktów wykazujących stabilną linię bazową oraz maksymalny poziom plateau, wartości EC50 i EMAX mogą być jedynie szacowane. W niniejszym przykładzie dokonano tego graficznie. Do dopasowania krzywej i obliczenia wartości EC50 można wykorzystać oprogramowanie komputerowe wykorzystujące funkcje logistyczne dla krzywych sigmoidalnych.
<img alt="Schemat komory perfuzyjnej, konfiguracja przetwornika siły, recyrkulacja płynu, kranik, sterowanie dopływem gazu." src="/files/ftp_upload/52324/52324fig1highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Schemat kąpieli tkankowej. Schemat przedstawiający pierścień tkanki umieszczony w dwuściennej kąpieli tkankowej z płaszczem wodnym. Dopływ i odpływ buforu są regulowane za pomocą szklanego kranika trójdrożnego zintegrowanego z podstawą komory. O2/CO2 jest wprowadzany poprzez aerator uszczelniony uszczelką, aby zapobiec wyciekowi PSS lub gazu. Wlot recyrkulacyjny znajduje się poniżej wylotu, aby zapewnić prawidłową recyrkulację i zapobiec tworzeniu się pęcherzy powietrza, które mogłyby spowodować rozregulowanie temperatury.
<img alt="Krzywa odpowiedź-dawka dla aorty piersiowej szczura, logarytmiczne PE, efekt prazosyny, wykres analizy porównawczej." src="/files/ftp_upload/52324/52324fig2highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Aorta piersiowa szczura + śródbłonek. Powyższy rysunek przedstawia cztery oddzielne eksperymenty (wykonane na różnych zwierzętach przez różnych badaczy przy użyciu różnych zestawów aparatury, co reprezentują różne kolory) w celu przetestowania zdolności prazosyny do przesunięcia skurczu indukowanego przez PE. Prazosyna (5 nM) wyraźnie przesunęła krzywą skurczu indukowanego przez PE w prawo w sposób równoległy.
<img alt="Odpowiedź aorty piersiowej szczura; wykres; siła vs log PE[M]; różne traktowania; efekt prazosyny; EC50." src="/files/ftp_upload/52324/52324fig3highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Aorta piersiowa szczura + śródbłonek. Graficzna ocena wartości EC50 dla PE w obecności (prazosyna) i w przypadku braku (nośnik) antagonisty. Oznaczono jedynie linię zieloną (grupa C).
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sól</td>
			<td>Masa cząsteczkowa (g/mol)</td>
			<td>5 litrów</td>
			<td>KOŃCOWE mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>               (gramy)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>58.45</td>
			<td>37.99</td>
			<td>130</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl </td>
			<td>74.56</td>
			<td>1.75</td>
			<td>4.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>136.1</td>
			<td>0.8</td>
			<td>1.18</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4•7H2O</td>
			<td>246.5</td>
			<td>1.45</td>
			<td>1.17</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>84.21</td>
			<td>6.25</td>
			<td>14.9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dekstroza </td>
			<td>180.16</td>
			<td>5</td>
			<td>5.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>380</td>
			<td>0.05</td>
			<td>0.03</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Skład fizjologicznego roztworu soli (PSS).Skład PSS buforowanego wodorowęglanami użytego w tym eksperymencie. Podano masy cząsteczkowe wszystkich soli oraz ilość dodaną do 5 L dH2O w celu uzyskania pożądanego stężenia.
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody >
		<tr >
			<td >Stężenie w kąpieli</td >
			<td >Ilość agonisty dodana do kąpieli</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >1 x 10-9 M</td >
			<td >50 ml 1 x 10-6 M</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >3 x 10-9 M</td >
			<td >100 ml 1 x 10-6 M</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >1 x 10-8 M</td >
			<td >35 ml 1 x 10-5 M</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >3 x 10-8 M </td >
			<td >100 ml 1 x 10-5 M</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >1 x 10-7 M</td >
			<td >35 ml 1 x 10-4 M</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >3 x 10-7 M</td >
			<td >100 ml 1 x 10-4 M</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >1 x 10-6 M</td >
			<td >35 ml 1 x 10-3 M</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >3 x 10-6 M</td >
			<td >100 ml 1 x 10-3 M</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >1 x 10-5 M</td >
			<td >35 ml 1 x 10-2 M</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >3 x 10-5 M</td >
			<td >100 ml 1 x 10-2 M</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >1 x 10-4 M</td >
			<td >35 ml 1 x 10-1 M</td >
		</tr >
	</tbody >
</table >
Tabela 2: Stężenia agonistów dodawanych do kąpieli tkankowej. Ilość agonisty, którą należy dodać do każdej kąpieli, aby prawidłowo skonstruować skumulowane krzywe zależności odpowiedzi od stężenia. Pożądane stężenie w kąpieli uzyskuje się poprzez sekwencyjne dodawanie coraz większych stężeń agonisty. Każda kolejna porcja uwzględnia stężenie agonisty już obecne w kąpieli. Przystąpiono do tego w celu zminimalizowania wzrostu objętości w kąpieli tkankowej, który wystąpiłby przy zastosowaniu rosnących objętości jednego stężenia agonisty.

Ten protokół opisuje pomiar izometrycznego skurczu w izolowanym preparacie mięśni gładkich, przy użyciu systemu izolowanej kąpieli tkankowej i komputerowej akwizycji danych.

Pomiar funkcji mięśni gładkich w izolowanej kąpieli tkankowej - zastosowania do badań farmakologicznych

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues.  ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest pomiar napięcia mięśni gładkich. Jest to realizowane poprzez wstępne wypreparowanie i przygotowanie tkanek, a następnie zamocowanie tkanki w izolowanej kąpieli tkankowej.Następnie sprawdza się żywotność tkanki i dokonuje pomiarów skurczu izometrycznego. Ostatecznie preparat tkanki izolowanej w kąpieli służy do badania funkcji receptorów, sygnalizacji receptorowej oraz reaktywności mięśni gładkich. Ogólnie rzecz biorąc, głównymi zaletami tej techniki są elastyczność systemu, szybkość uzyskiwania wyników oraz zachowanie ciągłości całej tkanki.Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w każdej dziedzinie, w której wykorzystuje się leki do oddziaływania na sygnalizację receptorową lub mięśnie gładkie. Należy zwrócić szczególną uwagę na kilka aspektów przygotowania. Niezbędne jest wstępne podgrzanie systemu kąpieli tkankowej do 37 °C poprzez włączenie recyrkulacyjnej kąpieli wodnej. Woda musi wpływać do każdego elementu przez najniższe złącze kolczaste i wypływać przez najwyższe złącze kolczaste.Każdy komponent musi zostać podłączony. Przetworniki siły należy skalibrować i uruchomić co najmniej 15 minut przed eksperymentem, aby ich temperatura ustabilizowała się. Następnie, podczas podłączania gazu, należy sprawdzić szczelność układu, a następnie go nadmuchać.Po napełnieniu układu roztworem należy go zaprawić i usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza. Wskazane jest również przetestowanie napowietrzaczy komory z tkanką. Prawidłowe napowietrzanie zapewni skuteczne rozprowadzenie leków, nie destabilizując jednocześnie tkanki bezpośrednio przed eksperymentem.Przeprowadź sekcję tkanki. Po znieczuleniu szczura, za pomocą nożyczek wywołaj odmę opłucnową. Przetnij przeponę u dołu klatki piersiowej.Następnie wykonaj nacięcie od dołu klatki piersiowej do mostka i rozdziel tkanki. Usuń organy znad kolumny kręgowej, aby odsłonić aortę, która biegnie bezpośrednio wzdłuż kręgosłupa. Teraz przetnij wszystkie połączenia z aortą i odetnij aortę prostopadle do kręgosłupa na wysokości przepony.Następnie delikatnie chwyć aortę i oddziel ją od kręgosłupa. Zacznij w dolnej części przepony, w sąsiedztwie kręgosłupa, i kieruj się w stronę serca. Należy zachować ostrożność, aby nie ciągnąć ani nie szarpać tkanki aorty, ponieważ może to doprowadzić do jej natychmiastowego uszkodzenia.Umieść aortę w szalce do sekcji zawierającej PSS. Następnie weź drut i zagnij go pod niewielkim kątem 90 stopni. Jeden z końców, ten zagięty, przymocuj do podstawy szalki do sekcji.Następnie ostrożnie wprowadź drut prowadzący do światła aorty i nasuń aortę na drut. Gdy wolny koniec drutu stanie się widoczny, delikatnie go zagnij i wciśnij w podstawę, stabilizując w ten sposób tkankę. Teraz, używając małych nożyczek naczyniowych i pincety, usuń okołonaczyniową tkankę tłuszczową oraz inne zbędne tkanki, aż aorta piersiowa stanie się biała i lekko włóknista.Po usunięciu nadmiaru tkanek ostrożnie zdejmij oczyszczoną aortę z drutu. Zakończ ten etap, przecinając aortę na pierścienie o szerokości od trzech do pięciu milimetrów. Otrzymano pierścień aorty.Przygotowano dwa haki tkankowe z szwami w celu ich przymocowania w komorze kąpieli. Jeden hak powinien posiadać szew z małą zawiązaną pętlą do przymocowania do pręta. Drugi hak wymaga fragmentu szwu o długości od 10 do 14 cm.Aby zawiązać węzeł, ostrożnie przymocuj parę takich haków tkankowych do każdego pierścienia aortalnego. Należy uważać, aby nie poplątać haków. Następnie przenieś każdy fragment tkanki do naczynia z PSS o temperaturze pokojowej, w którym uchwyt tkankowy jest przymocowany do statywu.Następnie nasuń zawiązany pętlę na kołek pręta i użyj długiego odcinka nici chirurgicznej, aby unieść tkankę. Potem umieść pręt w komorze i upewnij się, że jest on stabilnie zamocowany. Teraz przywiąż nić z pozostałego haczyka do przetwornika siły.Pozostaw odpowiedni luz w szwie, aby naprężenie między przetwornikiem siły a tkanką mogło być regulowane za pomocą mikrometru. Powtórz ten proces dla każdego pierścienia w każdej komorze. Następnie ustaw napięcie bierne.Użyj mikrometru, aby zwiększyć naprężenie do 2 g i poczekaj, aż naprężenie tkanki przestanie rosnąć. Następnie zwiększ naprężenie o kolejne 2 g i ponownie poczekaj na zmianę naprężenia. To koniec.Napięcie powinno teraz wynosić około 3,2 g. Powtórz ten proces dla każdego pierścienia w każdej komorze. Po ustawieniu wszystkich napięć pasywnych pozostaw tkanki na godzinę w celu wyrównania stanu równowagi.W tym czasie wymieniaj PSS co 15 minut i dokonuj pozostałych przygotowań do eksperymentu, takich jak przygotowanie leków przed końcem okresu równoważenia. Przepłucz tkankę po raz ostatni, zapisz dane i zresetuj wszystkie parametry wejściowe. Następnie, zgodnie ze szczegółami opisanymi w protokole tekstowym, przeprowadź wstępną stymulację.Należy pamiętać o udokumentowaniu tych działań w oprogramowaniu. Po początkowej stymulacji zmiana napięcia osiągnie poziom plateau. Następnie należy wypłukać lek stymulujący, aby napięcie tkanki powróciło do poziomu bazowego.Pozostawić tkankę w tym napięciu bazowym przez około 10 minut, a następnie przenieść jedną do kąpieli z nośnikiem, w tym przypadku wodą, a drugą do drugiej kąpieli. Dodać odpowiednią ilość prazosyny, aby uzyskać stężenie 5 nM w kąpieli. Inkubować tkanki w kąpielach przez godzinę bez przemywania.W międzyczasie przygotuj roztwór fenolu w szerokim zakresie stężeń zgodnie z krzywą logarytmiczną. Po godzinie dodaj do kąpieli agonistę fenolu w rosnących stężeniach, aby uzyskać kumulacyjną odpowiedź stężeniową. Po każdym dodaniu odczekaj, aż odpowiedź tkankowa osiągnie plateau, przed dodaniem kolejnego stężenia.Kontynuuj dodawanie kolejnych dawek, dopóki nie przestaną one zmieniać napięcia tkanki lub do momentu osiągnięcia plateau całej krzywej odpowiedzi. Aortę piersiową inkubowano w obecności antagonisty receptorów alfa-1 adrenergicznych POZ sim przez jedną godzinę przed dodaniem do kąpieli tkankowej agonisty receptorów alfa-1 adrenergicznych phenyl rine w celu wygenerowania kumulacyjnych krzywych odpowiedzi skurczowej oraz wyznaczenia maksymalnego i połowicznego maksymalnego skurczu wywołanego przez phenyl rine. Tkanki kontrolne traktowane samym nośnikiem zaznaczono kolorem zielonym.Wartość połowy maksimum określa stężenie efektywne leku. Te same pomiary dla tkanki traktowanej razynem przedstawiono na czarno. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat pomiaru funkcji mięśni gładkich w izolowanej kąpieli tkankowej.

measurement-smooth-muscle-function-isolated-tissue-bath-applications

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Pomiar funkcji mięśni gładkich w odizolowanym kąpielu tkankowym - zastosowania w badaniach farmakologicznych

Pomiary aktywności kanałów potasowych Kv7 (KCNQ) w izolowanych miocytach tętniczych (przy użyciu technik elektrofizjologicznych patch clamp) równolegle z pomiarami odpowiedzi skurczowych/rozkurczowych (przy użyciu myografii ciśnieniowej) mogą dostarczyć istotnych informacji na temat roli kanałów Kv7 w fizjologii i farmakologii mięśni gładkich naczyń krwionośnych.

Badanie funkcji kanałów potasowych Kv7 w mięśniach gładkich tętnic z wykorzystaniem elektrofizjologii patch-clamp i myografii ciśnieniowej

W miografii ciśnieniowej, nienaruszony mały fragment naczynia jest montowany na dwóch małych kaniulach i podbudowywany do odpowiedniego ciśnienia świetlnego. Tutaj opisujemy metodę pomiaru odpowiedzi wazorelaksacyjnej myszy tętnic krezkowych 3. rzędu u myszy c57 i sGCα1-/- myszy za pomocą miografii ciśnieniowej.

Ocena funkcji tętnicy oporowej myszy za pomocą miografii ciśnieniowej

Ten manuskrypt przedstawia prostą, ale potężną metodę in vitro do oceny kurczliwości mięśni gładkich w odpowiedzi na środki farmakologiczne lub stymulację nerwów. Główne zastosowania to badania przesiewowe leków i zrozumienie fizjologii tkanek, farmakologii i patologii.

Kurczliwość paska mięśni gładkich pęcherza moczowego jako metoda oceny farmakologii dolnych dróg moczowych

Jelito cienkie jest często narażone na działanie toksyn, które mogą wpływać na przepływ krwi i negatywnie wpływać na wchłanianie składników odżywczych. Za pomocą multimiografu i izolatów tętnic i żył krezkowych można badać pod kątem wazoaktywności związki lub toksyny.

Izolowanie i wykorzystanie odcinków tętnicy i żyły krezkowej bydła jako testu biologicznego do badania wazoaktywności w jelicie cienkim

Mysi mięsień brodawkowaty lewej komory może być użyty do zbadania kurczliwości serca in vitro. W tym artykule szczegółowo opisano izolację i protokoły eksperymentalne do badania charakterystyki kurczliwości serca.

Pomiary kurczliwości izolowanych mięśni brodawkowatych w celu zbadania inotropii serca u myszy

Ocena funkcjonalna połączenia nerwowo-mięśniowego (NMJ) może dostarczyć istotnych informacji na temat komunikacji między mięśniem a nerwem. W tym miejscu opisujemy protokół kompleksowej oceny zarówno NMJ, jak i funkcjonalności mięśni przy użyciu dwóch różnych preparatów mięśniowo-nerwowych, tj. płaszczkowato-kulszowego i przeponowo-przeponowego.

Pomiar funkcjonalności połączenia nerwowo-mięśniowego

Ten artykuł opisuje eksperymentalne protokoły do badania skurczów ex vivo ludzkiej mięśniówki macicy i ich zastosowanie w odkrywaniu leków. Technika ta jest wykorzystywana w celu lepszego zrozumienia fizjologii i patofizjologii mięśniówki macicy, a także do walidacji danych farmakologicznych z nowych sond badawczych lub potencjalnych leków.

Pomiary kurczliwości mięśni gładkich macicy w celu wspomagania opracowywania leków

Niniejszy protokół opisuje koncepcje i techniczne zastosowanie techniki miografu tensometrycznego z wykorzystaniem wielokomorowego systemu miograficznego w eksperymentalnej ocenie ex vivo funkcji śródbłonka aorty myszy.

Pomiar zależnej od śródbłonka wazorelaksacji w aorcie piersiowej myszy za pomocą tensometrycznej miografii komory o małej objętości

Prezentujemy metodę izolowania rurki jelitowej szczurów i oceny wpływu leków na ich napięcie, częstotliwość i amplitudę in vitro. Metoda ta stanowi cenne podejście dla naukowców badających rurki jelitowe.

Wykorzystanie systemu perfuzji tkanek in vitro do wykrywania czynności funkcjonalnych izolowanych rurek jelitowych w czasie rzeczywistym

Szczegółowe metody obrazowania Ca2+ o wysokiej rozdzielczości w mięśniach gładkich w obrębie izolowanych organów, obejmujące: przygotowanie tkanki, akwizycję obrazu oraz analizę danych.

Wykrywanie ogniskowych przejściowych zmian stężenia Ca2+ w mięśniach gładkich

Poznaj pomiar napięcia mięśni gładkich w izolowanej kąpieli tkankowej z aorty szczura. Ta metoda umożliwia badanie funkcji receptorów i reaktywności mięśniowej w farmakologii.

Pomiar funkcji mięśni gładkich w izolowanej kąpieli tkankowej - zastosowania do badań farmakologicznych

Przeglądaj więcej filmów