Name: Ocena skutków powtarzającego się narażenia organotypowych modeli 3D hodowli tkanek oskrzelowych i nosowych na cały dym papierosowy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 50 s
Description: Poznaj metodę oceny wpływu dymu papierosowego na ludzkie organotypowe modele 3D tkanek oskrzelowych i nosowych. Technika ta wykorzystuje interfejs powietrze-ciecz oraz analizę transkryptomiczną do badania toksykologii oddechowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Maurice'owi Smithowi i Marji Talikka za ich recenzję manuskryptu.

<ol><li>Pezzulo, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+air-liquid+interface+and+use+of+primary+cell+cultures+are+important+to+recapitulate+the+transcriptional+profile+of+in+vivo+airway+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Lung+Cellular+and+Molecular+Physiolog%22%5BJournal%5D)">The air-liquid interface and use of primary cell cultures are important to recapitulate the transcriptional profile of in vivo airway epithelia.</a> American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiolog. 300, L25-L31 (2011).</li>
<li>Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+third+dimension+bridges+the+gap+between+cell+culture+and+live+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews+Molecular+cell+biolog%22%5BJournal%5D)">The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue.</a> Nature reviews Molecular cell biolog. 8, 839-845 (2007).</li>
<li>Dvorak, A., Tilley, A. E., Shaykhiev, R., Wang, R., Crystal, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Do+airway+epithelium+air%E2%80%93liquid+cultures+represent+the+in+vivo+airway+epithelium+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+respiratory+cell+and+molecular+biolog%22%5BJournal%5D)">Do airway epithelium air–liquid cultures represent the in vivo airway epithelium transcriptome.</a> American journal of respiratory cell and molecular biolog. 44, 465(2011).</li>
<li>Wiszniewski, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+cultures+of+polarized+airway+epithelial+cells+from+patients+with+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biolog%22%5BJournal%5D)">Long-term cultures of polarized airway epithelial cells from patients with cystic fibrosis.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biolog. 34, 39-48 (2006).</li>
<li>Balharry, D., Sexton, K., BéruBé, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+approach+to+assess+the+toxicity+of+inhaled+tobacco+smoke+components%3A+nicotine%2C+cadmium%2C+formaldehyde+and+urethane%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicolog%22%5BJournal%5D)">An in vitro approach to assess the toxicity of inhaled tobacco smoke components: nicotine, cadmium, formaldehyde and urethane.</a> Toxicolog. 244, 66-76 (2008).</li>
<li>Mathis, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+bronchial+epithelial+cells+exposed+in+vitro+to+cigarette+smoke+at+the+air-liquid+interface+resemble+bronchial+epithelium+from+human+smokers%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physio%22%5BJournal%5D)">Human bronchial epithelial cells exposed in vitro to cigarette smoke at the air-liquid interface resemble bronchial epithelium from human smokers.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physio. 304, L489-L503 (2013).</li>
<li>Cho, M. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bioluminescent+cytotoxicity+assay+for+assessment+of+membrane+integrity+using+a+proteolytic+biomarker%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+in+Vitr%22%5BJournal%5D)">A bioluminescent cytotoxicity assay for assessment of membrane integrity using a proteolytic biomarker.</a> Toxicology in Vitr. 22, 1099-1106 (2008).</li>
<li>Stewart, C. E., Torr, E. E., Mohd Jamili, N. H., Bosquillon, C., Sayers, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+Differentiated+Human+Bronchial+Epithelial+Cell+Culture+Systems+for+Asthma+Research%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Allerg%22%5BJournal%5D)">Evaluation of Differentiated Human Bronchial Epithelial Cell Culture Systems for Asthma Research.</a> Journal of Allerg. 2012, 11(2012).</li>
<li>Blume, L. F., Denker, M., Gieseler, F., Kunze, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature+corrected+transepithelial+electrical+resistance+%28TEER%29+measurement+to+quantify+rapid+changes+in+paracellular+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmazi%22%5BJournal%5D)">Temperature corrected transepithelial electrical resistance (TEER) measurement to quantify rapid changes in paracellular permeability.</a> Pharmazi. , 19-24 (2010).</li>
<li>Chhin, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ciliary+beating+recovery+in+deficient+human+airway+epithelial+cells+after+lentivirus+ex+vivo+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+genetic%22%5BJournal%5D)">Ciliary beating recovery in deficient human airway epithelial cells after lentivirus ex vivo gene therapy.</a> PLoS genetic. 5, e1000422(2009).</li>
<li>Jiao, J., Meng, N., Wang, H., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+human+nasal+epithelial+cells+grown+as+explant+outgrowth+cultures+or+dissociated+tissue+cultures+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Me%22%5BJournal%5D)">Comparison of human nasal epithelial cells grown as explant outgrowth cultures or dissociated tissue cultures in vitro.</a> Front Me. 7, 486-491 (2013).</li>
<li>Talbot, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+assessment+of+reproductive+toxicity+of+tobacco+smoke+and+its+constituents%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+defects+research.+Part+C%2C+Embryo+today+%3A+review%22%5BJournal%5D)">In vitro assessment of reproductive toxicity of tobacco smoke and its constituents.</a> Birth defects research. Part C, Embryo today : review. 84, 61-72 (2008).</li>
<li>Port, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tobacco+smoke+induces+CYP1B1+in+the+aerodigestive+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesi%22%5BJournal%5D)">Tobacco smoke induces CYP1B1 in the aerodigestive tract.</a> Carcinogenesi. 25, 2275-2281 (2004).</li>
<li>Hoeng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+network-based+approach+to+quantifying+the+impact+of+biologically+active+substances%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov+Toda%22%5BJournal%5D)">A network-based approach to quantifying the impact of biologically active substances.</a> Drug Discov Toda. 17, 413-418 (2012).</li>
<li>Iskandar, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systems+approaches+evaluating+the+perturbation+of+xenobiotic+metabolism+in+response+to+cigarette+smoke+exposure+in+nasal+and+bronchial+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Res+In%22%5BJournal%5D)">Systems approaches evaluating the perturbation of xenobiotic metabolism in response to cigarette smoke exposure in nasal and bronchial tissues.</a> Biomed Res In. 2013, 512086(2013).</li>
<li>Karp, P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+model+of+differentiated+human+airway+epithelia.+Methods+for+establishing+primary+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biolog%22%5BJournal%5D)">An in vitro model of differentiated human airway epithelia. Methods for establishing primary cultures.</a> Methods in molecular biolog. 188, 115-137 (2002).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22ISO+3402%3A+Tobacco+and+tobacco+products+--+Atmosphere+for+conditioning+and+testing%22">ISO 3402: Tobacco and tobacco products -- Atmosphere for conditioning and testing</a>. , International Organization for Standardization. (1999).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22R%3A+A+Language+and+Environment+for+Statistical+Computing%22">R: A Language and Environment for Statistical Computing</a>. , The R Core Team. (2011).</li>
<li>Gautier, L., Moller, M., Friis-Hansen, L., Knudsen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+mapping+of+probes+to+genes+for+Affymetrix+chips%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatic%22%5BJournal%5D)">Alternative mapping of probes to genes for Affymetrix chips.</a> BMC Bioinformatic. 5, 111(2004).</li>
<li>Hermida, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confero%3A+an+integrated+contrast+data+and+gene+set+platform+for+computational+analysis+and+biological+interpretation+of+omics+data%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+genomic%22%5BJournal%5D)">Confero: an integrated contrast data and gene set platform for computational analysis and biological interpretation of omics data.</a> BMC genomic. 14, 514(2013).</li>
<li>Thomson, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+assessment+of+biological+impact+using+transcriptomic+data+and+mechanistic+network+models%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+and+applied+pharmacolog%22%5BJournal%5D)">Quantitative assessment of biological impact using transcriptomic data and mechanistic network models.</a> Toxicology and applied pharmacolog. 272, 863-878 (2013).</li>
<li>Teff, Z., Priel, Z., Gheber, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+forces+applied+by+cilia+depend+linearly+on+their+frequency+due+to+constant+geometry+of+the+effective+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journa%22%5BJournal%5D)">The forces applied by cilia depend linearly on their frequency due to constant geometry of the effective stroke.</a> Biophysical journa. 94, 298-305 (2008).</li>
<li>Hilgendorf, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caco-2+versus+Caco-2%2FHT29-MTX+co-cultured+cell+lines%3A+permeabilities+via+diffusion%2C+inside-+and+outside-directed+carrier-mediated+transport%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharm+Sc%22%5BJournal%5D)">Caco-2 versus Caco-2/HT29-MTX co-cultured cell lines: permeabilities via diffusion, inside- and outside-directed carrier-mediated transport.</a> J Pharm Sc. 89, 63-75 (2000).</li>
<li>Sutto, Z., Conner, G. E., Salathe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+human+airway+ciliary+beat+frequency+by+intracellular+pH%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+physiolog%22%5BJournal%5D)">Regulation of human airway ciliary beat frequency by intracellular pH.</a> The Journal of physiolog. 560, 519-532 (2004).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Similarities+and+differences+between+smoking-related+gene+expression+in+nasal+and+bronchial+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+genomic%22%5BJournal%5D)">Similarities and differences between smoking-related gene expression in nasal and bronchial epithelium.</a> Physiological genomic. 41, 1-8 (2010).</li>
</ol>

Badanie zostało sfinansowane przez Philip Morris International.

W tym miejscu wykazaliśmy możliwość zastosowania ludzkich organotypowych modeli tkanek oskrzeli i nosa do oceny wpływu powtarzającej się ekspozycji na CS. Jako alternatywę dla badań na zwierzętach opracowano szereg systemów narażenia na działanie aerozoli do toksykologicznej oceny narażenia na aerozole in vitro (np. Vitrocell, Cultex, ALICE itp.). Te moduły narażenia mogą być również wykorzystywane do oceny toksykologicznej zanieczyszczeń powietrza, cząstek unoszących się w powietrzu, nanocząstek itp. W tym badaniu wykorzystaliśmy system Vitrocell, który może pomieścić do 48 różnych próbek jednocześnie, co pozwala na eksperymenty na większą skalę i mniejszą zmienność między zabiegami. W przypadku każdej ekspozycji na aerozol in vitro ryzyko zanieczyszczenia kultur tkankowych pozostaje głównym ryzykiem, którego ograniczenie wymaga ostrożnego obchodzenia się z kulturami tkankowymi przez cały czas trwania doświadczeń.
Pomiar osadzania się cząstek w czasie rzeczywistym na mikrowadze podczas eksperymentu naświetlania pozwala monitorować, czy dawki CS generowane przez system naświetlania są zgodne z oczekiwaniami. Aby zapewnić dokładność mierzonego osadzania cząstek, należy prawidłowo ustawić pomiar online, zanim ekspozycja będzie krytyczna, np. ustawiając skalę na 0. Dodatkowo, ze względu na różnicę między obszarami mikrowagi (cm2) a wkładu do kultury tkankowej (0,33 cm2), dostosowaliśmy końcowe obliczenia do obszaru wkładu hodowlanego: tylko 33% osadzania na mikrowadze odzwierciedla rzeczywiste osadzanie we wstawce hodowlanej.
Pomiar TEER w celu ustalenia funkcjonalności bariery ciasnego połączenia i oceny przerwania warstwy nabłonkowej jest stosunkowo łatwą procedurą do wdrożenia, o czym pisaliśmy tutaj. Ponieważ jednak modele tkanek oskrzelowych i nosowych zawierają przeplatane komórki kubkowe wytwarzające śluz, przed pomiarem TEER należy przeprowadzić płukanie wierzchołkowe. Mycie wierzchołkowe ma kluczowe znaczenie, ponieważ obecność warstwy śluzu i zmienność jej grubości może wpływać na pomiar TEER, zakłócając wpływ ekspozycji na CS. Pogląd ten jest zgodny z tym, co zostało zgłoszone przez Hilgendorfa i współpracowników, w którym na przepuszczalność komórek Caco-2 wpłynęło współhodowla z wytwarzającą śluz linią komórek kubkowych HT29 23. Śluz musi zostać zmyty przed pomiarem TEER, ponieważ mycie wierzchołkowe tuż przed ekspozycją może zakłócać reakcje tkanek na CS. Dlatego pomiar wykonuje się trzy dni przed ekspozycją, a nie tuż przed ekspozycją.
Wykazaliśmy, że aktywność CYP1A1/CYP1B1 można zmierzyć na podstawie modeli hodowli organotypowych po ekspozycji na CS, chociaż aktywność była tylko nieznacznie zwiększona przez CS. Ten słaby sygnał może być wzmocniony przez dłuższą inkubację substratu CYP1A1/1B1 (tj. lucyferyny-CEE), na przykład przez 24 godziny (dane nie pokazane). Jednym z ograniczeń pomiaru aktywności CYP w niniejszej pracy jest brak normalizacji poziomu białka CYP lub liczby komórek, co może być brane pod uwagę w przyszłych badaniach w celu zapewnienia, że zmiana aktywności enzymu nie jest zależna od zmiany ani poziomu białka, ani liczby komórek.
Odnotowaliśmy, że ekspozycja na CS hamowała bicie rzęsek zarówno w modelu tkanki nosowej, jak i oskrzelowej. Podobne obserwacje przeprowadzono w różnych modelach ssaków i innych ssaków 12. W przypadku pomiaru dudnienia rzęsek kluczowe znaczenie ma zapewnienie, że tkanki są traktowane i traktowane w podobny sposób, na przykład w przypadku wdrożenia zmiany pożywki należy ją zastosować do wszystkich próbek. Sutto i współpracownicy stwierdzili, że pH wpłynęło na częstotliwość bicia rzęsek ssaków 24. Tak więc, porównując częstotliwości dudnień między komórkami traktowanymi różnymi związkami/mieszaninami, należy rozważyć dostosowanie pH w celu zminimalizowania zmienności pomiaru dudnienia rzęsek. Co więcej, temperatura, w której przeprowadzany jest pomiar, jest również krytyczna, ponieważ częstotliwość dudnienia rzęsek spada wraz ze spadkiem temperatury. Aby zminimalizować zmienność spowodowaną tymi zmianami, w tym badaniu zastosowano inkubator stopniowy, wyposażony w kontrolę temperatury, CO2 i wilgotności. Mimo to zaobserwowaliśmy, że częstość bicia rzęsek w tkankach oskrzeli po ekspozycji na CS była bardzo zmienna (tj. wzrost jednej wkładki i spadek drugiej wkładki), co sugeruje, że bicie rzęsek jest silnie zaburzone zaraz po ekspozycji. W przeciwieństwie do tego, zaobserwowaliśmy brak mierzalnych częstotliwości bicia rzęsek w tkance nosa po ekspozycji na CS, co sugeruje, że odpowiedź tkanki nosowej jest bardziej wrażliwa i spójna. Jest to zgodne z poprzednią publikacją pokazującą, że tkanka nosa ma mniejszą zdolność do detoksykacji w porównaniu z oskrzelami 25.
Wreszcie, wykazaliśmy, że profilowanie ekspresji genów z organotypowych modeli tkanek oskrzeli i nosa wystawionych na CS może wykazać wpływ CS na metabolizm ksenobiotyków. Co ciekawe, zaobserwowana zmiana w metabolizmie ksenobiotyków w organotypowych modelach oskrzelowych i nosowych in vitro narażonych na CS przypomina sytuację in vivo u palaczy, jak omówiono bardziej szczegółowo w poprzedniej publikacji 15. W przypadku analiz ekspresji genów zastosowanie zrobotyzowanego instrumentu umożliwia analizę o wysokiej przepustowości. Co więcej, automatyczna obsługa robotów dodatkowo zwiększa spójność i dokładność wyników ekspresji genów. Niemniej jednak szybkie pobranie próbek tkanek miało kluczowe znaczenie dla uniknięcia degradacji RNA podczas ekstrakcji RNA. Opisane tutaj podejścia do przetwarzania RNA i transkryptomiki można również zastosować do próbek tkanek in vivo .

Płuca są bezpośrednio i stale narażone na wdychanie powietrza, które może zawierać różne substancje toksyczne, takie jak zanieczyszczenia i składniki dymu papierosowego (CS). Badanie wpływu narażenia na te toksyny na tkanki układu oddechowego jest najbardziej pouczające, gdy odbywa się w sposób przypominający narażenie in vivo. W porównaniu z klasycznymi hodowlami komórkowymi zanurzonymi w 2D (np. normalne ludzkie komórki nabłonka oskrzeli (NHBE)), organotypowe modele tkanek 3D lepiej podsumowują morfologiczne, fizjologiczne i molekularne aspekty ludzkiego nabłonka dróg oddechowych in vivo1,2: modele tkanek 3D zawierają różnorodność typów komórek obserwowanych in vivo, w tym zróżnicowane komórki nabłonkowe, komórki rzęskowe i nierzęskowe, komórki kubkowe i komórki podstawne. Mają funkcjonalne ścisłe połączenia i wykazują fenotyp śluzowo-rzęskowy 1-3. Ponadto kultury mogą być hodowane na przepuszczalnej porowatej membranie, na granicy faz powietrze-ciecz, co pozwala na bezpośrednią ekspozycję na aerozol po stronie wierzchołkowej (podczas gdy strona podstawno-boczna jest zanurzona w pożywce hodowlanej) 3-5. Dvorak i współpracownicy stwierdzili, że profile ekspresji genów w modelach tkanki oskrzelowej były podobne do tych uzyskanych z ludzkich szczotek oskrzeli 3. Ponadto Mathis i współpracownicy wykazali, że odpowiedzi tych modeli tkankowych na CS były podobne do różnic obserwowanych między komórkami nabłonka oskrzeli uzyskanymi od palaczy a komórkami uzyskanymi od osób niepalących 6. Wreszcie, ponieważ modele tkanki oskrzelowej mogą być hodowane przez okres do kilku miesięcy 4,5, mogą być potencjalnie wykorzystane do zbadania skutków długotrwałej ekspozycji badanych elementów. 
Oceny cytotoksyczności są powszechnymi parametrami mierzonymi po zniewagach chemicznych lub w celu oceny toksyczności określonych związków lub mieszanin. Na przykład integralność błony można zmierzyć za pomocą testu luminescencyjnego i umożliwia ona pomiar zależnego od dawki efektu cytotoksycznego na hodowlę komórkową 7. Jednak w celu oceny patofizjologicznych skutków związków w stężeniach subtoksycznych należy zmierzyć inne parametry. Na przykład integralność tkanek określona za pomocą testu przeznabłonkowego oporu elektrycznego (TEER) zapewnia funkcjonalność połączeń ścisłych i monitoruje przerwanie warstwy nabłonkowej 8,9. Częstotliwość dudnienia rzęsek pozwala również na pomiar wpływu CS na tkanki oddechowe. Normalna częstotliwość bicia rzęsek wyściełających górne i dolne drogi oddechowe jest ważna dla ochrony przed infekcjami dróg oddechowych 10. Każda z rzęskowych komórek nabłonka walcowatego nabłonka oddechowego ma 200-300 rzęsek bijących z określoną częstotliwością w celu wyeliminowania czynników zakaźnych lub wdychanych cząstek stałych uwięzionych w śluzie uwalnianym przez przeplatane komórki kubkowe 11. CS zawiera substancje chemiczne, które mogą hamować bicie rzęsek 12, co prowadzi do zmniejszonej ochrony dróg oddechowych. Praca ta pokazuje, że bicie rzęsek można zmierzyć w organotypowych modelach tkankowych. Takie podejście pozwala ocenić, czy komórki nabłonkowe wykazują swoją normalną funkcję w organotypowej hodowli tkankowej. CS aktywuje również reakcje metabolizmu ksenobiotyków w drogach oddechowych w celu metabolizowania składników dymu tytoniowego 13. Można zmierzyć aktywność enzymów metabolizmu ksenobiotyków fazy I, CYP1A1 i CYP1B1, w modelach tkankowych. Dodatkowo, jak wcześniej informowano, globalną ekspresję genów można zmierzyć w organotypowych modelach tkanki oskrzelowej 6,14,15. Dane transkryptomiczne i podejście oparte na biologii systemów oparte na sieciach są wykorzystywane do oceny wpływu CS na metabolizm ksenobiotyków 15. 
Metodologie używane do wystawiania organotypowych modeli 3D tkanek oskrzelowych i nosowych na główny nurt CS za pomocą systemu ekspozycji in vitro oraz do pomiaru reakcji tkanek na tę ekspozycję w porównaniu z ekspozycją na świeże powietrze (kontrola) są szczegółowo opisane tutaj.

<table><tbody><tr><td>MucilAir-ludzkie fibroblasty-oskrzela</td><td>Nabłonek S&aaostry; rl, Genewa, Szwajcaria</td><td>http://www.epithelix.com/content/view/122/19/lang,en/</td><td></td></tr> <tr><td>MucilAir Culture Medium</td><td>Epithelix S&aacute; rl, Genewa, Szwajcaria</td><td>http://www.epithelix.com/content/view/84/16/lang,en/</td><td></td></tr> <tr><td>VITROCELL</td><td>VITROCELL systems GmbH, Waldkirch, Niemcy</td><td>http://www.vitrocell.com/index.php?Nav_Nummer=2&R=</td><td></td></tr><tr><td>3R4F papieros referencyjny</td><td>University of Kentucky</td><td>http://www2.ca.uky.edu/refcig/</td><td></td></tr> <tr><td>30-portowa karuzelowa maszyna do palenia SM2000</td><td>Philip Morris, Int.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kamera i oprogramowanie CiliaMetrix</td><td>La Haute &Eacute; cole de Gestion (HESGE), Genewa, Szwajcaria</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop Leica DMIL&nbsp;</td><td>Leica, Heerbrugg, Szwajcaria</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Źródło światła LED</td><td>Titan Tool Supplies, Buffalo, Nowy Jork</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Elektroda pałeczkowa STX-2</td><td>World Precision Instruments</td><td>http://www.wpiinc.com/products/physiology/stx2-chopstick-electrode-set-for-evom2/</td><td></td></tr> <tr><td>Woltoomomierz nabłonkowy EVOMXTM&nbsp;</td><td>World Precision Instruments</td><td>http://www.wpiinc.com/products/physiology/evom2-evom2-epithelial-voltohmmeter-for-teer/</td><td></td></tr> <tr><td>Odczynnik do wykrywania lucyferyny&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Instrument MagNA Lyser&nbsp;</td><td>Roche</td><td>http://www.roche.com/products/product-details.htm?region=us&type=product&id=66</td><td></td></tr><tr><td>chloroform&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/288306?lang=en&region=</td><td></td></tr><tr><td>Sześcian QIA&nbsp;</td><td>Bioanalizator Qiagen</td><td>9001882</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop</td><td>Thermo Scientific</td><td>http://www.nanodrop.com/</td><td></td></tr> <tr><td>Agilent 2100&nbsp;</td><td>Agilent</td><td>http://www.genomics.agilent.com/en/Bioanalyzer-System/2100-Bioanalyzer-Instruments/?cid=AG-PT-106</td><td></td></tr><tr><td>Affymetrix GeneChip Wysoka przepustowość 3' Zestaw IVT Express</td><td>Affymetrix</td><td>http://www.affymetrix.com/catalog/prod370001/AFFY/High-Throughput-(HT)-Whole-Transcript-(WT)-Kit</td><td></td></tr><tr><td>Scanner 3000 7G&nbsp;</td><td>Affymetrix</td><td>http://www.affymetrix.com/catalog/131503/AFFY/Scanner-3000-7G</td><td></td></tr></tbody></table>

ocena skutków powtarzającego się narażenia organotypowych modeli 3d hodowli tkanek oskrzelowych i nosowych na cały dym papierosowy

Impact Assessment of Repeated Exposure of Organotypic 3D Bronchial and Nasal Tissue Culture Models to Whole Cigarette Smoke

Dym papierosowy (CS) ma duży wpływ na biologię płuc i może prowadzić do rozwoju chorób płuc, takich jak przewlekła obturacyjna choroba płuc lub rak płuc. Aby zrozumieć mechanizmy leżące u podstaw rozwoju choroby, ważne byłoby zbadanie wpływu ekspozycji na CS bezpośrednio na tkanki płucne. Podejście to jest jednak trudne do wdrożenia w badaniach epidemiologicznych, ponieważ pobieranie próbek tkanki płucnej jest skomplikowane i inwazyjne. Alternatywnie, modele kultur tkankowych mogą ułatwić ocenę wpływu narażenia na tkankę płucną. Do tego celu tradycyjnie stosuje się zanurzone hodowle komórkowe 2D, takie jak normalne hodowle ludzkich komórek nabłonka oskrzeli (NHBE). Nie mogą być one jednak narażone bezpośrednio na dym w podobny sposób, jak w przypadku narażenia in vivo. Niedawno opracowane modele 3D hodowli tkankowych lepiej odzwierciedlają sytuację in vivo, ponieważ można je hodować na granicy faz powietrze-ciecz (ALI). Ich podstawowe strony są zanurzone w pożywce hodowlanej; natomiast ich wierzchołkowe boki są wystawione na działanie powietrza. Co więcej, organotypowe hodowle tkankowe, które zawierają różne typy komórek, lepiej reprezentują fizjologię tkanki in vivo. W niniejszej pracy zademonstrowano wykorzystanie systemu ekspozycji in vitro do wystawiania ludzkich organotypowych modeli tkanek oskrzelowych i nosowych na główny nurt CS. Zmierzono częstość dudnienia rzęsek i aktywność cytochromu P450s (CYP) 1A1/1B1 w celu oceny funkcjonalnego wpływu CS na tkanki. Ponadto, aby zbadać zmiany wywołane przez CS na poziomie molekularnym, wygenerowano profile ekspresji genów z tkanek po ekspozycji. Zaobserwowano nieznaczne zwiększenie aktywności CYP1A1/1B1 w tkankach narażonych na CS w porównaniu z tkankami narażonymi na działanie powietrza. Podejście oparte na biologii systemowej opartej na sieci i transkryptomice było wystarczająco solidne, aby wykazać wywołane przez CS zmiany w metabolizmie ksenobiotyków, które były podobne do tych obserwowanych w komórkach nabłonka oskrzeli i nosa uzyskanych od palaczy.

W opisanych poniżej wynikach tkanki organotypowe stanowiły pierwotne ludzkie komórki nabłonkowe wyizolowane od zdrowych, niepalących dawców rasy kaukaskiej, które zrekonstytuowano z wykorzystaniem fibroblastów 15. 
&nbsp;
3D modele tkanki oskrzelowej i nosowej 
Organotypowe modele oskrzeli i nosa in vitro przypominają na poziomie komórkowym nabłonek dróg oddechowych człowieka (Rycina 2). 
 
Ekspozycja na CS 
Organotypowe modele tkanki oskrzelowej i nosowej mogą być wielokrotnie poddawane działaniu głównego nurtu CS na granicy faz powietrze-ciecz. Procedura eksperymentalna ekspozycji na dym, zastosowana w celu uzyskania przedstawionych tutaj wyników, została zobrazowana na Rysunku 1. 
 
Rejestracja ruchów rzęsek 
Ruchy rzęsek rejestrowano w tkankach eksponowanych na powietrze, zgodnie z ilustracją w filmach. Ekspozycja na dym papierosowy (CS) wiązała się z obniżeniem częstotliwości ruchów rzęsek: silniejszy szczyt obserwowany wokół 4 Hz w grupie kontrolnej (sham) oraz przed ekspozycją nie jest już widoczny po ekspozycji na CS (Rycina 3). Ta zmniejszona częstotliwość sprawia, że ruchy rzęsek stają się mniej efektywne w usuwaniu śluzu i czynników zakaźnych 22. 
 
Pomiar TEER oraz aktywności CYP1A1/1B1 
Wartość TEER mierzono 48 h po ostatniej ekspozycji, aby upewnić się, że tkanka nadal pozostaje funkcjonalna. Aktywność CYP1A1/1B1 mierzono również 48 h po zakończeniu ekspozycji, zgodnie z przedstawionym na Rysunku 1. Wartości TEER w tkankach eksponowanych na CS nie różniły się znacząco w porównaniu z tkankami eksponowanymi na powietrze, co potwierdza brak istotnego działania cytotoksycznego dymu przy tym stężeniu. W 48 h po ekspozycji aktywność CYP1A1/1B1 w tkankach była lekko zwiększona, co wskazuje na umiarkowany wzrost mechanizmów obronnych tkanki po ekspozycji (Rysunek 4). 
 
Profile ekspresji genów i podejście biologii systemowej oparte na sieciach w badaniu wpływu ekspozycji na dym tytoniowy (CS) na zmiany w metabolizmie ksenobiotyków 
Tkanki pobrano w punktach czasowych 48 h po ekspozycji. Następnie przeprowadzono analizę mikromacierzy w celu wygenerowania profili ekspresji genów w tkankach eksponowanych na CS oraz powietrze. Wpływ ekspozycji na CS na metabolizm ksenobiotyków zbadano przy użyciu podejścia biologii systemowej opartej na sieciach, wykorzystując profile ekspresji genów zgodnie z wcześniejszymi doniesieniami 15. Zastosowanie podejścia biologii systemowej opartej na sieciach wykazało, że wpływ ekspozycji na CS na poziomie węzłów szkieletowych w modelu sieci metabolizmu ksenobiotyków był dobrze skorelowany między zbiorami danych in vitro a in vivo (Rysunek 5). W przeciwieństwie do tego, na poziomie zmian ekspresji poszczególnych genów zaobserwowano słabe korelacje między grupami in vitro (eksponowane na CS vs. eksponowane na powietrze) a in vivo (palacze vs. niepalący).
<img alt="Oś czasu ekspozycji tkanek w maszynie do palenia; pomiary obejmują TEER, aktywność CYP, ekstrakcję RNA." src="/files/ftp_upload/52325/52325fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Schemat procedury powtarzalnej ekspozycji modeli organotypowych tkanki oskrzelowej na dym tytoniowy (CS). Skróty: CYP, cytochromy P450; CS, dym tytoniowy; TEER, transepithelial electrical resistance (transepithelialna oporność elektryczna).
<img alt="Ustawienie hodowli na granicy fazy powietrze-ciecz; schematy komórek nabłonkowych; histologiczne przekroje tkanek; analiza śluzu." src="/files/ftp_upload/52325/52325fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Organotypowe modele hodowli tkanek nabłonkowych oskrzeli i nosa. Schemat przedstawiający wkładki do hodowli tkanek oskrzeli (A) i nosa (B) na granicy fazy powietrze-ciecz. Modele in vitro zawierały komórki rzęsiste widoczne w warstwie apikalnej komórek barwionych hematoksyliną i eozyną (C dla oskrzeli, D dla nosa), zgodnie z wcześniejszymi doniesieniami 15. Modele były hodowane wspólnie z fibroblastami, które są istotne dla wzrostu i różnicowania komórek nabłonkowych (wskazane strzałkami). Przedstawiono barwienie markerów linii dróg oddechowych: p63 (E dla oskrzeli, F dla nosa) oraz Muc5AC (G dla oskrzeli, H dla nosa), zgodnie z wcześniejszymi doniesieniami 15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52325/52325fig2large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Zmiany CBF w tkance oskrzeli i nosa po ekspozycji na CS; wykres słupkowy, analiza częstotliwości machania rzęsek." src="/files/ftp_upload/52325/52325fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Częstotliwość machania rzęsek. Częstotliwość machania rzęsek (CBF) mierzono w warunkach ekspozycji na powietrze oraz w hodowli przed i po ekspozycji. Obserwowano spadek CBF po ekspozycji na CS (reprezentatywne wyniki z dwóch insertów przedstawiono jako powtórzenie 1 (R1) i powtórzenie 2 (R2)).
<img alt="Ludzkie organotypowe modele tkankowe; aktywność CYP1, TEER po ekspozycji; wykresy dla oskrzeli i nosa." src="/files/ftp_upload/52325/52325fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Pomiar aktywności CYP1A1/CYP1B1 oraz TEER. Panele lewe przedstawiają aktywność CYP1A1/CYP1B1 w modelach tkankowych oskrzeli (A) i nosa (B). Panele prawe przedstawiają pomiar TEER w modelach tkankowych oskrzeli (C) i nosa (D). Przedstawiono średnie ± SD. Skróty: CS, dym papierosowy; CYP, cytochrom P450; TEER, transepithelial electrical resistance; RLU, relative luminescense unit.
<img alt="Schemat sieci metabolizmu ksenobiotyków; szkielet sieci różnicowej; wykresy danych oskrzelowych i nosowych." src="/files/ftp_upload/52325/52325fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5. Podejście biologii systemowej opartej na sieciach w celu oceny wpływu ekspozycji na CS w kontekście metabolizmu ksenobiotyków. Zmiany poziomów ekspresji genów wykorzystano do obliczenia aktywacji węzła szkieletowego modelu sieci metabolizmu ksenobiotyków (A), zgodnie z raportem w poprzedniej publikacji 15. Rysunek po prawej ilustruje koncepcję kwantyfikacji węzłów szkieletowych, znaną również jako „wartość szkieletu sieci różnicowej”, przy użyciu podejścia NPA. Niebieskie owale reprezentują aktywność węzłów szkieletowych (t.j. warstwę funkcjonalną), a zielone kule reprezentują ekspresję genów (t.j. warstwę transkrypcyjną). Wpływ ekspozycji na CS w organotypowych tkankach oskrzelowych (in vitro, eksponowane na CS vs eksponowane na powietrze) po 48 h od ekspozycji porównano z wpływem palenia na ludzki nabłonek oskrzelowy pobrany metodą bronchoskopii oraz nabłonek nosowy pobrany poprzez szczotkowanie małżowiny dolnej (GSE16008) (in vivo, palacze vs niepalący) (B). Wstawki: korelacja zmian ekspresji genów między zbiorami danych in vitro a in vivo. Skróty: CS, dym papierosowy; NPA, amplituda perturbacji sieci. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52325/52325fig5large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>

Celem tego protokołu jest wystawienie ludzkich organotypowych 3D modeli tkanek oskrzelowych i nosowych na główny nurt dymu papierosowego (CS) na granicy powietrze-ciecz. Wpływ CS na tkanki jest następnie badany za pomocą testu aktywności cytochromu P450, pomiaru bicia rzęsek i podejścia opartego na biologii systemowej.

Ocena skutków powtarzającego się narażenia organotypowych modeli 3D hodowli tkanek oskrzelowych i nosowych na cały dym papierosowy

Cigarette smoke (CS) has a major impact on lung biology and may result in the development of lung diseases such as chronic obstructive pulmonary disease ...

Ogólnym celem tej procedury jest ocena wpływu powtarzającej się ekspozycji organotypowych modeli 3D hodowli oskrzeli i tkanek nosa na cały dym papierosowy. W tym celu dokonuje się najpierw hodowli modeli hodowli tkanek organotypowych, oskrzeli i nosa na granicy faz powietrza i cieczy. Drugim krokiem jest wytworzenie aerozolu za pomocą maszyny do wędzenia i naświetlenie kultur tkankowych zgodnie z projektem eksperymentalnym w systemie ekspozycji.Następnie ocenia się wpływ ekspozycji, mierząc częstotliwość dudnienia rzęsek i integralność tkanek hodowli. Ostatnim krokiem jest pomiar wymiany transkryptomu indukowanej przez aerozol za pomocą technologii mikromacierzy. Ostatecznie zastosowano podejścia oparte na biologii systemowej opartej na sieci, aby pokazać wpływ całego dymu papierosowego na kulturę tkankową.Główną zaletą tych technik istniejących metod toksykologii oddechowej jest to, że podejścia te są zgodne z wymogami agencji regulacyjnych w celu znalezienia alternatyw dla testów na zwierzętach, umożliwiają ocenę skutków krótkotrwałego narażenia na dym papierosowy na komórki hodowane na granicy niepłynów, naśladując warunki występujące w drogach oddechowych człowieka. Aby rozpocząć eksperyment, dodaj 0,7 mililitra wstępnie podgrzanej pożywki hodowlanej do każdej studzienki sterylnej 24-dołkowej płytki. Następnie wyjmij opakowanie z tkanki i przenieś wkładki do kultur tkankowych na świeżo przygotowaną płytkę 24-dołkową.Utrzymuj kulturę tkankową w inkubatorze i wymieniaj pożywkę co dwa dni podczas wymiany pożywki. Zbadaj tkanki pod mikroskopem świetlnym, aby upewnić się, że są wolne od zanieczyszczeń i że nie ma wycieku pożywki. Trzy dni przed eksperymentami ekspozycyjnymi przemyć wierzchołkową stronę kultury tkankowej 200 mikrolitrami pożywki hodowlanej.Następnie należy podgrzać komorę klimatyczną systemu in vitro i moduł bazy uprawowej do 37 stopni Celsjusza. Po podgrzaniu napełnij moduł podstawy uprawy 17,5 mililitra podłoża na rząd. Wyjąć tkanki z inkubatora i przenieść wkładki do hodowli tkankowej z płytki hodowlanej do modułu bazy hodowlanej systemu naświetlania in vitro.Następnie przykryj moduł podstawy uprawy szklaną pokrywą. Przenieś tkanki do komory klimatycznej w celu wystawienia na działanie głównego nurtu dymu papierosowego lub cs. Generuj dym papierosowy za pomocą skalibrowanej 30-portowej maszyny do palenia karuzelowej.Pal papierosy do standardu, ale o długości około 35 milimetrów przy 55 mililitrach. Zaciągaj się przez dwie sekundy, dwa razy na minutę i ośmiosekundowy czas wydechu pompy. Wytwarzany dym papierosowy jest akumulowany i uwalniany do systemu ekspozycji in vitro.Odsłoń tkanki na sześć do siedmiu minut. Po przeniesieniu tkanek z powrotem na płytkę hodowlaną umieść je z powrotem w inkubatorze na jedną godzinę. Wyjąć płytki do hodowli tkankowych z inkubatora i pozostawić je pod maską w temperaturze pokojowej na 30 minut, aby ustabilizować dudnienie CLIA.Po ustabilizowaniu obserwuj tkanki pod mikroskopem świetlnym podłączonym do oprogramowania kliometrycznego. Następnie zapisz częstotliwość dudnienia rzęsek, mierząc częstotliwość co trzy sekundy przez jedną minutę, 48 godzin. Po ekspozycji dodaj 200 mikrolitrów pożywki hodowlanej do wierzchołkowej strony ludzkich tkanek nabłonka oskrzeli i zmierz opór tkanek, wkładając elektrodę pałeczkową do podłoża podstawnego i do nowo dodanego podłoża po wierzchołkowej stronie kultury tkankowej bez dotykania tkanki.Po wykonaniu pomiarów należy delikatnie usunąć pożywkę z wierzchołkowej strony kultur tkankowych za pomocą pipety do pasty podłączonej do pompy próżniowej i zwrócić tkanki do inkubatora. Aby zmierzyć aktywność enzymatyczną cytochromu P 4 50, przygotuj nową płytkę z wcześniej przygotowanym lucyferem i substratem CEE i przenieś inserty do tej pokrywy płytki i inkubuj wkładki tkankowe przez noc. Po inkubacji przenieść 50 mikrolitrów pożywki hodowlanej z każdej wkładki tkankowej do 96-dołkowej nieprzezroczystej białej płytki luminometru w temperaturze pokojowej.Następnie dodaj 50 mikrolitrów odczynnika wykrywającego Lucyfera do każdej studzienki i inkubuj płytkę w temperaturze pokojowej przez 20 minut. Po zakończeniu inkubacji zmierz luminescencję za pomocą luminometru. Pobrać płytkę z trójwymiarowymi wkładkami z tkanek organotypowych z inkubatora i umyć każdą wkładkę na płytce trzykrotnie zimnym PBS, a między przemyciami odessać PBS za pomocą poprzedniej pipety.Po ostatnim praniu należy zassać PBS i przykryć płytkę, aby zapobiec wyschnięciu wkładu. Następnie wytnij membranę wkładki dla każdej wkładki z płytki, aż membrana będzie leżeć płasko na ostrzu. Przenieś tkankę z ostrza do probówki homogenizującej i przykręć pokrywkę do probówki.Następnie potrząśnij, zwiruj i umieść na suchym lodzie. Rozmrażać i mielić próbki za pomocą przyrządu do homogenizacji z prędkością 6 000 obr./min przez 45 sekund. Pozostawić na pięć minut w temperaturze pokojowej, a następnie dodać 140 mikrolitrów chloroformu do próbki i ponownie wirować przez 15 sekund.Przenieść całą próbkę z probówki homogenizującej do probówki z blokadą fazową. Umieść go na wytrząsarce termicznej i potrząsaj nim przez dwie minuty z prędkością 1400 obr./min w temperaturze pokojowej. Następnie pozostaw na dwie minuty w temperaturze pokojowej.Po zakończeniu wstrząsania wirować probówkę przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza w temperaturze 12 000 G. Przenieść supernatant do nowej probówki o pojemności dwóch mililitrów. Następnie należy przemyć RNA, zawiesić i oczyścić. Po ekstrakcji RNA są sprawdzane pod względem jakości.Aby ocenić ilość i integralność, należy przygotować system obsługi cieczy i docelową syntezę. Umieść wyekstrahowany RNA. Płytki i wszystkie niezbędne odczynniki oraz laboratorium zużywają się w robocie.Pierwsze stężenia RNA zostaną znormalizowane. Następnie talia zostanie zmieniona na kolejne kroki od amplifikacji do etykietowania, oczyszczania i fragmentacji. Następnie mieszaninę hybrydyzacyjną dodaje się do 33 mikrolitrów rozdrobnionego i znakowanego RNA A, denaturuje próbki i wstępnie zwilża matrycę 200 mikrolitrami wstępnej hybrydyzacji.Wymieszaj z zestawu do mycia i bejcowania hybrydyzacji. Następnie umieść chip w piekarniku hybrydyzacyjnym ustawionym na 45 stopni Celsjusza i 60 obr./min na 10 minut. Usunąć bufor przed hybrydyzacją i załadować 200 mikrolitrów próbki.Inkubować matrycę przez 16 godzin w temperaturze 45 stopni Celsjusza i 60 obr./min w piekarniku. Odessać koktajl z chipa i napełnić mikromacierz 250 mikrolitrami buforu do płukania a. Otwórz oprogramowanie i uruchom Fluidics z paska menu oprogramowania.Wybierz interesujący Cię moduł i program 4 pierwszych 50 dla każdego modułu. Przypisz odpowiedni chip do każdego modułu, skanując kod kreskowy chipa i umieść chipy w układzie fluidycznym. Na koniec upewnij się, że skaner jest ciepły.Następnie załaduj chip do automatycznego podajnika skanera i zeskanuj mikromacierz. Częstotliwość bicia CELIA lub CBF tkanki nosa mierzono przed i po ekspozycji na powietrze lub dym papierosowy lub cs. CBF i tkanka nosa były wolniejsze po ekspozycji na cs.Niższa częstotliwość dudnienia CLIA zmniejsza skuteczność usuwania śluzu i czynników zakaźnych. Przeprowadzono analizy mikromacierzy w celu zbadania wpływu ekspozycji na CS w modelach organotypowych, oskrzelowych i nosowych. 48 godzin po ekspozycji.Ten wpływ CS in vitro porównano z wpływem palenia tytoniu na ludzką tkankę nabłonka oskrzeli pobraną odpowiednio za pomocą bronchoskopii i szczotkowania nabłonka nosa. Biologia systemów sieciowych wykazuje dodatnią korelację między węzłami szkieletowymi zbiorów danych in vivo i in vitro. Podejmując się tej procedury, należy pamiętać, że jest to nowo rozwijający się obszar badań.Z jednej strony znajdują się dwa kluczowe elementy, dobrze scharakteryzowana platforma ekspozycji na aerozole toll, a z drugiej odpowiedni system eksperymentalny, który może składać się z trójwymiarowego modelu hodowli tkankowej, który najlepiej naśladuje specyficzną architekturę, sygnały biochemiczne i mechaniczne, a także interakcję komórek komórkowych w mikrośrodowisku istotnym dla tkanki lub narządu docelowego. W trakcie dochodzenia.

impact-assessment-repeated-exposure-organotypic-3d-bronchial-nasal

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Ocena wpływu wielokrotnego narażenia organotypowych 3D modeli kultur tkankowych oskrzeli i nosa na cały dym papierosowy

Komórki nabłonka płuc można wyizolować z dróg oddechowych myszy i hodować na granicy fazy powietrze-ciecz jako model zróżnicowanego nabłonka oddechowego. Opisano protokół izolacji, hodowli i narażania tych komórek na dym papierosowy z głównego strumienia w celu zbadania odpowiedzi molekularnych na tę toksynę środowiskową.

Izolacja komórek nabłonka dróg oddechowych myszy i ekspozycja na eksperymentalny dym tytoniowy w układzie interfejsu powietrze-ciecz

Komórki nabłonka nosa, uzyskane poprzez powierzchowną biopsję zeskrobaną ludzkich ochotników, są rozszerzane i przenoszone do wkładek do hodowli tkankowych. Po osiągnięciu konfluencji komórki są hodowane na granicy faz powietrze-ciecz, dając kultury komórek rzęskowych i nierzęskowych. Zróżnicowane hodowle komórek nabłonka nosa dostarczają realnych modeli eksperymentalnych do badania błony śluzowej układu oddechowego.

Hodowla ludzkich komórek nabłonka nosa na granicy faz powietrza i cieczy

Celem tego protokołu jest dostarczenie zautomatyzowanych metod ilościowego określania przewlekłych patologii płuc w mysim modelu POChP. Protokół obejmuje wystawienie myszy na dym papierosowy (CS), pomiar czynności płuc, napompowanie płuc oraz zastosowanie metod morfometrycznych do pomiaru rozedmy płuc i przebudowy małych dróg oddechowych u myszy.

Zautomatyzowany pomiar rozedmy płuc i przebudowy małych dróg oddechowych u myszy narażonych na dym papierosowy

Na całym świecie rośnie liczba użytkowników elektronicznych papierosów (e-papierosów). Niewiele jednak wiadomo na temat skutków zdrowotnych wywoływanych przez wdychane aerozole do e-papierosów. W tym artykule opisano technikę wytwarzania aerozolu w e-papierosach odpowiednią do narażenia zwierząt i późniejszych badań toksykologicznych. Takie protokoły są wymagane do ustanowienia eksperymentalnie odtwarzalnych i znormalizowanych systemów ekspozycji na e-papierosy.

Wytwarzanie aerozolu z papierosów elektronicznych przez urządzenie do waporyzacji maszynowej trzeciej generacji: zastosowanie do badań toksykologicznych

Prezentujemy solidny, przenośny i predykcyjny system ekspozycji in vitro do badania i monitorowania cząstek unoszących się w powietrzu pod kątem ich ostrej cytotoksyczności płucnej poprzez eksponowanie hodowanych ludzkich komórek płuc na granicy powietrze-ciecz (ALI).

Ocena ostrej toksyczności inhalacyjnej cząstek unoszących się w powietrzu poprzez wystawienie hodowanych ludzkich komórek płuc na granicy faz powietrze-ciecz

Opisany tutaj jest protokół do badania, jak ekstrakt z dymu papierosowego wpływa na kolonizację bakteryjną w komórkach nabłonka płuc.

Badanie wpływu dymu papierosowego na zakażenie Pseudomonas w komórkach nabłonka płuc

Opisana jest metoda hodowli komórkowej i ekspozycji modelu oskrzelowego in vitro dla realistycznej, powtarzającej się ekspozycji inhalacyjnej na cząstki do testów toksyczności.

Model nabłonka oskrzeli na granicy faz powietrze-ciecz do realistycznego, powtarzającego się narażenia inhalacyjnego na cząstki unoszące się w powietrzu do testów toksyczności

Ten protokół demonstruje badanie patofizjologicznych skutków dymu papierosowego (CS) za pomocą systemu ekspozycji na inhalację całego ciała (WBI) (WBIS) zbudowanego we własnym zakresie. System ten może wystawiać zwierzęta na działanie CS w kontrolowanych, powtarzalnych warunkach w celu zbadania wpływu CS na rozedmę płuc i hematopoezę.

Narażenie na dym papierosowy u myszy korzystających z systemu inhalacji całego ciała

Przedstawiona tutaj jest powtarzalna, przystępna cenowo i solidna metoda izolacji i ekspansji pierwotnych komórek nabłonka oskrzeli do długoterminowego biobankowania i generowania zróżnicowanych komórek nabłonkowych przez hodowlę na granicy powietrze-ciecz.

Izolowanie komórek nabłonka oskrzeli z wyciętej tkanki płucnej w celu biobankowania i tworzenia dobrze zróżnicowanych kultur granicy faz powietrze-ciecz

Tutaj opisujemy model in vitro do izolowania i różnicowania mysich komórek nabłonka dróg oddechowych, skupiając się na ich aklimatyzacji do przewlekłego ekstraktu z dymu papierosowego (CSE). Model może zostać wykorzystany do kompleksowego scharakteryzowania multiomicznego wpływu CSE, co może dostarczyć informacji na temat reakcji komórkowych na przewlekłe narażenie na dym tytoniowy.

Model in vitro do badania różnicowania i zmian multiomiki na mysich komórkach nabłonka dróg oddechowych stymulowanych ekstraktem z dymu papierosowego

Poznaj metodę oceny wpływu dymu papierosowego na ludzkie organotypowe modele 3D tkanek oskrzelowych i nosowych. Technika ta wykorzystuje interfejs powietrze-ciecz oraz analizę transkryptomiczną do badania toksykologii oddechowej.

Ocena skutków powtarzającego się narażenia organotypowych modeli 3D hodowli tkanek oskrzelowych i nosowych na cały dym papierosowy (Wideo) | JoVE Journal

Ocena skutków powtarzającego się narażenia organotypowych modeli 3D hodowli tkanek oskrzelowych i nosowych na cały dym papierosowy

Przeglądaj więcej filmów