Name: Transfekcja genów w kierunku komórek sferoidalnych na mikromodelowanych płytkach hodowlanych do genetycznie modyfikowanego przeszczepu komórek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 40 s
Description: Poznaj metodę transfekcji genów w sferoidy komórkowe na mikromodelowanych płytkach hodowlanych do genetycznie modyfikowanego przeszczepu. Technika zapewnia przedłużoną ekspresję transgenów u zwierząt gospodarzy przy zachowaniu wrodzonej funkcji komórek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bardzo dziękujemy Dr. Takeshi Ikeya i personelowi technicznemu w Toyo Gosei, Tokio, Japonia za dostarczenie termoczułych mikrowzorów na płytkach hodowlanych, jak również za doradztwo naukowe. Dziękujemy również Pani Satomi Ogura, Pani Sae Suzuki, Pani Asuce Miyoshi i Pani Katsue Morii za pomoc techniczną w eksperymentach na zwierzętach. Prace te były częściowo wspierane finansowo przez JSPS KAKENHI Grant-in-Aid for Scientific Research, program Center of Innovation (COI) i program S-innovation z Japońskiej Agencji Nauki i Technologii (JST) oraz JSPS Core-to-Core Program, A. Zaawansowane sieci badawcze.

Wszystkie badania na zwierzętach zostały przeprowadzone za zgodą Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Uniwersytetu Tokijskiego, Tokio, Japonia.
1. Przygotowanie komórek
<ol>
	<li>W przypadku hepatocytów pierwotnych należy postępować zgodnie z protokołem izolacji hepatocytów od szczura za pomocą zmodyfikowanego dwuetapowego procesu trawienia kolagenazy13,14.
	<ol>
		<li>Znieczulenie szczurów Sprague Dawley (SD) (samiec, 5 tygodni) w znieczuleniu wziewnym izofluranem. Umieść szczura w komorze podłączonej do urządzenia do znieczulenia, aby dostarczyć izofluran do komory. Wyjmij szczura po zaśnięciu i połóż go na stole operacyjnym z wentylacją za pomocą maski. Kontrolować przepływ izofluranu w przybliżeniu na poziomie 0,4 – 0,7 l/min, sprawdzając stan zdrowia szczura. Perfuzję wątroby szczurów Sprague Dawley (SD) (samców, 5 tygodni) z żyły wrotnej wątroby specjalnym roztworem złożonym z 8 g/l chlorku sodu (NaCl), 400 mg/l chlorku potasu (KCl), 78 mg/l diwodorofosforanu sodu dwuwodnego (NaH2PO4·2H2O), 151 mg/l dwunastowodny wodorofosforan disodowy (Na2HPO4·12H2O), 2,38 g/l kwas 2-[4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynylo]etanosulfonowy (HEPES), 190 mg/l glikolu etylenowego (EGTA), 350 mg/l wodorowęglan sodu (NaHCO3) i 900 mg/l glukozy</li>.
		<li>Roztwór kolagenazy krąży w wątrobie. 
		UWAGA: Roztwór składa się z 500 mg/l kolagenazy, 9,8 g/l buforowanej soli Hanka, 2,38 g/ml HEPES, 556 mg/ml hydratu chlorku wapnia (CaCl2·H2O), 350 mg/LNaHCO3 i inhibitora trypsyny 50 mg/l, o pH dostosowanym do 7,2.</li>
		<li>Ostrożnie wyjmij wątrobę i delikatnie zmiel ją na talerzu za pomocą ostrza skalpela, dodaj zmodyfikowane podłoże Dulbecco Eagle's Medium (DMEM) uzupełnione 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i przefiltruj zawiesinę komórkową przez nylonową siatkę o grubości 100 μm. Aby usunąć dodatkowe zanieczyszczenia, odwirować zawiesinę komórek o masie 20 × g przez 1 minutę. Na tym etapie hepatocyty znajdują się w supernatancie.</li>
		<li>Powtórz etap wirowania dwukrotnie (w sumie trzy wirowania). Na koniec odwirować hepatocyty w ilości 50 × g przez 3 minuty, aby odzyskać je w postaci osadu.</li>
		<li>Ponownie zawiesić hepatocyty do stężenia 4 × 105 komórek/ml w specjalnej pożywce hodowlanej złożonej z DMEM uzupełnionego 10% FBS, 1% Pen-Strep-Glut (PSQ), 1% dimetylosulfotlenku (DMSO), 0,1 μmol/L deksametazonu, 0,5 μg/ml insuliny, 10 mmol/l nikotynamidu, 0,2 mmol/L fosforylowanego askorbinianu (Asc-2P) i 10 ng/ml ludzkiego naskórkowego czynnika wzrostu (hEGF)15. To specjalne podłoże jest niezbędne do zachowania funkcji wątroby w warunkach in vitro.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W celu uzyskania MSC szczurów należy poddać eutanazji szczury Sprague Dawley (SD) (samice, 5 tygodni) poprzez nadmierne podawanie izofluranu. Wyciąć kości udowe i piszczelowe, a następnie pobrać szpik kostny, wprowadzając igłę 22 G do trzonu kości, aby wypłukać ją za pomocą 10 ml DMEM uzupełnionego 10% FBS. Zebrać komórki przez filtrację przez siatkę nylonową o grubości 100 μm.</li>
	<li>Wysiewaj komórki na 10 cm szalkach hodowlanych za pomocą DMEM zawierającego 10% FBS i 1% penicyliny / streptomycyny. Do eksperymentów sferoidalnych użyj MSC w obrębie 5 pasaży</li>.
</ol>
2. Przygotowanie sferoid komórkowych 3D
<ol>
	<li>Komercyjnie otrzymanie płytek hodowlanych z mikrowzorami, na których obszary adhezji komórek są regularnie układane w dwuwymiarowym układzie o średnicy 100 μm, otoczone obszarami nieprzywierającymi pokrytymi matrycą PEG. 
	UWAGA: W przypadku przeszczepu komórek konieczne jest dodatkowe pokrycie termoczułym polimerem PIPAAm, aby umożliwić oderwanie komórek poprzez schłodzenie płytek (patrz krok 5.1). Wahania temperatury mogą wywoływać zmiany w składzie chemicznym tego polimeru8-10. W temperaturze 37 °C PIPAAm jest lekko hydrofobowy, co pozwala na hodowlę komórek w normalnych warunkach. Spadek temperatury poniżej 32 °C powoduje szybkie uwodnienie polimeru, co prowadzi do samoistnego oderwania się komórek.</li>
	<li>Wysiewać hepatocyty lub MSCs na 12-dołkowych płytkach z mikrowzorami o gęstości 4 × 105 komórek/basenik i inkubować je w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze zawierającej 5% CO2 . Komórki gromadzą się w mikrowzorzystych obszarach adhezji i stopniowo tworzą okrągłe sferoidy w ciągu 2 dni. 
	UWAGA: Do przygotowania komórek kontrolnych w kulturze jednowarstwowej należy użyć normalnych płytek 12-dołkowych i wysiać komórki o identycznej gęstości, postępując zgodnie z podobną procedurą, jak opisano powyżej.</li>
</ol>
3. Przygotowanie nanomiceli Polyplex
<ol>
	<li>Zsyntetyzować kopolimer blokowy, PEG-PAsp(DET) (poli[N'-[N-(2-aminoetylo)-2-aminoetylo]asparamid]) (PEG Mw = 12 000, stopień polimeryzacji (DP) segmentu PAsp(DET) = 59) i homopolimer, który składa się tylko z segmentu kationowego [PAsp(DET)] (DP = 55), postępując zgodnie z procedurami opisanymi wcześniej przez autorów 11,16,17.</li>
	<li>Przygotować zmieszany roztwór kopolimeru blokowego PEG-PAsp(DET) i homopolimeru PAsp(DET) o równym stosunku molowym pozostałych grup aminowych w 10 mM buforze HEPES (pH 7,3), dostosowując stężenie polimeru odpowiednio do 33,3 μg/ml i 19,1 μg/ml. 
	UWAGA: Opisane powyżej stężenia polimerów są wartościami reprezentatywnymi dla otrzymywania nanomiceli o resztkowym stosunku molowym całkowitych grup aminowych w dwóch polimerach do grup fosforanowych w pDNA (stosunek N/P) wynoszącym 10. Stosunek N/P może się różnić w zależności od typu komórki i przeznaczenia (szczegółowe informacje można znaleźć w Dyskusji). Połączone zastosowanie tych dwóch polimerów może zapewnić zarówno skuteczne ekranowanie PEG, jak i funkcjonowanie PAsp(DET) w celu zwiększenia ucieczki endosomalnej (szczegóły w Dyskusji)18.</li>
	<li>Przygotuj pDNA kodujące lucyferasę Gaussa, lucyferazy GL4 lub erytropoetynę, klonując segment wyrażający odpowiednie geny do plazmidu pCAG-GS (http://www.cdb.riken.jp/pcs/protocol/vector/map/m36.html) w celu uzyskania ekspresji pod promotorem/wzmacniaczem CAG przy użyciu zestawu handlowego zgodnie z protokołem producenta. Amplifikuj pDNA w kompetentnym szczepie Escherichia coli i oczyść go za pomocą systemu oczyszczania plazmidowego DNA wolnego od endotoksyn. Oznaczyć stężenie pDNA przy absorbancji 260 nm, aby otrzymać roztwór o stężeniu 150 μg/ml w 10 mM buforze HEPES (pH 7,3).</li>
	<li>Aby przygotować policyty nanomiceli, należy dokładnie wymieszać roztwór pDNA (150 μg/ml w 10 mM buforze HEPES) i wstępnie zmieszany roztwór dwóch polimerów w stosunku 2:1 (objętościowo).</li>
</ol>
4. Transfekcja genów do sferoidów
<ol>
	<li>Inkubuj komórki (hepatocyty lub MSC) przez 72 godziny po wysianiu na płytki z mikrowzorami, aby umożliwić utworzenie dojrzałych sferoidów. W przypadku transfekcji genów dodać 100 μl roztworu nanomiceli polipleksowej (zawierającego 10 μg pDNA) do każdego dołka po zastąpieniu pożywki hodowlanej 1 ml świeżej pożywki. Kontynuować inkubację z roztworem nanomiceli przez 24 godziny.</li>
	<li>W przypadku kontroli przy użyciu odczynnika do transfekcji na bazie lipidów, należy zmieszać roztwory pDNA z odczynnikiem w stosunku wagowym odczynnika / pDNA wynoszącym 3. Dostosuj końcową dawkę pDNA tak, aby była równa zarówno dla odczynnika na bazie lipidów, jak i metody nanomicelowej.</li>
</ol>
5. Odzyskiwanie i przeszczepianie sferoid komórkowych
<ol>
	<li>Zastąp pożywkę hodowlaną 200 μl schłodzonego PBS i umieść płytki na lodzie. 
	UWAGA: Ogólnie rzecz biorąc, sferoidy mogą oderwać się w ciągu około 15 minut i można je odzyskać w postaci zawiesiny do przeszczepu.</li>
	<li>Delikatnie odessać komórki w zawiesinie o objętości 200 μl za pomocą strzykawki z igłą 23 G lub 27 G do wstrzykiwań in vivo.</li>
</ol>
6. Ocena ekspresji transgenu
<ol>
	<li>W celu oceny in vitro ekspresji lucyferazy Gaussia wydzielanej w pożywce hodowlanej należy zebrać 50 – 100 μl pożywki dokładnie 24 godziny po zastąpieniu świeżą pożywką. Oszacuj ekspresję lucyferazy za pomocą komercyjnego systemu oznaczania lucyferazy renilli i luminometru zgodnie z protokołem producenta. 
	UWAGA: Gaussia lucyferazy pozostaje stabilna w pożywce hodowlanej przez ponad tydzień. Dlatego, aby ocenić wydajność ekspresji transgenu w czasie rzeczywistym, przed pobraniem próbki należy zastąpić pożywkę świeżą. Czas zmiany medium może być elastyczny.</li>
	<li>W celu oceny in vivo ekspresji transgenu u zwierząt gospodarza po przeszczepieniu komórek, należy znieczulić nagie myszy BALB/c (samice; 7 tygodni) w znieczuleniu wziewnym izofluranem.
	<ol>
		<li>Umieść mysz w komorze podłączonej do aparatu do znieczulenia, aby dostarczyć izofluran do komory. Wyjmij mysz po zaśnięciu i połóż ją na stole operacyjnym z wentylacją za pomocą maski. Kontroluj przepływ izofluranu w przybliżeniu na poziomie 0,2 – 0,5 l/min, sprawdzając stan myszy.</li>
		<li>Wstrzyknąć 200 μl zawiesiny komórkowej zawierającej sferoidy transfekowane pDNA wyrażającym lucyferazy GL4 (jak opisano w p4.1) do tkanki podskórnej w okolicy brzucha.</li>
		<li>Natychmiast po wstrzyknięciu D-lucyferyny (150 mg/kg; droga dożylna) należy zmierzyć ekspresję lucyferazy za pomocą systemu obrazowania IVIS zgodnie z protokołem producenta.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W celu oceny efektów terapeutycznych przeszczepu komórek należy wstrzyknąć 200 μl zawiesiny komórkowej zawierającej sferoidy transfekowane pDNA kodującym erytropoetynę do tkanki podskórnej w okolicy brzucha.
	<ol>
		<li>Pobrać próbki krwi przez krwawienie podżuchwowe, aby uzyskać około 200 μl krwi19. Zmierz hemoglobinę i hematokryt za pomocą analizatora próbek krwi. 
		UWAGA: Liczba komórek do przeszczepu jest regulowana przez liczbę wysianych na płytkach. Niestety, trudno jest określić dokładną liczbę komórek, ponieważ nie można zmierzyć liczby komórek wewnątrz sferoid.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po eksperymentach umieść myszy na poduszce grzewczej połączonej z regulatorem temperatury do momentu wybudzenia się ze znieczulenia.</li>
</ol>

<ol><li>Landry, J., Bernier, D., Ouellet, C., Goyette, R., Marceau, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spheroidal+aggregate+culture+of+rat+liver+cells%3A+histotypic+reorganization%2C+biomatrix+deposition%2C+and+maintenance+of+functional+activities%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Spheroidal aggregate culture of rat liver cells: histotypic reorganization, biomatrix deposition, and maintenance of functional activities.</a> J Cell Biol. 101 (3), 914-923 (1985).</li>
<li>Yuasa, C., Tomita, Y., Shono, M., Ishimura, K., Ichihara, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Importance+of+cell+aggregation+for+expression+of+liver+functions+and+regeneration+demonstrated+with+primary+cultured+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Importance of cell aggregation for expression of liver functions and regeneration demonstrated with primary cultured hepatocytes.</a> J Cell Physiol. 156 (3), 522-530 (1993).</li>
<li>Otsuka, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+multiarray+formation+of+hepatocyte+spheroids+on+a+microfabricated+PEG-brush+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Chembiochem%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional multiarray formation of hepatocyte spheroids on a microfabricated PEG-brush surface.</a> Chembiochem. 5 (6), 850-855 (2004).</li>
<li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+spheroid+culture+system+on+micropatterned+substrates+for+improved+differentiation+efficiency+of+multipotent+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">3D spheroid culture system on micropatterned substrates for improved differentiation efficiency of multipotent mesenchymal stem cells.</a> Biomaterials. 30 (14), 2705-2715 (2009).</li>
<li>Bartosh, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aggregation+of+human+mesenchymal+stromal+cells+%28MSCs%29+into+3D+spheroids+enhances+their+antiinflammatory+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Aggregation of human mesenchymal stromal cells (MSCs) into 3D spheroids enhances their antiinflammatory properties.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (31), 13724-13729 (2010).</li>
<li>Frith, J. E., Thomson, B., Genever, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+three-dimensional+culture+methods+enhance+mesenchymal+stem+cell+properties+and+increase+therapeutic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+C+Methods%22%5BJournal%5D)">Dynamic three-dimensional culture methods enhance mesenchymal stem cell properties and increase therapeutic potential.</a> Tissue Eng Part C Methods. 16 (4), 735-749 (2010).</li>
<li>Nakasone, Y., Yamamoto, M., Tateishi, T., Otsuka, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatocyte+spheroids+underlayered+with+nonparenchymal+cells+for+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22IEICE+Transactions+on+Electronics%22%5BJournal%5D)">Hepatocyte spheroids underlayered with nonparenchymal cells for biomedical applications.</a> IEICE Transactions on Electronics. E94, 176-180 (2011).</li>
<li>Nishida, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+reconstruction+with+tissue-engineered+cell+sheets+composed+of+autologous+oral+mucosal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Corneal reconstruction with tissue-engineered cell sheets composed of autologous oral mucosal epithelium.</a> N Engl J Med. 351 (12), 1187-1196 (2004).</li>
<li>Ohashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+functional+two-+and+three-dimensional+liver+systems+in+vivo+using+hepatic+tissue+sheets%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Engineering functional two- and three-dimensional liver systems in vivo using hepatic tissue sheets.</a> Nat Med. 13 (7), 880-885 (2007).</li>
<li>Sekine, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+cell+sheet+transplantation+improves+damaged+heart+function+via+superior+cell+survival+in+comparison+with+dissociated+cell+injection%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+A%22%5BJournal%5D)">Cardiac cell sheet transplantation improves damaged heart function via superior cell survival in comparison with dissociated cell injection.</a> Tissue Eng Part A. 17 (23-24), 2973-2980 (2011).</li>
<li>Itaka, K., Kataoka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+and+prospects+of+polyplex+nanomicelles+for+plasmid+DNA+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Progress and prospects of polyplex nanomicelles for plasmid DNA delivery.</a> Curr Gene Ther. 11 (6), 457-465 (2011).</li>
<li>Endo, T., Itaka, K., Shioyama, M., Uchida, S., Kataoka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+transfection+to+spheroid+culture+system+on+micropatterned+culture+plate+by+polyplex+nanomicelle%3A+a+novel+platform+of+genetically-modified+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Deliv+and+Transl+Res%22%5BJournal%5D)">Gene transfection to spheroid culture system on micropatterned culture plate by polyplex nanomicelle: a novel platform of genetically-modified cell transplantation.</a> Drug Deliv and Transl Res. 2 (5), 398-405 (2012).</li>
<li>Howard, R. B., Christensen, A. K., Gibbs, F. A., Pesch, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+enzymatic+preparation+of+isolated+intact+parenchymal+cells+from+rat+liver%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The enzymatic preparation of isolated intact parenchymal cells from rat liver.</a> J Cell Biol. 35 (3), 675-684 (1967).</li>
<li>Berry, M. N., Friend, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-yield+preparation+of+isolated+rat+liver+parenchymal+cells%3A+a+biochemical+and+fine+structural+study%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">High-yield preparation of isolated rat liver parenchymal cells: a biochemical and fine structural study.</a> J Cell Biol. 43 (3), 506-520 (1969).</li>
<li>Tateno, C., Yoshizato, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+cultivation+of+adult+rat+hepatocytes+that+undergo+multiple+cell+divisions+and+express+normal+parenchymal+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Long-term cultivation of adult rat hepatocytes that undergo multiple cell divisions and express normal parenchymal phenotypes.</a> Am J Pathol. 148 (2), 383-392 (1996).</li>
<li>Kanayama, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+PEG-based+biocompatible+block+catiomer+with+high+buffering+capacity+for+the+construction+of+polyplex+micelles+showing+efficient+gene+transfer+toward+primary+cells%5BTitle%5D)+AND+%22ChemMedChem%22%5BJournal%5D)">A PEG-based biocompatible block catiomer with high buffering capacity for the construction of polyplex micelles showing efficient gene transfer toward primary cells.</a> ChemMedChem. 1 (4), 439-444 (2006).</li>
<li>Itaka, K., Ishii, T., Hasegawa, Y., Kataoka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biodegradable+polyamino+acid-based+polycations+as+safe+and+effective+gene+carrier+minimizing+cumulative+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Biodegradable polyamino acid-based polycations as safe and effective gene carrier minimizing cumulative toxicity.</a> Biomaterials. 31 (13), 3707-3714 (2010).</li>
<li>Uchida, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PEGylated+Polyplex+With+Optimized+PEG+Shielding+Enhances+Gene+Introduction+in+Lungs+by+Minimizing+Inflammatory+Responses%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">PEGylated Polyplex With Optimized PEG Shielding Enhances Gene Introduction in Lungs by Minimizing Inflammatory Responses.</a> Mol Ther. 20 (6), 1196-1203 (2012).</li>
<li>Golde, W. T., Gollobin, P., Rodriguez, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid%2C+simple%2C+and+humane+method+for+submandibular+bleeding+of+mice+using+a+lancet%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Anim+%28NY%29%22%5BJournal%5D)">A rapid, simple, and humane method for submandibular bleeding of mice using a lancet.</a> Lab Anim (NY). 34, 39-43 (2005).</li>
<li>Uchida, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+injectable+spheroid+system+with+genetic+modification+for+cell+transplantation+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">An injectable spheroid system with genetic modification for cell transplantation therapy.</a> Biomaterials. 35 (8), 2499-2506 (2014).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

W tym protokole kluczowe znaczenie ma utrzymanie struktury 3D sferoidów podczas etapów wprowadzania genów i odzyskiwania sferoidów. Niezbędne jest utrzymanie korzystnego mikrośrodowiska dla komórek, aby uniknąć śmierci komórki lub utraty jej aktywności. Na przykład wydzielanie albuminy, reprezentatywna wrodzona funkcja hepatocytów, jest dobrze zachowane w sferoidach hepatocytów, podczas gdy hepatocyty w konwencjonalnej hodowli jednowarstwowej szybko tracą swoją zdolność wydzielniczą kilka dni po wysianiu12. W ...

Terapia przeszczepem komórek zyskała szeroką uwagę w leczeniu różnych nieuleczalnych chorób. Aktywność i okres półtrwania czynników bioaktywnych wydzielanych przez przeszczepione komórki są kluczowe dla poprawy skuteczności terapeutycznej systemu transplantacji komórkowej. Modyfikacja genetyczna komórek przed transplantacją jest korzystną techniką pozwalającą regulować i manipulować funkcjami komórkowymi, w tym wydzielaniem czynników bioaktywnych. Ważne jest również utrzymanie korzystnego mikrośrodowiska dla komórek, aby zapobiec ich obumarciu lub utracie aktywności. Trójwymiarowa (3D) hodowla sferoidów komórkowych, w której zachowane są oddziaływania międzykomórkowe, jest obiecująca w tym celu, na przykład w celu zwiększenia wydzielania albuminy przez pierwotne hepatocyty oraz promowania różnicowania wieloliniowego mezenchymalnych komórek macierzystych (MSCs) 1-7.
W niniejszym badaniu zastosowano nowatorski system łączący hodowlę sferoidów i transfekcję genów, który służy jako platforma do transplantacji genetycznie zmodyfikowanych komórek. Do tworzenia sferoidów komórkowych wykorzystano system hodowli sferoidów na płytkach hodowlanych z mikrowzorcem. Na płytkach tych obszary adhezji komórkowej o średnicy 100 µm są rozmieszczone regularnie w układzie dwuwymiarowym i otoczone obszarami nieadhezyjnymi pokrytymi macierzą PEG3. Poprzez wysianie odpowiedniej liczby komórek, zgodnie z mikrowzorcem podłoża hodowlanego, powstają macierze trójwymiarowych sferoidów o średnicy 100 µm.
Sferoidy są odzyskiwane bez naruszania ich struktury 3D przy użyciu termoczułych płytek do hodowli komórkowych, które zostały powleczone termoczułym polimerem, poli(izopropyloniamidem) (PIPAAm) 8-10. Mikrostruktura wzorca jest tworzona na płytkach termoczułych (wykonanych na zamówienie). Poprzez samo obniżenie temperatury płytek, sferoidy odrywają się od podłoża hodowlanego i ulegają dyspersji w roztworze soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS). W ten sposób można uzyskać dużą liczbę sferoidów o jednolitym rozmiarze 100 µm w formie zawiesiny do iniekcji.
<img alt="Schemat metody hodowli sferoidów: wysiew komórek, transfekcja nanomicelami, regeneracja, proces wstrzykiwania." p="" src="/files/ftp_upload/52384/52384fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> Rycina 1. Schematyczna prezentacja systemu hodowli sferoidów na płytce z mikrowzorami.Modyfikacja genetyczna jest realizowana poprzez transfekcję genów przy użyciu oryginalnego niewirusowego nośnika genów – nanomiceli polipleksowej. Składa się ona z plazmidowego DNA (pDNA) oraz blokowych kopolimerów polietylenoglikolu (PEG) i polikationów11. Posiadają one charakterystyczną strukturę rdzeń-otoczka, składającą się z otoczki PEG i wewnętrznego rdzenia skondensowanego pDNA, co umożliwia bezpieczne i skuteczne wprowadzanie genów do komórek w celach terapeutycznych11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52384/52384fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat tworzenia nanomiceli polipleksu pokazujący samorzutny montaż DNA z kopolimerami blokowymi poprzez oddziaływanie elektrostatyczne." src="/files/ftp_upload/52384/52384fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Struktura nanomiceli polipleksu utworzonej przez kompleks kwasów nukleinowych i kopolimerów blokowych PEG-blok-polikationu. W niniejszym badaniu główną zaletą tej techniki jest to, że struktura sferoidu nie ulega zaburzeniu podczas transfekcji genów za pomocą nanomiceli. Po transfekcjach sferoidów pierwotnych hepatocytów szczura za pomocą nanomiceli uzyskano przedłużoną ekspresję transgenu przez ponad miesiąc, z ciągłą sekrecją albuminy z hepatocytów na poziomie porównywalnym do sferoidów nietransfekowanych12. Ekspresja transgenu i sekrecja albuminy ze sferoidów są utrzymywane również po odzyskaniu ich z płytek termosensytywnych. Jest oczywiste, że nanomicele mogą bezpiecznie ułatwiać wprowadzanie genów bez upośledzania wrodzonych funkcji hepatocytów. Zatem połączenie hodowli komórek sferoidalnych na termosensytywnych płytkach z mikrowzorami oraz wprowadzania genów za pomocą nanomiceli stanowi obiecującą platformę dla transplantacji genetycznie zmodyfikowanych komórek. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52384/52384fig2large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

<table><tbody><tr><td>Pen-Strep-Glut</td><td>GIBCO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>deksametazon</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>041-18861</td><td></td></tr><tr><td>Nikotynamid</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>141-01202</td><td></td></tr><tr><td>Hank' s buforowana sól i 2-fosforan kwasu L-askorbinowego (Asc-2P)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8960</td><td></td></tr><tr><td>Ludzki naskórkowy czynnik wzrostu (hEGF)</td><td>Toyobo</td><td>PT10015</td><td></td></tr><tr><td>Płytki wielodołkowe z możliwością komórek</td><td>Toyo Gosei</td><td>PP-12</td><td></td></tr><tr><td>Termoczułe płytki do hodowli komórkowych (Upcell)</td><td>CellSeed Inc</td><td></td><td>Mikrowzorzysta architektura jest zbudowana na termoczułych płytkach (zbudowanych na zamówienie przez Toyo Gosei)</td></tr><tr><td>Odczynnik do transfekcji na bazie lipidów (FuGENE HD)</td><td>Promega</td><td>E2311</td><td></td></tr><tr><td>System testowy lucyferazy Renilla</td><td>Promega</td><td>E2810</td><td></td></tr><tr><td>pGL4 Lucyferazy Reporter Vector</td><td>Promega</td><td>E6651</td><td></td></tr><tr><td>pDNA eksprymujące Gaussia lucyferazy</td><td>New England BioLabs</td><td>N8082S</td><td></td></tr><tr><td>Mysi wektor eksprymujący erhtropoetynę</td><td>Origene</td><td>MC208445</td><td></td></tr><tr><td>pCAG-GS</td><td></td><td></td><td>Uprzejmie dostarczone przez Laboratorium Badań Komórek Pluripotencjalnych, Centrum Biologii Rozwoju, RIKEN</td></tr><<tr><td>em>Escherichia coli Kompetentne komórki DH5 i alfa</td><td>Takara</td><td>9057</td><td></td></tr><tr><td>System oczyszczania plazmidu DNA bez endotoksyn</td><td>Nippon Genetics</td><td>NucleoBond Xtra EF</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>639-00951</td><td></td></tr><tr><td>Inhibitor trypsyny</td><td>GIBCO</td><td>R-007-100</td><td></td></tr><tr><td>Luminometr</td><td>Promega</td><td>GloMax&trade; 96 Luminometr</td><td></td>mikropłytkowy</tr><tr><td>IVIS System obrazowania</td><td>Xenogen Corp.</td>System <td></td><td>obrazowania in vivo Xenogen IVIS Spectrum Analizator</td></tr><tr><td>próbek krwi</td><td>Sysmex</td><td>pocH-100i Automatyczny analizator</td><td></td> hematologiczny</tr></tbody></table>

transfekcja genów w kierunku komórek sferoidalnych na mikromodelowanych płytkach hodowlanych do genetycznie modyfikowanego przeszczepu komórek

Gene Transfection toward Spheroid Cells on Micropatterned Culture Plates for Genetically-modified Cell Transplantation

Aby poprawić skuteczność terapeutyczną przeszczepu komórek, opracowano system transplantacji z genetycznie modyfikowanych, wstrzykiwanych sferoidów. Sferoidy komórkowe są przygotowywane w systemie hodowlanym na płytkach z mikrowzorami pokrytych termoczułym polimerem. Na płytkach tworzy się szereg sferoid, odpowiadających obszarom adhezji komórek o średnicy 100 μm, które są regularnie ułożone w dwuwymiarowy sposób, otoczone obszarami nieprzywierającymi, które są pokryte matrycą glikolu polietylenowego (PEG). Sferoidy można łatwo odzyskać w postaci płynnej zawiesiny poprzez obniżenie temperatury płytek, a ich struktura jest dobrze zachowana poprzez przepuszczenie ich przez igły iniekcyjne o odpowiednio dużym kalibrze (ponad 27 G). Modyfikacja genetyczna odbywa się poprzez transfekcję genów przy użyciu oryginalnego niewirusowego nośnika genu, polyplex nanomicelle, który jest zdolny do wprowadzania genów do komórek bez naruszania struktury sferoidalnej. W przypadku pierwotnych sferoidów hepatocytów transfekowanych genem eksprymującym lucyferazy, lucyferazy jest trwale uzyskiwana u przeszczepionych zwierząt, wraz z zachowaną funkcją hepatocytów, na co wskazuje ekspresja albuminy. System ten może być stosowany do różnych typów komórek, w tym mezenchymalnych komórek macierzystych.

Transfekcję genową pDNA wykazującego ekspresję lucyferazy Gaussia przeprowadzono w sferoidach utworzonych z hepatocytów lub MSC, wykorzystując nanomicelle polipleksowe lub kontrolny odczyn do transfekcji oparty na lipidach12. Nanomicelle nie wywołały niemal żadnych zmian w strukturze sferoidów w porównaniu z sferoidami nietransfekowanymi na płytkach z mikrowzorcem, podczas gdy odczyn kontrolny znacząco zaburzył strukturę dzień po transfekcji (Rysunek 3). Po transfekcji z użyciem nanomicelli, s...

Ten protokół opisuje system przeszczepiania komórek za pomocą genetycznie modyfikowanych, wstrzykiwanych sferoidów. Sferoidy komórkowe są hodowane na mikrowzorcach i odzyskiwane po wprowadzeniu genów za pomocą nanomiceli polipleksowych. System ten ułatwia przedłużoną ekspresję transgenu z przeszczepionych komórek u zwierząt gospodarza, przy jednoczesnym zachowaniu wrodzonej funkcji komórek.

Transfekcja genów w kierunku komórek sferoidalnych na mikromodelowanych płytkach hodowlanych do genetycznie modyfikowanego przeszczepu komórek

To improve the therapeutic effectiveness of cell transplantation, a transplantation system of genetically modified, injectable spheroids was developed. ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest przeprowadzenie transplantacji komórek z wykorzystaniem genetycznie zmodyfikowanych wstrzykiwalnych steroidów. Osiąga się to poprzez przygotowanie w pierwszej kolejności trójwymiarowych organoidów komórkowych (OID) na mikrowzorowanych płytkach hodowlanych przy użyciu hepatocytów szczurzych lub MSC. Następnie roztwór polimerów i plazmidowego DNA jest dokładnie mieszany w celu przygotowania kompleksów nano my cells.Następnie przeprowadzana jest transfekcja PHE poprzez dodanie roztworu komórek plex nmy do pożywki hodowlanej. Na koniec asteroidy są odzyskiwane poprzez umieszczenie płytek na lodzie i aspirację oddzielonych asteroidów. Ostatecznie genetycznie zmodyfikowane asteroidy w zawiesinie są wykorzystywane do transplantacji komórkowej w celu uzyskania przedłużonej ekspresji transgenu z przeszczepionych komórek w organizmach gospodarzy, przy jednoczesnym zachowaniu wrodzonej funkcji komórek. Procedury zostały zaprezentowane przez panią Ulę, panią Yhę, panią Suzuki, pana Matsui oraz doktora, którzy wszyscy pracują w naszych laboratoriach.Aby wyizolować hepatocyty, należy użyć specjalnego roztworu opisanego w protokole tekstowym do perfuzji wąt

gene-transfection-toward-spheroid-cells-on-micropatterned-culture

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Transfekcja genów skierowana na komórki sferyczne na mikroprądkowanych płytkach hodowlanych w celu transplantacji komórek genetycznie zmodyfikowanych

Ten film wyjaśnia magnetyczny biodruk 3D hodowanych komórek raka trzustki i fibroblastów. Komórki raka trzustki i aktywowane komórki fibroblastów trzustki są hodowane i magnetyzowane przy użyciu biokompatybilnego zestawu nanocząstek, w celu wytworzenia sferoid pod wpływem sił magnetycznych.

Magnetycznie biodrukowane kokultury sferoidalne 3D: metoda kohodowli komórek rakowych i fibroblastów

Ten film pokazuje transformację ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) w sferyczne organoidy mózgu. Stosując specyficzne inhibitory, hPSC są kierowane do różnicowania się w kierunku linii neuronalnej, tworząc kolonie neuroektodermalne. Następnie wprowadzane są specjalne czynniki wzrostu, które sprzyjają samoorganizacji i proliferacji kolonii, co ostatecznie prowadzi do powstania sferycznych organoidów mózgowych.

Generowanie sferoid z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Wprowadzamy protokół generowania dużych liczb (od tysięcy do setek tysięcy) sferoid guza o jednakowej wielkości i składzie, używając dostępnych na rynku płytek mikrodołkowych.

Produkcja dużej liczby sferoid guza o kontrolowanej wielkości przy użyciu płytek mikrodołkowych

Identyfikacja nowych celów leków, które przechodzą od testów przedklinicznych do badań na ludziach, jest priorytetem naukowym. W tym celu opisujemy tutaj podejście genomiki funkcjonalnej do badania wpływu wyczerpania genów na sferoidy linii komórek nowotworowych, które bardziej odpowiednio modelują nowotwory u ludzi in vivo.

Wykorzystanie badań przesiewowych genomiki funkcjonalnej do identyfikacji potencjalnie nowych celów leków w hodowlach sferoidalnych komórek nowotworowych

Tutaj opisujemy protokół systematycznej hodowli sferoidów naskórka w hodowli zawiesinowej 3D. Protokół ten ma szerokie zastosowanie do stosowania w różnych typach tkanek nabłonkowych oraz do modelowania kilku chorób i stanów u ludzi.

Opracowanie wysokoprzepustowego systemu hodowli sferoidów naskórka do modelowania plastyczności komórek macierzystych keratynocytów

Obecny protokół opisuje technikę wytwarzania sferoidów tkankowych na dużą skalę przy użyciu wydrukowanego w 3D urządzenia przypominającego stempel.

Generowanie sferoid tkankowych za pomocą wydrukowanego w 3D urządzenia przypominającego stempel

Przedstawiamy protokół do hodowli sferoidów o wysokiej powtarzalności i ich charakterystyki fenotypowej za pomocą przechwytywania obrazów i proteomiki.

Półautomatyczna analiza fenotypowa funkcjonalnych hodowli komórek sferoidalnych 3D

Ten artykuł demonstruje ustandaryzowaną metodę konstruowania trójwymiarowych sferoid nowotworowych. Opisano również strategię obserwacji sferoidy i analizy głębokiego uczenia opartego na obrazach przy użyciu zautomatyzowanego systemu obrazowania.

Generowanie sferoid 3D guza do badań oceny leków

W tym artykule proponujemy protokół do produkcji hybrydowych sferoidów za pomocą pęsety optycznej. Metoda ta pozwala na precyzyjną kontrolę wczesnych etapów procesu powstawania sferoidów, co jest nieosiągalne innymi metodami.

Wykorzystanie pęsety optycznej do generowania sferoid hybrydowych

To badanie przedstawia opłacalną i efektywną metodologię generowania struktur komórkowych 3D za pomocą systemu opartego na stemplach do tworzenia mikrostudzienek w formach agarozowych. System sprzyja tworzeniu się jednolitych sferoidów/organoidów, poprawiając w ten sposób interakcje komórkowe. Takie podejście zmniejsza zmienność eksperymentalną i wspiera zastosowania w testowaniu leków i inżynierii tkankowej.

Generowanie trójwymiarowych sferoidów/organoidów z dwuwymiarowych kultur komórkowych przy użyciu nowatorskiego urządzenia do stemplowania

Poznaj metodę transfekcji genów w sferoidy komórkowe na mikromodelowanych płytkach hodowlanych do genetycznie modyfikowanego przeszczepu. Technika zapewnia przedłużoną ekspresję transgenów u zwierząt gospodarzy przy zachowaniu wrodzonej funkcji komórek.

Transfekcja genów w kierunku komórek sferoidalnych na mikromodelowanych płytkach hodowlanych do genetycznie modyfikowanego przeszczepu komórek (Wideo) | JoVE Journal

Transfekcja genów w kierunku komórek sferoidalnych na mikromodelowanych płytkach hodowlanych do genetycznie modyfikowanego przeszczepu komórek

Przeglądaj więcej filmów