Ocena skuteczności uczulenia na leki przeciwnowotworowe in vitro i in vivo
6 lutego 2015
Tutaj, monitorowanie metabolizmu komórek nowotworowych w czasie rzeczywistym, w połączeniu z modelem przerzutów in vivo błony kosmówkowo-omocznikowej (CAM) zarodka kurczaka, są wykorzystywane do oceny nowych celów/środków przeciwnowotworowych pod kątem ich zdolności do uwrażliwiania komórek nowotworowych na chemoterapeutyki uszkadzające DNA.
Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest ocena skuteczności uczulenia na leki przeciwnowotworowe poprzez pomiar zmian w metabolizmie komórkowym in vitro i częstości przerzutów in vivo. Osiąga się to poprzez najpierw transekcję komórek rakowych in vitro z cząsteczkami antysensownymi, aby powalić cel zainteresowania. Następnie transfekowane komórki są umieszczane na chipach biosensorów i ładowane do systemu pomiaru metabolizmu w celu wyliczenia zmian w zakwaszeniu, oddychaniu i adhezji podczas leczenia farmakologicznego.
Oddzielnie transfekowane komórki są traktowane lekiem i wstrzykiwane do krążenia żylnego zarodka kurczaka w celu oceny wpływu na częstość przerzutów. Wyniki wskazują na uwrażliwienie na leki przeciwnowotworowe, co ilustrują zmiany w metabolizmie komórkowym i częstości przerzutów. Technika ta rozszerza rozwój terapii przeciwnowotworowej, ponieważ pozwala na jednoczesną ocenę parametrów, które nie zawsze są brane pod uwagę podczas konwencjonalnych badań przedklinicznych docelowych leków lub związków.
Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w nowe cele leków biorące udział w naprawie DNA, może być również stosowana do walidacji celów w innych systemach, takich jak kontrola cyklu komórkowego. Po przecięciu komórek nowotworowych oligonukleotydami antysensownymi, zgodnie z protokołem tekstowym w sterylnym środowisku, użyj 400 mikrolitrów PBS, aby dokładnie umyć sześć chipów biosensora Aby wysterylizować chipy, usuń PBS i dodaj 400 mikrolitrów 70% etanolu inkubuj przez 20 minut przed użyciem PBS do trzykrotnego umycia chipów. Umieść po trzy chipsy w sterylnych naczyniach hodowlanych, oznaczonych jako kontrolne i docelowe zainteresowanie, i oznacz dwie 50-mililitrowe probówki w podobny sposób.
Następnie użyj PBS do umycia transfekowanych komórek przed dodaniem odpowiedniej objętości 0,25% trypsyny EDTA, poczekaj, aż monowarstwa się oderwie i przenieś zawiesinę komórek do odpowiedniej probówki. Po policzeniu komórek dostosuj objętość, aby osiągnąć końcowe stężenie 6,0 razy 10 do piątych komórek na mililitr, dodając pożywkę lub zagęszczając komórki. Przygotowując jedną grupę na raz, dodaj 250 mikrolitrów roztworu komórkowego do każdego chipa biosensora.
Umieść sterylne naczynia zawierające chipsy w komorze wilgotnościowej, aby zapobiec parowaniu i inkubuj przez noc w celu przeprowadzenia pomiarów metabolizmu zgodnie z opisem eksperymentalnym szczegółowo opisanym w protokole tekstowym oznacz 1450 mililitrowych probówek i dodaj 50 mililitrów wzrostu, pożywkę plus 0,2% FBS i jeden x penicylina i streptomycyna. Albo PS. Umieść sześć probówek w jednym systemie pomiaru metabolizmu, sześć probówek w drugim, a pozostałą probówkę w trzecim stojaku na probówki, który również zawiera probówki z cisplatyną. Użyj membrany przepuszczającej powietrze, aby uszczelnić pierwsze dwa stojaki, aby zapobiec parowaniu.
Następnie należy przygotować odpowiednią objętość sześciu mikromolowych cisplatyn w pożywce z 0,2% FBS i jednym XPS. Dozuj wymaganą objętość pożywki do czterech oznaczonych 50-mililitrowych probówek i umieść je z powrotem w czterech szczelinach trzeciego stojaka na probówki do pomiaru metabolizmu. Użyj membrany przepuszczającej powietrze, aby uszczelnić rurki.
Oznacz sześć 50-mililitrowych probówek i dodaj 20 mililitrów do każdej z 0,1% roztworu Triton X W podłożu roztwór Triton X będzie leżał na pozostałych komórkach i zapewni wartość zerową dla każdego chipa. Umieść probówki w czwartym stojaku na probówki i zamknij je. Następnie załaduj chipy do modułów bio.
Załaduj dwie baraki do uchwytu na dwa strąki, a następnie rozpocznij eksperyment. Po przygotowaniu zarodków kurcząt, zgodnie z zapisem w protokole tekstowym, w drugim dniu transfekcji komórek, należy podzielić grupę kontrolną i docelową grupę interesu na dwie kolby na nośnik i dwie na cisplatynę. Odessać pożywkę i użyć trzech mililitrów świeżej, pożywki lub pożywki z sześcioma mikromolowymi cisplatynami w celu uzupełnienia.
Kolby inkubuje się przez sześć godzin. Po inkubacji odessać pożywkę, a następnie umyć i spróbować anyżować komórki, przenieść zawiesinę komórek do czterech odpowiednio oznakowanych 15-mililitrowych probówek przed odwirowaniem i użyciem PBS do trzykrotnego przemycia Resus ponownie zawiesić komórki. A następnie po zliczeniu użyj PBS do rozcieńczenia lub odwirowania, aby skoncentrować komórki do końcowego stężenia 1,0 razy 10 do szóstych komórek na mililitr.
Przenieść zawiesinę komórek do pięciu mililitrowych probówek oznaczonych do wstrzykiwań i umieścić na lodzie. Następnie odłóż na bok 24 9-dniowe zarodki kurze do wstrzyknięcia pod mikroskopem stereoskopowym i za pomocą szklanej igły przymocowanej do elastycznej rurki podłączonej do jednomililitrowej strzykawki powolnym ruchem pulsacyjnym. Wstrzyknąć 1,0 razy 10 do piątej komórki w objętości 100 mikrolitrów do krążenia żylnego błony choal toic lub krzywki za pomocą miękkiej chusteczki.
Delikatnie przetrzeć miejsce wstrzyknięcia, aby zatamować upływ krwi i wchłonąć rozlany płyn. Po każdym wstrzyknięciu należy odpowiednio oznaczyć każdy pojemnik na zarodki pod mikroskopem fluorescencyjnym. Potwierdź obecność i rozmieszczenie komórek fluorescencyjnych w układzie naczyniowym krzywki.
Zwróć uwagę na wszelkie zarodki, w których liczba komórek nowotworowych wydaje się niska lub dystrybucja jest słaba. Na koniec umieść zarodki kurczaka w komorze wilgotnościowej i inkubuj przez siedem do dziewięciu dni przed wyliczeniem ognisk przerzutowych, jak opisano w protokole tekstowym, jak pokazano tutaj, po 24 godzinach u ludzi, 5 49 komórek raka płuc leczonych BRCA dwa ukierunkowanych na SO i cisplatynę wykazało wczesne i nieodwracalne zmniejszenie oddychania w porównaniu z komórkami, które otrzymały kontrolę SO i samą cisplatynę. Spadek o 39% w porównaniu z komórkami kontrolnymi rozpoczął się około 10 godzin przed wykrywalnym spadkiem adhezji komórek, co sugeruje, że wystąpił on niezależnie od zmian w liczbie komórek i że może to być zdarzenie formujące, które poprzedza śmierć komórki, jak wykazano tutaj.
Podczas 72-godzinnego eksperymentu nie zaobserwowano różnicy w zakwaszeniu, co sugeruje, że leczenie BRCA, 2, SO, i cisplatyną miało niewielki lub żaden wpływ na metabolizm glukozy. W tym eksperymencie ludzkie komórki raka płuc A 5 49 leczono kontrolą SO lub BRCA dwa A SO w obecności lub bez cisplatyny i wstrzyknięto do krążenia żylnego cam. Dziewięć dni później komórki leczone BRCA dwa A SO i cisplatyną wykazywały o 77% niższą częstość ognisk przerzutowych w porównaniu z komórkami leczonymi kontrolą A SO i cisplatyną lub BRCA dwa A SSO samodzielnie, co sugeruje, że leczenie BRCA dwa A SO i cisplatyną może potencjalnie zmniejszać lub zapobiegać obciążeniu przerzutami u pacjentów z guzami litymi.
Zgodnie z tą procedurą można zastosować bardziej tradycyjne metody, takie jak proliferacja komórek, testy i badania ksenoprzeszczepów in vivo, w celu dalszego zbadania wpływu określonego celu na zwiększenie wrażliwości leku.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie ocenia skuteczność uwrażliwiania na leki przeciwnowotworowe poprzez monitorowanie metabolizmu komórek nowotworowych oraz częstotliwości przerzutowania. Z wykorzystaniem modelu zarodka kurczaka badanie analizuje, w jaki sposób nowe środki przeciwnowotworowe mogą zwiększyć wrażliwość komórek nowotworowych na chemioterapeutyki.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Onkologia
- Metabolizm komórkowy
- Uwrażliwianie na leki
Wstęp
- Leczenie nowotworów często obejmuje chemioterapeutyki, które mogą być nieskuteczne w przypadku niektórych guzów.
- Zrozumienie metabolizmu komórek nowotworowych może dostarczyć wiedzy na temat oporności na leki.
- Modele in vivo są niezbędne do badania przerzutów oraz działania leków.
- Techniki monitorowania w czasie rzeczywistym mogą usprawnić ocenę skuteczności leków.
Cel badania
- Ocena wpływu nowych środków przeciwnowotworowych na metabolizm komórek nowotworowych.
- Ocena częstości przerzutowania leczonych komórek rakowych.
- Opracowanie metody jednoczesnej oceny efektów działania leków in vitro oraz in vivo.
Zastosowane metody
- Transfekcja komórek nowotworowych cząsteczkami antysensownymi w celu wyciszenia genów docelowych.
- Pomiar metabolizmu komórkowego przy użyciu chipów z biosensorami.
- Iniekcja potraktowanych komórek do embrionów kurczaka w celu badania przerzutowania.
- Analiza zmian zakwaszenia, oddychania i adhezji podczas leczenia farmakologicznego.
Główne wyniki
- Po zastosowaniu leku zaobserwowano istotne zmiany w metabolizmie komórkowym.
- Częstość przerzutowania była zależna od uwrażliwienia komórek nowotworowych.
- Metoda ta umożliwia kompleksową ocenę celów terapeutycznych leków.
- Wyniki wspierają opracowanie bardziej skutecznych terapii przeciwnowotworowych.
Wnioski
- Niniejsze badanie przedstawia nowatorskie podejście do oceny uwrażliwienia na leki przeciwnowotworowe.
- Monitorowanie metabolizmu w czasie rzeczywistym może dostarczyć istotnych informacji dla strategii terapeutycznych.
- Model zarodka kurczego jest efektywnym narzędziem do badania przerzutów in vivo.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Niniejszy protokół umożliwia jednoczesną ocenę metabolizmu komórek nowotworowych oraz częstości przerzutowania w celu zweryfikowania strategii uwrażliwiania na leki przeciwnowotworowe. Dzięki integracji odczytów metabolicznych w czasie rzeczywistym z modelowaniem przerzutów in vivo, metoda ta wspiera wczesne ograniczanie ryzyka w przypadku kandydatów na inhibitory naprawy DNA. Podejście to zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celu poprzez powiązanie efektów mechanistycznych z funkcjonalnymi wynikami przeciwnowotworowymi.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie inhibicji BRCA2 jako mechanizmu zwiększającego wrażliwość komórek nowotworowych na uszkodzenia DNA indukowane cisplatyną.
- Wartość operacyjna: Dostarcza ilościowych danych w czasie rzeczywistym dotyczących respiracji i zakwaszenia, co pozwala odróżnić efekty cytostatyczne od cytotoksycznych.
- Wartość naukowa: Wspiera walidację celu poprzez wykazanie, że zmiany metaboliczne poprzedzają utratę adhezji, co wskazuje na kluczowe zdarzenie w odpowiedzi na lek.
Przesiewy i opracowanie testu
- Wartość naukowa: Ustanawia zestandaryzowany schemat pracy z chipem biosensora do monitorowania dynamicznych zmian w metabolizmie komórkowym podczas leczenia farmakologicznego.
- Wartość operacyjna: Umożliwia wysokorozdzielcze śledzenie respiracji i zakwaszenia minuta po minucie przez 72 godziny w celu uchwycenia dynamiki czasowej odpowiedzi na lek.
- Wartość naukowa: Ułatwia standaryzację testu poprzez zastosowanie określonych stężeń komórek i kontrolowanych warunków transfekcji we wszystkich grupach eksperymentalnych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Wykorzystanie modelu błony chorioallantoicznej (CAM) zarodka kurczego do ilościowego określenia częstotliwości przerzutowania jako funkcjonalnego wskaźnika inwazyjności i ekstrawazacji komórek nowotworowych.
- Wartość operacyjna: Umożliwienie bezpośredniego porównania stopnia przerzutowania między komórkami kontrolnymi a komórkami z zahamowanym BRCA2 traktowanymi cisplatyną, co wykazało 77% redukcję ognisk przerzutowych.
- Wartość naukowa: Wykazanie, że inhibicja BRCA2 w połączeniu z cisplatyną zmniejsza potencjał przerzutowy, co potwierdza jej rolę w przełamywaniu oporności adaptacyjnej.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta łączy wczesny etap odkrywania z walidacją przedkliniczną, wiążąc mechanistyczne wnioski in vitro z efektami fenotypowymi in vivo, co wspiera decyzje typu go/no-go w procesie priorytetyzacji celów.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez poprzez powiązanie wyciszenia genu BRCA2 ze specyficznymi zmianami w oddychaniu, które poprzedzają wykrywalne zmiany w adhezji.
- Przesiewanie: Dostarcza gotowych do analizy, ilościowych wyników metabolicznych, które umożliwiają porównania między różnymi warunkami traktowania i kandydatami na związki aktywnymi.
- Analityka: Generuje dane rozdzielcze w czasie dotyczące zakwaszenia, oddychania i adhezji, co pozwala na mechanistyczną redukcję ryzyka w odniesieniu do celów naprawy DNA.
- Badania translacyjne: Łączy efekty uwrażliwiania in vitro ze zmniejszoną częstotliwością przerzutowania in vivo, co jest zgodne z celami ciągłości przedklinicznej.
- Wykorzystanie przedsiębiorcze: Tworzy platformę wielokrotnego użytku do oceny strategii uwrażliwiania w różnych szlakach naprawy DNA oraz innych mechanizmach oporności.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną poprzez korelację wczesnych zmian metabolicznych z długoterminowym hamowaniem przerzutowania.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność dzięki standaryzacji przygotowania chipów biosensorowych, protokołów transfekcji oraz procedur wstrzykiwania do zarodków.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność kapitałową, umożliwiając wczesne rozróżnienie obiecujących celów przed zainwestowaniem w badania na ksenograftach mysich.
- Wpływ na portfolio: Wspiera rozwój skorygowany o ryzyko poprzez identyfikację kandydatów wykazujących zarówno interakcję z celem, jak i funkcjonalną aktywność antyprzerzutniczą.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie transfekcji komórek, obsługi chipów biosensorowych oraz manipulacji zarodkami kurczymi.
- Zależne od dostępu do systemu pomiaru metabolizmu zdolnego do monitorowania zakwaszenia i respiracji w czasie rzeczywistym.
- Wymaga ustandaryzowanych protokołów przygotowania cisplatyny, inkubacji zarodków oraz liczenia ognisk przerzutowych.
- Wiąże się z koniecznością uwzględnienia adaptacji przy przenoszeniu modelu CAM na inne typy nowotworów lub tła genetyczne.
- Ograniczone 7–9 dniowym oknem inkubacji zarodka, co zawęża zakres długoterminowych badań nad przerzutowaniem.
