Name: Ocena skuteczności uczulenia na leki przeciwnowotworowe in vitro i in vivo (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 19 s
Description: Odkryj metodę oceny uczulenia na leki przeciwnowotworowe poprzez pomiar metabolizmu komórek in vitro i częstości przerzutów in vivo na modelu zarodka kurzego. Technika ta umożliwia kompleksową ocenę celów lekowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była możliwa dzięki grantom dla JK z Ontario Centres of Excellence i Ontario Research Fund.
Chcielibyśmy podziękować Siddice Pardhan i Dr. Peterowi Fergusonowi za pomoc techniczną podczas kręcenia filmu.

UWAGA: Poniższy protokół został zaprojektowany do użytku z przylegającymi komórkami. Konieczne są modyfikacje w celu zastosowania metody do nieprzylegających komórek hodowanych w zawiesinie. Eksperymenty CAM opisane w protokole są przeznaczone do stosowania z komórkami, które wyrażają marker fluorescencyjny (np. GFP, RFP itp.). Dziewięciodniowe zarodki kurcząt są wymagane w 2. dniu protokołu doświadczalnego do eksperymentów CAM.
1. Przygotowanie i transfekcja komórek nowotworowych za pomocą oligonukleotydów antysensownych (ASO)
<ol>
	<li>Odessać pożywkę z kolby T75 zawierającej interesujące nas komórki, przemyć 1XPBS i dodać 2 ml 0,25% trypsyny/EDTA. Dodać 10 ml kompletnej pożywki wzrostowej do każdej kolby i przenieść komórki w roztworze do probówki o pojemności 50 ml. Policz komórki i dostosuj objętość tak, aby końcowe stężenie wynosiło 1,0x105 komórek na ml.</li>
	<li>Oznacz dwie grupy kolb T25: jedna grupa będzie zawierać osiem kolb, oznaczonych 1-8, i będzie używana do eksperymentu pomiaru metabolizmu w czasie rzeczywistym; a druga grupa będzie również zawierać 8 kolb i będzie używana do eksperymentu CAM z zarodkami kurzymi. Dodać 2 ml komórek w roztworze do każdej kolby i umieścić w inkubatorze (37 °C, 5%CO2O/N).</li>
	<li>Następnego ranka (Dzień 0, Czas 0) oznacz trzy probówki o pojemności 5 ml w następujący sposób: kontrolny (nieukierunkowany ASO lub siRNA), "cel zainteresowania" (tj. ukierunkowany na ASO lub siRNA) i Lipofectamine 2000 (lub podobny odczynnik do transfekcji). Rozcieńczyć podstawowe roztwory ASO do odpowiedniego stężenia z pożywką wolną od surowicy w odpowiedniej probówce.
	<ol>
		<li>Dodać wymaganą ilość odczynnika do transfekcji do odpowiedniej probówki i inkubować w podłożu bez surowicy przez 5 minut. Dodać roztwór odczynnika do transfekcji do probówek ASO i inkubować przez 20 minut.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodać 250 μl kontrolnego roztworu odczynnika do transfekcji ASO do każdej z kolb 1-4 w każdej grupie i 250 μl roztworu odczynnika do transfekcji ASO "będącego przedmiotem zainteresowania" do każdej z kolb 5-8 w każdej grupie. Inkubować przez 4 godziny (37 oC, 5% CO2 ).
	<ol>
		<li>Podczas inkubacji należy postępować zgodnie z czynnościami opisanymi w ppkt 2.1. Po inkubacji dodać 3 ml kompletnej pożywki do każdej kolby w grupie doświadczalnej CAM i powrócić do inkubatora O/N (37 oC, 5% CO2 ). Przeprowadzić eksperyment grupy metabolizmu zgodnie z opisem w sekcji 2.2. Przeprowadzić zestaw eksperymentów CAM zgodnie z opisem w sekcji 4.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie chipów biosensorów i zasiewanie komórek
<ol>
	<li>W sterylnym środowisku ostrożnie umyj sześć chipów biosensora 400 μl PBS. Sterylizuj wióry 400 μl 70% etanolu przez 20 minut. Przemyć trzykrotnie 400 μl PBS.
	<ol>
		<li>Umieść chipsy w sterylnych naczyniach do hodowli tkankowych, aby zapobiec zanieczyszczeniu. Umieść trzy frytki w naczyniu oznaczonym jako "kontrola", a trzy w naczyniu oznaczonym jako "cel zainteresowania".</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oznaczyć dwie probówki o pojemności 50 ml jako "kontrolne" i "będące przedmiotem zainteresowania". Umyj komórki PBS i dodaj odpowiednią objętość 0,25% trypsyny/EDTA. Poczekaj, aż monowarstwa się odczepi i zbierz komórki z każdej kolby. Umieścić roztwór w odpowiedniej probówce.
	<ol>
		<li>Policz komórki i dostosuj objętość tak, aby końcowe stężenie wynosiło 6,0x105 komórek/ml. Odwirować i ponownie zawiesić komórki, jeśli początkowe stężenie jest zbyt niskie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodaj 250 μl roztworu komórkowego do każdego chipa biosensora w odpowiedniej grupie (w sumie 1,25x105 komórek na chip). Wykonuj to zadanie pojedynczo, aby zminimalizować ryzyko pomylenia chipów. Umieść sterylne naczynia zawierające wióry w komorze wilgotnościowej, aby zapobiec parowaniu, a następnie umieść komorę wilgotnościową w inkubatorze O/N (37 oC, 5% CO2 ).</li>
	<li>Następnego ranka (Dzień 1) ostrożnie odessać pożywkę z każdego chipa i zastąpić ją 250 μl pożywki wzrostowej uzupełnionej 0,2% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) oraz 1x penicyliną i streptomycyną (P/S). Inkubować przez 4 godziny (37 oC, 5% CO2 ).</li>
</ol>
3. Przygotowanie systemu pomiaru metabolizmu i przygotowanie roztworu
<ol>
	<li>Podczas inkubacji należy przygotować wymagane roztwory leków i system pomiaru metabolizmu do nadchodzącego testu. 
	UWAGA: System pomiaru metabolizmu składa się łącznie z sześciu modułów. Każdy moduł mieści jeden chip na eksperyment.
	<ol>
		<li>Podzielić test na następujące grupy doświadczalne: po jednym chipie z każdej z grup "kontrolnych" i "docelowych zainteresowania", które otrzymują nośnik na czas trwania testu; dwa chipy z każdej grupy otrzymują leczenie farmakologiczne przez określony czas podczas testu, a następnie nośnik w okresie wymywania.</li>
		<li>W przypadku badań uczulających na leki, należy zmodyfikować długość, czas i stężenie leczenia farmakologicznego, aby dopasować je do konkretnego leku, o którym mowa. 
		UWAGA: W przypadku cisplatyny następujące kroki zostały określone empirycznie na komórkach A549 i mogą się różnić w zależności od linii komórkowej. Wszystkie etapy należy wykonywać przy domyślnym natężeniu przepływu 4 μl/min. 
		6 godzin podłoża wzrostowego + 0,2% FBS i 1x P/S 
		24 godziny cisplatyny 6 μM w pożywce + 0,2% FBS 1x P/S 
		24 godziny pożywki + 0,2% FBS i 1x P/S 
		18 godzin podłoża wzrostowego + 0,2% FBS i 1x P/S 
		4 godziny od 0,1% Triton-X 
		UWAGA: Odchylenia od tych kroków będą wymagały obliczeń w celu określenia wymaganej objętości pożywki i roztworów leków w oparciu o pożądane natężenie przepływu i czas trwania eksperymentu. Poniższe sekcje są oparte na krokach opisanych powyżej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oznaczyć i napełnić czternaście probówek o pojemności 50 ml 50 ml pożywki wzrostowej + 0,2% FBS i 1x P/S. Umieść sześć w jednym stojaku na probówki systemu pomiaru metabolizmu, sześć w innym, a pozostałe dwie w trzecim stojaku na probówki, który zawiera również probówki z cisplatyną. Uszczelnij pierwsze dwa stojaki membraną przepuszczającą powietrze, aby zapobiec parowaniu.</li>
	<li>Przygotować roztwór 6 μM cisplatyny (o odpowiedniej objętości) w pożywce + 0,2% FBS z 1x P/S. Dozować wymaganą objętość roztworu cisplatyny do czterech znakowanych probówek o pojemności 50 ml.
	<ol>
		<li>Umieść probówki w pozostałych czterech szczelinach w trzecim stojaku na probówki do pomiaru metabolizmu. Upewnij się, że rurki są umieszczone w odpowiednich szczelinach, które odpowiadają żądanym biomodułom. Uszczelnij rurki membraną przepuszczającą powietrze.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować i oznaczyć sześć probówek o pojemności 50 ml i napełnić je po 20 ml 0,1% roztworu Triton-X w podłożu. Roztwór Triton-X podda lizie wszystkie pozostałe ogniwa i zapewni wartość "zero" dla każdego chipa. Umieść probówki w czwartym stojaku na probówki do pomiaru metabolizmu i uszczelnij membraną przepuszczającą powietrze, aby zapobiec nadmiernemu parowaniu.</li>
	<li>Załaduj chipy do biomodułów i rozpocznij eksperyment.</li>
</ol>
4. Eksperyment CAM Leczenie i wstrzykiwanie narkotyków
UWAGA: Kroki i procedura przygotowania zarodków kurczaka do eksperymentu CAM są opisane gdzieindziej 19
<ol>
	<li>Rozpocznij przetwarzanie eksperymentu CAM 48 godzin po transfekcji (dzień 2). Podzielić grupy "kontrolną" i "docelową wartość zainteresowania" na dwie kolby dla nośnika i dwie dla cisplatyny. Odessać pożywkę z kolb i uzupełnić 3 ml świeżej pożywki lub 6 μM cisplatyny. Inkubować przez 6 godzin (37 oC, 5% CO2 ).</li>
	<li>Odessać pożywkę, następnie umyć i trypsynizować komórki; zebrać trypsynizowane komórki w roztworze do czterech odpowiednio oznakowanych probówek o pojemności 15 ml.
	<ol>
		<li>Odwirować i umyć komórki trzykrotnie PBS. Ponownie zawiesić osad komórkowy w 5 ml PBS i policzyć komórki.</li>
		<li>Dostosuj objętość tak, aby końcowe stężenie komórek wynosiło 1,0x106 komórek/ml. Przenieść roztwór komórek do oznakowanych probówek o pojemności 5 ml do wstrzykiwań i umieścić na lodzie. Przed wstrzyknięciem delikatnie odwrócić probówki, aby upewnić się, że komórki są dobrze wymieszane.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odłożyć na bok łącznie 24 zarodki kurczaka (w wieku 9 dni) do wstrzyknięcia (po 6 na grupę). Wstrzyknięcie należy wykonać za pomocą szklanej igły przymocowanej do elastycznej rurki połączonej ze strzykawką o pojemności 1 ml. Osoba wykonująca wstrzyknięcie powinna być zaślepiona na grupę leczoną.
	<ol>
		<li>Za pomocą mikroskopu stereoskopowego wstrzyknąć 1,0x105 komórek w objętości 100 μl do krążenia żylnego CAM. Użyj powolnej, pulsacyjnej techniki, aby wstrzyknąć pełną objętość komórek. Delikatnie przetrzyj miejsce wstrzyknięcia miękką chusteczką, aby zatamować przepływ krwi i wchłonąć rozlany płyn. Po każdym wstrzyknięciu należy odpowiednio oznaczyć każdy pojemnik na zarodki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Potwierdź obecność i rozmieszczenie komórek fluorescencyjnych w układzie naczyniowym CAM po wstrzyknięciu, wizualizując je za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. Zwróć uwagę na wszelkie zarodki, w których liczba komórek nowotworowych wydaje się niska lub dystrybucja jest słaba.</li>
	<li>Umieść zarodki kurczaka w komorze wilgotnościowej i przechowuj je w inkubatorze (37 °C, 60% wilgotności). Odczekaj 7-9 dni przed wyliczeniem ognisk przerzutowych.</li>
</ol>
5. Wyliczanie ognisk przerzutów
<ol>
	<li>Podczas 7-9 dniowego okresu inkubacji monitoruj zarodki i wyrzuć martwe. Upewnij się, że komora wilgotnościowa pozostaje wilgotna przez cały czas trwania inkubacji.</li>
	<li>Za pomocą fluorescencyjnego mikroskopu stereoskopowego przy 20-krotnym powiększeniu zeskanuj całą górną powierzchnię zarodka CAM w regularny, przypominający siatkę wzór.</li>
	<li>Policz liczbę ognisk przerzutowych w każdym polu widzenia, a następnie zlicz liczbę, aby uzyskać ostateczną sumę na zarodek. Takie postępowanie w przypadku sześciu zarodków w każdej grupie zapewni średnią liczbę ognisk przerzutów na leczenie.</li>
</ol>

<ol><li>Bouwman, P., Jonkers, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+deregulated+DNA+damage+signalling+on+cancer+chemotherapy+response+and+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">The effects of deregulated DNA damage signalling on cancer chemotherapy response and resistance.</a> Nat Rev Cancer. 12, 587-598 (2012).</li>
<li>Bozic, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+dynamics+of+cancer+in+response+to+targeted+combination+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Evolutionary dynamics of cancer in response to targeted combination therapy.</a> Elife. 2, e00747(2013).</li>
<li>Diaz, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+evolution+of+acquired+resistance+to+targeted+EGFR+blockade+in+colorectal+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The molecular evolution of acquired resistance to targeted EGFR blockade in colorectal cancers.</a> Nature. 486, 537-540 (2012).</li>
<li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hallmarks+of+cancer%3A+the+next+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Hallmarks of cancer: the next generation.</a> Cell. 144, 646-674 (2011).</li>
<li>Rytelewski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+BRCA2+and+Thymidylate+Synthase+Creates+Multidrug+Sensitive+Tumor+Cells+via+the+Induction+of+Combined+%27Complementary+Lethality%27%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">Inhibition of BRCA2 and Thymidylate Synthase Creates Multidrug Sensitive Tumor Cells via the Induction of Combined 'Complementary Lethality'.</a> Mol Ther Nucleic Acids. 2, e78(2013).</li>
<li>Lord, C. J., Ashworth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DNA+damage+response+and+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The DNA damage response and cancer therapy.</a> Nature. 481, 287-294 (2012).</li>
<li>Helleday, T., Petermann, E., Lundin, C., Hodgson, B., Sharma, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+repair+pathways+as+targets+for+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">DNA repair pathways as targets for cancer therapy.</a> Nat Rev Cancer. 8, 193-204 (2008).</li>
<li>Shaheen, M., Allen, C., Nickoloff, J. A., Hromas, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+lethality%3A+exploiting+the+addiction+of+cancer+to+DNA+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Synthetic lethality: exploiting the addiction of cancer to DNA repair.</a> Blood. 117, 6074-6082 (2011).</li>
<li>Green, S., Benedetti, J., Smith, A., Crowley, J. Clinical trials in oncology. 28, CRC press. (2012).</li>
<li>Begley, C. G., Ellis, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+development%3A+Raise+standards+for+preclinical+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Drug development: Raise standards for preclinical cancer research.</a> Nature. 483, 531-533 (2012).</li>
<li>Galluzzi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+definitions+of+cell+death+subroutines%3A+recommendations+of+the+Nomenclature+Committee+on+Cell+Death+2012%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Molecular definitions of cell death subroutines: recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death 2012.</a> Cell Death Differ. 19, 531-533 (2012).</li>
<li>Ruggeri, B. A., Camp, F., Miknyoczki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+disease%3A+pre-clinical+animal+models+of+cancer+and+their+applications+and+utility+in+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Animal models of disease: pre-clinical animal models of cancer and their applications and utility in drug discovery.</a> Biochem Pharmacol. 87, 150-161 (2014).</li>
<li>Kwon, M. C., Berns, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+for+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Oncol%22%5BJournal%5D)">Mouse models for lung cancer.</a> Mol Oncol. 7, 165-177 (2013).</li>
<li>Young, M., Ordonez, L., Clarke, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+are+the+best+routes+to+effectively+model+human+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Oncol%22%5BJournal%5D)">What are the best routes to effectively model human colorectal cancer.</a> Mol Oncol. 7, 178-189 (2013).</li>
<li>Sharma, S. V., Haber, D. A., Settleman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+line-based+platforms+to+evaluate+the+therapeutic+efficacy+of+candidate+anticancer+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Cell line-based platforms to evaluate the therapeutic efficacy of candidate anticancer agents.</a> Nat Rev Cancer. 10, 241-253 (2010).</li>
<li>Garnett, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+identification+of+genomic+markers+of+drug+sensitivity+in+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Systematic identification of genomic markers of drug sensitivity in cancer cells.</a> Nature. 483, 570-575 (2012).</li>
<li>Alborzinia, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+monitoring+of+cisplatin-induced+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Real-time monitoring of cisplatin-induced cell death.</a> PLoS One. 6, e19714(2011).</li>
<li>Cvetkovic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KISS1R+induces+invasiveness+of+estrogen+receptor-negative+human+mammary+epithelial+and+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">KISS1R induces invasiveness of estrogen receptor-negative human mammary epithelial and breast cancer cells.</a> Endocrinology. 154, 1999-2014 (2013).</li>
<li>Leong, H. S., Chambers, A. F., Lewis, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+cancer+cell+migration+and+metastatic+growth+in+vivo+in+the+chick+embryo+using+fluorescence+intravital+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Assessing cancer cell migration and metastatic growth in vivo in the chick embryo using fluorescence intravital imaging.</a> Methods Mol Biol. 872, 1-14 (2012).</li>
<li>Hung, Y. P., Albeck, J. G., Tantama, M., Yellen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+cytosolic+NADH-NAD%28%2B%29+redox+state+with+a+genetically+encoded+fluorescent+biosensor%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Imaging cytosolic NADH-NAD(+) redox state with a genetically encoded fluorescent biosensor.</a> Cell Metab. 14, 545-554 (2011).</li>
<li>Tantama, M., Hung, Y. P., Yellen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+intracellular+pH+in+live+cells+with+a+genetically+encoded+red+fluorescent+protein+sensor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Imaging intracellular pH in live cells with a genetically encoded red fluorescent protein sensor.</a> J Am Chem Soc. 133, 10034-10037 (2011).</li>
<li>Rytelewski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BRCA2+inhibition+enhances+cisplatin-mediated+alterations+in+tumor+cell+proliferation%2C+metabolism%2C+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Onc%22%5BJournal%5D)">BRCA2 inhibition enhances cisplatin-mediated alterations in tumor cell proliferation, metabolism, and metastasis.</a> Mol. Onc. 8 (8), 1429-1440 (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Ze względu na nieodłączne koszty i ryzyko związane z badaniami klinicznymi istnieje potrzeba opracowania lepszej i bardziej rygorystycznej metodologii badań przedklinicznych w celu odpowiedniej oceny nowych schematów leczenia przeciwnowotworowego. Wszystkie obecnie powszechnie stosowane techniki wykazują słabości, które mogą ograniczać ich zdolność do rozróżniania między potencjalnie obiecującymi celami/środkami terapeutycznymi a tymi, które mogą być mniej skuteczne. Opracowaliśmy protokół oceny nowych podejść przeciwnow...

Nabyta oporność na celowane i/lub cytotoksyczne leczenie raka jest poważnym problemem klinicznym, który może prowadzić do niepowodzenia leczenia, nawrotu choroby i zwiększonej śmiertelności pacjentów1. Biorąc pod uwagę wysoki poziom heterogeniczności w większości nowotworów, jest matematyczną pewnością, że guz o wystarczająco dużej liczbie komórek będzie zawierał podzbiór komórek opornych na pojedyncze lub skojarzone terapie ukierunkowane na szlaki molekularne, od których zależy przeżycie tych komórek2,3. Takie komórki nowotworowe mogą być pozytywnie wybrane podczas leczenia, co prowadzi do nawrotu choroby. Opracowanie nowych terapii, które jednocześnie są ukierunkowane na różne mechanizmy przeżycia komórek nowotworowych, zarówno przed, jak i po selekcji za pośrednictwem leczenia, ma zatem znaczenie kliniczne.
Wysoki poziom niestabilności genomu i mutacji w genomach nowotworów jest podstawową cechą, która odróżnia komórki rakowe od komórek gospodarza niebędących nowotworami4. W związku z tym użyteczną strategią zwiększania skuteczności chemioterapii uszkadzającej DNA i zapobiegania rozwojowi oporności jest aktywne hamowanie naprawy DNA w komórkach nowotworowych5. Jest to aktywna dziedzina badań, a w warunkach przedklinicznych badane są różne nowe cele naprawy DNA. Opracowano szereg małocząsteczkowych lub opartych na antysensowności inhibitorów tych celów, które są obecnie testowane6-8. Celem jest zidentyfikowanie najbardziej obiecujących kandydatów przedklinicznych oraz ocena ich bezpieczeństwa i skuteczności w badaniach klinicznych.
Wysokie koszty badań klinicznych i ryzyko niepowodzenia (z różnych powodów, w tym nieoptymalnej oceny przedklinicznej) są ogromnymi przeszkodami dla postępu w rozwoju nowych terapii9. Zastosowanie odpowiednich i rygorystycznych modeli przedklinicznych w celu odpowiedniej oceny nowych celów terapeutycznych i potencjalnych leków może zmniejszyć wysoki odsetek niepowodzeń w badaniach klinicznych10.
Niektóre powszechnie stosowane metody przedkliniczne do oceny skuteczności nowych schematów przeciwnowotworowych to: a) pomiar zdolności do redukcji proliferacji komórek nowotworowych in vitro (testy proliferacji komórek), b) wywołane terapią zmniejszenie zdolności komórek nowotworowych do tworzenia kolonii kultur tkankowych (testy tworzenia kolonii), c) wywołane terapią zmniejszenie aktywności metabolicznej komórek nowotworowych in vitro (konwersja barwnika redoks) , d) indukcja wywołana terapiąŚmierć komórek nowotworowych in vitro (apoptoza, martwica, autofagia, związana z mitozą i innymi)11 oraz e) indukowane terapią in vivo zmniejszenie wzrostu lub ablacja ksenoprzeszczepów ludzkich i mysich12-14. 
Główną słabością wymienionych metod in vitro jest to, że żadna z nich nie zapewnia ciągłej oceny efektów potencjalnych terapii w czasie rzeczywistym. Dostarczają one informacji tylko w wybranych, szeroko oddalonych od siebie punktach czasowych w trakcie leczenia. Takie pomiary mają zmniejszoną zdolność do dokładnego odzwierciedlenia wielkości i czasu odpowiedzi komórek nowotworowych. Modele ksenoprzeszczepów u myszy in vivo są również ograniczone wysokimi kosztami, czasem do zakończenia oraz ryzykiem nieoptymalnego dawkowania i czasu leczenia (harmonogramu). Ponadto istnieją dowody na to, że modele ksenoprzeszczepów gryzoni są ograniczonymi predyktorami skuteczności klinicznej u ludzi, w porównaniu z oceną in vitro odpowiedzi pierwotnych ludzkich komórek nowotworowych i ustalonych linii ludzkich komórek nowotworowych na potencjalne interwencje terapeutyczne15,16. 
Opracowaliśmy nowatorski protokół łączony do oceny nowych kombinacji leków przed klinicznym podejściem, w sposób, który rozwiązuje słabości bardziej powszechnych procedur wymienionych powyżej. Zamiast testów proliferacji, tworzenia kolonii lub konwersji barwnika redoks, wykorzystaliśmy jednostkę pomiaru metabolizmu do analizy adhezji komórek, oddychania i zakwaszenia w czasie rzeczywistym podczas całego okresu leczenia17. Jednocześnie badaliśmy efekty skojarzonego leczenia in vivo, wykorzystując model inwazji i przerzutów błony kosmówkowo-omoczniowej zarodka kurczaka (CAM)18,19. Użyliśmy tych metod do oceny zdolności oligonukleotydu antysensownego (ASO) ukierunkowanego na BRCA2 do wzmocnienia skuteczności powszechnie stosowanego leku chemioterapeutycznego cisplatyny.

<table><tbody><tr><td>Komórki A549</td><td>ATCC</td><td>CCL-185</td><td>http://www.atcc.org/products/all/CCL-185.aspx</td></tr><tr><td>Folia AeraSeal</td><td>Carl Roth GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AMEM</td><td>Bisent Bioproducts</td><td>210-011-QK</td><td></td></tr><tr><td>Antysensowne oligodeoksynukleotydy</td><td>Avecia</td><td></td><td>BRCA2 sekwencja docelowa: 5' - UAAGGAACGUCAAGAGAUAC - 3' (zasady 7241-7259 )</td></tr><tr><td>Axio Zoom V16 Mikroskop</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>http://www.zeiss.ca/microscopy/en_ca/products/stereo-zoom-microscopes/axio-zoom-v16.html</td></tr><tr><td>Bionas Biosensor Chips</td><td>Bionas GmbH i Micronas GmbH</td><td>BIS8001D</td><td></td></tr><tr><td>System Bionas Discovery 2500&nbsp;</td><td>Bionas GmbH</td><td></td><td>http://www.bionas-discovery.com/prodservices/instruments/system2500/</td></tr> <tr><td>Cisplatin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>479306</td><td></td></tr><tr><td>Zapłodnione jaja kurze</td><td>pozyskiwane lokalnie</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca&nbsp;</td><td>Gibco - Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000&nbsp;</td><td>Invitrogen - Technologie Życia&nbsp;</td><td>12566014</td><td>http://www.lifetechnologies.com/ca/en/home/life-science/protein-expression-and-analysis/transfection-selection/lipofectamine-2000.html</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Bioprodukty z żubra</td><td>311-010-CL</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna (0,25%)/EDTA</td><td>Bioprodukty z żubra</td><td>325-043-CL</td><td></td></tr></tbody></table>

ocena skuteczności uczulenia na leki przeciwnowotworowe in vitro i in vivo

Evaluating the Effectiveness of Cancer Drug Sensitization In Vitro and In Vivo

Ze względu na wysoki poziom heterogeniczności i mutacji nieodłącznie związanych z ludzkimi nowotworami, terapie pojedynczym środkiem lub schematy skojarzone, które są ukierunkowane na ten sam szlak, prawdopodobnie zakończą się niepowodzeniem. Należy położyć nacisk na hamowanie szlaków, które są odpowiedzialne za wewnętrzną i/lub adaptacyjną oporność na terapię. Aktywnym obszarem badań jest opracowywanie i testowanie inhibitorów naprawy DNA, które promują działanie i zapobiegają oporności na powszechnie stosowaną chemioterapię i radioterapię. Zastosowaliśmy nowatorski protokół do oceny skuteczności hamowania BRCA2 jako sposobu na uwrażliwienie komórek nowotworowych na cisplatynę, lek uszkadzający DNA. Metabolizm komórek nowotworowych (zakwaszenie i oddychanie) był monitorowany w czasie rzeczywistym przez okres 72 godzin, aby określić skuteczność leczenia minuta po minucie. W połączeniu przeprowadziliśmy ocenę częstości przerzutów za pomocą modelu wynaczynienia i inwazji błony kosmówkowo-omoczniowej zarodka kurczaka (CAM). Protokół ten odnosi się do niektórych słabości powszechnie stosowanych metod in vitro i in vivo do oceny nowych schematów terapii przeciwnowotworowych. Może być stosowany jako dodatek do powszechnie stosowanych metod, takich jak testy proliferacji komórek, testy śmierci komórek i badania ksenoprzeszczepów mysich in vivo, w celu dokładniejszego rozróżnienia potencjalnych celów i czynników oraz wybrania tylko najbardziej obiecujących kandydatów do dalszego rozwoju.

Wyniki i ryciny dostosowane za zgodą z opublikowanej pracy22.
Hamowanie BRCA2 indukuje spadek respiracji w komórkach nowotworowych traktowanych cisplatyną
Ludzkie komórki raka płuca A549 traktowane ASO celującym w BRCA2 oraz cisplatyną wykazały wczesny i nieodwracalny spadek oddychania w porównaniu do komórek, które otrzymały kontrolne ASO i samą cisplatynę; po 24 h traktowania cisplatyną różnica w oddychaniu między komórkami traktowanymi ASO prz...

Tutaj, monitorowanie metabolizmu komórek nowotworowych w czasie rzeczywistym, w połączeniu z modelem przerzutów in vivo błony kosmówkowo-omocznikowej (CAM) zarodka kurczaka, są wykorzystywane do oceny nowych celów/środków przeciwnowotworowych pod kątem ich zdolności do uwrażliwiania komórek nowotworowych na chemoterapeutyki uszkadzające DNA.

Ocena skuteczności uczulenia na leki przeciwnowotworowe in vitro i in vivo

Due to the high level of heterogeneity and mutations inherent in human cancers, single agent therapies, or combination regimens which target the same ...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest ocena skuteczności uczulenia na leki przeciwnowotworowe poprzez pomiar zmian w metabolizmie komórkowym in vitro i częstości przerzutów in vivo. Osiąga się to poprzez najpierw transekcję komórek rakowych in vitro z cząsteczkami antysensownymi, aby powalić cel zainteresowania. Następnie transfekowane komórki są umieszczane na chipach biosensorów i ładowane do systemu pomiaru metabolizmu w celu wyliczenia zmian w zakwaszeniu, oddychaniu i adhezji podczas leczenia farmakologicznego.Oddzielnie transfekowane komórki są traktowane lekiem i wstrzykiwane do krążenia żylnego zarodka kurczaka w celu oceny wpływu na częstość przerzutów. Wyniki wskazują na uwrażliwienie na leki przeciwnowotworowe, co ilustrują zmiany w metabolizmie komórkowym i częstości przerzutów. Technika ta rozszerza rozwój terapii przeciwnowotworowej, ponieważ pozwala na jednoczesną ocenę parametrów, które nie zawsze są brane pod uwagę podczas konwencjonalnych badań przedklinicznych docelowych leków lub związków.Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w nowe cele leków biorące udział w naprawie DNA, może być również stosowana do walidacji celów w innych systemach, takich jak kontrola cyklu komórkowego. Po przecięciu komórek nowotworowych oligonukleotydami antysensownymi, zgodnie z protokołem tekstowym w sterylnym środowisku, użyj 400 mikrolitrów PBS, aby dokładnie umyć sześć chipów biosensora Aby wysterylizować chipy, usuń PBS i dodaj 400 mikrolitrów 70% etanolu inkubuj przez 20 minut przed użyciem PBS do trzykrotnego umycia chipów. Umieść po trzy chipsy w sterylnych naczyniach hodowlanych, oznaczonych jako kontrolne i docelowe zainteresowanie, i oznacz dwie 50-mililitrowe probówki w podobny sposób.Następnie użyj PBS do umycia transfekowanych komórek przed dodaniem odpowiedniej objętości 0,25% trypsyny EDTA, poczekaj, aż monowarstwa się oderwie i przenieś zawiesinę komórek do odpowiedniej probówki. Po policzeniu komórek dostosuj objętość, aby osiągnąć końcowe stężenie 6,0 razy 10 do piątych komórek na mililitr, dodając pożywkę lub zagęszczając komórki. Przygotowując jedną grupę na raz, dodaj 250 mikrolitrów roztworu komórkowego do każdego chipa biosensora.Umieść sterylne naczynia zawierające chipsy w komorze wilgotnościowej, aby zapobiec parowaniu i inkubuj przez noc w celu przeprowadzenia pomiarów metabolizmu zgodnie z opisem eksperymentalnym szczegółowo opisanym w protokole tekstowym oznacz 1450 mililitrowych probówek i dodaj 50 mililitrów wzrostu, pożywkę plus 0,2% FBS i jeden x penicylina i streptomycyna. Albo PS. Umieść sześć probówek w jednym systemie pomiaru metabolizmu, sześć probówek w drugim, a pozostałą probówkę w trzecim stojaku na probówki, który również zawiera probówki z cisplatyną. Użyj membrany przepuszczającej powietrze, aby uszczelnić pierwsze dwa stojaki, aby zapobiec parowaniu.Następnie należy przygotować odpowiednią objętość sześciu mikromolowych cisplatyn w pożywce z 0,2% FBS i jednym XPS. Dozuj wymaganą objętość pożywki do czterech oznaczonych 50-mililitrowych probówek i umieść je z powrotem w czterech szczelinach trzeciego stojaka na probówki do pomiaru metabolizmu. Użyj membrany przepuszczającej powietrze, aby uszczelnić rurki.Oznacz sześć 50-mililitrowych probówek i dodaj 20 mililitrów do każdej z 0,1% roztworu Triton X W podłożu roztwór Triton X będzie leżał na pozostałych komórkach i zapewni wartość zerową dla każdego chipa. Umieść probówki w czwartym stojaku na probówki i zamknij je. Następnie załaduj chipy do modułów bio.Załaduj dwie baraki do uchwytu na dwa strąki, a następnie rozpocznij eksperyment. Po przygotowaniu zarodków kurcząt, zgodnie z zapisem w protokole tekstowym, w drugim dniu transfekcji komórek, należy podzielić grupę kontrolną i docelową grupę interesu na dwie kolby na nośnik i dwie na cisplatynę. Odessać pożywkę i użyć trzech mililitrów świeżej, pożywki lub pożywki z sześcioma mikromolowymi cisplatynami w celu uzupełnienia.Kolby inkubuje się przez sześć godzin. Po inkubacji odessać pożywkę, a następnie umyć i spróbować anyżować komórki, przenieść zawiesinę komórek do czterech odpowiednio oznakowanych 15-mililitrowych probówek przed odwirowaniem i użyciem PBS do trzykrotnego przemycia Resus ponownie zawiesić komórki. A następnie po zliczeniu użyj PBS do rozcieńczenia lub odwirowania, aby skoncentrować komórki do końcowego stężenia 1,0 razy 10 do szóstych komórek na mililitr.Przenieść zawiesinę komórek do pięciu mililitrowych probówek oznaczonych do wstrzykiwań i umieścić na lodzie. Następnie odłóż na bok 24 9-dniowe zarodki kurze do wstrzyknięcia pod mikroskopem stereoskopowym i za pomocą szklanej igły przymocowanej do elastycznej rurki podłączonej do jednomililitrowej strzykawki powolnym ruchem pulsacyjnym. Wstrzyknąć 1,0 razy 10 do piątej komórki w objętości 100 mikrolitrów do krążenia żylnego błony choal toic lub krzywki za pomocą miękkiej chusteczki.Delikatnie przetrzeć miejsce wstrzyknięcia, aby zatamować upływ krwi i wchłonąć rozlany płyn. Po każdym wstrzyknięciu należy odpowiednio oznaczyć każdy pojemnik na zarodki pod mikroskopem fluorescencyjnym. Potwierdź obecność i rozmieszczenie komórek fluorescencyjnych w układzie naczyniowym krzywki.Zwróć uwagę na wszelkie zarodki, w których liczba komórek nowotworowych wydaje się niska lub dystrybucja jest słaba. Na koniec umieść zarodki kurczaka w komorze wilgotnościowej i inkubuj przez siedem do dziewięciu dni przed wyliczeniem ognisk przerzutowych, jak opisano w protokole tekstowym, jak pokazano tutaj, po 24 godzinach u ludzi, 5 49 komórek raka płuc leczonych BRCA dwa ukierunkowanych na SO i cisplatynę wykazało wczesne i nieodwracalne zmniejszenie oddychania w porównaniu z komórkami, które otrzymały kontrolę SO i samą cisplatynę. Spadek o 39% w porównaniu z komórkami kontrolnymi rozpoczął się około 10 godzin przed wykrywalnym spadkiem adhezji komórek, co sugeruje, że wystąpił on niezależnie od zmian w liczbie komórek i że może to być zdarzenie formujące, które poprzedza śmierć komórki, jak wykazano tutaj.Podczas 72-godzinnego eksperymentu nie zaobserwowano różnicy w zakwaszeniu, co sugeruje, że leczenie BRCA, 2, SO, i cisplatyną miało niewielki lub żaden wpływ na metabolizm glukozy. W tym eksperymencie ludzkie komórki raka płuc A 5 49 leczono kontrolą SO lub BRCA dwa A SO w obecności lub bez cisplatyny i wstrzyknięto do krążenia żylnego cam. Dziewięć dni później komórki leczone BRCA dwa A SO i cisplatyną wykazywały o 77% niższą częstość ognisk przerzutowych w porównaniu z komórkami leczonymi kontrolą A SO i cisplatyną lub BRCA dwa A SSO samodzielnie, co sugeruje, że leczenie BRCA dwa A SO i cisplatyną może potencjalnie zmniejszać lub zapobiegać obciążeniu przerzutami u pacjentów z guzami litymi.Zgodnie z tą procedurą można zastosować bardziej tradycyjne metody, takie jak proliferacja komórek, testy i badania ksenoprzeszczepów in vivo, w celu dalszego zbadania wpływu określonego celu na zwiększenie wrażliwości leku.

evaluating-effectiveness-cancer-drug-sensitization-vitro

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Ocena skuteczności wrażliwości na leki przeciwnowotworowe in vitro i in vivo

Oporność na leki celowane jest powszechna, a potrzeba identyfikacji mechanizmów oporności - przed lub po rozpoczęciu badań klinicznych - jest kluczowa dla kierowania alternatywnymi strategiami leczenia klinicznego. W tym miejscu przedstawiamy protokół parowania wyprowadzenia linii lekoopornych in vitro z sekwencjonowaniem, aby przyspieszyć odkrycie tych mechanizmów.

Implementacja testów oporności na leki in vitro: maksymalizacja potencjału w zakresie odkrywania klinicznie istotnych mechanizmów oporności

Opisujemy wysokoprzepustowy test wrażliwości na leki dla pierwotnych komórek szpiczaka mnogiego. Polega ona na rekonstrukcji mikrośrodowiska szpiku kostnego (w tym macierzy zewnątrzkomórkowej i zrębu) na płytkach wielodołkowych oraz nieinwazyjnej metodzie podłużnego oznaczania żywotności komórek.

Organotypowy wysokoprzepustowy system do charakteryzowania wrażliwości pierwotnych komórek szpiczaka mnogiego na leki

Obecny raport podsumowuje protokół, który może być wykorzystany do modelowania wpływu niszy mikrośrodowiska szpiku kostnego na komórki białaczkowe, kładąc nacisk na wzbogacenie najbardziej chemoodpornej subpopulacji.

Modelowanie białaczki opornej na chemioterapię in vitro

Celem tego protokołu jest ocena specyficzności leków przeciwnowotworowych in vitro przy użyciu mieszanych kultur zawierających zarówno komórki nowotworowe, jak i nienowotworowe.

Ocena swoistości leków przeciwnowotworowych in vitro

Prezentujemy trójwymiarowy (3D) model raka płuc oparty na biologicznym rusztowaniu kolagenowym do badania wrażliwości na terapie ukierunkowane na niedrobnokomórkowego raka płuc (NSCLC). Pokazujemy różne techniki odczytu w celu określenia wskaźnika proliferacji, apoptozy i stanu przejścia nabłonkowo-mezenchymalnego (EMT). Zebrane dane są integrowane z modelem in silico w celu przewidywania wrażliwości leków.

Połączony model tkankowy 3D guza płuca wykonany in vitro/in silico do przewidywania skuteczności leków w określonych tłach mutacyjnych

Opisano metodę in vitro do ustalania podwójnej odporności na EGFR-TKI i MET-TKI w komórkach nowotworowych. Metoda ta jest przydatna do opracowywania metod leczenia pacjentów z mutacjami EGFR, u których występuje progresja choroby pomimo leczenia EGFR-TKI amplifikacją MET. Może być również modyfikowany pod kątem inhibitorów ukierunkowanych na inne cząsteczki.

Ustalanie podwójnej oporności na EGFR-TKI i MET-TKI w komórkach gruczolakoraka płuc in vitro z 2-etapową procedurą eskalacji dawki

Ten protokół opisuje, jak ocenić synergizm między przeciwciałem przeciwnowotworowym a lekami przeciwnowotworowymi w modelach przedklinicznych za pomocą równania indeksu kombinacji Chou i Talalay.

Zwiększenie skuteczności przeciwciał przeciwnowotworowych przez leki przeciwnowotworowe: wykrywanie synergizmu przeciwciało-lek za pomocą równania indeksu kombinacji

Tutaj opisujemy metodę wspólnej hodowli in vitro do rekurencyjnego wyzwania limfocytów T ukierunkowanych na nowotwór, co pozwala na fenotypową i funkcjonalną analizę aktywności przeciwnowotworowych limfocytów T.

Ponowne badanie komórek nowotworowych in vitro w celu predykcyjnej oceny funkcji przeciwnowotworowej komórek T receptora antygenu chimerycznego

Ten manuskrypt opisuje, jak ocenić in vivo immunogenność pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z komórek nowotworowych (EVs) za pomocą cytometrii przepływowej. EV pochodzące z nowotworów poddawanych immunogennej śmierci komórek indukowanej leczeniem wydają się szczególnie istotne w nadzorze immunologicznym nad nowotworami. Protokół ten stanowi przykład oceny EV guza immunostymulującego indukowanego oksaliplatyną, ale można go dostosować do różnych ustawień.

In vivo (in vivo) Badania przesiewowe immunogenności pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z guza za pomocą cytometrii przepływowej limfocytów T śledziony

Ten protokół opisuje standaryzowaną ocenę wrażliwości leków na ukierunkowane inhibitory sygnalizacji w modelach organoidowych pochodzących od pacjentów z NSCLC.

Profilowanie wrażliwości na terapie celowane w organoidach pochodzących od pacjentów z niedrobnokomórkowym rakiem płuca z mutacją EGFR

Ten protokół przedstawia zestaw eksperymentów przyjętych do oceny fotoprzełączalnych peptydów przeciwnowotworowych, które mogą być użyte w przedklinicznych badaniach przesiewowych takich związków. Obejmuje to ocenę cytotoksyczności w hodowlach komórkowych 2D i 3D, ocenę skuteczności fotoizomeryzacji ex vivo (tkanki modelowej) oraz skuteczności in vivo.

Ocena in vitro i in vivo fotokontrolowanych związków biologicznie czynnych - potencjalni kandydaci na leki w fotofarmakologii nowotworów

Odkryj metodę oceny uczulenia na leki przeciwnowotworowe poprzez pomiar metabolizmu komórek in vitro i częstości przerzutów in vivo na modelu zarodka kurzego. Technika ta umożliwia kompleksową ocenę celów lekowych.

Ocena skuteczności uczulenia na leki przeciwnowotworowe in vitro i in vivo

Przeglądaj więcej filmów