Model szczura kaniulowanego kaniulowanego w krezkowym przewodzie chłonnym: zastosowanie do oceny transportu leków limfatycznych w jelitach

Ogólnym celem niniejszej procedury jest ocena szybkości i stopnia transportu lipidów oraz leków do limfatycznego układu jelitowego po podaniu dojelitowym. Jest to realizowane poprzez wstępną izolację i kaniulację przewodu limfatycznego krezki w celu poboru limfy. W drugim kroku kaniulowane jest dwunastnicze, aby umożliwić infuzję do jelita, a następnie kaniulowana jest tętnica szyjna w celu umożliwienia pobierania próbek krwi.

W ostatnim kroku substancja badawcza jest podawana do dwunastnicy, a następnie pobierane są próbki limfy i krwi w celu ilościowego oznaczenia systemowego poziomu lipidów lub leku. Ostatecznie model ten może być wykorzystany do oceny całkowitego wchłaniania oraz jelitowego transportu limfatycznego lipidów i leków po podaniu do jelit. Główną zaletą tej techniki jest możliwość bezpośredniego kaniulowania przewodu limfatycznego krezkowego i pobierania limfy przez cały okres eksperymentu.

Umożliwia to oszacowanie całkowitej masy materiału, który wpływa do chłonki krezkowej i przez nią przepływa. Model ten pozwala na ocenę in vivo transportu leków oraz lipidów. Może być on również wykorzystany do pomiaru transportu limfatycznego w jelitach dowolnego interesującego czynnika, a także do badania zmian w transporcie limfatycznym tych czynników w odpowiedzi na różne bodźce lub stany chorobowe.

Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa, ponieważ kaniulacja przewodu chłonnego krezkowego jest skomplikowana i trudna ze względu na to, że przewód jest mały, kruchy i znajduje się u zwierząt na czczo. Procedurę zaprezentują moja koleżanka i członkini kadry naukowej Uniwersytetu Monash, dr Natalie Cus, oraz starszy postdoc w grupie, dr LJ Hugh. Dzień przed operacją przytnąć kaniule do odpowiedniej długości i za pomocą sterylnego skalpela wykonać skośne cięcie na końcówce każdego odcinka rurki. Następnie, aby przygotować kaniulę wewnątrzdwunastniczą, zagiąć kaniulę w pętlę, a następnie podgrzać rurkę, aby stworzyć punkt zakotwiczenia.

W dniu zabiegu zgolić sierść z prawej strony brzucha i szyi oraz z lewego obszaru obojczyka u zanestetyzowanego dorosłego szczura, a następnie aseptycznie oczyścić obszary operacyjne, wykonując trzy kolejne przemycia roztworem powidonu jodowego i 70% ethanol, aby przeprowadzić kaniulację przewodu limfatycznego. Umieścić zwierzę prawym bokiem do góry i za pomocą sterylnego ostrza skalpela otworzyć górną warstwę ściany mięśniowej brzucha, wykonując proste czterocentymetrowe nacięcie od wyrostka miecza do prawej flanki, około dwóch centymetrów poniżej łuku żebrowego. Odsunąć jelito cienkie pod lewą ścianę brzucha i użyć dwóch do trzech kawałków sterylnej gazy nasyconej solą fizjologiczną, aby utrzymać je w tej pozycji.

Następnie ustabilizuj szczura, opierając go na plastikowej strzykawce o pojemności 10 mililitrów, umieszczonej poziomo pod grzbietem zwierzęcia na wysokości prawej nerki. Aby ułatwić wizualizację przewodu chłonnego krezkowego, zlokalizuj górny przewód chłonny krezkowy, który ma średnicę około 0,5 do 1 milimetra, przebiega prostopadle do prawej nerki oraz znajduje się bezpośrednio rostralnie i równolegle do ciemnoczerwonej, pulsującej tętnicy krezkowej. Należy zauważyć, że u szczurów nienaćmiących, jak pokazano tutaj, górny przewód chłonny krezkowy jest biały, nieprzezroczysty i łatwiejszy do wizualizacji niż u szczurów zainfekowanych.

Następnie należy przeprowadzić parę prostych pęset przez tkankę tłuszczową krocza przy dolnym brzegu prawej nerki, równolegle do górnego przewodu limfatycznego krezki, oraz przez warstwy tkanki łącznej bezpośrednio poniżej żyły głównej dolnej. Następnie, używając końcówki pęsety, należy przeciągnąć kaniulę limfatyczną przez tkankę tłuszczową krocza tak, aby jeden jej koniec znajdował się bezpośrednio obok przewodu limfatycznego krezki, a drugi był wyprowadzony na zewnątrz organizmu zwierzęcia na poziomie prawej nerki. Następnie, przy użyciu mikroskopu chirurgicznego i pęsety jubilerskiej, należy wyizolować przewód limfatyczny krezki z nakładających się warstw tkanki łącznej i tłuszczowej poprzez rozwarstwianie tępe, rozpoczynając od dolnego końca i dbając o to, aby nie uszkodzić przewodu limfatycznego po jego wyizolowaniu.

Za pomocą końcówki pęsety precyzyjnej wykonaj niewielki otwór w przewodzie limfatycznym. Po upewnieniu się, że kaniula limfatyczna jest całkowicie wypełniona roztworem przeciwkrzepliwym i nie zawiera pęcherzyków powietrza, użyj małej pęsety, aby wprowadzić kaniulę limfatyczną przez miejsce nakłucia na głębokość około dwóch do czterech milimetrów do wnętrza przewodu limfatycznego krezki. Jeśli kaniulacja przebiegła pomyślnie, z wolnego końca zbierającego kaniuli będzie obserwowany stopniowy wypływ limfy jelitowej.

W takim przypadku nanieś małą kroplę kleju cyjanoakrylanowego nad otworem wejściowym do przewodu chłonnego, aby zabezpieczyć kaniulę, uważając, by nie zatkać naczynia nadmiarem kleju. W celu kaniulacji dwunastnicy najpierw zlokalizuj tkankę, identyfikując ją jako intensywnie różowy odcinek jelita cienkiego, który po delikatnym pociągnięciu w dół odsłania żołądek. Następnie za pomocą sterylnej igły 23G wykonaj małą dziurkę w dwunastnicy w okolicy odźwiernika, około dwóch centymetrów poniżej połączenia żołądka z dwunastnicą.

Następnie wprowadź zakrzywiony koniec kaniuli dwunastniczej przez miejsce nakłucia i unieruchom kaniulę za pomocą kropli kleju akrylowego Sano. Następnie za pomocą szwów zamknij nacięcie ściany mięśni brzucha. Kaniulację tętnicy szyjnej można przeprowadzić przed lub po kaniulacji przewodu limfatycznego krezkowego. Zazwyczaj preferujemy kaniulację tętnicy szyjnej przed kaniulacją przewodu limfatycznego, aby zmniejszyć ryzyko przemieszczenia kaniuli limfatycznej podczas przemieszczania zwierzęcia. Aby przeprowadzić kaniulację tętnicy szyjnej, najpierw zaznacz kaniulę tętnicy szyjnej 2,5 centymetrów od ściętego końca, aby zidentyfikować odcinek rurki, który należy wprowadzić do tętnicy.

Następnie podłącz nieostry koniec kaniuli do igły o rozmiarze 25 G przymocowanej do strzykawki wypełnionej roztworem przeciwzakrzepowym i wypełnij kaniulę tym roztworem, upewniając się, że nie pozostały w niej pęcherzyki powietrza. Następnie wykonaj nacięcie podłużne o długości od 1 do 1,5 cm przez warstwę skóry nad lewą stroną tchawicy w płaszczyźnie strzałkowej, a następnie za pomocą pęsety tępej rozdziel tkankę łączną podskórną i odsłoń znajdujące się pod nią parzyste mięśnie szyi. Odsunąć mięśnie szyi, aby odsłonić pulsującą lewą tętnicę szyjną wspólną, znajdującą się około 1 cm poniżej powierzchni skóry.

Następnie oczyść tętnicę z przylegającej tkanki łącznej za pomocą rozdzielania tępego i użyj tępych pęsety tkankowej, aby wyizolować odcinek tętnicy o długości około jednego centymetra. Następnie za pomocą pęsety z cienkimi końcówkami przełóż dwa szwy jedwabne pod tętnicą szyjną, umieszczając je na obu końcach wyizolowanego odcinka tętnicy. Następnie zawiąż szew znajdujący się najdalej od serca i obojczyka szczura, a pod tętnicą szyjną umieść parę prostych pęset z cienkimi końcówkami, aby zablokować przepływ krwi przez tętnicę.

Teraz, używając precyzyjnych nożyczek tęczówkowych, wykonaj małe nacięcie na górnej powierzchni tętnicy, w odległości około jednej trzeciej od górnej krawędzi wyizolowanego obszaru. Wprowadź końcówkę kaniuli do tętnicy za pomocą pęsety zakrzywionej. Po wprowadzeniu usuń prostą pęsetę precyzyjną, aby zablokować przepływ krwi, a następnie przesuń kaniulę o 2.5 centymetrów do wnętrza tętnicy, używając dwóch par pęset.

Jedna osoba przytrzymuje kaniulę wewnątrz tętnicy, aby zapobiec cofaniu się krwi, a druga wprowadza kaniulę. Następnie należy użyć małego zacisku tętniczego, aby utrzymać kaniulę wewnątrz tętnicy. Do kaniuli wstrzykuje się roztwór przeciwzakrzepowy, a następnie odsysa niewielką ilość krwi, aby potwierdzić drożność cewki.

Następnie przepłucz kaniulę roztworem przeciwzakrzepowym i zapieczętuj jej koniec za pomocą płomienia zapalniczki. Na koniec użyj szwów, aby przymocować kaniulę na miejscu, i zdejmij zacisk tętniczy. Następnie załóż trzeci szew wokół tętnicy i kaniuli, skróć długość szwów wokół tętnicy i po okresie rekonwalescencji zamknij ranę szyi kolejnymi szwami, a następnie wprowadź interesującą formulację do organizmu zwierzęcia za pomocą kaniuli dwunastniczej.

Jak pokazano na wykresie, po podaniu lipofilnego leku modelowego, halal fanene, średni przepływ limfy u szczurów, u których kaniulacja przebiegła pomyślnie, wynosił od 0,4 do 1,3 ml/h. U niektórych zwierząt szybkość przepływu limfy była nieco niższa w ciągu pierwszych jednej do trzech godzin po kaniulacji, a następnie wzrosła, co jest zjawiskiem często obserwowanym po udanej kaniulacji limfatycznej. Natomiast u szczurów, u których kaniulacja była nieudana, szybkość przepływu pozostawała znacznie niższa niż w udanych eksperymentach przez cały okres pobierania próbek.

Podobnie, w tych reprezentatywnych eksperymentach skumulowany transport limfatyczny triglicerydów i halalan RIN był znacznie niższy u zwierząt, u których kaniulacja nie powiodła się. Natomiast w grupach z udaną kaniulacją średni skumulowany transport halalan wyniósł 15,1% dawki, a skumulowany transport triglicerydów wyniósł 61 milligrams w ciągu 10 hours. W tym reprezentatywnym eksperymencie transportu lipidów proporcja podanej znakowanej radioaktywnie egzogennej dawki lipidów przetransportowanej w limfie wyniosła 54% Wartości te nie różniły się znacząco od tych zaobserwowanych wcześniej.

W przypadku podobnej formulacji szybkość transportu zarówno triglicerydów, jak i leków do limfy osiąga szczyt kilka godzin po podaniu lipidów i leku, a następnie powraca do poziomów bazowych. Jest to typowe dla eksperymentów dotyczących jelitowego transportu lipidów i leków do limfy. Szybkość transportu leku w limfie w każdym przedziale czasowym odzwierciedla sytuację w przypadku transportu triglicerydów, ponieważ lek jest transportowany do limfy.

W związku z lipoproteinami bogatymi w trójglicerydy, po opanowaniu techniki, kanulacja może zostać przeprowadzona w ciągu 30 minut, jeśli nie wystąpią żadne trudności. Po wykonaniu tej procedury składniki zawarte w pobranej limfie mogą zostać wyizolowane i wykorzystane w dodatkowych eksperymentach, na przykład poprzez reinfuzję zwierzętom biorczym w celu bezpośredniej oceny ich funkcji, metabolizmu, klirensu lub wzorców dystrybucji. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat technik izolacji i kanulacji przewodu chłonnego krezkowego, tętnicy szyjnej oraz dwunastnicy.

Stosując te techniki, powinni Państwo być w stanie ocenić transport zarówno leków, lipidów, jak i innych czynników z jelita do i przez chłonkę krezkową w modelu Viva.