Name: Wytwarzanie limfocytów CAR T do terapii adoptywnej w kontekście standardu opieki nad glejakiem (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 55 s
Description: Poznaj metodę wytwarzania limfocytów CAR T skierowanych przeciwko EGFRvIII w glejakach. Technika obejmuje radioterapię całego mózgu, temozolomid i transfekcję retrowirusową mysich limfocytów T.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować dr Laurze Johnson i dr Richardowi Morganowi za dostarczenie retrowirusowego konstruktu CAR. Autorzy dziękują również Giao Ngyuen za jej pomoc w dozymetrii napromieniania całego mózgu. Praca ta była wspierana przez grant NIH NCI 1R01CA177476-01.

Ten protokół opiera się na eksperymentalnym projekcie, w którym 10 myszy jest leczonych po 10 7 limfocytów CAR T każda. Oznacza to, że potrzebnych będzie 108 limfocytów CAR T; Wydajność należy przeszacować o 5 x 107-1 x 108, aby uwzględnić utratę rentowności. Następujący protokół jest skalowany w celu wygenerowania około 200 x 106 komórek. Komórki są następnie podawane dożylnie samicom myszy C57BL / 6 z 9-dniowymi syngenicznymi guzami wewnątrzczaszkowymi EGFRvIII-dodatnimi, rozwiniętymi z istniejących linii komórkowych gwiaździaka KR158B lub czerniaka B16. Równocześnie z wytwarzaniem limfocytów CAR T, myszom z nowotworem podaje się klinicznie istotne dawki limfodepletywnego TMZ (60 mg / kg) i WBI (16,5 Gy).
Myszy były utrzymywane i hodowane w warunkach wolnych od patogenów w Duke University Medical Center (DUMC). Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez Duke University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). 
1. Podawanie temozolomidu myszom z nowotworem
Dni od 0 do 4:
<ol>
	<li>Obliczyć całkowitą liczbę myszy do wstrzyknięcia i pomnożyć ją przez 0,5, aby określić potrzebną objętość roztworu TMZ (np. 30 myszy x 0,5 ml = 15 ml TMZ) i dodać 1,5 ml do tej objętości, aby uwzględnić rozlanie się (16,5 ml TMZ).</li>
	<li>Pomnóż tę całkowitą objętość przez 3 mg/ml, aby określić potrzebną masę liofilizowanego TMZ (np. 16,5 x 3 = 49,5 mg TMZ). Odważyć to na 50 ml stożkowy. 
	UWAGA: TMZ jest toksyczny przez wdychanie, spożycie i kontakt z oczami, skórą i błonami śluzowymi. Skonsultuj się z działem bezpieczeństwa pracy i/lub zdrowia środowiskowego instytucji w celu uzyskania zaleceń dotyczących zmniejszenia ryzyka narażenia. </li>
	<li>Pomnóż całkowitą objętość przez 0,15, aby określić potrzebną objętość dimetylosulfotlenku (DMSO) (np. 16,5 x 0,15 = 2,475 ml DMSO). Filtruj wysterylizuj tę objętość DMSO (plus dodatkowe 2 ml w celu uwzględnienia rozlania) przez filtr 0,2 μm do sterylnej probówki. Dodaj 2,475 ml sterylnego DMSO do proszku TMZ.</li>
	<li>Umieścić roztwór TMZ/DMSO w zlewce z wodą nad płytą grzejną o temperaturze 65 °C na 10-15 minut. Gdy TMZ zostanie całkowicie rozpuszczony, roztwór powinien stać się bladożółty; jeśli roztwór stanie się różowy, oznacza to, że TMZ ulega degradacji i należy przygotować nowy roztwór ze świeżą partią TMZ.</li>
	<li>Obliczyć odpowiednią objętość sterylnego roztworu soli fizjologicznej, mnożąc 0,85 przez całkowitą objętość (0,85 x 16,5 ml = 14,025 ml soli fizjologicznej). Dodać 15 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej do stożkowego naczynia o pojemności 50 ml. Podczas gdy TMZ rozpuszcza się w DMSO, podgrzej sól fizjologiczną do 65 °C.</li>
	<li>Odwiruj roztwór TMZ/DMSO, aby upewnić się, że proszek TMZ jest całkowicie rozpuszczony i powoli dodaj podgrzaną sól fizjologiczną do roztworu TMZ/DMSO.</li>
	<li>Natychmiast po przygotowaniu należy w pełni załadować 15 strzykawek tuberkulinowych po 1 ml roztworem TMZ do podania 4-dniowym myszom z guzem.</li>
	<li>Powtórz tę procedurę w dniach od 1 do 4, co daje w sumie pięć podań TMZ.</li>
</ol>
2. Napromienianie całego mózgu myszy z nowotworem
Dni od 2 do 4:
<ol>
	<li>Włącz promiennik rentgenowski i pozwól mu rozgrzać się do pełnego napięcia. Upewnij się, że odpowiedni filtr jest na swoim miejscu i wprowadź odpowiednie ustawienia napięcia i prądu (Rysunek 2A). 
	UWAGA: Dozymetria naświetlacza powinna być ustalona wcześniej, aby określić odpowiednią objętośćtage ustawienia i układ sieci (Rysunek 2A,B).</li>
	<li>Oblicz czas potrzebny do uzyskania napromieniowania rentgenowskiego o wartości 5,5 Gy. Na przykład, jeśli promieniowanie rentgenowskie jest dostarczane z prędkością 2 Gy/min, to 2,75 minuty jest konieczne, aby dostarczyć łącznie 5,5 Gy. Wprowadź odpowiedni czas trwania. 
	UWAGA: Tabela 2 zawiera dawki WBI u myszy i ich kliniczne odpowiedniki u ludzi. W kontekście glejaków o wysokim stopniu złośliwości, 60 Gy frakcjonowany WBI (2 frakcje Gy, 5 dni w tygodniu przez 6 tygodni) jest klinicznym standardem opieki, a mysim odpowiednikiem zastosowanym tutaj jest 16,5 Gy (5,5 Gy x 3).</li>
	<li>Przygotować świeży roztwór ketaminy/ksylazyny do znieczulenia ogólnoustrojowego, dodając 2 ml ketaminy i 1 ml ksylazyny do 17 ml soli fizjologicznej, tak aby końcowy roztwór wynosił 10 mg/ml ketaminy i 1 mg/ml ksylazyny. </li>
	<li>Zważyć myszy i podać dootrzewnowo 10 μl ketaminy/ksylazyny na gram masy ciała, tak aby zwierzęta otrzymały dawkę ketaminy w dawce 100 mg/kg i 10 mg/kg ksylazyny. Myszy powinny być w pełni uspokojone i widocznie oddychać w ciągu 2 minut od podania ketaminy/ksylazyny.</li>
	<li>Aby utrzymać nawilżenie okulistyczne u zwierząt w stanie uspokojenia, delikatnie wetrzyj niewielką ilość maści ze sztucznymi łzami w każde oko.</li>
	<li>Umieść uspokojone myszy na siatce w taki sposób, aby głowy były umieszczone w obszarze, który otrzymuje największą intensywność promieniowania rentgenowskiego (ryc. 2B,C). Osłoń ciała od szyi w dół za pomocą ołowianych rurek o odpowiedniej wielkości, aby zablokować ogólnoustrojowe dostarczanie promieniowania rentgenowskiego (rysunek 2D).</li>
	<li>Umieść myszy ustawione pod wiązką promieniowania rentgenowskiego tak, aby laser oznaczający ognisko wiązki promieniowania rentgenowskiego znajdował się na współrzędnej (0,0) na układzie siatki. Rozpocznij dostarczanie promieni rentgenowskich.</li>
	<li>Po zakończeniu prześwietlania wyjmij zwierzęta z promiennika i umieść je na ciepłej poduszce grzewczej. Nie należy trzymać zwierząt w stanie uspokojonym ze zwierzętami przytomnymi, dopóki zwierzęta nie odzyskają wystarczającej przytomności, aby utrzymać pozycję leżącą mostka. Gdy zwierzęta będą w stanie utrzymać pozycję leżącą mostka, umieść przytomne zwierzęta z powrotem w odpowiednich klatkach.</li>
	<li>Powtórz tę procedurę w 3 i 4 dniu, aby uzyskać w sumie trzy frakcjonowane dawki promieniowania.</li>
</ol>
3. Transfekcja
Dzień -1:
<ol>
	<li>Przygotować pożywkę D10, dodając 50 ml płodowej surowicy bydlęcej (FBS) do 500 ml zmodyfikowanego podłoża Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM).</li>
	<li>Przygotuj pożywkę z limfocytów T (TCM), dodając 5,5 ml L-glutaminy, 5,5 ml pirogronianu sodu, 5,5 ml aminokwasów endogennych i 5,5 ml ołówka/streptomycyny (pióro/paciorkowca) do 500 ml pożywki RPMI-1640. Następnie dodać 550 μl 2-merkaptoetanolu i 550 μl gentamycyny. Na koniec dodaj 50 ml FBS.</li>
	<li>Pobrać HEK293T komórek z hodowli in vitro i doprowadzić do stężenia 7,5 x 106 komórek/ml w pożywce D10.</li>
	<li>Umieścić na płytce 10 ml pożywki D10 i dodać 1 ml zawiesiny HEK293T komórek do każdej z płytek pokrytych poli-D-lizyną (PDL) o wymiarach 16 x 10 cm.</li>
	<li>Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .</li>
</ol>
Dzień 0:
<ol start="6">
	<li>Zastąp pożywkę 10 ml świeżego D10 co najmniej 30 minut przed transfekcją komórek.</li>
	<li>Określ ilość plazmidu wektorowego, wektora pCL-Eco i odczynnika do transfekcji liposomalnej wymaganej do transfekcji, mnożąc całkowitą liczbę płytek + 1 (16 + 1 = 17) przez 14,1 μg plazmidu wektorowego (14,1 x 17 = 239,7 μg), 9,9 μg wektora pCL-Eco (9,9 x 17 = 168,3 μg) i 60 μl odczynnika do transfekcji liposomalnej (60 x 17 = 1,020 μl). Wszystkie odczynniki powinny mieć temperaturę pokojową przed przygotowaniem roztworów.</li>
	<li>Oznacz dwie probówki A i B. W probówce A dodać 239,7 μg plazmidu wektorowego i 168,3 μg wektora pCL-Eco do (1,5 x 17) ml pożywki orła modyfikowanej surowicą o obniżonej surowicy (RS-MEM). W probówce B dodać 1020 μl odczynnika do transfekcji liposomalnej do (1,5 x 17) ml RS-MEM.</li>
	<li>Inkubować A i B oddzielnie przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Delikatnie wymieszaj A i B razem (wiruj przez 1-2 sekundy lub kilkakrotnie odwróć) i inkubuj przez 20 minut w temperaturze pokojowej, aby utworzyć kompleks lipidowo-DNA.</li>
	<li>Dodaj kroplami kompleks lipidowo-DNA, aby HEK293T komórki w naczyniu o średnicy 10 cm.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze 37 °C przez 6-8 godzin lub przez noc (nie dłużej niż 24 godziny).</li>
	<li>Po 6-8 godzinnej inkubacji zastąp pożywkę 12 ml świeżego TCM do produkcji wirusa. To posiane podłoże zostanie użyte w dniu 2 jako supernatant wirusowy do transdukcji limfocytów T.</li>
</ol>
4. Splenektomia i przygotowanie limfocytów T
Dzień 0:
<ol>
	<li>Wlej 10 ml TCM do stożkowego pojemnika o pojemności 50 ml i umieść na lodzie w celu pobrania śledziony.</li>
	<li>Uśmierc odpowiednią liczbę zwierząt przez uduszenie CO2 i wtórne ścięcie: Umieść zwierzęta w klatce otrzymującej CO2 z natężeniem przepływu 10-30% objętości klatki na minutę, zgodnie z wytycznymi Amerykańskiego Stowarzyszenia Lekarzy Weterynaryjnych (nie więcej niż 5 zwierząt może być uśmierconych jednocześnie) do zakończenia oddychania i przez dwie minuty po nim. Usuń zwierzęta z komory CO2 i odetnij głowę. 
	UWAGA: Jedna śledziona 6-12 tygodniowej samicy myszy C57BL/6 da około 4,5-5 x 107 splenocytów. Tutaj zostaną pobrane 4 śledziony na około 200 x 106 komórek.</li>
	<li>Połóż mysz tak, aby jej prawa strona była skierowana do góry i spryskaj 70% etanolem. Za pomocą kleszczy chwyć cienki fałd skóry poniżej lewej klatki piersiowej i wytnij lekkie nacięcie nożyczkami. Oderwij skórę, ostrożnie chwyć cienki fałd otrzewnej kleszczami i wytnij mały ubytek.</li>
	<li>Śledziona jest małym, wydłużonym, ciemnoczerwonym narządem, który przypomina spłaszczoną fasolę; delikatnie chwyć śledzionę kleszczami i wytnij, odcinając otaczającą tkankę łączną. Umieścić wycięte śledziony w stożku zawierającym 10 ml TCM na lodzie.</li>
	<li>Wylać śledziony na sitko do komórek o siatku 70 μm i zdezagregować przez rozgniecenie końcem wnętrza strzykawki o pojemności 5 ml w celu wytworzenia zawiesiny jednokomórkowej. Maksymalnie dwie śledziony powinny być zdezagregowane na jedno siatko siatkowe.</li>
	<li>Użyj niewielkiej objętości TCM, aby ostrożnie umyć sitko po dezagregacji, aby zebrać pozostałe splenocyty. Zbierz wszystkie zdezagregowane śledziony w jednokomórkową zawiesinę. Doprowadzić końcową objętość do 50 ml za pomocą TCM na jedno pranie i wirować przy 300 x g przez 10 minut.</li>
	<li>Przygotować roztwór 1x buforu do lizy, dodając 5 ml 10x buforu do lizy do 45 ml sterylnej wody. Aby wyeliminować czerwone krwinki, ponownie zawiesić osad w 5 ml 1x buforu do lizy na śledzionę w stożkowym opakowaniu o pojemności 50 ml, dobrze mieszając, delikatnie pipetując w górę iw dół. W przypadku przekroczenia 5 śledzion należy użyć probówki wirówkowej o pojemności 250 ml. Umieścić probówkę stożkową lub wirówkową w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C na 5 minut.</li>
	<li>Usunąć reakcję lizy z łaźni wodnej i dodać TCM w stosunku 1:1 z buforem do lizy, aby zneutralizować reakcję. Prać wirując w temperaturze 300 x g przez 10 min.</li>
	<li>Odessać supernatant i całkowicie zawiesić osad w TCM (2 ml/śledzionę, łącznie 8 ml na 4 śledziony) pipetując w górę i w dół.</li>
	<li>Policz komórki, dodając 10 μl zawiesiny komórek do 190 μl błękitu trypanowego (rozcieńczenie 1:20). Pomnóż liczbę uzyskaną w jednym z czterech kwadratów w siatce przez 20 x 104 x całkowita objętość (8 ml), aby uzyskać całkowitą liczbę komórek (np. 125 komórek x 20 x 104 x 8 ml = 200 x 106 splenocytów).</li>
	<li>Rozcieńczyć komórki do stężenia 2 x 106 komórek/ml w TCM, uzupełnione 2 μg/ml konkanawaliny A (ConA) i 50 IU / ml rekombinowanej ludzkiej interleukiny-2 (rhIL-2). Tak więc, dla 200 x 106 splenocytów, dodaj 92 ml pożywki do 8 ml komórek, 200 μg ConA i 5,000 IU rhIL-2.</li>
	<li>Dodaj 2 ml komórek do każdej studzienki z 24-dołkowymi płytkami poddanymi kulturze tkankowej, tak aby 4 x 106 komórek znajdowało się w każdym dołku (np. 100 ml komórek będzie wymagało około 4 płytek).</li>
	<li>Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .</li>
</ol>
5. Transdukcja
Dzień 1:
<ol>
	<li>Oblicz liczbę 24-dołkowych płytek niepoddanych hodowli tkankowej potrzebnych do transdukcji, mnożąc liczbę pobranych śledzion przez 2 (na 4 śledziony potrzeba 8 płytek).</li>
	<li>Następnie oblicz wymaganą objętość roztworu rekombinowanego ludzkiego fragmentu fibronektyny (RHFF) potrzebnego do pokrycia płytek, mnożąc (całkowita liczba dołków + 3) x 0,5 ml (8 płytek x 24 dołki = 192 + 3 = 195) x 0,5 ml = 97,5 ml.</li>
	<li>Przygotować 97,5 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) zawierającej RHFF w stężeniu 25 μg/ml, mnożąc całkowitą objętość przez 25 μg (97,5 x 25 = 2437,5 μg). Dodać tę ilość RHFF do 97,5 ml PBS.</li>
	<li>Pokryj 24-dołkowe płytki poddane hodowli nietkankowej, dodając 0,5 ml roztworu PBS/RHFF na dołek.</li>
	<li>Inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
Dzień 2:
<ol start="6">
	<li>Zrzuć roztwór PBS/RHFF z płytek 24-dołkowych poddanych działaniu kultur nietkankowych.</li>
	<li>Dodać 1 ml/basenik 2% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w PBS i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut.</li>
	<li>Usuń BSA, mocno obracając płytę. Umyć, dodając 2 ml PBS.</li>
	<li>Zebrać supernatant wirusa, przenosząc pożywkę z każdej płytki HEK293T PDL do probówki wirówkowej o pojemności 250 ml i wirować przez 10 minut przy 500 x g.</li>
	<li>Ostrożnie przenieść supernatant wirusa do świeżej probówki wirówkowej o pojemności 250 ml, uważając, aby nie naruszyć osadu komórkowego, który mógł się utworzyć.</li>
	<li>Dodać świeży TCM do supernatantu wirusa tak, aby końcowa objętość była o 3 ml większa niż ilość potrzebna do studzienek pokrytych RHFF. Na przykład w przypadku 192 studzienek pokrytych RHFF należy doprowadzić objętość supernatantu wirusa do 192 + 3 ml = 195 ml.</li>
	<li>Wyjąć wyhodowane splenocyty z inkubatora i zawiesić ponownie, delikatnie pipetując w górę i w dół 2-3 razy do każdej studzienki. Przenieść do stożka o pojemności 250 ml. W przypadku korzystania z pipety wielokanałowej użycie sterylnego zbiornika przed przeniesieniem pomoże przyspieszyć ten krok. Policz zgodnie z wcześniejszym opisem i wiruj z prędkością 300 x g przez 10 minut.</li>
	<li>Dodać rhIL-2 do supernatantu wirusa w stężeniu 50 j.m./ml. Na przykład dodać 50 x 195 = 9,750 IU rhIL-2 do 195 ml supernatantu wirusa.</li>
	<li>Zawiesić splenocyty w supernatancie wirusa w stężeniu 1 x 106 komórek/ml</li>
	<li>Dodać 1 ml/dołek zawiesiny splenocytów do 24-dołkowych płytek pokrytych RHFF.</li>
	<li>Wirować przez 90 minut zgodnie z następującymi ustawieniami: 770 x g, przyspieszenie = 4, hamowanie/opóźnienie = 0, 32 °C.</li>
	<li>Przygotować roztwór TCM o stężeniu 50 j.m./ml rhIL-2. Na przykład przygotuj roztwór 200 TCM, dodając 10 000 IU rhIL-2. Dodać 1 ml rhIL-2/TCM do każdego dołka po odwirowaniu.</li>
	<li>Hodowla przez noc w temperaturze 37 °C w 5% CO2 .</li>
</ol>
6. Hodowla i zbiór komórek T CAR
Dzień 3 i 4:
<ol>
	<li>Jeśli limfocyty T osiągną >80% konfluencji, komórki mogą zostać podzielone (zwykle dzieje się to w 3 lub 4 dniu). Aby podzielić komórki, delikatnie pipetuj w górę i w dół do każdej studzienki 2-3 razy i przenieś 1 ml z każdej studzienki do nowych dołków świeżej 24-dołkowej płytki poddanej działaniu kultur tkankowych. Następnie dodać 1 ml świeżego TCM z 50 j.m./ml IL-2 do każdej studzienki tak, aby końcowa objętość wynosiła 2 ml we wszystkich studzienkach.</li>
	<li>Jeśli komórki nie osiągną zbieżności >80%, wykonaj wymianę pożywki o połowę, powoli odpipetowując 1 ml pożywki od góry każdej studzienki. Unikaj przeszkadzania komórek osiadłych na dnie podczas usuwania nośnika. Dodać 1 ml świeżego TCM zawierającego 50 j.m./ml rhIL-2.</li>
</ol>
Dzień 5:
<ol start="3">
	<li>Zawiesić limfocyty CAR T, delikatnie pipetując 3 razy w górę i w dół w każdym dołku i przenieść do probówki wirówkowej o pojemności 250 ml. Wiruj komórki w odległości 300 x g przez 10 min.</li>
	<li>Całkowicie zassać supernatant bez zakłócania osadu. Umyj raz PBS, policz komórki zgodnie z wcześniejszym opisem i umyj PBS po raz drugi. Typowa wydajność komórek CAR T wynosi około 1 x 106 komórek na dołek (8 płytek x 24 dołki = 192 x 106 komórek CAR T).</li>
	<li>Zawiesić komórki w PBS w stężeniu 5 x 107/ml do wstrzyknięcia 1 x 107 w objętości 200 μg (np. dla komórek T 192 x 106 CAR zawiesić przemyty osad w 3,84 ml PBS).</li>
</ol>
7. Podawanie limfocytów T CAR myszom z nowotworem
Dzień 5:
<ol>
	<li>Transport komórek na lodzie do zakładu dla zwierząt w celu wstrzyknięcia dożylnego. Załaduj 500-1,000 μl do strzykawki insulinowej za pomocą igły 27 - 31 G, upewniając się, że wszystkie pęcherzyki zostały usunięte.</li>
	<li>Chwyć mysz u podstawy ogona i umieść w rurce ograniczającej.</li>
	<li>Pociągnij ogon napięty z żyłą skierowaną do góry i wsuń igłę około 1-2 mm pod skórą do żyły, wkładając ją równolegle do żyły ogonowej. Powoli wydalić 200 μl do żyły. Jeśli igła zostanie prawidłowo wprowadzona do żyły, objętość łatwo wpłynie; W przeciwnym razie pojawi się opór, a igła będzie musiała zostać usunięta z ogona i ponownie prawidłowo włożona.</li>
</ol>

<ol><li>Stupp, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiotherapy+plus+concomitant+and+adjuvant+temozolomide+for+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma.</a> N Engl J Med. 352 (10), 987-996 (2005).</li>
<li>Kantoff, P., Higano, C., Shore, N., Berger, E., Small, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sipuleucel-T+immunotherapy+for+castration-resistant+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Sipuleucel-T immunotherapy for castration-resistant prostate cancer.</a> N Engl J Med. (363), 411-422 (2010).</li>
<li>Hodi, F. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+survival+with+ipilimumab+in+patients+with+metastatic+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Improved survival with ipilimumab in patients with metastatic melanoma.</a> N Engl J Med. 363 (8), 711-723 (2010).</li>
<li>Schwartzentruber, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((gp100+peptide+vaccine+and+interleukin-2+in+patients+with+advanced+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">gp100 peptide vaccine and interleukin-2 in patients with advanced melanoma.</a> N Engl J Med. 364 (22), 2119-2127 (2011).</li>
<li>Gross, G., Gorochov, G., Waks, T., Eshhar, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+effector+T+cells+expressing+chimeric+T+cell+receptor+with+antibody+type-specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+Proc%22%5BJournal%5D)">Generation of effector T cells expressing chimeric T cell receptor with antibody type-specificity.</a> Transplant Proc. 21 (1 Pt 1), 127-130 (1989).</li>
<li>Pule, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virus-specific+T+cells+engineered+to+coexpress+tumor-specific+receptors%3A+persistence+and+antitumor+activity+in+individuals+with+neuroblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Virus-specific T cells engineered to coexpress tumor-specific receptors: persistence and antitumor activity in individuals with neuroblastoma.</a> Nat Med. 14 (11), 1264-1270 (2008).</li>
<li>Kochenderfer, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B-cell+depletion+and+remissions+of+malignancy+along+with+cytokine-associated+toxicity+in+a+clinical+trial+of+anti-CD19+chimeric-antigen-receptor-transduced+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">B-cell depletion and remissions of malignancy along with cytokine-associated toxicity in a clinical trial of anti-CD19 chimeric-antigen-receptor-transduced T cells.</a> Blood. 119 (12), 2709-2720 (2012).</li>
<li>Porter, D. L., Levine, B. L., Kalos, M., Bagg, A., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor-modified+T+cells+in+chronic+lymphoid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor-modified T cells in chronic lymphoid leukemia.</a> N Engl J Med. 365 (8), 725-733 (2011).</li>
<li>Brentjens, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety+and+persistence+of+adoptively+transferred+autologous+CD19-targeted+T+cells+in+patients+with+relapsed+or+chemotherapy+refractory+B-cell+leukemias%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Safety and persistence of adoptively transferred autologous CD19-targeted T cells in patients with relapsed or chemotherapy refractory B-cell leukemias.</a> Blood. 118 (18), 4817-4828 (2011).</li>
<li>Wikstrand, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+antibodies+against+EGFRvIII+are+tumor+specific+and+react+with+breast+and+lung+carcinomas+and+malignant+gliomas%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Monoclonal antibodies against EGFRvIII are tumor specific and react with breast and lung carcinomas and malignant gliomas.</a> Cancer Res. 55 (14), 3140-3148 (1995).</li>
<li>Sampson, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EGFRvIII+mCAR-modified+T-cell+therapy+cures+mice+with+established+intracerebral+glioma+and+generates+host+immunity+against+tumor-antigen+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">EGFRvIII mCAR-modified T-cell therapy cures mice with established intracerebral glioma and generates host immunity against tumor-antigen loss.</a> Clin Cancer Res. 20 (4), 972-984 (2014).</li>
<li>Kuppner, M. C., Hamou, M. F., Sawamura, Y., Bodmer, S., de Tribolet, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+lymphocyte+function+by+glioblastoma-derived+transforming+growth+factor+beta+2%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosurg%22%5BJournal%5D)">Inhibition of lymphocyte function by glioblastoma-derived transforming growth factor beta 2.</a> J Neurosurg. 71 (2), 211-217 (1989).</li>
<li>Wintterle, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+B7-related+molecule+B7-H1+by+glioma+cells%3A+a+potential+mechanism+of+immune+paralysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Expression of the B7-related molecule B7-H1 by glioma cells: a potential mechanism of immune paralysis.</a> Cancer Res. 63 (21), 7462-7467 (2003).</li>
<li>Fecci, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+regulatory+T-cell+fraction+amidst+a+diminished+CD4+compartment+explains+cellular+immune+defects+in+patients+with+malignant+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Increased regulatory T-cell fraction amidst a diminished CD4 compartment explains cellular immune defects in patients with malignant glioma.</a> Cancer Res. 66 (6), 3294-3302 (2006).</li>
<li>Wilmotte, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B7-homolog+1+expression+by+human+glioma%3A+a+new+mechanism+of+immune+evasion%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">B7-homolog 1 expression by human glioma: a new mechanism of immune evasion.</a> Neuroreport. 16 (10), 1081-1085 (2005).</li>
<li>Yang, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mediation+of+enhanced+transcription+of+the+IL-10+gene+in+T+cells%2C+upon+contact+with+human+glioma+cells%2C+by+fas+signaling+through+a+protein+kinase+A-independent+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Mediation of enhanced transcription of the IL-10 gene in T cells, upon contact with human glioma cells, by fas signaling through a protein kinase A-independent pathway.</a> Journal of Immunology. 171 (8), 3947-3954 (2003).</li>
<li>Reilly, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temozolomide%3A+a+new+oral+cytotoxic+chemotherapeutic+agent+with+promising+activity+against+primary+brain+tumours%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Temozolomide: a new oral cytotoxic chemotherapeutic agent with promising activity against primary brain tumours.</a> Eur J Cancer. 29A (7), 940-942 (1993).</li>
<li>Newcomb, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Combination+of+Ionizing+Radiation+and+Peripheral+Vaccination+Produces+Long-term+Survival+of+Mice+Bearing+Established+Invasive+GL261Gliomas%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">The Combination of Ionizing Radiation and Peripheral Vaccination Produces Long-term Survival of Mice Bearing Established Invasive GL261Gliomas.</a> Clin Cancer Res. 12, 4730-4737 (2006).</li>
<li>Park, B., Yee, C., Lee, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+radiation+on+the+immune+response+to+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">The effect of radiation on the immune response to cancers.</a> Int J Mol Sci. 15 (1), 927-943 (2014).</li>
<li>Fritzell, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intratumoral+temozolomide+synergizes+with+immunotherapy+in+a+T+cell-dependent+fashion%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunol+Immunother%22%5BJournal%5D)">Intratumoral temozolomide synergizes with immunotherapy in a T cell-dependent fashion.</a> Cancer Immunol Immunother. 62 (9), 1463-1474 (2013).</li>
<li>Park, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-priming+by+temozolomide+enhances+antitumor+immunity+of+dendritic+cell+vaccination+in+murine+brain+tumor+model%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Cross-priming by temozolomide enhances antitumor immunity of dendritic cell vaccination in murine brain tumor model.</a> Vaccine. 25 (17), 3485-3491 (2007).</li>
<li>Emens, L. A., Jaffee, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leveraging+the+activity+of+tumor+vaccines+with+cytotoxic+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Leveraging the activity of tumor vaccines with cytotoxic chemotherapy.</a> Cancer Res. 65 (18), 8059-8064 (2005).</li>
<li>Murphy, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vivo+immunotherapy+screen+of+costimulatory+molecules+identifies+Fc-OX40L+as+a+potent+reagent+for+the+treatment+of+established+murine+gliomas%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">An in vivo immunotherapy screen of costimulatory molecules identifies Fc-OX40L as a potent reagent for the treatment of established murine gliomas.</a> Clin Cancer Res. 18 (17), 4657-4668 (2012).</li>
<li>Newcomb, E. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiotherapy+enhances+antitumor+effect+of+anti-CD137+therapy+in+a+mouse+Glioma+model%5BTitle%5D)+AND+%22Radiat+Res%22%5BJournal%5D)">Radiotherapy enhances antitumor effect of anti-CD137 therapy in a mouse Glioma model.</a> Radiat Res. 173 (4), 426-432 (2010).</li>
<li>Su, Y. B., Krown, S. E., Livingston, P. O., Wolchok, J. D., Chapman, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+lymphotoxic+is+dose-intensified+temozolomide%3F+The+glioblastoma+experience%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">How lymphotoxic is dose-intensified temozolomide? The glioblastoma experience.</a> J Clin Oncol. 23 (18), 4235-4236 (2005).</li>
<li>Neyns, B., Tosoni, A., Hwu, W. J., Reardon, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dose-dense+temozolomide+regimens%3A+antitumor+activity%2C+toxicity%2C+and+immunomodulatory+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Dose-dense temozolomide regimens: antitumor activity, toxicity, and immunomodulatory effects.</a> Cancer. 116 (12), 2868-2877 (2010).</li>
<li>Muranski, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+intensity+lymphodepletion+and+adoptive+immunotherapy-how+far+can+we+go%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Clin+Pract+Oncol%22%5BJournal%5D)">Increased intensity lymphodepletion and adoptive immunotherapy-how far can we go.</a> Nat Clin Pract Oncol. 3 (12), 668-681 (2007).</li>
<li>Wrzesinski, C., Restifo, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Less+is+more%3A+lymphodepletion+followed+by+hematopoietic+stem+cell+transplant+augments+adoptive+T-cell-based+anti-tumor+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Less is more: lymphodepletion followed by hematopoietic stem cell transplant augments adoptive T-cell-based anti-tumor immunotherapy.</a> Current Opinion in Immunology. 17 (2), 195-201 (2005).</li>
<li>Dudley, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adoptive+cell+therapy+for+patients+with+metastatic+melanoma%3A+evaluation+of+intensive+myeloablative+chemoradiation+preparative+regimens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Adoptive cell therapy for patients with metastatic melanoma: evaluation of intensive myeloablative chemoradiation preparative regimens.</a> J Clin Oncol. 26 (32), 5233-5239 (2008).</li>
<li>Sanchez-Perez, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloablative+Temozolomide+Enhances+CD8%28%2B%29+T-Cell+Responses+to+Vaccine+and+Is+Required+for+Efficacy+against+Brain+Tumors+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Myeloablative Temozolomide Enhances CD8(+) T-Cell Responses to Vaccine and Is Required for Efficacy against Brain Tumors in Mice.</a> Plos One. 8 (3), (2013).</li>
<li>Su, Y. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+CD4%2B+lymphopenia+in+melanoma+patients+treated+with+temozolomide%3A+a+toxicity+with+therapeutic+implications%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Selective CD4+ lymphopenia in melanoma patients treated with temozolomide: a toxicity with therapeutic implications.</a> J Clin Oncol. 22 (4), 610-616 (1200).</li>
<li>Dummer, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+homeostatic+proliferation+elicits+effective+antitumor+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">T cell homeostatic proliferation elicits effective antitumor autoimmunity.</a> J Clin Invest. 110 (2), 185-192 (2002).</li>
<li>Gattinoni, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Removal+of+homeostatic+cytokine+sinks+by+lymphodepletion+enhances+the+efficacy+of+adoptively+transferred+tumor-specific+CD8%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Removal of homeostatic cytokine sinks by lymphodepletion enhances the efficacy of adoptively transferred tumor-specific CD8+ T cells.</a> J Exp Med. 202 (7), 907-912 (2005).</li>
<li>Wrzesinski, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+intensity+lymphodepletion+enhances+tumor+treatment+efficacy+of+adoptively+transferred+tumor-specific+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunother%22%5BJournal%5D)">Increased intensity lymphodepletion enhances tumor treatment efficacy of adoptively transferred tumor-specific T cells.</a> J Immunother. 33 (1), 1-7 (2010).</li>
<li>Hughes, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfer+of+a+TCR+gene+derived+from+a+patient+with+a+marked+antitumor+response+conveys+highly+active+T-cell+effector+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Transfer of a TCR gene derived from a patient with a marked antitumor response conveys highly active T-cell effector functions.</a> Hum Gene Ther. 16 (4), 457-472 (2005).</li>
<li>Morgan, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition+of+glioma+stem+cells+by+genetically+modified+T+cells+targeting+EGFRvIII+and+development+of+adoptive+cell+therapy+for+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Recognition of glioma stem cells by genetically modified T cells targeting EGFRvIII and development of adoptive cell therapy for glioma.</a> Hum Gene Ther. 23 (10), 1043-1053 (2012).</li>
<li>Kerkar, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+engineering+of+murine+CD8%2B+and+CD4%2B+T+cells+for+preclinical+adoptive+immunotherapy+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunother%22%5BJournal%5D)">Genetic engineering of murine CD8+ and CD4+ T cells for preclinical adoptive immunotherapy studies.</a> J Immunother. 34 (4), 343-352 (2011).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Opisany tutaj harmonogram leczenia został opracowany w celu modelowania klinicznego standardu opieki i wykorzystania jego efektów w terapii adopcyjnej CAR. Dawki limfocytów CAR T, schematy TMZ i podawanie radioterapii mogą być modyfikowane w celu zwiększenia aktywności limfocytów T in vivo , limfodeplecji i zabijania guza. Schematy TMZ można zwiększyć, aby uzyskać mieloablację gospodarza i zwiększoną ekspansję adoptywnie przeniesionych komórek30. Co więcej, limfodepletywne działanie TMZ można podsumow...

Glejak wielopostaciowy (GBM) jest najczęstszym pierwotnym złośliwym nowotworem mózgu i niezmiennie kończy się śmiercią. Resekcja chirurgiczna w połączeniu z niespecyficzną standardową chemioterapią i radioterapią nie eliminuje całkowicie komórek nowotworowych, co skutkuje ponurym rokowaniem krótszym niż 15 miesięcy u pacjentów z tą chorobą1. W przeciwieństwie do tego, immunoterapia oferuje precyzyjne podejście do specyficznego celowania w komórki nowotworowe, a zatem może służyć jako wysoce skuteczna platforma leczenia o zmniejszonym ryzyku toksyczności ubocznej2-4. Limfocyty T zmodyfikowane ex vivo w celu ekspresji chimerycznych receptorów antygenowych (CAR) oferują wszechstronną strategię immunoterapii nowotworów. CAR są generowane przez fuzję zewnątrzkomórkowego zmiennego regionu przeciwciała z jedną lub więcej wewnątrzkomórkowych cząsteczek sygnalizacyjnych limfocytów T, zamiast receptora5 limfocytów T ograniczonego głównym kompleksem zgodności tkankowej (MHC) o pełnej długości. Ten tryb rozpoznawania antygenu podobnego do przeciwciała pozwala reaktywnym limfocytom T specyficznym dla antygenu na rozpoznawanie i reagowanie na antygeny nowotworowe przy braku MHC i może być przystosowany do praktycznie nieskończonego repertuaru antygenów.
Limfocyty T CAR zmodyfikowane przeciwko różnym antygenom nowotworowym wykazały skuteczność przedkliniczną i wybitną obietnicę w klinice6-9. W szczególności, w kontekście GBM, wykazano, że platforma komórek CAR T ukierunkowana na wariant receptora naskórkowego czynnika wzrostu III (EGFRvIII), specyficzną dla nowotworu mutację ulegającą ekspresji na powierzchni komórki10, przedłuża przeżycie myszy z glejakiem11. Jednak pomimo ich wszechstronności, korzyści kliniczne płynące z terapii adopcyjnej CAR nie zostały w pełni zrealizowane, częściowo ze względu na immunosupresję związaną z nowotworem i unikanie odpowiedzi immunologicznej12-16, a także wyzwania związane z tworzeniem i utrzymywaniem limfocytów T specyficznych dla antygenu in vivo. Wykorzystanie standardu opieki (SOC) w połączeniu z immunoterapią może potencjalnie przezwyciężyć kilka z tych ograniczeń, co skutkuje zwiększoną skutecznością zarówno w warunkach przedklinicznych, jak i klinicznych.
SOC dla poresekcji GBM składa się z wysokiej dawki temozolomidu (TMZ), środka alkilującego DNA17 i napromieniania całego mózgu (WBI)1. Przypuszcza się, że terapie te działają synergistycznie ze szczepionkami przeciwnowotworowymi poprzez regulację w górę ekspresji MHCguza 18-20 i wydalanie antygenów przez martwe komórki nowotworowe17,19,21,22. Rzeczywiście, dodanie TMZ20,23 lub WBI18,24 prowadzi do zwiększonej skuteczności przeciwnowotworowej leczenia opartego na odporności w warunkach przedklinicznych. Ponadto, podobnie jak wiele nieswoistych chemioterapeutyków cytotoksycznych, TMZ jest znany z wywoływania limfopeniiukładowej 25,26, która może być wykorzystana jako sposób kondycjonowania gospodarza dla platform terapii adopcyjnej27-29. Wykazano, że limfodeplecja za pośrednictwem TMZ zwiększa częstotliwość i funkcję limfocytów T specyficznych dla antygenu, co prowadzi do zwiększenia skuteczności platformy terapii adoptywnej przeciwko nowotworom wewnątrzczaszkowym30. W kontekście terapii CAR, limfodeplecja służy jako środek kondycjonowania gospodarza zarówno poprzez zmniejszenie liczby endogennych supresorowych limfocytów T31, jak i indukowanie proliferacji homeostazy32 poprzez zmniejszoną konkurencję o cytokiny33, zwiększając w ten sposób aktywność przeciwnowotworową11,34. Biorąc pod uwagę synergiczny związek między GBM SOC a platformami immunoterapii, ocena nowych terapii adopcyjnych i platform szczepionek w kontekście SOC ma kluczowe znaczenie dla wyciągnięcia znaczących wniosków dotyczących skuteczności.
W tym protokole opisujemy metodę generowania i dożylnego podawania mysich limfocytów CAR T specyficznych dla EGFRvIII wraz z TMZ i WBI u myszy z guzami wewnątrzczaszkowymi EGFRvIII-dodatnimi (zobacz Rysunek 1 dla harmonogramu leczenia). Krótko mówiąc, limfocyty CAR T są wytwarzane ex vivo przez transdukcję retrowirusową. Komórki 293T ludzkiej embrionalnej nerki (HEK) są transfekowane przy użyciu kompleksu DNA/lipid (zawierającego wektor CAR i plazmidy pCL-Eco) w celu wytworzenia wirusa, który jest następnie wykorzystywany do transdukcji aktywowanych mysich splenocytów, które są zbierane i hodowane równolegle. W trakcie wytwarzania CAR mysi gospodarze z guzami wewnątrzczaszkowymi EGFRvIII-dodatnimi są napromieniani frakcjonowanym promieniowaniem rentgenowskim całego mózgu i ogólnoustrojowe leczenie TMZ w dawkach porównywalnych z klinicznym SOC. Limfocyty T CAR są następnie dostarczane dożylnie do gospodarzy limfodeplenowatych.
Następująca procedura jest opisana w siedmiu oddzielnych fazach: (1) Podawanie temozolomidu myszom z nowotworem, (2) Napromienianie całego mózgu myszy z nowotworem, (3) Transfekcja, (4) Splenektomia i przygotowanie limfocytów T, (5) Transdukcja, (6) Hodowla i zbiór komórek CAR T oraz (7) Podawanie limfocytów CAR T myszom z nowotworem. Fazy te składają się z kilku kroków, które trwają 6-7 dni i są wykonywane jednocześnie.

<table><tbody><tr><td>pCL-Eco Retrovirus Packaging Vector</td><td>Imgenex</td><td>10045P</td><td>Wektor pomocniczy do generowania retrowirusa CAR</td></tr><tr><td>Concanavalin A</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C2010</td><td>Niespecyficzny mitogen do indukcji proliferacji limfocytów T i transdukcji wirusa</td></tr><tr><td>Retronektyna</td><td>ClonTech/Takara</td><td>T100B</td><td>Ułatwia retrowirusową transdukcję limfocytów T</td></tr><tr><td>Lipofectamina 2000</td><td>Life Technologies</td><td>11668-019</td><td>Odczynnik do transfekcji</td></tr><tr><td>DMEM, wysoka zawartość glukozy, pirogronian</td><td>Technologie życia</td><td>11995-065</td><td>Pożywki hodowlane HEK293</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Life Technologies</td><td>11875-093</td><td>Pożywka do hodowli komórek</td></tr><tr><td>T Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td><td>Life technologies</td><td>11058-021</td><td>Media transfekcyjne</td></tr><tr><td>200 mM L-Glutamine</td><td>Life technologies</td><td>25030-081</td><td>Suplement pożywki do hodowli komórek T</td></tr><tr><td>100 mM Pirogronian sodu</td><td>Technologie życia</td><td>11360-070</td><td>Suplement pożywki do hodowli komórek T</td></tr><tr><td>100X MEM Aminokwasy endogenne Rozwiązanie</td><td>Technologie życia</td><td>11140-050</td><td>Suplement do hodowli komórek T</td></tr><tr><td>55 mM 2-merkaptoetanol</td><td>Technologie życia</td><td>21985-023</td><td>Środek redukujący do usuwania wolnych rodników</td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/ml)</td><td>Life technologies</td><td>15140-122</td><td>Suplement pożywki do hodowli komórek T</td></tr><tr><td>Gentamycyna (50 mg / ml)</td><td>Technologie życia</td><td>15750-060</td><td>Suplement pożywki do hodowli komórek</td></tr><tr><td>T GemCell Pochodzenie w USA Surowica bydlęca</td><td>Gemini Bio Products</td><td>100-500</td><td>Dostarcza czynniki wzrostu i składniki odżywcze do wzrostu komórek in vitro</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA), frakcja V&ndash; Standardowe</td><td>produkty Gemini Bio</td><td>700-100P</td><td>Blokuje niespecyficzne wiązanie retrowirusa z płytkami pokrytymi retronektyną</td></tr><tr><td>Pharm Lyse (10x koncentrat)</td> <td>BD Biosciences</td><td>555899</td><td>Lizuje czerwone krwinki podczas przetwarzania splenocytów</td></tr><tr><td>70 &mu; m Sterylne sitka komórkowe</td><td>Corning</td><td>352350</td><td>Odfiltrowuje duże cząsteczki tkanek podczas przetwarzania splenocytów</td></tr><tr><td>100 mm Naczynia hodowlane BioCoat z poli-D-lizyną</td><td>Corning</td><td>356469</td><td>Wspomaga adhezję komórek HEK293 w celu maksymalizacji proliferacji po transfekcji</td></tr><tr><td colspan="4">[nagłówek]</td></tr><tr><td>Temozolomid</td><td>Best Pharmatech</td><td>N/A</td><td>Liofilizowany proszek przygotowany w dniu podania</td></tr><tr><td>Dimethyl Sulfoxide</td><td>Sigma Life Sciences</td><td>D2650</td><td>Niezbędny do całkowitego rozpuszczenia temozolomidu</td></tr><tr><td>Saline</td><td>Hospira</td><td>IM 0132 (5/04)</td><td>Rozpuszczalnik do temozolomidu i ketaminy/ksylazyny</td></tr><tr><td>Ketathesia HCl</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>11695-0701-1</td><td>Roztwór ketaminy</td></tr><tr><td>AnaSed</td><td>Lloyd Inc</td><td>N/A</td><td>Sterylny roztwór ksylazyny 100 mg/ml</td></tr></tbody></table>

wytwarzanie limfocytów car t do terapii adoptywnej w kontekście standardu opieki nad glejakiem

Generation of CAR T Cells for Adoptive Therapy in the Context of Glioblastoma Standard of Care

Adoptywna immunoterapia limfocytami T oferuje obiecującą strategię celowania i eliminowania złośliwych glejaków. Limfocyty T mogą być modyfikowane ex vivo w celu ekspresji chimerycznych receptorów antygenowych specyficznych dla antygenów glejaka (limfocyty CAR T). Ekspansja i funkcja adoptyjnie przenoszonych limfocytów CAR T może być nasilona przez limfodepletywne i rakobójcze działanie standardowej chemioterapii i radioterapii. Opisujemy metodę generowania limfocytów CAR T ukierunkowanych na EGFRvIII, antygen specyficzny dla glejaka, i oceny ich skuteczności w połączeniu z mysim modelem standardowej opieki nad glejakiem. Limfocyty T są modyfikowane przez transdukcję z wektorem retrowirusowym zawierającym gen anty-EGFRvIII CAR. Zwierzęta z nowotworem są poddawane kondycjonowaniu gospodarza poprzez cykl temozolomidu i napromieniania całego mózgu w schematach dawkowania zaprojektowanych tak, aby modelować kliniczny standard opieki. Limfocyty CAR T są następnie dostarczane dożylnie do przygotowanych gospodarzy. Metoda ta może być stosowana do oceny skuteczności przeciwnowotworowej limfocytów CAR T w kontekście standardowej opieki.

Komórki CAR T są generowane poprzez transdukcję z użyciem wektora retrowirusowego EGFRvIII CAR11. Wektor ten, MSGV1, został opracowany na podstawie wektora SFGtcLuc_ITE435, który zawiera długie powtórzenia końcowe (LTR) mysiego wirusa komórek macierzystych (MSCV), rozszerzony region gag i miejsce splicingowe otoczki (donor splicingu, sd, oraz akceptor splicingu, sa) oraz wirusowy sygnał pakowania (ψ). Konstrukt EGFRvIII CAR zawierający ludzki jednowałańcuchowy fragment zmienny (scFv) 139 przeciwko E...

Limfodepletywne i immunomodulacyjne efekty standardu leczenia chemioterapią i radioterapią mogą być wykorzystane do zwiększenia skuteczności przeciwnowotworowej immunoterapii limfocytami T. Przedstawiamy metodę generowania limfocytów T receptora antygenu chimerycznego (CAR) specyficznych dla EGFRvIII i podawania ich w kontekście standardowej opieki nad glejakiem.

Wytwarzanie limfocytów CAR T do terapii adoptywnej w kontekście standardu opieki nad glejakiem

Adoptive T cell immunotherapy offers a promising strategy for specifically targeting and eliminating malignant gliomas. T cells can be engineered ex vivo ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wytworzenie genetycznie zmodyfikowanych mysich limfocytów T z chimerycznym receptorem antygenowym oraz ocena ich skuteczności w kontekście standardowego leczenia. W przypadku glejaka wysokiego stopnia realizuje się to poprzez rozpoczęcie standardowego leczenia, obejmującego napromieniowanie całego mózgu oraz podanie temozolomidu myszom. Następnie produkowany jest retrowirus wykazujący ekspresję wektora CAR, a następnie mysie limfocyty T są transdukowane tym retrowirusem CAR.Na koniec komórki CAR-T są podawane myszom leczonym zgodnie ze standardem opieki, co ostatecznie obejmuje podanie komórek CAR-T w połączeniu z całościowym napromieniowaniem mózgu i temozolomidem. Podanie to służy sprawdzeniu, czy przygotowanie organizmu gospodarza za pomocą standardowej terapii zwiększa skuteczność platformy adoptywnego transferu limfocytów T. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie immunoterapii guzów mózgu, takie jak skuteczność przeciwnowotworowa nowych immunoterapii w kontekście standardowej opieki nad pacjentami z glejakami wysokiego stopnia złośliwości.Choć metoda ta może dostarczyć informacji na temat skuteczności zmodyfikowanych genetycznie mi i komórek T w walce z glejakami wysokiego stopnia, może być ona również zastosowana w innych układach, takich jak ocena terapii komórkami T przeciwko czerniakowi oraz modelom przerzutów do płuc i innych obszarów mózgu. Ogólnie rzecz biorąc, osoby rozpoczynające pracę z tą metodą mogą napotkać trudności, ponieważ procedura ta wymaga równoległego wykonywania kilku etapów.Z tego względu planowanie i organizacja zadań są kluczowe. Procedurę zademonstrują Catherine Uni oraz Carter s Deva, utalentowani doktoranci z mojego laboratorium. Po przygotowaniu roztworu temozolomidu (TMZ) o stężeniu 3 mg/mL w DMSO, należy umieścić go w zlewce z wodą na płycie grzejczej w temperaturze 65 °C na 10 do 15 minut.Po całkowitym rozpuszczeniu TMZ roztwór powinien przybrać bladożółty kolor. Napełnij do pełna 15 strzykawek o pojemności 1 ml roztworem TMZ. TMZ należy podać w ciągu 90 minut od przygotowania, aby zapobiec jego wytrąceniu się z roztworu. W celu przeprowadzenia napromieniowania całego mózgu włącz irradiator rentgenowski i poczekaj na jego rozgrzanie, upewnij się, że zastosowano odpowiedni filtr, a następnie wprowadź właściwe ustawienia napięcia i natężenia prądu.Po uspokojeniu myszy zgodnie z protokołem tekstowym, należy umieścić je na siatce w taki sposób, aby ich głowy znajdowały się w obszarze o najwyższej intensywności promieniowania rentgenowskiego. Do osłonięcia ciał od szyi w dół należy użyć ołowianych rurek, aby zablokować systemowe dostarczanie promieniowania rentgenowskiego. Po zakończeniu naświetlania należy wyjąć myszy z urządzenia rentgenowskiego.Wyjmij zwierzęta z irradiatora. Gdy zwierzęta odzyskają wystarczającą świadomość i będą utrzymywać pozycję leżenia na brzuchu, umieść je z powrotem w odpowiednich klatkach. Po przygotowaniu pożywki D 10 i zebraniu komórek HEC 2 93 T zgodnie z protokołem tekstowym, dodaj jeden mililitr zawiesiny komórkowej o stężeniu 7,5 × 10⁶ komórek na mililitr do każdej z płytek 10 cm powlekanych poli-L-lizyną zawierających 10 ml pożywki D 10 i inkubuj przez noc do następnego dnia.Po przygotowaniu plazmidu i odczynnika do transfekcji zgodnie z opisem w protokole tekstowym, należy dodać kompleks lipidowo-DNA kroplami do komórek HEC 2 93 T i inkubować przez sześć do ośmiu godzin. Następnie należy zastąpić medium 12 ml świeżego medium do hodowli komórek T (TCM). W kolejnym kroku jedną śledzionę należy przelać przez sitko komórkowe o oczkach 70 µm i rozbić za pomocą tępego końca wnętrza strzykawki 5 ml, aby uzyskać zawiesinę pojedynczych komórek.Po przygotowaniu świeżej puli TCM, rozdrobnioną śledzionę w 50 mililitrowej probówce stożkowej w TCM i pellet, komórki oczyszcza się z erytrocytów, używając pięciu mililitrów 1x buforu lizującego na każdą śledzionę do resuspensji komórek, mieszając je dokładnie poprzez delikatne pipetowanie w górę i w dół. Zawiesinę komórkową należy umieścić w kąpieli wodnej w temperaturze 37 °C na pięć minut. Po wyjęciu z kąpieli wodnej, reakcję lizy neutralizuje się poprzez dodanie TCM w stosunku 1:1 do buforu lizującego, a następnie przemywa przez wirowanie przy 300 ×g przez 10 minut.Po odessaniu supernatantu należy użyć dwóch mililitrów TCM na śledzionę, aby resuspender osad. W celu policzenia komórek należy dodać 10 µL zawiesiny komórkowej do 190 µL błękitu trypanowego. Po obliczeniu całkowitej liczby komórek należy użyć TCM uzupełnionego o dwie µg/mL konkanawalin A oraz 50 IU/mL rekombinowanej ludzkiej interleukiny 2, aby rozcieńczyć komórki do stężenia 2 × 10⁶ komórek/mL. Do każdej studzienki 24-dołkowej płytki hodowlanej do tkanek należy dodać dwa mililitry lub 4 × 10⁶ komórek i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w dniu następującym po splenektomii.Przygotować PBS zawierający 25 µg/mL rekombinowanego fragmentu ludzkiej fibronektyny (RHFF) i pokryć nieprzetworzone do hodowli tkankowych płytki 24-dołkowe, dodając 0,5 mL roztworu do każdego dołka; pozostawić do następnego dnia. Usunąć roztwór z dołków i dodać do każdego z nich 1 mL 2% BSA w PBS, a następnie inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut.Następnie usuń BSA, zdecydowanie odwracając płytkę do góry dnem, a następnie dodaj dwa mililitry PBS w celu przemycia. Po zebraniu nadsączu wirusowego z komórek HEC 2 93 T, dodaj świeże TCM do objętości końcowej w mililitrach równej liczbie studni pokrytych RHFF, plus dodatkowe trzy mililitry. Wyjmij hodowane splenocyty z inkubatora i resuspenduj, delikatnie pipetując w górę i w dół dwa do trzech razy w każdej próbce.Przenieść zawiesiny komórkowe do probówki stożkowej o pojemności 50 ml. Następnie resuspendować komórki w nadsączu wirusowym do stężenia 1×10⁶ komórek/ml. Potem do studzienek płytek pokrytych RHFF dodać po 1 ml zawiesiny na każdą studzienkę.Następnie wiruj płytki przez 90 minut w temperaturze 32 °C przy 770 g, z przyspieszeniem ustawionym na 4 i hamowaniem ustawionym na 0 podczas wirowania. Przygotuj roztwór rekombinowanego ludzkiego IL-2 w stężeniu 50 IU/ml w pożywce TCM. Po wirowaniu dodaj 1 ml pożywki do każdego dołka płytki i inkubuj przez noc.Jeśli limfocyty T osiągną konfluencję przekraczającą 80%, należy rozdzielić komórki, delikatnie pipetując je w górę i w dół w każdej studni dwa do trzech razy. Następnie przenieść jeden mililitr z każdej studni do nowych studni świeżej 24-studzienkowej płytki do hodowli tkanek. Do każdej studni dodać jeden mililitr świeżego TCM z 50 jednostkami międzynarodowymi na mililitr IL-2; jeśli komórki nie osiągną konfluencji powyżej 80%, wymienić połowę medium, powoli odpipetowując jeden mililitr medium z powierzchni każdej studni i zastępując go jednym mililitrem świeżego TCM zawierającego 50 jednostek międzynarodowych na mililitr rekombinowanej ludzkiej IL-2. Resuspender komórki CAR-T, delikatnie pipetując je w górę i w dół trzy razy w każdej studni, a następnie przenieść do probówki do wirowania o pojemności 250 mililitrów.Wiruj komórki przy 300 GS przez 10 minut. Następnie całkowicie odessaj nadsącz, uważając, aby nie naruszyć osadu. Przemyj komórki roztworem PBS, a następnie je policz przed drugim przemyciem.Typowa wydajność komórek CAR-T wynosi około 1 × 10⁶ komórek na dołek w PBS Resus. Zawiesić komórki w stężeniu 5 × 10⁷ na ml, aby przygotować dawkę 1 × 10⁷ w objętości 200 µl. W celu wstrzyknięcia preparatu myszom z nowotworem należy użyć igły o rozmiarze 27–31 G, aby nabrać 500–1000 µl do strzykawki insulinowej, upewniając się, że wszystkie pęcherzyki powietrza zostały usunięte. Komórki CAR-T wygenerowano poprzez transdukcję wektorem retrowirusowym E GFR V three CAR, który zawiera długie powtórzenia końcowe wirusa MSCV.Rozszerzony region gag, miejsce splicingu otoczki oraz sygnał pakowania wirusa. EG FFR V three CAR zawierający ludzki jednołańcuchowy fragment zmienny przeciwko EG FRV three 1 39 został sklonowany do wektora retrowirusowego tandemowo z mysimi regionami wewnątrzkomórkowymi CD eight, tm CD 28 4 1 BBB oraz CD three zeta. Po transdukcji komórki T EG FFR V three CAR mogą zostać poddane kwantyfikacji i fenotypowaniu za pomocą cytometrii przepływowej z wykorzystaniem panelu dwukolorowego składającego się z biotynilowanego multimeru pochodnego EG FFR V three sprzężonego ze streptawidyną oraz przeciwciała anty-CD three fit C. Stosując protokół opisany w tym filmie, ekspresję CAR rutynowo obserwuje się w 55 do 70% CD three-dodatnich mysich komórek T.Komórki CAR-T można dodatkowo fenotypować poprzez dodanie innych przeciwciał znakowanych fluorescencyjnie do dwukolorowego panelu CAR, jak pokazano w tym przykładzie; barwienie na CD8 i CD4 wykazuje, że 70% przetransdukowanych komórek CAR to limfocyty T CD8-dodatnie, natomiast 20% to limfocyty T CD4-dodatnie. Po opanowaniu tej techniki można ją przeprowadzić w ciągu 12 godzin w okresie jednego tygodnia, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić inne metody, takie jak ELISA, ELISPOT i/lub wewnątrzkomórkowe barwienie cytokin, w celu uzyskania odpowiedzi na dodatkowe pytania.Na przykład, czy Twoje limfocyty T przetransdukowane chimerycznym receptorem antygenowym reagują funkcjonalnie na rozpoznanie antygenu i czy ich funkcjonalność jest swoista względem antygenu? Pamiętaj, że praca z retrowirusami, temozolomidem i promieniowaniem rentgenowskim może być niezwykle niebezpieczna i wymaga zachowania środków ostrożności, takich jak praca w warunkach BSL-2, stosowanie środków ochrony osobistej, przeprowadzanie eksperymentów w wyznaczonych obszarach oraz przejście odpowiedniego szkolenia z zakresu obchodzenia się ze zwierzętami.Podczas wykonywania tych procedur należy zawsze stosować sprzęt rentgenowski.

generation-car-t-cells-for-adoptive-therapy-context-glioblastoma

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Generowanie komórek CAR T do terapii adoptywnej w kontekście standardowej opieki nad pacjentami z glioblastomem

Ten film demonstruje technikę generowania ex vivo limfocytów T z chimerycznym receptorem antygenowym (CAR) specyficznym dla antygenu nowotworowego. Wektory retrowirusowe przenoszące transgeniczne RNA są mieszane z komórkami śledziony w pożywce uzupełnionej interleukiną-2 w celu promowania przeżycia i proliferacji komórek T. Mieszanina jest następnie przenoszona na płytkę pokrytą rekombinowanymi fragmentami ludzkiej fibronektyny i odwirowywana, aby ułatwić fuzję wirusa z komórką, umożliwiając...

Technika ex vivo do generowania specyficznych dla nowotworu chimerycznych komórek T receptora antygenowego

Opisano nowatorską metodologię stosowaną w leczeniu nawracających glejaków. To podejście do leczenia polega na zastosowaniu naprzemiennych pól elektrycznych do leczenia nowotworów (TTFields), znanych jako terapia TTF w połączeniu z bewacyzumabem, lekiem celowanym, który jest obecnie zatwierdzony przez FDA jako monoterapia.

Terapia polowa w leczeniu nowotworów w połączeniu z bewacyzumabem w leczeniu nawracającego glejaka wielopostaciowego

Tutaj prezentujemy protokół przygotowania i stereotaktycznego podawania allogenicznych ludzkich limfocytów u myszy z niedoborem odporności z ortotopowymi ludzkimi pierwotnymi guzami mózgu. Badanie to dostarcza dowodów na słuszność koncepcji zarówno wykonalności, jak i skuteczności przeciwnowotworowej immunoterapii komórkowych dostarczanych do mózgu.

Stereotaktyczny transfer adoptywny cytotoksycznych komórek odpornościowych w mysich modelach ortotopowego ludzkiego glejaka wielopostaciowego ksenoprzeszczepów

Tutaj prezentujemy protokół produkcji i testów przedklinicznych mysich limfocytów T CD19 CAR metodą transdukcji retrowirusowej i wykorzystania jako terapii przeciwko ustalonemu syngenicznemu chłoniakowi B-komórkowemu A20 u myszy BALB/c z lub bez kondycjonowania wstępnego limfodepletingu.

Syngeniczny model chłoniaka z komórek B myszy do przedklinicznej oceny limfocytów T CD19 CAR

Tutaj opisujemy metodę wspólnej hodowli in vitro do rekurencyjnego wyzwania limfocytów T ukierunkowanych na nowotwór, co pozwala na fenotypową i funkcjonalną analizę aktywności przeciwnowotworowych limfocytów T.

Ponowne badanie komórek nowotworowych in vitro w celu predykcyjnej oceny funkcji przeciwnowotworowej komórek T receptora antygenu chimerycznego

Opisujemy podejście do niezawodnego generowania limfocytów T z chimerycznym receptorem antygenowym (CAR) i testowania ich różnicowania i funkcji in vitro i in vivo.

Wytwarzanie limfocytów T z chimerycznym receptorem antygenowym (CAR) do immunoterapii adoptywnej

Guzy ośrodkowego układu nerwowego (OUN) są główną przyczyną zgonów związanych z rakiem u dzieci, a lokoregionalne terapie immunologiczne są coraz częściej testowane dla pacjentów w badaniach klinicznych. Protokół ten opisuje metody lokoregionalnej implantacji kaniuli u myszy w celu przedklinicznej oceny infuzji immunoterapeutycznych ukierunkowanych na guzy OUN.

Implantacja kaniuli wewnątrzczaszkowej do seryjnych infuzji limfocytów T lokoregionalnego receptora chimerycznego antygenu (CAR) u myszy

Ten protokół usprawnia produkcję wektorów retrowirusowych i transdukcję mysich limfocytów T, ułatwiając efektywne wytwarzanie mysich komórek CAR-T.

Wydajne wytwarzanie mysich chimerycznych receptorów antygenowych (CAR)-T

Ten protokół zapewnia usprawniony przepływ pracy do generowania i testowania ludzkich limfocytów regulatorowych receptora antygenu chimerycznego (Treg CAR).

Wytwarzanie ludzkich limfocytów T regulatorowych receptora antygenu chimerycznego

Ten protokół opisuje szczegółową procedurę generowania przejściowych limfocytów T z chimerycznym receptorem antygenowym (CAR) przy użyciu nieintegrującego mRNA do immunoterapii nowotworów i dostarcza wiarygodnych metod oceny komórek CAR-T i ich funkcji cytotoksycznej.

Niewirusowe podejście do generowania przejściowych limfocytów T receptora chimerycznego antygenu przy użyciu mRNA do immunoterapii nowotworów

Poznaj metodę wytwarzania limfocytów CAR T skierowanych przeciwko EGFRvIII w glejakach. Technika obejmuje radioterapię całego mózgu, temozolomid i transfekcję retrowirusową mysich limfocytów T.

Wytwarzanie limfocytów CAR T do terapii adoptywnej w kontekście standardu opieki nad glejakiem

Przeglądaj więcej filmów