Name: Test błony chorioomoczniowej piskląt in ovo (CAM) jako skuteczny model ksenoprzeszczepu raka wątrobowokomórkowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
Description: Poznaj metodę ksenoprzeszczepu raka wątrobowokomórkowego na błonie chorioomoczniowej piskląt. Model CAM umożliwia hodowlę trójwymiarowych, unaczynionych guzów z przeżywalnością zarodków do 93%.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

A.S. było częściowo wspierane przez granty z National Institutes of Health (NIH), National Institute of Dental and Craniofacial Research (5R03DE021741-02) i National Cancer Institute (1K08CA154963-01A1). 
Instytut Medyczny Howarda Hughesa zapewnił finansowanie dla M.L. poprzez HHMI Medical Research Fellows Program.

1. Inkubacja jaj
<ol>
	<li>Uzyskać 8-dniowe jaja zarodkowe wolne od określonych patogenów.</li>
	<li>Umieść jajka w obrotowej tacce na jajka, stemplowanymi końcami skierowanymi do góry i umieść obrotową tacę w inkubatorze do jaj. Inkubować jaja przez 48 godzin w temperaturze 36 °C i wilgotności 50%.</li>
</ol>
2. Upuszczanie CAM i otwieranie jaj
<ol>
	<li>Zbierz jaja z inkubatora. Umieść jajka w stojaku na jajka, stemplowaną stroną do góry i doprowadź do okapu z przepływem laminarnym.</li>
	<li>Wyłącz światła w pomieszczeniu i okapie.</li>
	<li>Lekko przyłóż wytłoczony koniec jajka do świecy do jajek, aby odsłonić układ naczyniowy CAM oraz worek powietrzny. 
	UWAGA: Świeca do jaj jest źródłem światła używanym do wizualizacji rozwijającego się zarodka i związanego z nim worka powietrznego i naczyń krwionośnych.</li>
	<li>Umieść znak ołówka między dwoma głównymi naczyniami krwionośnymi.</li>
	<li>Włącz światła i za pomocą sterylnego popychacza wykonaj jeden otwór na końcu jajka nad workiem powietrznym (wytłoczony koniec) i jeden otwór w śladzie ołówka. Nie wciskaj szpilki do końca; Zwykle wystarczy otwór o głębokości około 3 mm.</li>
	<li>Wyłącz światła. Ściśnij bańkę bezpieczeństwa, mocno dociskając otwarty koniec do otworu nad workiem powietrznym. Zastosuj ssanie, aby wciągnąć powietrze do otworu w śladzie ołówka, powodując opadnięcie CAM z muszli w miejscu znaku ołówka.</li>
	<li>Sprawdź, czy worek powietrzny przesunął się z wytłoczonego końca jajka do otworu oznaczonego ołówkiem za pomocą świecznika. Jeśli tak się nie stało, użyj pinezki, aby nieco pogłębić oba otwory, a następnie ponownie zastosuj ssanie za pomocą gruszki bezpieczeństwa.</li>
	<li>Włącz światła. Trzymając jajko w jednej ręce, włącz narzędzie obrotowe dremel z dołączoną tarczą tnącą 15/16 cala i wykonaj dwa poprzeczne nacięcia na tyle głęboko, aby przeciąć skorupę, ale nie na tyle głęboko, aby przeciąć aż do wciśniętej krzywki. Wykonaj nacięcia o długości około 2 cm i w odległości 1 cm od siebie. Wykonaj nacięcia na tyle szerokie, aby mógł przejść przez nie silikonowy pierścień o średnicy 1 cm, ale cieńszy niż szerokość standardowej taśmy klejącej.</li>
	<li>Następnie wykonaj 1 cięcie wzdłużne między i na końcach dwóch poprzecznych cięć, lekko dotykając tarczą tnącą do skorupy.</li>
	<li>Wsuń sterylne kleszczyki pod skorupę i równolegle do muszli. Chwyć kawałek muszli kleszczami i usuń cały kawałek czysto.</li>
	<li>Umieść taśmę klejącą na nowo otwartym oknie, upewniając się, że jeden koniec jest złożony na siebie, aby ułatwić usunięcie.</li>
	<li>Umieść jaja z powrotem w inkubatorze w tacce na jajka (NIE w obrotowych stojakach na jajka) do czasu zaszczepienia.</li>
</ol>
3. Szczepienie
<ol>
	<li>Mieszaninę białek błony podstawnej, taką jak matrigel, należy przechowywać na lodzie (aby zapobiec polimeryzacji) i umieścić w kapturze.</li>
	<li>Użyć 2 mM EDTA do odłączenia komórek (4 - 5 ml na kolbę T75) i umieścić kolby w inkubatorze do hodowli tkankowych na 5 minut.</li>
	<li>Ponownie zawiesić oderwane komórki w pożywce i policzyć za pomocą hemocytometru i błękitu trypanowego. Użyj od 500 000 do 2 000 000 komórek do szczepienia na CAM, w zależności od linii komórkowej. Zoptymalizuj odpowiednią liczbę we wstępnych eksperymentach.</li>
	<li>Odmierz objętość wymaganą dla odpowiedniej liczby komórek i odwiruj przy 500 x g przez 5 minut.</li>
	<li>Odrzucić supernatant, a następnie ponownie zawiesić osad komórkowy w 40 μl PBS++ i 20 μl mieszaniny błony podstawnej. 
	UWAGA: W tym momencie komórki można leczyć lekami lub innymi środkami testowymi w razie potrzeby do eksperymentów poprzez ponowne zawieszenie w zawiesinie mieszaniny komórka/błona podstawna. Alternatywnie, środki mogą być pipetowane na zawiesinę mieszaniny komórka/błona podstawna po szczepieniu.</li>
	<li>Wyjmij stojak na jajka z jajami z inkubatora i umieść w okapie z przepływem laminarnym.</li>
	<li>Odklej taśmę od okna, wyjmij silikonowy pierścień o średnicy 1 mm z nakrętki fiolki kriogenicznej za pomocą wysterylizowanych kleszczy i upuść pierścień przez okienko.</li>
	<li>Odpipetować 60 μl roztwór komórek PBS++ i mieszaniny błony podstawnej bezpośrednio do środka pierścienia silikonowego spoczywającego na CAM.</li>
	<li>Zaklej ponownie okno taśmą i przenieś stojak na jajka z powrotem do inkubatora. W tym momencie należy zachować ostrożność podczas przenoszenia jaj, ponieważ pierścień i zawiesina komórek mogą łatwo ulec przemieszczeniu.</li>
	<li>Pozwól guzom rosnąć przez 5 do 7 dni.</li>
</ol>
4. Zbieranie nowotworów
<ol>
	<li>Umieść podkładkę w kapturze. Przygotuj płytki o wymiarach 35 x 10 mm i pojemniki paraformaldehydowe zgodnie z potrzebami do badania histologicznego. Umieść 1 ml PBS++ na każdej płytce o wymiarach 35 x 10 mm.</li>
	<li>Umieść torbę z zagrożeniem biologicznym w kapturze. Weź sterylne nożyczki do rozwarstwiania i włóż spiczasty koniec do jajka w otworze w pobliżu wytłoczonego końca.</li>
	<li>Przeciąć całe jajko wzdłuż. 
	UWAGA: CAM i guz z pierścieniem powinny przylegać do górnej połowy skorupy z okienkiem.</li>
	<li>Za pomocą nożyczek preparacyjnych i kleszczy wypreparuj guz z dala od CAM i umieść guz na płytce o wymiarach 35 x 10 mm. Zmierz i zważ guzy. Utrwalił guzy w paraformaldehydzie, a następnie zatopił je w parafinie do wykorzystania w eksperymentach histologicznych i immunohistochemicznych.</li>
</ol>
5. (Opcjonalnie): Dysocjacja komórek nowotworowych
<ol>
	<li>Użyj nożyczek preparacyjnych, aby zmielić guz na płytce 35 x 10 mm. Wlej zmielony guz do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i usuń jak najwięcej PBS++ poprzez pipetowanie.</li>
	<li>Dodać 2 ml kolagenazy (1 mg/ml w PBS++), kilkakrotnie obrócić probówkę i inkubować probówkę w temperaturze 37 °C przez co najmniej 30 minut (do kilku godzin).</li>
	<li>Dodać 5 ml pożywki do każdej probówki i dokładnie zawiesić, pipetując w górę i w dół 20 - 40 razy. Dokładne pipetowanie ma kluczowe znaczenie dla całkowitej dysocjacji komórek.</li>
	<li>Pozostawić osad do opadnięcia i przenieść supernatant do świeżej probówki. Wirować przy 500 x g przez 5 min. Usunąć supernatant, pozostawiając zdysocjowaną osadkę komórkową. 
	UWAGA: W tym momencie granulki komórkowe mogą być używane do różnych eksperymentów (cytometria przepływowa, liza do stosowania w Western blotting, izolacja RNA itp.). Całkowitą liczbę komórek nowotworowych można również uzyskać za pomocą hemocytometru i barwienia błękitem trypanowym. Należy pamiętać, że mniejsze, owalne komórki są komórkami kurczaka z CAM i nie powinny być liczone jako komórki nowotworowe. Powinna istnieć minimalna liczba zanieczyszczających komórek nienowotworowych (CAM), jeśli guz jest ostrożnie wycinany z dala od CAM.</li>
</ol>

<ol><li>Sangiovanni, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+survival+of+cirrhotic+patients+with+a+hepatocellular+carcinoma+detected+during+surveillance%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Increased survival of cirrhotic patients with a hepatocellular carcinoma detected during surveillance.</a> Gastroenterology. 126 (4), 1005-1014 (2004).</li>
<li>Lopez, P. M., Villanueva, A., Llovet, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+review%3A+evidence-based+management+of+hepatocellular+carcinoma--an+updated+analysis+of+randomized+controlled+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Aliment+Pharmacol+Ther%22%5BJournal%5D)">Systematic review: evidence-based management of hepatocellular carcinoma--an updated analysis of randomized controlled trials.</a> Aliment Pharmacol Ther. 23 (11), 1535-1547 (2006).</li>
<li>Llovet, J. M., Burroughs, A., Bruix, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Hepatocellular carcinoma.</a> Lancet. 362 (9399), 1907-1917 (2003).</li>
<li>Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+is+the+evidence+that+tumors+are+angiogenesis+dependent%5BTitle%5D)+AND+%22J+Natl+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">What is the evidence that tumors are angiogenesis dependent.</a> J Natl Cancer Inst. 82, 4-6 (1990).</li>
<li>Hagedorn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accessing+key+steps+of+human+tumor+progression+in+vivo+by+using+an+avian+embryo+model%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Accessing key steps of human tumor progression in vivo by using an avian embryo model.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (5), 1643-1648 (2005).</li>
<li>Dumartin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Netrin-1+mediates+early+events+in+pancreatic+adenocarcinoma+progression%2C+acting+on+tumor+and+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Netrin-1 mediates early events in pancreatic adenocarcinoma progression, acting on tumor and endothelial cells.</a> Gastroenterology. 138 (4), 1595-1606 (2010).</li>
<li>Aguirre-Ghiso, J. A., Estrada, Y., Liu, D., Ossowski, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ERK%28MAPK%29+activity+as+a+determinant+of+tumor+growth+and+dormancy%3B+regulation+by+p38%28SAPK%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">ERK(MAPK) activity as a determinant of tumor growth and dormancy; regulation by p38(SAPK).</a> Cancer Res. 63 (7), 1684-1695 (2003).</li>
<li>Baroni, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribonomic+and+short+hairpin+RNA+gene+silencing+methods+to+explore+functional+gene+programs+associated+with+tumor+growth+arrest%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Ribonomic and short hairpin RNA gene silencing methods to explore functional gene programs associated with tumor growth arrest.</a> Methods Mol Biol. 383, 227-244 (2007).</li>
<li>Lopez-Rivera, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+nitric+oxide+synthase+drives+mTOR+pathway+activation+and+proliferation+of+human+melanoma+by+reversible+nitrosylation+of+TSC2%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Inducible nitric oxide synthase drives mTOR pathway activation and proliferation of human melanoma by reversible nitrosylation of TSC2.</a> Cancer Res. 74 (4), 1067-1078 (2014).</li>
<li>Balke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+short-term+in+vivo+model+for+giant+cell+tumor+of+bone%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">A short-term in vivo model for giant cell tumor of bone.</a> BMC Cancer. 11, 241(2011).</li>
<li>Balke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphologic+characterization+of+osteosarcoma+growth+on+the+chick+chorioallantoic+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Res+Notes%22%5BJournal%5D)">Morphologic characterization of osteosarcoma growth on the chick chorioallantoic membrane.</a> BMC Res Notes. 3, 58(2010).</li>
<li>Sys, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+in+ovo+CAM-assay+as+a+xenograft+model+for+sarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">The in ovo CAM-assay as a xenograft model for sarcoma.</a> J Vis Exp. (77), e50522(2013).</li>
<li>Dohle, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chick+ex+ovo+culture+and+ex+ovo+CAM+assay%3A+how+it+really+works%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Chick ex ovo culture and ex ovo CAM assay: how it really works.</a> J Vis Exp. (33), (2009).</li>
<li>Ossowski, L., Reich, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+model+for+quantitative+study+of+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Experimental model for quantitative study of metastasis.</a> Cancer Res. 40 (7), 2300-2309 (1980).</li>
<li>Ghanekar, A., Ahmed, S., Chen, K., Adeyi, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cells+do+not+arise+from+tumor-initiating+cells+in+human+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Endothelial cells do not arise from tumor-initiating cells in human hepatocellular carcinoma.</a> BMC Cancer. 13, 485(2013).</li>
<li>Ho, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+a+novel+immunomodulating+agent%2C+FTY720%2C+on+tumor+growth+and+angiogenesis+in+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer+Ther%22%5BJournal%5D)">Effects of a novel immunomodulating agent, FTY720, on tumor growth and angiogenesis in hepatocellular carcinoma.</a> Mol Cancer Ther. 4 (9), 1430-1438 (2005).</li>
<li>Hagedorn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VEGF+coordinates+interaction+of+pericytes+and+endothelial+cells+during+vasculogenesis+and+experimental+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">VEGF coordinates interaction of pericytes and endothelial cells during vasculogenesis and experimental angiogenesis.</a> Dev Dyn. 230 (1), 23-33 (2004).</li>
</ol>

A.S. otrzymuje fundusze od firmy farmaceutycznej Advaxis na wsparcie badania klinicznego zainicjowanego przez badacza.

Kilka kluczowych kroków w tym protokole najprawdopodobniej odpowiada za poprawę przeżywalności zarodka, a także zwiększoną niezawodność wzrostu guza. Upuszczenie CAM z dala od skorupy poprzez zastosowanie ssania do worka powietrznego jest mniej inwazyjne niż inne istniejące metody (użycie igły do usunięcia albuminy z jaja, rozwarstwienie itp.). Użycie sterylnego pinezki do stworzenia dwóch małych otworów wymaganych do tej metody jest najtrudniejszą częścią protokołu. Użycie zbyt dużej siły może spowodować uszkodzenie CAM...

Rak wątrobowokomórkowy (HCC) jesttrzecią najczęstszą przyczyną zgonów z powodu raka na świecie1. Obecnie tylko 30% pacjentów z HCC kwalifikuje się do potencjalnie wyleczalnych zabiegów chirurgicznych2, a chemioterapia ogólnoustrojowa nie jest skuteczna3. W związku z tym istnieje pilna niezaspokojona potrzeba kliniczna w zakresie nowatorskich terapii HCC oraz opracowania systemów modelowych odpowiednich do skutecznego testowania nowych leków. Test błony kosmówkowo-omoczniowej (CAM) piskląt zapewnia powtarzalną, opłacalną i szybką metodę średnioprzepustową testowania potencjalnych leków przeciwnowotworowych in vivo.
Test CAM był szeroko stosowany do badania angiogenezy4. Został również z powodzeniem opracowany w model ksenoprzeszczepu nowotworowego nowotworów, w tym glejaka5, raka trzustki6, czerniaka7-9 i kostniakomięsaka10-11. W literaturze wykorzystano zarówno techniki in ovo12, jak i ex ovo13, przy czym szczegóły różnią się w zależności od protokołu. Jednym z głównych wyzwań dla modelu ksenoprzeszczepu CAM jest stosunkowo wysoka częstość śmierci zarodka po manipulacji komórką jajową, z opublikowanymi wskaźnikami śmiertelności zarodków piskląt w zakresie od 25 do 50 procentw wieku 11-14 lat.
W tym artykule opisujemy rozwój modelu in ovo ksenoprzeszczepu HCC, który niezawodnie powoduje wzrost trójwymiarowych, unaczynionych guzów, które histologicznie przypominają niezróżnicowane HCC. Zaadaptowaliśmy protokół opisany po raz pierwszy przez Ossowskiego i wsp. 14 i osiągnęły wskaźniki przeżywalności zarodków piskląt do 93% przy wyjątkowo wysokim przeszczepie guza.

<table><tbody><tr><td>Jaja inkubowane premium</td> Charles <td>River</td><td>N/A</td><td>http://www.criver.com/files/pdfs/avian/av_c_spf_egg_price_list.aspx</td></tr><tr><td>Inkubatory do jaj</td><td>GQF</td><td>Hova-Bator 2362N</td><td></td></tr><tr><td>Obrotowe tacki na jajka</td><td>GQF</td><td>1611 Automatyczna obracarka</td><td></td>do</tr><tr><td>jaj Świecarka do jaj</td><td>Lyon</td><td>Hi-Power 950-070</td><td></td></tr><tr><td>Narzędzie obrotowe Dremel 100 z tarczą do cięcia 15/16</td><td>Dremel</td><td>100-N/7</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne kleszcze, pinezki, nożyczki preparacyjne, taśma</td><td></td><td></td><td></td>klejąca</tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>356234</td><td></td></tr><tr><td>Fiolki kriogeniczne, gwint zewnętrzny z podkładką silikonową</td><td>Corning</td><td>430659</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza z Clostridium histolyticum</td><td>Sigma</td><td>C9891</td><td></td></tr></tbody></table>

test błony chorioomoczniowej piskląt in ovo (cam) jako skuteczny model ksenoprzeszczepu raka wątrobowokomórkowego

The In Ovo Chick Chorioallantoic Membrane (CAM) Assay as an Efficient Xenograft Model of Hepatocellular Carcinoma

Błona kosmówkowo-omoczniowa piskląt (CAM) zaczyna się rozwijać w 7 dniu po zapłodnieniu i dojrzewa w 12 dniu. CAM ma naturalny niedobór odporności i jest wysoce unaczyniony, co czyni go idealnym systemem do implantacji guza. Ponadto CAM zawiera białka macierzy zewnątrzkomórkowej, takie jak fibronektyna, laminina, kolagen, integryna alfa(v)beta3 i MMP-2, co czyni go atrakcyjnym modelem do badania inwazji guza i przerzutów. Naukowcy od dawna wykorzystują fizjologię CAM, wykorzystując ją jako model angiogenezy. Niedawno test CAM został zmodyfikowany tak, aby działał jako system modelowy ksenoprzeszczepów in vivo dla różnych nowotworów, który wypełnia lukę między podstawowymi pracami in vitro a bardziej złożonymi modelami raka zwierzęcego. Test CAM pozwala na badanie wzrostu guza, terapii przeciwnowotworowych i pronowotworowych szlaków molekularnych w biologicznie istotnym systemie, który jest efektywny zarówno kosztowo, jak i czasowo. W tym miejscu opisujemy rozwój modelu ksenoprzeszczepu CAM raka wątrobowokomórkowego (HCC) z przeżywalnością zarodka do 93% i wiarygodnym pobraniem guza prowadzącym do wzrostu trójwymiarowych, unaczynionych guzów.

Poniżej przedstawiono reprezentatywne zdjęcia kluczowych etapów protokołu. Rysunek 1A obrazuje użycie świeca do wizualizacji rozwijającego się zarodka, pęcherzyka powietrznego oraz unaczynienia błony CAM. Rysunek 1B-1C pokazują proces opuszczania błony CAM poprzez wykonanie dwóch otworów i następnie zastosowanie podciśnienia za pomocą gruszki bezpieczeństwa, a Rysunek 1D przedstawia pomyślnie opuszczoną błonę CAM z dużym pęcherzem powietrznym pod otworem zaznaczonym ołów...

Błona kosmówkowo-omoczniowa (CAM) jest niedoszczepiona immunologicznie i wysoce unaczyniona, co czyni ją naturalnym modelem in vivo wzrostu guza i angiogenezy. W tym protokole opisujemy wiarygodną metodę hodowli trójwymiarowych, unaczynionych guzów raka wątrobowokomórkowego (HCC) za pomocą testu CAM.

Test błony chorioomoczniowej piskląt in ovo (CAM) jako skuteczny model ksenoprzeszczepu raka wątrobowokomórkowego

The chick chorioallantoic membrane (CAM) begins to develop by day 7 after fertilization and matures by day 12. The CAM is naturally immunodeficient and ...

Ogólnym celem niniejszego eksperymentu jest opracowanie wiarygodnego modelu ksenoprzeszczepu raka wątrobowokomórkowego w błonie oskrzeli zarodka kurczaka (CAM). Osiąga się to najpierw poprzez inkubację jaj w celu przygotowania ich do inokulacji. W drugim kroku usuwa się błonę żółtkową i chorioallantoiczną lub CAM jaja, a następnie w skorupce jaja wycina się okienko.Następnie, przez okno w skorupce jaja, do jaja aplikuje się komórki raka hepatokomórkowego człowieka w celu wywołania wzrostu guza. Wyniki pokazują, że przy użyciu linii komórkowych raka hepatokomórkowego człowieka udało się wyhodować trójwymiarowe guzy unaczynione. Stosując ten protokół, osiągnięto przeżywalność embrionów na poziomie do 93%.Głównymi zaletami testu CAM w porównaniu z innymi technikami in vivo, takimi jak mysie modele nowotworowe, są krótki czas trwania badania, niskie całkowite koszty eksperymentu oraz łatwa powtarzalność. Testy CAM mogą być wykorzystywane do badania angiogenezy, guza, inwazji komórkowej oraz przerzutów. Mogą być również stosowane do określania wpływu małych cząsteczek i leków na wzrost i rozwój nowotworów.Wizualna prezentacja tej procedury jest istotna, ponieważ przygotowanie jaja obejmuje wiele różnych etapów, w tym świecenie jaj, identyfikację naczyń krwionośnych oraz wykonywanie niewielkich nakłuć w pobliżu komory powietrznej i na szczycie jaja, bez doprowadzania do jego opróżnienia. Wycinanie okienek bez rozbicia skorupy jaja oraz upewnienie się, że zarodek pozostaje nienaruszony podczas wszystkich tych procesów, może być wyzwaniem dla nowych użytkowników. Aby rozpocząć, należy umieścić.Ośmiodniowe jaja rodzimej kury, wolne od swoistych patogenów (SPF), umieszczone w obrotowej tacy do jaj z zaznaczonymi końcami skierowanymi do góry. Umieść obrotową tacę w inkubatorze do jaj w temperaturze 36 °C i przy wilgotności 50% i inkubuj jaja przez 48 h. Po inkubacji umieść jaja w stojaku do jaj zaznaczonymi końcami do góry, a następnie wstaw je do komory z laminarnym przepływem powietrza.Wyłącz oświetlenie w pomieszczeniu i w dygestorium, a następnie lekko przyłóż ostemplowany koniec jaja do świetnika do jaj, aby odsłonić unaczynienie błony pozarodkowej pisklęcia, znanej jako CAM, oraz komorę powietrzną. Ołówkiem zaznacz miejsce pomiędzy dwoma głównymi naczyniami krwionośnymi. Następnie wykonaj jeden otwór na czubku jaja powyżej komory powietrznej przy ostemplowanym końcu oraz drugi otwór w miejscu zaznaczonym ołówkiem.Za pomocą sterylnej pinezki należy wykonać otwór o głębokości około trzech milimetrów. Należy wycisnąć powietrze z gruszki ssącej i mocno przycisnąć jej otwarty koniec do otworu nad workiem powietrznym. Powoli zwolnij nacisk na gruszkę, aby wytworzyć podciśnienie, które wciągnie powietrze przez otwór w miejscu zaznaczonym ołówkiem, co spowoduje oddzielenie się kamery od skorupy.Za pomocą świecokreślarki potwierdź, że worek powietrzny przesunął się z ostro zakończonego końca jaja do otworu zaznaczonego ołówkiem. Jeśli tak się nie stało, pogłęb nieco oba otwory i ponownie zastosuj ssanie za pomocą gruszki bezpieczeństwa. Następnie przytrzymaj jajo w jednej ręce, używając narzędzia rotacyjnego z zamontowaną tarczą tnącą o średnicy 1/16 cala.Wykonaj dwa cięcia poprzeczne przez skorupę, uważając, aby nie uszkodzić krzywki. Cięcia powinny mieć długość 2 cm i być oddalone od siebie o 1 cm. Następnie wykonaj cięcia podłużne na końcach obu cięć poprzecznych, lekko dotykając skorupy tarczą tnącą.Aby usunąć skorupkę, należy wsunąć sterylny pęsetę pod fragment skorupki, prowadząc ją równolegle do niego. Chwycić fragment pęsetą i ostrożnie go usunąć. Zagiąć jeden koniec kawałka taśmy tak, aby przylegał do siebie, a następnie zakleić otwór w jajku.Umieść jajo w tacy i wstaw tacę do inkubatora bez obracania na nie więcej niż dwie do trzech godzin przed inokulacją. Aby przygotować się do inokulacji, umieść mieszaninę białek błony podstawnej, taką jak matrigel, na lodzie, aby zapobiec polimeryzacji. Następnie użyj czterech do pięciu mililitrów 2 mM roztworu EDTA na kolbę, aby odkleić komórki nowotworowe, i umieść kolbę w inkubatorze do hodowli tkanek na pięć minut.Następnie zawiesić oddzielone komórki w medium i policzyć ich liczbę. Do przeszczepienia na błonę chalazalną (CAM) należy użyć od 500 000 do 2 milionów komórek, w zależności od linii komórkowej. Następnie przenieść objętość niezbędną do uzyskania odpowiedniej liczby komórek do nowej probówki i wirować przez pięć minut.Przy przeciążeniu 500 ×g odlej nadsącz i resuspenduj osad komórkowy w 40 µL PBS zawierającego wapń i magnez, znanego jako PBS++, oraz w 20 µL mieszaniny błony podstawnej. Na tym etapie do zawiesiny komórkowej można dodać leki lub inne substancje testowe.Następnie umieść tackę z jajami w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Oderwij taśmę z jaja, a następnie za pomocą fiolki kriogenicznej wprowadź przez otwór na rurkę kamerową sterylny silikonowy pierścień o średnicy 1 mm. Wprowadź 60 µL roztworu zawiesiny komórek, PBS++ i mieszaniny błony podstawnej do wnętrza pierścienia silikonowego, ponownie zaklej okno taśmą i ostrożnie przenieś tackę z jajami z powrotem do inkubatora.Pozostawić guzy do wzrostu przez pięć do siedmiu dni. W celu pobrania guzów należy umieścić podkład chłonny oraz worek na odpady biologiczne w komorze laminarnej.Przygotować płytki o wymiarach 35 mm na 10 mm zawierające 1 ml PBS++ oraz pojemniki z parafomaldehydem, zgodnie z potrzebami dla histologii. Wprowadzić ostrze sterylnych nożyczek do sekcji do jaja przez otwór znajdujący się w pobliżu stemplowanego końca i przeciąć wzdłuż całej długości jaja. Zarodek oraz guz z pierścieniem powinny pozostać przytwierdzone do górnej połowy skorupki z otworem.Wyjąć guz z kamery za pomocą narzędzi do dyssekcji, nożyczek i pęsety, a następnie umieścić go na płytce o wymiarach 35 mm na 10 mm. Zmierzyć i zważyć guz. Utrwalić guz w paraformaldehydzie i zalać parafiną w celu wykorzystania w badaniach histologicznych i immunohistochemicznych.Po pobraniu guza, rozdrobnić go na płytce za pomocą nożyczek chirurgicznych. Następnie przelać rozdrobniony guz do probówki do wirowania o pojemności 15 ml i usunąć PBS++ za pomocą pipety. Dodać 2 ml roztworu kolagenazy w PBS++ o stężeniu 1 mg/ml i wymieszać, kilkakrotnie odwracając probówkę.Inkubować probówkę w temperaturze 37 °C przez co najmniej 30 minut, maksymalnie do kilku godzin. Następnie dodać do probówki 5 mL pożywki i wymieszać dokładnie, pipetując od 20 do 40 razy. Jest to kluczowe dla całkowitej dysocjacji komórek.Po opadnięciu osadu przenieść supernatant do nowej probówki, odwiruj probówkę z prędkością 500 ×g przez pięć minut i odlej nadsącz, pozostawiając osad z dysocjowanych komórek. Po osadzeniu komór na błonie CAM z komórkami nowotworu HUH 7, wewnątrz pierścienia widoczny był unaczyniony guz. Po pięciu dniach wzrostu analiza histologiczna guza HUH 7 z testu CAM wykazała, że komórki nowotworowe przypominają nieróżnicowalne komórki raka wątrobowokomórkowego.Podczas pracy z tą metodą należy pamiętać, że w zależności od rodzaju użytych komórek lub leków mogą być wymagane określone optymalizacje. Na przykład niektóre linie komórkowe mogą wymagać wyższej lub niższej gęstości w celu utworzenia trójwymiarowych guzów.

the-ovo-chick-chorioallantoic-membrane-cam-assay-as-an-efficient

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Test membrany allantois-chorionu kurczaka In Ovo jako efektywny modelksenograftowy raka wątrobowokomórkowego

Błona chorioallantoiczna (CAM) zarodka kurczaka stanowi unikalne, naturalnie immunodeficyjne środowisko hodowlane do badania angiogenezy i tumorigenzy. Niniejszy artykuł wideo prezentuje poszczególne etapy hodowli kurczaka ex ovo, aplikację substancji potencjalnie angiogennych oraz skuteczną inokulację komórek i tkanek nowotworowych na powierzchni CAM.

Hodowla kurcząt ex ovo oraz test CAM ex ovo: jak to naprawdę działa

W tym filmie opisujemy wszczepianie komórek rakowych na błonę kosmówkowo-omoczniową kurczaka w celu wygenerowania modelu in ovo. Model z powodzeniem wszczepia komórki raka jajnika w celu zbadania progresji raka ginekologicznego.

Modelowanie raka błony moczowo-omoczniowej kurczaka: model in ovo do badania nowotworzenia i przerzutów komórek rakowych

W tym filmie opisujemy metodę wspólnego hodowania zwojów korzenia grzbietowego i komórek rakowych na błonie kosmówkowo-omoczniowej kurcząt lub CAM w celu zbadania inwazji okołonerwowej.

Błona kosmówkowo-omocznaniowa piskląt lub model guza CAM: metoda in ovo do symulacji okołonerwowej inwazji komórek nowotworowych

Ten film pokazuje izolację błony kosmówkowo-omoczniowej zawierającej guz od zarodka kurczaka. Pozyskany CAM może być wykorzystany do dalszych zastosowań.

Zbiór błony chorioallantoicznej piskląt: metoda izolowania błony chorioomocznowej zawierającej przeszczep guza z jaja kurzego

Błona kosmówkowo-omoczniowa (CAM) in ovo jest przeszczepiona świeżymi tkankami nowotworowymi pochodzącymi z mięsaka, ich pojedynczymi zawieszeniami komórkowymi oraz stałymi i przejściowymi fluorescencyjnie znakowanymi liniami komórkowymi mięsaka. Model służy do badania zachowań przeszczepu (żywotność, wskaźnik proliferacji Ki67, martwica, infiltracja) i gospodarza (naciekanie fibroblastów, wrastanie naczyń).

Test CAM in ovo jako model ksenoprzeszczepu mięsaka

Inwazja okołonerwowa jest agresywnym fenotypem dla raka płaskonabłonkowego głowy i szyi oraz innych nowotworów. Model błony kosmówkowo-omoczniowej pisklęcia został wykorzystany do badania angiogenezy, inwazji raka i przerzutów. Tutaj pokazujemy, w jaki sposób ten model można wykorzystać do oceny inwazji okołonerwowej in vivo.

Błona naczyniówkowo-omocznaniowa piskląt w modelu in vivo do oceny inwazji okołonerwowej w raku głowy i szyi

Rak jasnokomórkowy nerki z przerzutami jest chorobą, która nie posiada kompleksowego modelu zwierzęcego do dokładnych badań przedklinicznych. Protokół ten ilustruje dwa nowatorskie modele zwierzęce choroby: ortotopowo wszczepiony model myszy i model błony kosmówkowo-omoczniowej kurczaka, z których oba wykazują przerzuty do płuc przypominające przypadki kliniczne.

Porównanie modelu przerzutowego raka jasnokomórkowego nerki ustalonej w nerce myszy i na błonie kosmówkowo-omoczniowej kurczaka

Prezentujemy model błony kosmówkowo-omoczniowej kurczaka jako alternatywny, nadający się do przeszczepu, model in vivo do wszczepiania ginekologicznych i urologicznych linii komórkowych raka oraz guzów pochodzących od pacjentów.

Wykorzystanie błony chorio-omoczniowej kurczaka w modelu in vivo do badania nowotworów ginekologicznych i urologicznych

Ten protokół opisuje trzy metody pozyskiwania i wykorzystywania zarodków kurczaków w wieku od 5 do 8 dni oraz ich błony kosmówkowo-omoczniowej (CAM) jako modelu in vivo do badania obrazowania ultrasonograficznego z kontrastem i dostarczania leków za pośrednictwem mikropęcherzyków.

Przygotowanie zarodków ex ovo kurczaków i naczyń błony moczowo-omoczniowej jako modelu in vivo do obrazowania ultrasonograficznego ze wzmocnieniem kontrastowym i badań nad dostarczaniem leków za pośrednictwem mikropęcherzyków

Tutaj opisujemy protokół rozwoju modelu ksenoprzeszczepu błony kosmówkowo-omoczniowej (CAM) dla ludzkiej tkanki jajnika i demonstrujemy skuteczność tej techniki, ramy czasowe rewaskularyzacji przeszczepu oraz żywotność tkanki w ciągu 6-dniowego okresu szczepienia.

Model błony moczowo-omoczniowej kurcząt (CAM) jako narzędzie do badania przeszczepu tkanki jajnika

Poznaj metodę ksenoprzeszczepu raka wątrobowokomórkowego na błonie chorioomoczniowej piskląt. Model CAM umożliwia hodowlę trójwymiarowych, unaczynionych guzów z przeżywalnością zarodków do 93%.

Test błony chorioomoczniowej piskląt in ovo (CAM) jako skuteczny model ksenoprzeszczepu raka wątrobowokomórkowego

Przeglądaj więcej filmów