Name: Test kolorymetryczny, który specyficznie mierzy aktywność proteolityczną Granzyme B: hydroliza Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 20 s
Description: Poznaj kolorymetryczny test pomiaru aktywności proteolitycznej Granzyme B w próbkach ludzkich, mysich lub szczurzych. Ta metoda pozwala badaczom ilościowo ocenić funkcję proteazy z wysoką specyficznością.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca otrzymała wsparcie w postaci grantu HA 6136/1-1 od Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Niemieckiej Fundacji Badawczej) dla MH. JAT jest wspierany przez granty programowe i projektowe Narodowej Rady Zdrowia i Badań Medycznych Australii.

UWAGA: Śledziony pochodziły od myszy (w wieku 6-10 tygodni), a wszystkie eksperymenty na zwierzętach przeprowadzono zgodnie z wytycznymi etyki zwierzęcej Centrum Onkologicznego Petera MacCalluma (E486).
1. Przygotowanie próbek.
<ol>
	<li>Przygotowanie aktywowanych mysich komórek NK.
	<ol>
		<li>Wyizoluj pierwotne naiwne komórki NK z jednokomórkowych zawiesin śledziony myszy C57BL / 6 lub B6.GrzmB-/- (GzmB gen zerowy) przez selekcję negatywną przy użyciu dostępnych na rynku zestawów.</li>
		<li>Postępuj zgodnie z protokołem producenta. Krótko mówiąc, magnetycznie znakuj komórki "inne niż NK", takie jak limfocyty T i B, komórki dendrytyczne, granulocyty, makrofagi i czerwone krwinki, używając przeciwciał sprzężonych z biotyną przeciwko ich specyficznym markerom powierzchniowym. Użyj separacji magnetycznej za pomocą kulek anty-biotyny, aby zubożyć komórki "inne niż NK".</li>
		<li>Hodowla izolowanych komórek NK przez 5-7 dni w pożywce zawierającej IL-2 (1 000 U/ml) w stężeniu 700 000 komórek/ml na 24-dołkowych płytkach w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Alternatywnie, użyj aktywowanych limfocytów T 19, pierwotnego CTL z ograniczeniem antygenu od transgenicznych myszy z receptorem komórek T OT1 20, CTL generowanych w mieszanych kulturach limfocytów 21 lub supernatantów z aktywowanych komórek NK w celu określenia aktywności wydzielanego GzmB 19.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Utrzymanie ludzkiej linii komórkowej NK i izolacja pierwotnych komórek NK.
	<ol>
		<li>Utrzymuj ludzką białaczkę NK (komórki YT) w pożywce Roswell Park Memorial Institute (RPMI) uzupełnionej 10% płodową surowicą cielęcą. Alternatywnie, oczyść pierwotne komórki NK z krwi obwodowej zdrowych osób i stymuluj przez 2-3 dni w pożywce zawierającej IL-2 w stężeniu 100 U/ml, jak opisano wcześniej 22.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wytwarzanie lizatów komórkowych.
	<ol>
		<li>Umyj komórki trzykrotnie w PBS (pH 7,4), a następnie zawieś w buforze do lizy Nonidet P-40 (0,1% NP-40, 250 mM NaCl, 25 mM Hepes, 2,5 mM EDTA). Najlepiej lizować co najmniej 5 x 106 komórek NK lub 1 x 107 komórek T w buforze 100 μl. Nie należy dodawać inhibitorów proteazy, ponieważ wiele z nich jest nieodwracalnymi inhibitorami proteaz serynowych, a w szczególności tryptaz, takich jak GzmA. Inkubować na lodzie przez 20 minut, a następnie granulować jądra w mikrowirówce o stężeniu 15 000 x g przez 10 minut. Wyrzucić osad jądrowy i przenieść supernatant do świeżej probówki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Określić stężenie białka w lizatach.
	<ol>
		<li>Użyj dostępnego na rynku protokołu z wyboru, takiego jak kwas Bradforda lub kwas bicinchoninowy (BCA) i określ stężenie białka. Upewnij się, że stężenie wynosi minimum ~2 mg/ml. Przechowywać lizaty w temperaturze -20 °C do momentu, gdy będą potrzebne (aktywność granzyme jest stabilna przez wiele miesięcy w temperaturze -20 °C).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Test aktywności Granzyme B
<ol>
	<li>Przygotowanie odczynników
	<ol>
		<li>Przygotować 10 mM zapasu substratów (Boc-AAD-S-Bzl lub Ac-IEPD-pNA) w DMSO (~5 mg/ml) i przechowywać w podwielokrotnościach w temperaturze -20 °C. Przygotować świeżo roztwór roboczy i wyrzucić po każdym dniu, ponieważ Boc-AAD-S-Bzl ulega częściowej hydrolizie podczas przechowywania w DMSO.</li>
		<li>Przygotować 250 mM zapasu odczynnika kolorymetrycznego (5,5'-ditio-bis(kwas 2-nitrobenzoesowy), DTNB) w DMSO (0,09 g/ml) i przechowywać w temperaturze -20 °C. Codziennie przygotowywać świeże rozcieńczenie robocze. Ten odczynnik jest wymagany tylko dla podłoży z grupami wskaźnikowymi SBzl, a nie pNA.</li>
		<li>Uzupełnij świeży bufor (0,1 M HEPES, 0,05 M MgCl2, pH 7,3) co 2-3 tygodnie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Doprowadź DTNB i podłoża syntetyczne do temperatury pokojowej. Rozcieńczyć substraty (1:16, np. 100 μl w 1,6 ml buforu) i DTNB (1:250, np. 10 μl w 2,5 ml buforu) i dobrze wymieszać.</li>
	<li>Rozcieńczyć co najmniej 100 μg lizatu białkowego z każdej próbki w buforze do końcowej objętości 160 μl. Za pomocą pipety wielokanałowej dodać 50 μl na studzienkę w trzech powtórzeniach (~33,3 μg/dołek) na dolnej płytce winylowej 96-dołkowej w kształcie litery "U". Dołącz kontrolkę "tylko bufor" (również w trzech egzemplarzach).</li>
	<li>Dodać 100 μl rozcieńczonego DTNB do próbki/buforu kontrolnego (pomiń ten krok podczas pracy z Ac-IEPD-pNA. 
	UWAGA: Rozszczepienie Ac-IEPD-pNA przez GzmB bezpośrednio uwalnia fluorogenne pNA (Figura 4B).</li>
	<li>Za pomocą pipety wielokanałowej szybko dodaj 50 μl rozcieńczonych substratów do każdego zestawu trzech próbek, zaczynając od buforu, następnie wszelkich kontroli ujemnych, a kończąc na oczekiwanych próbkach dodatnich.</li>
	<li>Umieść płytkę w czytniku płytek. Zmierzyć aktywność Asp-azy przez hydrolizę Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl/Ac-IEPD-pNA w czytniku mikropłytek przy OD 405 nm. Użyj protokołu testu kinetycznego, wykonaj 25 odczytów co 15 sekund (ok. 6 minut całkowitego czasu odczytu).</li>
	<li>Użyj odczytów absorbancji wygenerowanych w każdym punkcie czasowym, aby ręcznie obliczyć szybkość rozszczepiania substratu, jeśli oprogramowanie czytnika płytek nie może wygenerować wartości Vmax.</li>
</ol>
3. Analiza danych
UWAGA: Wygenerowane dane są prezentowane jako maksymalna prędkość, zdefiniowana jako zmiana OD w czasie (mOD/min).
<ol>
	<li>Aby przeanalizować dane, określ maksymalną szybkość rozszczepiania substratu, która jest obliczana na podstawie szybkości zmiany absorbancji. Zrób to automatycznie za pomocą oprogramowania do odczytywania płytek, które zazwyczaj ma tę opcję.</li>
	<li>Alternatywnie, po przejrzeniu wykresów kinetycznych zmian absorbancji, które są generowane podczas testu kinetycznego na czytniku płytek, należy ręcznie wybrać punkty danych, które dają najbardziej stromą linię prostą. W przypadku większości testów maksymalna szybkość jest osiągana w ciągu pierwszych 2 minut testu.</li>
	<li>Odejmij początkowy odczyt OD od najwyższego odczytu OD na tej linii prostej i podziel przez przedział czasu. Przenieś surowe dane do programu Microsoft Excel/Graph pad w celu analizy statystycznej i wyświetlenia graficznego.</li>
</ol>

<ol><li>Trapani, J. A., Browne, K. A., Dawson, M., Smyth, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunopurification+of+functional+Asp-ase+%28natural+killer+cell+granzyme+B%29+using+a+monoclonal+antibody%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Immunopurification of functional Asp-ase (natural killer cell granzyme B) using a monoclonal antibody).</a> Biochem Biophys Res Commun. 195 (2), 910-920 (1993).</li>
<li>Ewen, C. L., Kane, K. P., Bleackley, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quarter+century+of+granzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">A quarter century of granzymes.</a> Cell Death Differ. 19 (1), 28-35 (2012).</li>
<li>Hoves, S., Trapani, J. A., Voskoboinik, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+battlefield+of+perforin%2Fgranzyme+cell+death+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">The battlefield of perforin/granzyme cell death pathways.</a> J Leukoc Biol. , (2009).</li>
<li>Peters, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxic+T+lymphocyte+granules+are+secretory+lysosomes%2C+containing+both+perforin+and+granzymes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Cytotoxic T lymphocyte granules are secretory lysosomes, containing both perforin and granzymes.</a> J Exp Med. 173 (5), 1099-1109 (1991).</li>
<li>Berthou, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acquisition+of+granzyme+B+and+Fas+ligand+proteins+by+human+keratinocytes+contributes+to+epidermal+cell+defense%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Acquisition of granzyme B and Fas ligand proteins by human keratinocytes contributes to epidermal cell defense.</a> J Immunol. 159 (11), 5293-5300 (1997).</li>
<li>Tschopp, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Granzyme+B%2C+a+novel+mediator+of+allergic+inflammation%3A+its+induction+and+release+in+blood+basophils+and+human+asthma%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Granzyme B, a novel mediator of allergic inflammation: its induction and release in blood basophils and human asthma.</a> Blood. 108 (7), 2290-2299 (2006).</li>
<li>Strik, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+mast+cells+produce+and+release+the+cytotoxic+lymphocyte+associated+protease+granzyme+B+upon+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Immunol%22%5BJournal%5D)">Human mast cells produce and release the cytotoxic lymphocyte associated protease granzyme B upon activation.</a> Mol Immunol. 44 (14), 3462-3472 (2007).</li>
<li>Jahrsdorfer, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Granzyme+B+produced+by+human+plasmacytoid+dendritic+cells+suppresses+T+cell+expansion%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Granzyme B produced by human plasmacytoid dendritic cells suppresses T cell expansion.</a> Blood. , (2009).</li>
<li>Hagn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+B+cells+secrete+granzyme+B+when+recognizing+viral+antigens+in+the+context+of+the+acute+phase+cytokine+IL-21%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Human B cells secrete granzyme B when recognizing viral antigens in the context of the acute phase cytokine IL-21.</a> J Immunol. 183 (3), 1838-1845 (2009).</li>
<li>Hagn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+B+cells+differentiate+into+granzyme+B-secreting+cytotoxic+B+lymphocytes+upon+incomplete+T-cell+help%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Human B cells differentiate into granzyme B-secreting cytotoxic B lymphocytes upon incomplete T-cell help.</a> Immunol Cell Biol. 90 (4), 457-467 (2012).</li>
<li>Froelich, C. J., Pardo, J., Simon, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Granule-associated+serine+proteases%3A+granzymes+might+not+just+be+killer+proteases%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">Granule-associated serine proteases: granzymes might not just be killer proteases.</a> Trends Immunol. 30 (3), 117-123 (2009).</li>
<li>Hagn, M., Jahrsdorfer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+do+human+B+cells+secrete+granzyme+B%3F+Insights+into+a+novel+B-cell+differentiation+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Oncoimmunology%22%5BJournal%5D)">Why do human B cells secrete granzyme B? Insights into a novel B-cell differentiation pathway.</a> Oncoimmunology. 1 (8), 1368-1375 (2012).</li>
<li>Susanto, O., Trapani, J. A., Brasacchio, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controversies+in+granzyme+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Antigens%22%5BJournal%5D)">Controversies in granzyme biology.</a> Tissue Antigens. 80 (6), 477-487 (2012).</li>
<li>Walch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxic+cells+kill+intracellular+bacteria+through+granulysin-mediated+delivery+of+granzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cytotoxic cells kill intracellular bacteria through granulysin-mediated delivery of granzymes.</a> Cell. 157 (6), 1309-1323 (2014).</li>
<li>Odake, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+and+murine+cytotoxic+T+lymphocyte+serine+proteases%3A+subsite+mapping+with+peptide+thioester+substrates+and+inhibition+of+enzyme+activity+and+cytolysis+by+isocoumarins%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Human and murine cytotoxic T lymphocyte serine proteases: subsite mapping with peptide thioester substrates and inhibition of enzyme activity and cytolysis by isocoumarins.</a> Biochemistry. 30 (8), 2217-2227 (1991).</li>
<li>Casciola-Rosen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+and+human+granzyme+B+have+distinct+tetrapeptide+specificities+and+abilities+to+recruit+the+bid+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Mouse and human granzyme B have distinct tetrapeptide specificities and abilities to recruit the bid pathway.</a> J Biol Chem. 282 (7), 4545-4552 (2007).</li>
<li>Kaiserman, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+major+human+and+mouse+granzymes+are+structurally+and+functionally+divergent%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The major human and mouse granzymes are structurally and functionally divergent.</a> J Cell Biol. 175 (4), 619-630 (2006).</li>
<li>Powers, J. C., Kam, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide+thioester+substrates+for+serine+peptidases+and+metalloendopeptidases%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Peptide thioester substrates for serine peptidases and metalloendopeptidases.</a> Methods Enzymol. 248, 3-18 (1995).</li>
<li>Hagn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activated+mouse+B+cells+lack+expression+of+granzyme%5BTitle%5D)+AND+%22B.+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Activated mouse B cells lack expression of granzyme.</a> B. J Immunol. 188 (2), 3886-3892 (2012).</li>
<li>Konjar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+and+mouse+perforin+are+processed+in+part+through+cleavage+by+the+lysosomal+cysteine+proteinase+cathepsin+L%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Human and mouse perforin are processed in part through cleavage by the lysosomal cysteine proteinase cathepsin L.</a> Immunology. 131 (2), 257-267 (2010).</li>
<li>Sutton, V. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Residual+active+granzyme+B+in+cathepsin+C-null+lymphocytes+is+sufficient+for+perforin-dependent+target+cell+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Residual active granzyme B in cathepsin C-null lymphocytes is sufficient for perforin-dependent target cell apoptosis.</a> J Cell Biol. 176 (4), 425-433 (2007).</li>
<li>Trapani, J. A., Smyth, M. J., Apostolidis, V. A., Dawson, M., Browne, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Granule+serine+proteases+are+normal+nuclear+constituents+of+natural+killer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Granule serine proteases are normal nuclear constituents of natural killer cells.</a> J Biol Chem. 269 (28), 18359-18365 (1994).</li>
<li>Cullen, S. P., Adrain, C., Luthi, A. U., Duriez, P. J., Martin, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+and+murine+granzyme+B+exhibit+divergent+substrate+preferences%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Human and murine granzyme B exhibit divergent substrate preferences.</a> J Cell Biol. 176 (4), 435-444 (2007).</li>
<li>Thornberry, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+combinatorial+approach+defines+specificities+of+members+of+the+caspase+family+and+granzyme+B.+Functional+relationships+established+for+key+mediators+of+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">A combinatorial approach defines specificities of members of the caspase family and granzyme B. Functional relationships established for key mediators of apoptosis.</a> J Biol Chem. 272 (29), 17907-17911 (1997).</li>
<li>Bird, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+regulation+of+apoptosis%3A+the+cytotoxic+lymphocyte+serpin+proteinase+inhibitor+9+protects+against+granzyme+B-mediated+apoptosis+without+perturbing+the+Fas+cell+death+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Selective regulation of apoptosis: the cytotoxic lymphocyte serpin proteinase inhibitor 9 protects against granzyme B-mediated apoptosis without perturbing the Fas cell death pathway.</a> Mol Cell Biol. 18 (11), 6387-6398 (1998).</li>
<li>Bots, M., Medema, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serpins+in+T+cell+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Serpins in T cell immunity.</a> J Leukoc Biol. 84 (5), 1238-1247 (2008).</li>
<li>Sun, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+family+of+10+murine+ovalbumin+serpins+includes+two+homologs+of+proteinase+inhibitor+8+and+two+homologs+of+the+granzyme+B+inhibitor+%28proteinase+inhibitor+9%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">A new family of 10 murine ovalbumin serpins includes two homologs of proteinase inhibitor 8 and two homologs of the granzyme B inhibitor (proteinase inhibitor 9).</a> J Biol Chem. 272 (24), 15434-15441 (1997).</li>
<li>Bird, C. H., Hitchen, C., Prescott, M., Harper, I., Bird, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunodetection+of+granzyme+B+tissue+distribution+and+cellular+localisation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Immunodetection of granzyme B tissue distribution and cellular localisation.</a> Methods Mol Biol. 844, 237-250 (2012).</li>
<li>Jenkins, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+CTL+activity+for+different+CD8%2B+effector+T+cells+supports+the+idea+that+lower+TCR%2Fepitope+avidity+may+be+advantageous+for+target+cell+killing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Visualizing CTL activity for different CD8+ effector T cells supports the idea that lower TCR/epitope avidity may be advantageous for target cell killing.</a> Cell Death Differ. 16 (4), 537-542 (2009).</li>
<li>Edwards, K. M., Kam, C. M., Powers, J. C., Trapani, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+cytotoxic+T+cell+granule+serine+protease+granzyme+H+has+chymotrypsin-like+%28chymase%29+activity+and+is+taken+up+into+cytoplasmic+vesicles+reminiscent+of+granzyme+B-containing+endosomes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The human cytotoxic T cell granule serine protease granzyme H has chymotrypsin-like (chymase) activity and is taken up into cytoplasmic vesicles reminiscent of granzyme B-containing endosomes.</a> J Biol Chem. 274 (43), 30468-30473 (1999).</li>
<li>Sutton, V. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initiation+of+apoptosis+by+granzyme+B+requires+direct+cleavage+of+bid%2C+but+not+direct+granzyme+B-mediated+caspase+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Initiation of apoptosis by granzyme B requires direct cleavage of bid, but not direct granzyme B-mediated caspase activation.</a> J Exp Med. 192 (10), 1403-1414 (2000).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Historycznie rzecz biorąc, granzymy zostały zidentyfikowane jako kluczowe cząsteczki efektorowe cytotoksycznych limfocytów (komórek CTL i NK) zdolne do indukowania szybkiej śmierci apoptotycznej w komórkach docelowych. Wynikało to głównie z działania GzmB, który rozszczepiał cząsteczki docelowego substratu na resztach asparaginianu (D), a tym samym był w stanie aktywować kaskadę kaspazy zarówno poprzez rozszczepianie pro-kaspaz, jak i kilku ich dalszych celów. Jednak obecnie uznaje się, że ekspresja GzmB nie ogranicza si...

Granzymes to rodzina proteaz serynowych znajdujących się w lizosomach wydzielniczych komórek NK i cytotoksycznych limfocytów T (CTL) 1. U ludzi (A, B, H, K i M) występuje pięć różnych granzymów, a u myszy (A - G, K, M i N) 10 2,3. Granzyme A i Granzyme B (GzmA, GzmB) są najliczniejsze i zostały szeroko przebadane w środowisku ludzi i gryzoni.
Klasyczną funkcją GzmB jest indukcja apoptozy w komórkach docelowych wykonywana w połączeniu z białkiem tworzącym pory perforyną, które umożliwia granzymowi dostęp do cytozolu 4 komórki docelowej. Chociaż ekspresja GzmB jest jednoznacznie stwierdzona w limfocytach cytotoksycznych, ostatnie badania dotyczą wielu innych typów komórek wykazujących ekspresję GzmB, w tym między innymi keratynocytów 5, bazofili 6, komórek tucznych 7, plazmocytoidalnych komórek dendrytycznych 8 i limfocytów B 9,10. W tym kontekście ujawniono nieapoptotyczne funkcje GzmB, począwszy od udziału w procesach zapalnych, przebudowy tkanek i innych właściwości immunoregulacyjnych 11-14.
Biorąc pod uwagę, że zaproponowano szerszą biologiczną rolę GzmB niż wcześniej podejrzewano, badacze potrzebują niezawodnych i konkretnych narzędzi do jego wykrywania. Zaletą jest specyficzne wymaganie GzmB do rozszczepiania po stronie karboksylowej reszt kwasu asparaginowego, właściwość unikalna wśród eukariotycznych proteaz serynowych 15. GzmB myszy, człowieka i szczura są strukturalnie bardzo podobne, jednak rozszerzona specyficzność substratu myszy GzmB różni się nieznacznie od swoistości zarówno człowieka, jak i szczura 16, co oznacza, że niektóre ogólne substraty z Asp na końcu (P1) mogą być skutecznie rozszczepiane przez GzmB ze wszystkich trzech gatunków, podczas gdy inne substraty z bardziej skomplikowanymi sekwencjami przed P1 mogą dawać bardzo zróżnicowane wyniki. Zarówno w dawnej, jak i nowszej literaturze fakt ten spowodował znaczne zamieszanie i błędną interpretację biologicznego znaczenia niektórych wyników eksperymentalnych, mimo że starannie kontrolowane, badania kinetyczne starały się skorygować tę sytuację 17.
W tym artykule staraliśmy się zilustrować te punkty za pomocą dwóch dostępnych na rynku substratów, a mianowicie Boc-Ala-Ala-Asp-SBzl i N-acetyl-Ile-Glu-Pro-Asp-p-nitroanilidku. Te dwa odczynniki generują różne grupy reaktywne po rozszczepieniu (wolny sulfirryl kontra fluorescencyjny wolny paranitroanilid), ale nie ma to żadnego wpływu na rozszczepienie proteolityczne. Opisany protokół jest nowoczesną adaptacją bardzo starego protokołu 18, ale powinien pomóc badaczom w odpowiednim wykorzystaniu różnych substratów GzmB, zapewniając jednocześnie ramy metodologiczne do wykrywania aktywności innych granzymów, takich jak GzmA i GzmH.

<table><tbody><tr><td>Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl</td><td>SM Biochemicals LLC, CA</td><td>SMSB05</td><td>Podłoże Granzyme B (mysz i człowiek)</td></tr><tr><td>Ac-IEPD-pNA&nbsp;</td><td>SM Biochemicals LLC, CA</td><td>SMPNA009</td><td>Podłoże Granzyme B (tylko ludzkie)</td></tr><tr><td>N-&#945;-CBZ-L-lizyna-S-Bzl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3647</td><td>Podłoże Granzyme A</td></tr><tr><td>Suc-Phe-Leu-Phe-S-Bzl</td><td>SM Biochemicals LLC, CA</td><td>SB025</td><td>Podłoże Granzyme H</td></tr><tr><td>5,5'-dithio-bis(kwas 2-nitrobenzoesowy)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8130</td><td>DTNB, Ellman' s Odczynnik</td></tr><tr><td>Zestaw do izolacji komórek NK Mysz II</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-096-892</td><td>zestaw do selekcji negatywnej</td></tr><tr><td>Zestaw do izolacji komórek NK ludzki</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-092-657</td><td>zestaw do selekcji negatywnej</td></tr><tr><td>Czytnik płytek</td><td>Biorad iMark</td><td></td><td>Biorad Microplate Manager Wersja oprogramowania MPM6.3</td></tr><tr><td>Serocluster U-bottom winylowa płytka 96-dołkowa</td><td>Corning, MA, USA</td><td>2797</td><td></td></tr></tbody></table>

test kolorymetryczny, który specyficznie mierzy aktywność proteolityczną granzyme b: hydroliza boc-ala-ala-asp-s-bzl

A Colorimetric Assay that Specifically Measures Granzyme B Proteolytic Activity: Hydrolysis of Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl

Proteaza serynowa Granzyme B (GzmB) pośredniczy w apoptozie komórek docelowych, gdy jest uwalniana przez cytotoksyczne limfocyty T (CTL) lub komórki NK (NK). GzmB jest najczęściej badanym granzymem u ludzi i myszy, dlatego naukowcy potrzebują konkretnych i wiarygodnych narzędzi do badania jego funkcji i roli w patofizjologii. Wymaga to szczególnie testów, które nie rozpoznają proteaz, takich jak kaspazy lub inne granzymy, które są strukturalnie lub funkcjonalnie powiązane. Tutaj stosujemy preferencję GzmB dotyczącą rozszczepienia po resztach kwasu asparaginowego w teście kolorymetrycznym przy użyciu peptydu tioestru Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl. GzmB jest jedyną ssaczą proteazą serynową zdolną do rozszczepienia tego substratu. Substrat jest rozszczepiany z podobną wydajnością przez GzmB ludzi, myszy i szczurów, co jest właściwością niepodzielną dla innych dostępnych na rynku substratów peptydowych, nawet takich, które są reklamowane jako odpowiednie do tego celu. Protokół ten jest demonstrowany przy użyciu niefrakcjonowanych lizatów z aktywowanych komórek NK lub CTL i jest również odpowiedni dla rekombinowanych proteaz generowanych w różnych systemach prokariotycznych i eukariotycznych, pod warunkiem, że stosowane są odpowiednie kontrole. Test ten jest wysoce specyficzną metodą służącą do ustalenia potencjalnej aktywności proapoptotycznej cząsteczek cytotoksycznych w limfocytach ssaków oraz ich rekombinowanych odpowiedników wyrażanych za pomocą różnych metodologii.

Substrat Boc-AAD-S-Bzl jest swoisty dla GzmB
Serynowa proteaza GzmB jest głównym składnikiem limfocytów cytotoksycznych (komórek CTL i NK) i odpowiada przede wszystkim za indukcję szybkiej śmierci apoptotycznej w komórkach docelowych, takich jak komórki zainfekowane wirusem lub przekształcone. Wynika to w dużej mierze z preferencji substratowej w kierunku cięcia po określonych, specyficznych resztach asparaginianu w wybranych białkach – cechy wspólnej z kaspazami, które równie...

Opisujemy prosty, ilościowy test kolorymetryczny, który konkretnie mierzy aktywność proteolityczną ludzkiego, mysiego lub szczurzego Granzyme B (GzmB). Protokół ten można łatwo dostosować do określania aktywności proteazy innych granulowanych proteaz serynowych poprzez hydrolizę innych syntetycznych substratów peptydowych z odpowiednią sekwencją rozpoznawania.

Test kolorymetryczny, który specyficznie mierzy aktywność proteolityczną Granzyme B: hydroliza Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl

The serine protease Granzyme B (GzmB) mediates target cell apoptosis when released by cytotoxic T lymphocytes (CTL) or natural killer (NK) cells. GzmB is ...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest pomiar aktywności proteolitycznej proteazy wewnątrzkomórkowej granzymy B. Osiąga się to poprzez przygotowanie lizatu badanych komórek, a następnie szybkie dodanie substratu do próbek. Aktywność granzymy B jest następnie mierzona za pomocą reakcji kolorymetrycznej. Ostatecznie wysoce specyficzne cięcie alla alla as s benzo przez granzymę B może zostać ocenione na podstawie jej unikalnej specyficzności substratowej względem reszt kwasu aspartylowego.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak wykrywanie ekspresji granzymy B za pomocą PCR lub Western blot, jest fakt, że hydroliza benzylowa jest specyficzna dla granzymy B i jednocześnie wskazuje na aktywność proteazy. Aby przygotować lizaty komórkowe, należy najpierw wyizolować pierwotne komórki NK z zawiesin pojedynczych komórek śledziony myszy typu dzikiego C 57 black six lub myszy kontrolnych z nokautem genu granzymy B poprzez selekcję negatywną z użyciem dostępnych komercyjnie zestawów, zgodnie z instrukcjami producenta, po uprzedniej aktywacji komórek. Kulturę należy przemyć trzykrotnie w PBS, wirując z maksymalną prędkością przez 2–3 sekundy, a następnie zawiesić osad zawierający minimum 5 milionów komórek NK w 100 µL buforu do lizy Nont P 40 na lodzie przez 20 minut.Następnie odwiruj lizat w mikrocentryfudze przez 10 minut przy 15 000 Gs i przenieś nadsadew do nowej probówki. Po oznaczeniu stężenia białka zgodnie z odpowiednim, dostępnym komercyjnie protokołem, przechowuj próbkę w stężeniu co najmniej około 2 mg/ml w temperaturze -20 °C w celu przeprowadzenia testu aktywności granzymu B. Następnie rozcień co najmniej 100 µg białka z lizatu na próbkę w świeżo przygotowanym buforze HEPS do końcowej objętości 160 µl.Następnie, używając pipety wielokanałowej, nanieś 50 µL próbki na dołek w trzech powtórzeniach do winylowej płytki 96-dołkowej z dnem w kształcie litery U. Dbając o uwzględnienie trzech dołków kontrolnych zawierających sam bufor, dodaj do każdego 100 µL rozcieńczonego DTNB. Następnie szybko dodaj 50 µL świeżo rozcieńczonego substratu alala asks s benzoyl do każdego z dołków z samym buforem, następnie do kontroli negatywnych, kończąc na próbkach z oczekiwanym wynikiem dodatnim.Zmierz aktywność aase poprzez hydrolizę alala as benzyl w czytniku mikropłytek przy gęstości optycznej 405 nanometrów, stosując protokół analizy kinetycznej z 25 pomiarami co 15 sekund. Następnie, za pomocą oprogramowania czytnika płytek, oblicz maksymalną szybkość rozszczepiania substratu dla każdej dołki, a następnie przenieś surowe dane do odpowiedniego oprogramowania do analizy statystycznej, wykorzystując myszy z nokautem genu granzyme. Odkryto, że syntetyczny substrat peptydowy alala as benzyl jest specyficznie hydrolizowany przez granzyme B. Dalsze intensywne rozszczepianie syntetycznego substratu można zmierzyć w lizatach komórkowych z pierwotnych komórek NK typu dzikiego, ale nie w komórkach NK pochodzących od zwierząt z nokautem granzyme B, które służą jako kontrola.W tym doświadczeniu aktywność proteolityczna granzymu A, który wykazuje specyficzność substratową podobną do trypsyny i występuje w lizatach obu typów komórek, była równa, co zmierzono poprzez hydrolizę BLT benzyl, I-E-P-D-P-N-A, który był stosowany ogólnie do badania aktywności granzymu B u różnych gatunków. W tym reprezentatywnym doświadczeniu analiza sekwencji tetrapeptydowych wykazała, że ludzki, ale nie mysi granzym B, może efektywnie przecinać po sekwencji IEPD, która odpowiada sekwencji rozpoznawczej w białku bid zarówno u ludzi, jak i u myszy. Z kolei zmniejszenie ilości lizatu ludzkich komórek białaczki NK z 30 µg do 10 µg nadal skutkuje obecnością wystarczającej ilości granzymu B do hydrolizy substratu I-E-P-D-P-N-A.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat wyboru odpowiedniego substratu oraz kontroli eksperymentalnych do analizy in vitro czerwonego enzymu B u ludzi i myszy.

a-colorimetric-assay-that-specifically-measures-granzyme-b

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

Test kolorymetryczny, który specyficznie mierzy aktywność proteolityczną granzymy B: Hydroliza Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl

W tym filmie wykonujemy zymografię, technikę elektroforetyczną, aby przeanalizować aktywność proteolityczną w próbkach biologicznych.

Fluorescencyjna zymografia peptydów: zmodyfikowana technika wykrywania aktywności proteazy za pomocą substratów fluorogennych w żelach zymogramowych

Ten film opisuje test luminescencyjny in vitro kaspazy-3/7 do ilościowego określenia śmierci komórki lub apoptozy. Test mierzy luminescencję wytwarzaną po rozszczepieniu kaspazy-3/7 proluminescencyjnego substratu DEVD. Generowana luminescencja jest proporcjonalna do aktywności kaspazy-3/7.

Test kaspazy-3/7: Test oparty na luminescencji do ilościowego określania apoptozy poprzez pomiar aktywności kaspazy-3/7 w eksplantatach skóry żaby

Ten film demonstruje test do badania proteolitycznego aktywności proteaz za pomocą peptydów fluorogennych. Proteaza rozpoznaje miejsce jego rozszczepienia na peptydzie, rozszczepiając go i oddzielając wygaszacz od fluoroforu, umożliwiając jego emisję fluorescencyjną. Sygnał fluorescencyjny jest wykrywany i analizowany w celu sprawdzenia wydajności rozszczepienia różnych wariantów peptydów.

Test rozszczepienia peptydów fluorogenicznych w celu zbadania aktywności proteolitycznej proteaz

Ten film demonstruje test do monitorowania aktywacji neutrofili i egzocytozy granulek za pomocą testu degranulacji. Po aktywacji przez związki prozapalne, ziarnistości cytoplazmatyczne w neutrofilach zawierających żelatynazę łączą się z błoną komórkową, uwalniając swój ładunek. Obecność żelatynazy w supernatancie ocenia się poprzez hydrolizę substratu żelatyny sprzężonego z fluoroforem, potwierdzając aktywację i degranulację neutrofili.

Test degranulacji w celu monitorowania aktywacji neutrofili i uwalniania żelatynazy

Ten film demonstruje test degranulacji granulek azurofilowych u neutrofili myszy, polegający na stymulacji neutrofili do uwalniania granulek azurofilowych zawierających mieloperoksydazę. Następująca po niej reakcja enzymatyczna jest wykorzystywana do ilościowego określenia poziomów mieloperoksydazy, dostarczając informacji na temat aktywacji neutrofili.

Test do monitorowania degranulacji granulek azurofilowych w neutrofilach po aktywacji

Opisujemy tutaj opłacalny system ekspresji granzymu wykorzystujący komórki HEK293T, który daje wysokie plony czystej, w pełni glikozylowanej i enzymatycznie aktywnej proteazy.

Wysokowydajny i ekonomiczny system ekspresji ludzkich granzymów w komórkach ssaków

Tutaj prezentujemy protokoły do szybkiego badania i charakteryzowania enzymów pod kątem aktywności przeciwdrobnoustrojowej. Test dyfuzji mikroszkiełkowej i test uwalniania barwnika wykorzystują docelowe substraty bakteryjne do jakościowej i ilościowej oceny aktywności enzymatycznej.

Testy jakościowe i ilościowe do wykrywania i charakterystyki białkowych środków przeciwdrobnoustrojowych

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół dla zmodyfikowanej techniki zymograficznej, w której peptydy fluorescencyjne są używane jako degradowalny substrat zamiast natywnych białek. Elektroforeza próbek biologicznych w fluorescencyjnych zymogramach peptydowych umożliwia wykrycie szerszego zakresu proteaz niż dotychczasowe techniki zymograficzne.

Wykrywanie aktywności proteazy za pomocą fluorescencyjnej symografii peptydowej

Obecny protokół opisuje dwie metody pomiaru aktywności kaspazy za pomocą substratu fluorogenicznego za pomocą cytometrii przepływowej lub spektrofluorometru.

Pomiar aktywności kaspazy za pomocą testu fluorometrycznego lub cytometrii przepływowej

Tutaj opisujemy protokoły biofizycznej charakterystyki tworzenia kompleksów trójskładnikowych indukowanych przez chimery ukierunkowane na proteolizę (PROTACS), które obejmują ligazy ubikwityny: ligazę Von Hippel-Lindau, ligazę E3 (VHL) i Cereblon (CRBN).  Metody biofizyczne zilustrowane w niniejszym artykule obejmują powierzchniowy rezonans plazmonowy (SPR), interferometrię biowarstwową (BLI) i izotermiczną kalorymetrię miareczkową (ITC).

Opracowanie i zastosowanie testów biofizycznych do oceny tworzenia kompleksów trójskładnikowych indukowanych przez chimery ukierunkowane na proteolizę (PROTACS)

Ten protokół opisuje rozwój metody testu kolorymetrycznego do określania zdolności związków do hamowania lub aktywowania aktywności elastazy.

Kwantyfikacja modulacji aktywności enzymu elastazy za pomocą analizy kolorymetrycznej

Poznaj kolorymetryczny test pomiaru aktywności proteolitycznej Granzyme B w próbkach ludzkich, mysich lub szczurzych. Ta metoda pozwala badaczom ilościowo ocenić funkcję proteazy z wysoką specyficznością.

Test kolorymetryczny, który specyficznie mierzy aktywność proteolityczną Granzyme B: hydroliza Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl

Przeglądaj więcej filmów