Test kolorymetryczny, który specyficznie mierzy aktywność proteolityczną Granzyme B: hydroliza Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl
28 listopada 2014
Opisujemy prosty, ilościowy test kolorymetryczny, który konkretnie mierzy aktywność proteolityczną ludzkiego, mysiego lub szczurzego Granzyme B (GzmB). Protokół ten można łatwo dostosować do określania aktywności proteazy innych granulowanych proteaz serynowych poprzez hydrolizę innych syntetycznych substratów peptydowych z odpowiednią sekwencją rozpoznawania.
Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest pomiar aktywności proteolitycznej proteazy wewnątrzkomórkowej granzymy B. Osiąga się to poprzez przygotowanie lizatu badanych komórek, a następnie szybkie dodanie substratu do próbek. Aktywność granzymy B jest następnie mierzona za pomocą reakcji kolorymetrycznej. Ostatecznie wysoce specyficzne cięcie alla alla as s benzo przez granzymę B może zostać ocenione na podstawie jej unikalnej specyficzności substratowej względem reszt kwasu aspartylowego.
Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak wykrywanie ekspresji granzymy B za pomocą PCR lub Western blot, jest fakt, że hydroliza benzylowa jest specyficzna dla granzymy B i jednocześnie wskazuje na aktywność proteazy. Aby przygotować lizaty komórkowe, należy najpierw wyizolować pierwotne komórki NK z zawiesin pojedynczych komórek śledziony myszy typu dzikiego C 57 black six lub myszy kontrolnych z nokautem genu granzymy B poprzez selekcję negatywną z użyciem dostępnych komercyjnie zestawów, zgodnie z instrukcjami producenta, po uprzedniej aktywacji komórek. Kulturę należy przemyć trzykrotnie w PBS, wirując z maksymalną prędkością przez 2–3 sekundy, a następnie zawiesić osad zawierający minimum 5 milionów komórek NK w 100 µL buforu do lizy Nont P 40 na lodzie przez 20 minut.
Następnie odwiruj lizat w mikrocentryfudze przez 10 minut przy 15 000 Gs i przenieś nadsadew do nowej probówki. Po oznaczeniu stężenia białka zgodnie z odpowiednim, dostępnym komercyjnie protokołem, przechowuj próbkę w stężeniu co najmniej około 2 mg/ml w temperaturze -20 °C w celu przeprowadzenia testu aktywności granzymu B. Następnie rozcień co najmniej 100 µg białka z lizatu na próbkę w świeżo przygotowanym buforze HEPS do końcowej objętości 160 µl.
Następnie, używając pipety wielokanałowej, nanieś 50 µL próbki na dołek w trzech powtórzeniach do winylowej płytki 96-dołkowej z dnem w kształcie litery U. Dbając o uwzględnienie trzech dołków kontrolnych zawierających sam bufor, dodaj do każdego 100 µL rozcieńczonego DTNB. Następnie szybko dodaj 50 µL świeżo rozcieńczonego substratu alala asks s benzoyl do każdego z dołków z samym buforem, następnie do kontroli negatywnych, kończąc na próbkach z oczekiwanym wynikiem dodatnim.
Zmierz aktywność aase poprzez hydrolizę alala as benzyl w czytniku mikropłytek przy gęstości optycznej 405 nanometrów, stosując protokół analizy kinetycznej z 25 pomiarami co 15 sekund. Następnie, za pomocą oprogramowania czytnika płytek, oblicz maksymalną szybkość rozszczepiania substratu dla każdej dołki, a następnie przenieś surowe dane do odpowiedniego oprogramowania do analizy statystycznej, wykorzystując myszy z nokautem genu granzyme. Odkryto, że syntetyczny substrat peptydowy alala as benzyl jest specyficznie hydrolizowany przez granzyme B. Dalsze intensywne rozszczepianie syntetycznego substratu można zmierzyć w lizatach komórkowych z pierwotnych komórek NK typu dzikiego, ale nie w komórkach NK pochodzących od zwierząt z nokautem granzyme B, które służą jako kontrola.
W tym doświadczeniu aktywność proteolityczna granzymu A, który wykazuje specyficzność substratową podobną do trypsyny i występuje w lizatach obu typów komórek, była równa, co zmierzono poprzez hydrolizę BLT benzyl, I-E-P-D-P-N-A, który był stosowany ogólnie do badania aktywności granzymu B u różnych gatunków. W tym reprezentatywnym doświadczeniu analiza sekwencji tetrapeptydowych wykazała, że ludzki, ale nie mysi granzym B, może efektywnie przecinać po sekwencji IEPD, która odpowiada sekwencji rozpoznawczej w białku bid zarówno u ludzi, jak i u myszy. Z kolei zmniejszenie ilości lizatu ludzkich komórek białaczki NK z 30 µg do 10 µg nadal skutkuje obecnością wystarczającej ilości granzymu B do hydrolizy substratu I-E-P-D-P-N-A.
Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat wyboru odpowiedniego substratu oraz kontroli eksperymentalnych do analizy in vitro czerwonego enzymu B u ludzi i myszy.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia ilościowy test kolorymetryczny służący do pomiaru aktywności proteolitycznej Granzymu B (GzmB) w próbkach pochodzących od ludzi, myszy lub szczurów. Metodę tę można dostosować do innych serynowych proteaz ziarnistych, stosując odpowiednie syntetyczne substraty peptydowe.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Aktywność proteaz
- Biologia komórki
Wprowadzenie
- Granzym B jest serynową proteazą zaangażowaną w odpowiedzi immunologiczne.
- Pomiar jego aktywności jest kluczowy dla zrozumienia jego roli w cytotoksyczności komórkowej.
- Istniejące metody, takie jak PCR czy Western blot, nie mierzą bezpośrednio aktywności proteazy.
- Niniejszy test zapewnia specyficzny i bezpośredni pomiar aktywności GzmB.
Cel badania
- Opracowanie prostego testu do ilościowego oznaczenia aktywności GzmB.
- Przedstawienie metody, która może zostać dostosowana do innych proteaz.
- Udoskonalenie istniejących technik poprzez zapewnienie specyficzności względem aktywności GzmB.
Stosowane metody
- Przygotowanie lizatów komórkowych z pierwotnych komórek NK.
- Wykorzystanie reakcji kolorymetrycznej do pomiaru aktywności GzmB.
- Izolacja komórek NK ze śledzion modeli myszy typu dzikiego oraz myszy z knock-outem genu granzymu B.
- Hydroliza substratu w celu oceny aktywności proteazy.
Główne wyniki
- Test skutecznie mierzy aktywność GzmB poprzez specyficzne rozszczepienie substratu.
- Wykazuje on wysoką specyficzność wobec GzmB w porównaniu z innymi metodami.
- Wyniki wskazują na aktywność proteazy na podstawie hydrolizy substratu.
- Metoda ta jest możliwa do zaadaptowania dla innych serynowych proteaz ziarnistych.
Wnioski
- Opracowany test jest niezawodnym narzędziem do pomiaru aktywności GzmB.
- Oferuje on zalety w porównaniu z tradycyjnymi metodami dzięki bezpośredniej ocenie funkcji proteazy.
- Podejście to może usprawnić badania nad odpowiedziami immunologicznymi i biologią proteaz.
Najczęściej Zadawane Pytania
Znaczenie dla Przemysłu
Dokładny pomiar aktywności proteolitycznej granzymu B jest niezbędny do walidacji funkcji limfocytów cytotoksycznych w rozwoju immunoterapii. Ten test kolorymetryczny zapewnia bezpośredni i specyficzny odczyt aktywności proteazy, co umożliwia mechanistyczną ocenę ryzyka w zakresie angażowania celu oraz potencjału proapoptotycznego w modelach przedklinicznych. Jego kompatybilność międzygatunkowa wspiera ciągłość translacyjną z badań na gryzoniach do zastosowań u ludzi.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie szlaków apoptozy zależnej od granzymu B w limfocytach cytotoksycznych.
- Wartość operacyjna: Pozwala odróżnić aktywną proteazę od samej ekspresji, co redukuje liczbę wyników fałszywie dodatnich podczas walidacji celu.
- Wartość prognostyczna: Wspiera funkcjonalne potwierdzenie roli granzymu B jako mechanistycznego czynnika napędzającego odpornościowe usuwanie nowotworu.
Przesiewy i opracowanie testu
- Gotowość do analizy: Wykorzystuje substrat Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl hydrolizowany wyłącznie przez Granzyme B w układach ludzkich, mysich i szczurzych.
- Wynik ilościowy: Pomiar początkowych szybkości hydrolizy za pomocą reakcji kolorymetrycznej sprzężonej z DTNB przy 405 nm do analizy kinetycznej.
- Kontrola specyficzności: Wyklucza interferencję kaspaz i innych granzymów dzięki unikalnej preferencji do asparaginianu.
- Powtarzalność: Kompatybilny z niefrakcjonowanymi lizatami i proteazami rekombinowanymi przy zastosowaniu odpowiednich kontroli.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie w kontekście chorób: Możliwość zastosowania w modelach nadzoru immunologicznego nad nowotworami, infekcjach wirusowych oraz patologiach autoimmunologicznych, w których Granzyme B pośredniczy w śmierci komórki docelowej.
- Ciągłość translacyjna: Umożliwia spójny pomiar aktywności u różnych gatunków, co wspiera ekstrapolację danych z modelu mysiego na ludzki.
- Decyzje z uwzględnieniem ryzyka: Dostarcza biomarkera opartego na aktywności, który pozwala na priorytetyzację kandydatów o potwierdzonym potencjale cytotoksycznym.
Integracja potoku i przepływu pracy
Analiza ta wpisuje się w proces odkrywania leków, od walidacji celu po optymalizację wiodących związków, w którym funkcjonalna aktywność proteazy dostarcza informacji o skuteczności biologicznej i mechanizmie działania.
- Biologia odkrywcza: Potwierdza hipotezę, że Granzyme B indukuje apoptozę w limfocytach efektorowych poprzez specyficzne dla substratu cięcie.
- Przesiewanie: Dostarcza zestandaryzowanych, ilościowych odczytów aktywności do porównywania warunków lub perturbacji genetycznych.
- Analityka: Generuje dane kinetyczne (Vmax), umożliwiające porównywanie próbek i statystyczną ocenę zdolności proteolitycznej.
- Badania translacyjne: Wspiera walidację przedkliniczną poprzez weryfikację zachowanej aktywności Granzyme B u ludzi, myszy i szczurów.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Platforma możliwa do adaptacji do innych proteaz ziarnistych poprzez zamianę substratu, co zwiększa długoterminową użyteczność.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Bezpośredni pomiar funkcji proteolitycznej zmniejsza zależność od markerów zastępczych, takich jak poziomy mRNA lub białek.
- Wartość operacyjna: Prosty format oparty na płytkach, minimalny czas pracy manualnej oraz kompatybilność ze standardowymi czytnikami mikropłytek.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) w oparciu o aktywność funkcjonalną, a nie tylko ekspresję, co zwiększa pewność prognostyczną.
- Wpływ na portfolio: Ułatwia dostosowany do ryzyka rozwój immunoterapii poprzez wczesne potwierdzenie potencji mechanistycznej na etapie rozwoju.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest biegłość w izolacji i lizie pierwotnych komórek odpornościowych w kontrolowanych warunkach, aby zachować aktywność proteaz.
- Metoda zależy od dostępu do czytnika mikropłytek zdolnego do kinetycznych pomiarów OD405 oraz kompatybilnego oprogramowania analitycznego.
- Niezbędne jest uwzględnienie kontroli z knockoutem Granzyme B w celu potwierdzenia specyficzności testu, zgodnie z przykładem w źródle.
- Adaptacja metody do innych proteaz wymaga walidacji alternatywnych substratów w celu zachowania równoważnej specyficzności i zakresu sygnału.
- Ograniczenie praktyczne: test mierzy całkowitą aktywność lizatu i może wymagać frakcjonowania w przypadku badań lokalizacji subkomórkowej.
