Name: Pomiary funkcjonalnej rekonstytucji i aktywności kanałowej oczyszczonego białka CFTR typu dzikiego i zmutowanego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 59 s
Description: Poznaj metodę pomiaru aktywności kanałowej CFTR po rekonstytucji w proteoliposomach z użyciem selektywnej elektrody jodkowej. Technika ta umożliwia badanie wpływu modulatorów na funkcję białka.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy oświadczają, że nie mają żadnych konkurencyjnych interesów finansowych.

<ol><li>Kim Chiaw, P., Eckford, P. D., Bear, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+the+mechanisms+underlying+CFTR+channel+activity%2C+the+molecular+basis+for+cystic+fibrosis+and+strategies+for+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Essays+Biochem%22%5BJournal%5D)">Insights into the mechanisms underlying CFTR channel activity, the molecular basis for cystic fibrosis and strategies for therapy.</a> Essays Biochem. 50 (1), 233-248 (2011).</li>
<li>Bear, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+functional+reconstitution+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+%28CFTR%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Purification and functional reconstitution of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR).</a> Cell. 68 (4), 809-818 (1992).</li>
<li>Cai, Z., Sohma, Y., Bompadre, S. G., Sheppard, D. N., Hwang, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+high-resolution+single-channel+recording+to+functional+studies+of+cystic+fibrosis+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Application of high-resolution single-channel recording to functional studies of cystic fibrosis mutants.</a> Methods Mol Biol. 741, 419-441 (2011).</li>
<li>Genetic Analysis Consortium. , 
 <a target="_blank" href="http://www.genet.sickkids.on.ca/cftr/Home.html">http://www.genet.sickkids.on.ca/cftr/Home.html</a> (1989).</li>
<li>Kerem, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+cystic+fibrosis+gene%3A+genetic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Identification of the cystic fibrosis gene: genetic analysis.</a> Science. 245 (4922), 1073-1080 (1989).</li>
<li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+of+defective+anion+transport+in+L+cells+expressing+recombinant+forms+of+CFTR%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Molecular basis of defective anion transport in L cells expressing recombinant forms of CFTR.</a> Hum Mol Genet. 2 (8), 1253-1261 (1993).</li>
<li>Mendoza, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirements+for+efficient+correction+of+DeltaF508+CFTR+revealed+by+analyses+of+evolved+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Requirements for efficient correction of DeltaF508 CFTR revealed by analyses of evolved sequences.</a> Cell. 148 (1-2), 164-274 (2012).</li>
<li>Rabeh, W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correction+of+both+NBD1+energetics+and+domain+interface+is+required+to+restore+DeltaF508+CFTR+folding+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Correction of both NBD1 energetics and domain interface is required to restore DeltaF508 CFTR folding and function.</a> Cell. 148 (1-2), 150-163 (2012).</li>
<li>Aleksandrov, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allosteric+modulation+balances+thermodynamic+stability+and+restores+function+of+DeltaF508%5BTitle%5D)+AND+%22CFTR.+J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Allosteric modulation balances thermodynamic stability and restores function of DeltaF508.</a> CFTR. J Mol Biol. 419 (1-2), 41-60 (2012).</li>
<li>Ramsey, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+CFTR+potentiator+in+patients+with+cystic+fibrosis+and+the+G551D+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">A CFTR potentiator in patients with cystic fibrosis and the G551D mutation.</a> N Engl J Med. 365 (18), 1663-1672 (2011).</li>
<li>Riordan, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+characterization+of+recombinant+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+from+Chinese+hamster+ovary+and+insect+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Purification and characterization of recombinant cystic fibrosis transmembrane conductance regulator from Chinese hamster ovary and insect cells.</a> J. Biol. Chem. 270 (28), 17033-17043 (1995).</li>
<li>Ryan, L., Rimington, T., Cant, N., Ford, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+purification+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+protein+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Expression and purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator protein in Saccharomyces cerevisiae.</a> JoVE. (61), (2012).</li>
<li>Ostedgaard, L. S., Welsh, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partial+purification+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Partial purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator.</a> J Biol Chem. 267 (36), 26142-26149 (1992).</li>
<li>Peng, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+affinity+isolation+of+recombinant+protein+using+the+baculovirus%2Finsect+cell+expression+system%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expr+Purif%22%5BJournal%5D)">One-step affinity isolation of recombinant protein using the baculovirus/insect cell expression system.</a> Protein Expr Purif. 4 (2), 95-100 (1993).</li>
<li>Ramjeesingh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+procedure+for+the+efficient+purification+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+%28CFTR%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">A novel procedure for the efficient purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR).</a> Biochem J. 327 (1), 17-21 (1997).</li>
<li>Rosenberg, M. F., Kamis, A. B., Aleksandrov, L. A., Ford, R. C., Riordan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+crystallization+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+%28CFTR%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Purification and crystallization of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR).</a> J Biol Chem. 279 (37), 39051-39057 (2004).</li>
<li>Ramjeesingh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+reconstitution+of+epithelial+chloride+channel+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Purification and reconstitution of epithelial chloride channel cystic fibrosis transmembrane conductance regulator.</a> Methods Enzymol. 294, 227-246 (1999).</li>
<li>Sorscher, E. J., Sommerfelt, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+recombinant+protein+derived+from+the+baculovirus+expression+system+using+glutathione+affinity+agarose%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Purification of recombinant protein derived from the baculovirus expression system using glutathione affinity agarose.</a> Methods Mol Biol. 3, 337-348 (1995).</li>
<li>Eckford, P. D., Li, C., Ramjeesingh, M., Bear, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+%28CFTR%29+potentiator+VX-770+%28ivacaftor%29+opens+the+defective+channel+gate+of+mutant+CFTR+in+a+phosphorylation-dependent+but+ATP-independent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) potentiator VX-770 (ivacaftor) opens the defective channel gate of mutant CFTR in a phosphorylation-dependent but ATP-independent manner.</a> J Biol Chem. 287 (44), 36639-36649 (2012).</li>
<li>Alkhouri, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+properties+of+molecular+probes+for+the+rescue+site+on+mutant+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Synthesis and properties of molecular probes for the rescue site on mutant cystic fibrosis transmembrane conductance regulator.</a> J Med Chem. 54 (24), 8693-8701 (2011).</li>
<li>Eckford, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VX-809+and+Related+Corrector+Compounds+Exhibit+Secondary+Activity+Stabilizing+Active+F508del-CFTR+after+Its+Partial+Rescue+to+the+Cell+Surface%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">VX-809 and Related Corrector Compounds Exhibit Secondary Activity Stabilizing Active F508del-CFTR after Its Partial Rescue to the Cell Surface.</a> Chem Biol. 21 (5), 666-678 (2014).</li>
<li>Kim Chiaw, P., Wellhauser, L., Huan, L. J., Ramjeesingh, M., Bear, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chemical+corrector+modifies+the+channel+function+of+F508del-CFTR%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.Pharmacol%22%5BJournal%5D)">A chemical corrector modifies the channel function of F508del-CFTR.</a> Mol.Pharmacol. 78 (3), 411-418 (2010).</li>
<li>Verkman, A. S., Galietta, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chloride+channels+as+drug+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Chloride channels as drug targets.</a> Nat Rev Drug Discov. 8 (2), 153-171 (2009).</li>
<li>Pasyk, S., Li, C., Ramjeesingh, M., Bear, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+interaction+of+a+small-molecule+modulator+with+G551D-CFTR%2C+a+cystic+fibrosis-causing+mutation+associated+with+severe+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Direct interaction of a small-molecule modulator with G551D-CFTR, a cystic fibrosis-causing mutation associated with severe disease.</a> Biochem J. 418 (1), 185-190 (2009).</li>
<li>Norez, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+CFTR+chloride+channel+activity+and+pharmacology+using+radiotracer+flux+methods%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cyst+Fibros%22%5BJournal%5D)">Determination of CFTR chloride channel activity and pharmacology using radiotracer flux methods.</a> J Cyst Fibros. 3 (2), 119-121 (2004).</li>
<li>Whitney, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+alginate+secretion+across+the+bacterial+outer+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Structural basis for alginate secretion across the bacterial outer membrane.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (32), 13083-13088 (2011).</li>
<li>Islam, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proton-dependent+gating+and+proton+uptake+by+Wzx+support+O-antigen-subunit+antiport+across+the+bacterial+inner+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Proton-dependent gating and proton uptake by Wzx support O-antigen-subunit antiport across the bacterial inner membrane.</a> mBio. 4 (5), e00678-e00613 (2013).</li>
<li>Ramjeesingh, M., et al. Ch. 16. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRamjeesingh%2C+M+%22Reliable+Lab+Solutions%3A+Essential+Ion+Channel+MethodsReliable+Lab+Solutions%22">Reliable Lab Solutions: Essential Ion Channel MethodsReliable Lab Solutions</a>. Conn, P. M. , Academic Press. 337-357 (2010).</li>
<li>Wellhauser, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+small-molecule+modulator+interacts+directly+with+deltaPhe508-CFTR+to+modify+its+ATPase+activity+and+conformational+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">A small-molecule modulator interacts directly with deltaPhe508-CFTR to modify its ATPase activity and conformational stability.</a> Mol Pharmacol. 75 (6), 1430-1438 (2009).</li>
<li>Lee, S. Y., Letts, J. A., MacKinnon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+reconstitution+of+purified+human+Hv1+H%2B+channels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Functional reconstitution of purified human Hv1 H+ channels.</a> J Mol Biol. 387 (5), 1055-1060 (2009).</li>
<li>Chang, X. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+kinase+A+%28PKA%29+still+activates+CFTR+chloride+channel+after+mutagenesis+of+all+10+PKA+consensus+phosphorylation+sites%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Protein kinase A (PKA) still activates CFTR chloride channel after mutagenesis of all 10 PKA consensus phosphorylation sites.</a> J. Biol. Chem. 268 (15), 11304-11311 (1993).</li>
<li>Gadsby, D. C., Nairn, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+CFTR+Cl-+ion+channels+by+phosphorylation+and+dephosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.Second+Messenger+Phosphoprotein+Res%22%5BJournal%5D)">Regulation of CFTR Cl- ion channels by phosphorylation and dephosphorylation.</a> Adv.Second Messenger Phosphoprotein Res. 33, 79-106 (1999).</li>
<li>Li, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATPase+activity+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">ATPase activity of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator.</a> J Biol Chem. 271 (45), 28463-28468 (1996).</li>
<li>Ma, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thiazolidinone+CFTR+inhibitor+identified+by+high-throughput+screening+blocks+cholera+toxin-induced+intestinal+fluid+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Thiazolidinone CFTR inhibitor identified by high-throughput screening blocks cholera toxin-induced intestinal fluid secretion.</a> J Clin Invest. 110 (11), 1651-1658 (2002).</li>
<li>Kopeikin, Z., Sohma, Y., Li, M., Hwang, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+mechanism+of+CFTR+inhibition+by+a+thiazolidinone+derivative%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">On the mechanism of CFTR inhibition by a thiazolidinone derivative.</a> J Gen Physiol. 136 (6), 659-671 (2010).</li>
<li>Wang, X. F., Reddy, M. M., Quinton, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+a+new+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+inhibitor+on+Cl-+conductance+in+human+sweat+ducts%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effects of a new cystic fibrosis transmembrane conductance regulator inhibitor on Cl- conductance in human sweat ducts.</a> Exp Physiol. 89 (4), 417-425 (2004).</li>
</ol>

Autorzy przyjmują do wiadomości rady dr Mohabira Ramjeesingha podczas opracowywania opisanych tu metod oczyszczania. Badania te były wspierane przez granty operacyjne dla C.E.B. z Kanadyjskich Instytutów Badań nad Zdrowiem (CIHR) i Mukowiscydozy Kanady (CFC). P.D.W.E. było częściowo wspierane przez stypendia przyznawane przez CIHR i CFC. Autorzy przyznają, że dr R. Bridges (Rosalind University of Medicine and Science) dostarcza leki korygujące, wzmacniające i inhibitory, a ich dystrybucją zajmuje się Cystic Fibrosis Foundation Therapeutics (CFFT). Autorzy doceniają również wybitne zasługi Baylor Cell Culture Facility (grant NIH P30 CA125123) w ekspresji Wt i zmutowanego białka CFTR przy użyciu systemu bakulowirusa. Nieaktywny analog VX-770, V-09-1188, był prezentem od Vertex Pharmaceuticals.

Istnieje ograniczona liczba protokołów oczyszczania dla pełnej, funkcjonalnej izolacji CFTR z różnych komórkowych systemów nadekspresji. Opisana tutaj metoda jest korzystna, ponieważ umożliwia szybkie oczyszczanie Wt-CFTR lub wysokie wzbogacenie F508del- i G551D-CFTR w umiarkowanych ilościach, co jest wysoce funkcjonalne w testach, w tym ATPazie i bezpośrednich pomiarach funkcji kanału, w tym pomiarach jednokanałowych w płaskich układach dwuwarstwowych i zademonstrowanych pomiarach funkcji kanału populacji CFTR, które są...

Transport chlorków przez błony wierzchołkowe komórek nabłonkowych w takich tkankach jak płuca, jelita, trzustka i gruczoły potowe odbywa się głównie za pośrednictwem Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR), regulowanego przez ATP i fosforylację członka podrodziny białek błonowych ABC (ATP-Binding Cassette) C (przegląd w1). Podobnie jak inni członkowie podrodziny ABCC, CFTR jest dużym, wielozakresowym integralnym białkiem błonowym, które wiąże ATP w dwóch miejscach wiązania nukleotydów utworzonych na granicy domen wiążących nukleotydy (NBD), gdzie posiada niewielką aktywność ATPazy w jednym miejscu. Jednak w przeciwieństwie do innych członków podrodziny ABCC, CFTR ewoluował jako unikalny regulowany kanał Cl, a nie jako aktywny transporter substancji rozpuszczonej.
Mutacje w CFTR powodują mukowiscydozę, chorobę dotykającą wiele narządów, w tym płuca, przewód pokarmowy, trzustkę i układ rozrodczy, prowadząc do zachorowalności i śmiertelności u młodych dorosłych. Choroba płuc zazwyczaj odpowiada za wczesną śmiertelność w mukowiscydozie i w większości przypadków jest spowodowana utratą funkcji CFTR na powierzchni nabłonka przewodzących dróg oddechowych. Brak aktywności kanału chlorkowego CFTR powoduje zmniejszenie ruchu zarówno Cl-, jak i wody po nabłonku powierzchniowym, aby zmodyfikować warstwę płynu na wierzchołkowej powierzchni nabłonka rzęskowego układu oddechowego. W ten sposób powstaje lepka ciecz na powierzchni dróg oddechowych, która upośledza zdolność komórek nabłonka rzęskowego układu oddechowego do skutecznego usuwania patogenów z dróg oddechowych. W konsekwencji większość pacjentów z mukowiscydozą cierpi na nawracające napady infekcji płuc i uszkodzenie płuc z powodu stanu zapalnego.
Zgodnie z oczekiwaniami, badania nad mechanizmem działania normalnego białka CFTR skupiały się przede wszystkim na szczegółowych badaniach elektrofizjologicznych jego aktywności bramkowania kanału. Badania jednokanałowe wykazały bezpośrednio, że CFTR funkcjonuje jako zależny od PKA kanał Cl-, który posiada bramkę2 regulowaną przez ATP. Szczegółowe badania elektrofizjologiczne dostarczają wielu informacji na temat pojedynczych kanałów CFTR1,3, jednak mogą istnieć obawy, czy charakterystyka któregokolwiek z poszczególnych pojedynczych kanałów, które były badane, odzwierciedla całą populację kanałów CFTR i dlatego wyniki pojedynczego kanału powinny być zawsze rozpatrywane wraz z metodami badania populacji makroskopowej. Bezpośrednie badanie aktywności kanału populacyjnego oczyszczonego CFTR może potencjalnie dostarczyć informacji na temat defektu molekularnego związanego z mutacjami powodującymi chorobę i przyczynić się do odkrycia modulatorów chemicznych, które naprawiają zmutowane białka CFTR. Do tej pory istnieje ponad 1900 różnych mutacji w CFTR, które uważa się za powodujące mukowiscydozę4. Główna mutacja, F508del-CFTR, znaleziona na co najmniej jednym allelu u około 90% pacjentów w Ameryce Północnej i Europie, prowadzi do nieprawidłowego fałdowania i zatrzymywania białek w retikulum endoplazmatycznym5. F508del-CFTR ma również inne konsekwencje, w tym wadliwą aktywność kanału6-9. Wynikający z tego brak CFTR na powierzchni komórki wiąże się z ciężką chorobą. Uważa się, że G551D-CFTR, rzadziej występująca mutacja, jest prawidłowo sfałdowana, ale jest dysfunkcyjna jako kanał chlorkowy na powierzchni komórki6. Opracowanie korektorów i wzmacniaczy małych cząsteczek ma na celu skorygowanie fałdowania i/lub transportu mutantów, takich jak F508del-CFTR, na powierzchnię komórki, oraz odpowiednio wzmocnienie lub zwiększenie aktywności kanału mutacji, takich jak G551D, gdy są obecne na powierzchni komórki. Podczas gdy korektory VX-809 i VX-661 (nie są jeszcze zatwierdzone do stosowania u pacjentów, wzmacniacz Kalydeco (iwakaftor; VX-770) jest stosowany w dawce 150 mg co 12 godzin u pacjentów z mukowiscydozą >6 lat z co najmniej jedną mutacją G551D-CFTR, a ostatnio u pacjentów z jedną z G178R, S549N, S549R, G551S, G1244E, S1251N, S1255P i G1349D. Kalydeco jest zarówno bezpieczny, jak i przyczynia się do poprawy wskaźników klinicznych choroby mukowiscydozy10, jednak mechanizm działania tej małej cząsteczki był słabo poznany w momencie zatwierdzenia przez FDA do stosowania u pacjentów.
Kilka metod oczyszczania CFTR zostało opisanych wcześniej2,11-18, z których wiele wymaga dużo czasu na ukończenie. W niedawnej publikacji19 opisano unikalną metodę szybkiego oczyszczania i rekonstytucji dla nadekspresji CFTR w systemie ekspresji komórek Sf9, a to oczyszczone białko w określonych układach lipidowych wykorzystano do opracowania testu aktywności kanału halogenkowego CFTR dla populacji cząsteczek CFTR. Test podsumowuje znany wpływ fosforylacji, nukleotydów i inhibitorów na funkcję CFTR. System został wykorzystany do zbadania wpływu wzmacniacza VX-770/Kalydeco na Wt- (typ dziki), F508del- i G551D-CFTR i po raz pierwszy wykazano, że lek oddziałuje bezpośrednio z białkiem CFTR w celu wzmocnienia jego aktywności kanałowej w sposób niezależny od ATP, wykazując użyteczność i zastosowanie tych metod do badania interakcji CFTR i mutantów z nukleotydami i małymi cząsteczkami z perspektywy populacji w celu uzyskania odpowiedzi klinicznej istotne pytania dotyczące białka. Metody te wykorzystano również do badania innych cząsteczek wzmacniających i ich pochodnych20, a także wpływu korektora małych cząsteczek na aktywność białka21.
Testy wypływu były wcześniej używane w wielu badaniach do badania aktywności mutantów CFTR i wpływu związków modulujących CFTR na jego aktywność, w tym testy całych komórek przy użyciu elektrod, radioaktywnych znaczników i fluoroforów22,23, pęcherzyków błonowych z elektrodami jonoselektywnymi24 oraz oczyszczonego odtworzonego CFTR z radioaktywnymi znacznikami25. Jednak zastosowanie elektrod jonoselektywnych do badania oczyszczonego, odtworzonego CFTR zostało po raz pierwszy zgłoszoneniedawno19. Adaptacja obecnej metody została wykorzystana do rekonstytucji i charakterystyki funkcjonalnej dwóch białek błonowych w Pseudomonas aeruginosa, powszechnym patogenie mukowiscydozy. Rekonstytucja oczyszczonego białka błony zewnętrznej AlgE w połączeniu z pomiarami wypływu jodku została wykorzystana do wsparcia modelu wydzielania alginianu anionowego przez ten transporter26. Pomiary rekonstytucji i wypływu jodku zastosowano do oczyszczonego białka Wzx, co pozwoliło na zaproponowanie modelu, który sugeruje zależny od H + mechanizm antyportowy translokacji oligosacharydów związanych z lipidami przez wewnętrzną błonę bakteryjną przez to białko27. W obu przypadkach jodek został użyty jako substytut substratu anionowego, aczkolwiek przy niższej przepustowości niż można by się spodziewać w przypadku substratu natywnego. Metoda ta może być odpowiednia do adaptacji do innych białek z kationowymi szlakami transportu lub przewodzenia dla substratów anionowych.
Tutaj opisana jest procedura szybkiego oczyszczania białka CFTR i jego rekonstytucji do proteoliposomów określonego lipidu. Procedura szybkiej rekonstytucji może być łatwo dostosowana do stosowania z CFTR oczyszczonym innymi metodami, pod warunkiem, że rodzaj detergentu użytego do oczyszczania jest podatny na usunięcie za pomocą metod zastosowanych tutaj lub może zostać wymieniony na odpowiedni detergent przed procedurą rekonstytucji. Szczegółowo opisano metodę wypływu jodku do pomiaru aktywności kanałowej oczyszczonego i odtworzonego białka CFTR oraz przedstawiono kilka typowych wyników, które można uzyskać tą metodą.

<table><tbody><tr><td>fos-cholina 14 detergent</td><td>Anatrace Affymetrix (www.anatrace.affymetrix.com)</td><td>F312</td><td>Affymetrix: Produkty Anatrace; CAS#&nbsp; :77733-28-9</td></tr><tr><td>Kompletne tabletki koktajlowe inhibitorów proteazy bez EDTA</td><td>Roche (www.roche-applied-science.com)</td><td>04 693 132 001</td><td>Tabletki koktajlowe inhibitorów proteazy bez EDTA (1 na 50 ml lub mini: 1 na 10 ml) (Roche Diagnostics GmbH; Nr ref.: 11873 580 001)</td></tr><tr><td>cOmplete ULTRA Tablets, Mini, bez EDTA, EASYpack&nbsp;</td><td>Roche (www.roche-applied-science.com)</td><td>05 892 791 001</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA Agarose</td><td>Qaigen GmbH</td><td>1018240</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Kolumny przesiewowe</td><td>Fisher Healthcare</td><td>11-387-50</td><td></td></tr><tr><td>Filtry odśrodkowe Amicon Ultra, Ultracel-100K</td><td>Millipore (www.millipore.com)</td><td>UFC910008</td><td></td></tr><tr><td>Kinaza białkowa A zależna od cAMP (PKA), podjednostka</td> <td>katalitycznaNew England Biolabs (www.neb.com/products/p6000-camp-dependent-protein-kinase-pka-catalytic-subunit)</td><td></td><td>Peirce PKA nadaje się również</td></tr><tr><td>do PC, Jajo kurze</td><td>Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com)</td><td>840051C</td><td></td></tr><tr><td>POPC</td><td>Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com)</td><td>850457C</td><td></td></tr><tr><td>PS, Lipidy polarne Porcine Brain</td><td>Avanti (www.avantilipids.com)</td><td>840032C</td><td>CFTR został pomyślnie odtworzony do Egg PC, POPC, 2:1 (w/w) Egg PC:POPC lub mieszaniny PE:PS:PC:ergosterolu, 5:2:2:1 (w/w)</td></tr><tr><td>PE, Jaja kurze</td><td>Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com)</td><td>841118C</td><td></td></tr><tr><td>Ergosterol</td><td>Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td><td>45480</td><td></td></tr><tr><td>Pierce Kolumna wirowa do usuwania detergentu</td><td>Thermo Scientific</td><td>87779</td><td>Kolumny o pojemności 1 ml</td></tr><tr><td>valinomycyna</td><td>Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td><td>V-0627</td><td></td></tr><tr><td>VX-770 (ivacaftor)</td><td>Selleck Chemicals</td><td>S1144</td><td></td></tr><tr><td>jodkowa selektywna mikroelektroda</td><td>Lazar Research Laboratories (www.shelfscientific.com/cgi-bin/tame/newlaz/microionn.tam)</td><td>LIS-146ICM</td><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; </td></tr><tr><td colspan="4">[nagłówek]</td></tr><tr><td>Oprogramowanie Clampex 8.1</td><td>Axon Instruments (www.axon.com)</td><td></td><td>używamy komponentów systemu ClampX z domowym filtrem do monitorowania i rejestrowania odpowiedzi na naszą elektrodę</td></tr><tr><td>Alternatywne oprogramowanie: ArrowLabb System&nbsp;</td><td>Lazar Research Laboratories (www.shelfscientific.com/cgi-bin/tame/newlaz/ionsystems.tam)</td><td>LIS-146LICM-XS</td><td>Lazar Research sprzedaje miernik, który może współpracować z komputerem i oprogramowaniem w celu rejestrowania odpowiedzi sondy. To oprogramowanie powinno pełnić podobną funkcję do naszej konfiguracji.</td></tr><tr><td>małe mieszadła</td><td>Big Science Inc (www.stirbars.com)</td><td>SBM-0502-CMB</td><td>wybierz mieszadło wystarczająco małe, aby łatwo zmieścić się w studzience 96-dołkowej płytki</td></tr><tr><td>Sephadex G50, drobne</td><td>GE Health Care (www.gelifesciences.com)</td><td>17-0042-01</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Laboratory Supplies Co, Inc.</td><td>G112SP1G</td><td>Odpowiednie powinny być również dźwiękomierze do kąpieli innych producentów</td></tr></tbody></table>

pomiary funkcjonalnej rekonstytucji i aktywności kanałowej oczyszczonego białka cftr typu dzikiego i zmutowanego

Functional Reconstitution and Channel Activity Measurements of Purified Wildtype and Mutant CFTR Protein

Przezbłonowy regulator przewodnictwa (CFTR) mukowiscydozy jest unikalnym członkiem nadrodziny transporterów ATP Binding Cassette (ABC). Fosforylacja i zależna od nukleotydów aktywność kanałów chlorkowych CFTR była często badana w całych układach komórkowych oraz jako pojedyncze kanały w wyciętych łatach błonowych. Wykazano, że wiele mutacji powodujących mukowiscydozę zmienia tę aktywność. Chociaż opublikowano niewielką liczbę protokołów oczyszczania, brakowało metody szybkiej rekonstytucji, która zachowywałaby aktywność kanału, oraz odpowiedniej metody badania aktywności kanału populacyjnego w oczyszczonym systemie. W tym miejscu opisano szybkie metody oczyszczania i funkcjonalnej rekonstytucji białka CFTR o pełnej długości w proteoliposomach o określonym składzie lipidowym, który zachowuje aktywność jako regulowany kanał halogenkowy. Ta metoda rekonstytucji wraz z nowatorskim testem aktywności kanału opartym na strumieniu stanowi odpowiedni system do badania właściwości kanałów populacyjnych CFTR typu dzikiego i mutantów wywołujących chorobę F508del- i G551D-CFTR. W szczególności metoda ta jest przydatna w badaniu bezpośredniego wpływu fosforylacji, nukleotydów i małych cząsteczek, takich jak wzmacniacze i inhibitory, na aktywność kanału CFTR. Metody te są również podatne na badanie innych kanałów/transporterów membranowych dla substratów anionowych.

W niniejszej publikacji opisano metody oczyszczania, rekonstytucji oraz pomiaru aktywności regulowanych kanałów białka CFTR. Rycina 1a przedstawia schemat procedur oczyszczania, rekonstytucji i odpływu jodków. Metody rekonstytucji oraz pomiary aktywności kanałów za pomocą przepływu jodków zostały szczegółowo omówione w powiązanym materiale wideo.
Oczyszczanie i rekonstytucja CFTR w proteoliposomach
Białko CFTR może być funkcjonalnie ekspresowane na ...

Opisana tutaj jest szybka i skuteczna procedura funkcjonalnego odtwarzania oczyszczonego dzikiego i zmutowanego białka CFTR, które zachowuje aktywność tego kanału chlorkowego, który jest wadliwy w mukowiscydozie. Wypływ jodku z odtworzonych proteoliposomów, w którym pośredniczy CFTR, umożliwia badanie aktywności kanałów i wpływu małych cząsteczek.

Pomiary funkcjonalnej rekonstytucji i aktywności kanałowej oczyszczonego białka CFTR typu dzikiego i zmutowanego

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of ...

Ogólnym celem tej procedury jest pomiar funkcji populacji kanałów CFTR w systemie zrekonstytuowanym oraz zbadanie odpowiedzi kanałów na obecność cząsteczek modulatorów. Jest to realizowane poprzez uprzednie oczyszczenie białka CFTR typu dzikiego lub zmutowanego z komórek SF nine z wykorzystaniem szybkiej procedury oczyszczania, która pozwala na uzyskanie funkcjonalnego białka CFTR w roztworze detergentu. Drugim krokiem jest rekonstytucja oczyszczonego białka w proteoliposomach o określonym składzie lipidowym, wybranym przez eksperymentatora.Następnie, poprzez usunięcie nadmiaru jodku liposomalnego, tworzy się gradient chemiczny jodku w poprzek błony, aby wygenerować siłę napędową dla ruchu jonów przez kanał CFTR. Ostatnim krokiem jest aktywacja kanału i zainicjowanie uwalniania jodku z proteoliposomów w obecności badanej cząsteczki modulatora. Ostatecznie, do monitorowania funkcji kanału CFTR w czasie rzeczywistym w tym zrekonstytuowanym układzie wykorzystuje się elektrodę selektywną do jodków.Metoda ta umożliwia badanie aktywności kanałów chlorkowych oczyszczonej populacji cząsteczek CFTR po ich rekonstytucji w liposomach fosfolipidowych. Choć metoda ta została opracowana w celu u

functional-reconstitution-channel-activity-measurements-purified

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Funkcjonalne odtworzenie i pomiary aktywności kanałowej oczyszczonego białka CFTR typu dzikiego i mutantnego

Przedstawimy sposób badania wpływu pojedynczej mutacji punktowej na funkcję kanału jonowego.

Mutageneza i analiza funkcjonalna kanałów jonowych heterologicznie eksprymowanych w komórkach ssaków

Próby ekspresji regulatora przewodnictwa przezbłonowego w mukowiscydozie (CFTR) w Saccharomyces cerevisiae przynosiły dotychczas stosunkowo niskie ilości białka. Niniejszy protokół oraz powiązane z nim odczynniki dystrybuowane przez Cystic Fibrosis Foundation powinny umożliwić przygotowanie miligramowych ilości tego „trudnego” eukariotycznego białka błonowego.

Ekspresja i oczyszczanie białka regulatora przewodnictwa przezbłonowego w mukowiscydozie w Saccharomyces cerevisiae

Wykazano, że regulator przewodnictwa przezbłonowego w mukowiscydozie (CFTR), będący nabłonkowym kanałem chlorkowym, oddziałuje z różnymi białkami i reguluje istotne procesy komórkowe; wśród nich dobrze udokumentowano oddziaływania pośredniczone przez motyw PDZ białka CFTR. Niniejszy protokół opisuje opracowane przez nas metody składania kompleksu sygnalizacyjnego makromolekularnego CFTR zależnego od domeny PDZ in vitro.

In vitro analiza makromolekularnych kompleksów sygnałowych CFTR zależnych od domen PDZ

Opisano procedury całkowitego odtworzenia prototypu kanału potasowego bramkowanego napięciem do błon lipidowych. Odtworzone kanały nadają się do testów biochemicznych, zapisów elektrycznych, badań przesiewowych ligandów i badań krystalograficznych elektronów. Metody te mogą mieć ogólne zastosowanie w badaniach strukturalnych i funkcjonalnych innych białek błonowych.

Rekonstytucja kanału Kv do błon lipidowych w badaniach strukturalnych i funkcjonalnych

Heterologiczna ekspresja i oczyszczanie transbłonowego regulatora przewodnictwa mukowiscydozy (CFTR) są znaczącymi wyzwaniami i czynnikami ograniczającymi rozwój terapii lekowych mukowiscydozy. Protokół ten opisuje dwie metody izolacji miligramowych ilości CFTR odpowiednie do badań funkcjonalnych i strukturalnych.

Oczyszczanie białka transbłonowego regulatora przewodnictwa mukowiscydozy ulegającego ekspresji w Saccharomyces cerevisiae

Dziedziczne zaburzenia rytmu serca są często spowodowane mutacjami, które zmieniają powierzchniowe dostarczanie jednego lub więcej kanałów jonowych. Tutaj dostosowujemy testy cytometrii przepływowej, aby zapewnić ilościowe określenie względnej całkowitej i powierzchniowej ekspresji białek w rekombinowanych kanałach jonowych ulegających ekspresji w komórkach tsA-201.

Wyznaczanie względnej powierzchni komórki i całkowitej ekspresji rekombinowanych kanałów jonowych za pomocą cytometrii przepływowej

Ten artykuł opisuje konkretne metody uzyskiwania biochemicznych ilości TRPV1 rozpuszczonego w detergentach do analizy spektroskopowej. Połączone protokoły zapewniają narzędzia biochemiczne i biofizyczne, które można dostosować w celu ułatwienia badań strukturalnych i funkcjonalnych kanałów jonowych ssaków w środowisku kontrolowanym przez błonę.

Oczyszczanie i rekonstytucja TRPV1 do analizy spektroskopowej

Ten protokół przedstawia metodę pomiaru wiązania nukleotydów adeninowych z receptorami w czasie rzeczywistym w środowisku komórkowym. Wiązanie mierzy się jako transfer energii rezonansu Förstera (FRET) między pochodnymi nukleotydów trinitrofenylowych a białkiem znakowanym niekanonicznym, fluorescencyjnym aminokwasem.

Pomiar wiązania nukleotydów z nienaruszonymi, funkcjonalnymi białkami błonowymi w czasie rzeczywistym

Ten protokół opisuje metodę badania elektrogenicznych białek błonowych poprzez pomiar zmian potencjału błonowego. Test ten stanowi platformę do funkcjonalnego odczytu wielu kanałów jonowych ulegających endogenicznej ekspresji w liniach komórkowych nabłonka.

Oparty na fluorescencji test potencjału błonowego do wysokoprzepustowego badania funkcjonalnego dwóch endogennych kanałów jonowych w dwóch nabłonkowych liniach komórkowych

Funkcjonalna fluorometria ukierunkowana na miejsce to metoda badania ruchów domen białek w czasie rzeczywistym. Modyfikacja tej techniki pod kątem jej zastosowania w komórkach natywnych umożliwia teraz wykrywanie i śledzenie ruchów pojedynczego czujnika napięcia z bramkowanych napięciem kanałów Ca2+ w mysich izolowanych włóknach mięśni szkieletowych.

Funkcjonalna fluorometria ukierunkowana na miejsce w komórkach natywnych w celu zbadania pobudliwości mięśni szkieletowych

Elektrofizjologia to złoty standard w badaniu aktywności kanałów jonowych. Istnieje jednak wiele alternatywnych podejść, w tym metod optycznych. W tym miejscu opisujemy metodę monitorowania aktywności bogatego w leucynę powtórzenia zawierającego 8-kanałowe (LRRC8) kanały anionowe utworzone przy użyciu metody opartej na rezonansowym transferze energii Förstera (FRET) między podjednostkami.

Monitorowanie aktywności powtórzeń bogatych w leucynę zawierających 8 kanałów (LRRC8/VRAC) przy użyciu transferu energii rezonansowej Förstera z emisją uczuloną (SE-FRET)

Poznaj metodę pomiaru aktywności kanałowej CFTR po rekonstytucji w proteoliposomach z użyciem selektywnej elektrody jodkowej. Technika ta umożliwia badanie wpływu modulatorów na funkcję białka.

Pomiary funkcjonalnej rekonstytucji i aktywności kanałowej oczyszczonego białka CFTR typu dzikiego i zmutowanego

Przeglądaj więcej filmów