Pomiary funkcjonalnej rekonstytucji i aktywności kanałowej oczyszczonego białka CFTR typu dzikiego i zmutowanego

Ogólnym celem tej procedury jest pomiar funkcji populacji kanałów CFTR w systemie zrekonstytuowanym oraz zbadanie odpowiedzi kanałów na obecność cząsteczek modulatorów. Jest to realizowane poprzez uprzednie oczyszczenie białka CFTR typu dzikiego lub zmutowanego z komórek SF nine z wykorzystaniem szybkiej procedury oczyszczania, która pozwala na uzyskanie funkcjonalnego białka CFTR w roztworze detergentu. Drugim krokiem jest rekonstytucja oczyszczonego białka w proteoliposomach o określonym składzie lipidowym, wybranym przez eksperymentatora.

Następnie, poprzez usunięcie nadmiaru jodku liposomalnego, tworzy się gradient chemiczny jodku w poprzek błony, aby wygenerować siłę napędową dla ruchu jonów przez kanał CFTR. Ostatnim krokiem jest aktywacja kanału i zainicjowanie uwalniania jodku z proteoliposomów w obecności badanej cząsteczki modulatora. Ostatecznie, do monitorowania funkcji kanału CFTR w czasie rzeczywistym w tym zrekonstytuowanym układzie wykorzystuje się elektrodę selektywną do jodków.

Metoda ta umożliwia badanie aktywności kanałów chlorkowych oczyszczonej populacji cząsteczek CFTR po ich rekonstytucji w liposomach fosfolipidowych. Choć metoda ta została opracowana w celu uzyskania wglądu w funkcję kanału CFTR oraz wpływ modulatorów małocząsteczkowych, można ją zastosować również w innych układach, na przykład do funkcjonalnej charakterystyki innych białek błonowych. Aby osiągnąć sukces, osoby rozpoczynające pracę z tą metodą muszą upewnić się, że zoptymalizowały stosunek białka do lipidów dla swojego układu, nie pracują z białkiem o niskiej aktywności lub białkiem niefunkcjonalnym oraz że wytworzyły odpowiedni gradient jodków przez szczelne pęcherzyki.

Aby przygotować lipid, najpierw wysusz 5 mg fosfatydylocholiny z żółtka jaja lub egg PC w probówce z nietrwałego szkła borokrzemianowego w strumieniu argonu przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Następnie oblicz objętość potrzebnego buforu 6 zgodnie z opisem w protokole tekstowym, a następnie dodaj bufor 6 bezpośrednio do lipidów. Uszczelnij probówkę perfilenami, a następnie mieszaj ją w wstrząsarku typu vortex przez dwie minuty w temperaturze pokojowej, aby zawiesić lipid w buforze.

Następnie w temperaturze pokojowej zawieś lipid, używając igły o rozmiarze 25 G przymocowanej do strzykawki o pojemności 1 ml, aż na ściankach probówki nie będzie widocznego filmu lipidowego. Bufor będzie mętny ze względu na zawieszone lipidy. Poddaj lipid w probówce 22. serii sonikacji w kąpieli sonikacyjnej z lodem, a następnie umieść probówkę na lodzie na jedną minutę.

Powtórz ten cykl trzy razy. Następnie dodaj białko CFTR do lipidów, aby uzyskać objętość końcową 1 ml. Wymieszaj białko z zawiesiną lipidową, przeciągając roztwór 10 razy przez igłę o rozmiarze 25 G.

Próbkę należy pozostawić na lodzie przez 30 minut, obracając probówkę pięć razy co pięć minut w celu wymieszania podczas inkubacji. Odłam dolną zakładkę jednorazowej kolumny wiążącej detergent i wiruj kolumnę przez dwie minuty przy 2000 ×g. Aby usunąć bufor do przechowywania, przemyj kolumnę pięcioma mililitrami buforu 7 i wiruj kolumnę przez cztery minuty przy 2000 ×g, aby wypłukać bufor płuczący.

Przemyj kolumnę trzykrotnie, przenieś całą próbkę lipidów białkowych o objętości 1 ml na wierzch żywicy kolumny, a następnie inkubuj kolumnę przez dwie minuty w temperaturze pokojowej. Wirowarką odwiruj kolumnę w temperaturze pokojowej przez cztery minuty przy 2000 ×g. Następnie przenieś mętny roztwór liposomów białkowych do czystej probówki typu microfuge i umieść probówkę na lodzie. Namocz 5 g kulek Cidex G 50 w 50 ml buforu 9 przez co najmniej dwie godziny w temperaturze pokojowej.

Następnie napełnij cztery małe kolumny przesiewowe nasyconymi kuleczkami, aż będą pełne w co najmniej trzech czwartych swojej objętości. Odwiruj kolumny przez cztery minuty przy 2000 ×g, aby usunąć nadmiar buforu z żywicy. Po wirowaniu w kolumnie powinno znajdować się około 2,25 ml upakowanej żywicy.

Kluczowe jest, aby żywica była odpowiednio hydratyzowana przed elucją z liposomami protea. Następnie przenieś 125 µL próbki liposomów protea na górę każdej kolumny i wiruj przez cztery minuty przy 2000 ×g. Połącz frakcje EIT do wykorzystania w eksperymentach FLX z jodkiem.

Umieść mały magnetyczny mieszadło w jednym dołku płytki 96-dołkowej, a następnie dodaj do dołka 150 µL VX seven 70 o stężeniu 20 µM w buforze dziewięć. Użyj końcówki do pipety, aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza. Następnie dodaj do dołka 150 µL próbki liposomów protea, tak aby objętość całkowita wynosiła 300 µL.

Umieść płytkę 96-dołkową na mieszadle magnetycznym przy prędkości 130 obr./min. Wprowadź końcówkę elektrody czułej na jodek do roztworu, uważając, aby nie dotknęła ona mieszadełka ani dna dołka. Aby zarejestrować przebiegi sygnału z elektrody, przefiltruj sygnał za pomocą filtra dolnoprzepustowego z częstotliwością próbkowania 2 Hz i rejestruj przebiegi z próbki przez pięć minut, aby umożliwić jej równowagowanie.

Powinno to spowodować uzyskanie stabilnej, niemal płaskiej linii bazowej. Następnie należy dodać 3 µL 100 mM roztworu zapasowego Mg-ATP o pH 7. Aby aktywować kanały CFTR, należy pozostawić próbkę do wyrównania przez kolejne pięć minut, aż do osiągnięcia nowej linii bazowej.

Następnie należy dodać 3 µL stockowego roztworu walinomycyny o stężeniu 2 µM, aby zniwelować gradient elektrochemiczny generowany przez aktywność CFTR. Spadek napięcia wynikający z aktywności CFTR w transporcie jodku należy rejestrować przez co najmniej pięć minut.

Następnie, w celu przeprowadzenia kontroli, dodaj do próbki trzy µL roztworu 10% Triton X 100, aby uwolnić jodek z wnętrza liposomów proteowych. Znaczące uwolnienie jodku wskazuje, że ilość jodku uwięzionego w pęcherzykach nie była czynnikiem ograniczającym aktywność CFTR. Po pomiarze próbki przygotuj serię rozcieńczeń jodku potasu w buforze dziewięć, w zakresie stężeń od mikromolarnych do nanomolarnych.

Zaczynając od roztworu o najniższym stężeniu, należy zapisać odpowiedź elektrody w miliwoltach dla każdego stężenia jodku, aby wygenerować krzywą standardową. Przeprowadzono analizę aktywności CFTR typu dzikiego w odniesieniu do jodku. Aktywność strumienia F mierzono w nanomolach na sekundę po rekonstytucji.

Strumień jonów jodku jest znacznie stymulowany w obecności CFTR i TP w porównaniu z kontrolą pozbawioną CFTR oraz poprzez dodanie TP. Gdy CFTR jest fosforylowany przez cykliczną AMP-zależną kinazę białkową, podjednostkę katalityczną znaną jako PKA, natomiast wstępne opracowanie silnym inhibitorem CFTR inhibitor 172 zmniejsza szybkość strumienia jodku. Zdolność VX 770 do potęgowania strumienia jodku w CFTR typu dzikiego była badana bez i z fosforylacją przez PKA. VX 770 zwiększył względny strumień jodku tylko w obecności fosforylowanego CFTR. Skuteczność VX 770 zbadano przy użyciu wariantu CFTR zwanego Delta 508 CFTR; nieaktywny analog V091188 nie potęguje aktywności fosforylowanego delta 508 CFTR, podczas gdy VX 770 zwiększa względny strumień jodku. Po opanowaniu technika ta może zostać zrealizowana od oczyszczania po pomiary aktywności CFTR w typowym ośmiogodzinnym dniu pracy; oczyszczanie CFTR trwa około czterech godzin, a rekonstytucja zajmuje kolejną godzinę przed rozpoczęciem testu eFlex.

Po przeprowadzeniu tej procedury można zastosować inne metody, w tym test TPS oraz pomiar przewodnictwa jednokanałowego w para-lipidach, wykorzystując ten sam preparat białka CFTR, aby dalej scharakteryzować interakcję z małymi cząsteczkami. Dzięki zastosowaniu tych metod badacz mukowiscydozy będzie w stanie odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie modulatorów CFTR, a mianowicie: czy dany modulator oddziałuje bezpośrednio z białkiem CFTR oraz jaki jest mechanizm działania tego modulatora.