Name: Zubożenie cholesterolu makrofagów i jego wpływ na fagocytozę Cryptococcus neoformans (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 7 s
Description: Poznaj metodę zubożenia cholesterolu w makrofagach i jego wpływ na fagocytozę Cryptococcus neoformans. Technika ta pozwala badać rolę steroli w infekcjach grzybiczych in vitro.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty NIH AI56168, AI71142, AI87541 i AI100631 MDP. Maurizio Del Poeta jest badaczem chorób zakaźnych Burroughs Wellcome.

1. Niedobór cholesterolu w komórkach J774A.1 z MβCD
<ol>
	<li>W sterylnej komorze bezpieczeństwa biologicznego wysiew 105 komórek podobnych do makrofagów J774A.1 na studzienkę na 96-dołkowej płytce do hodowli komórkowej w 200 μl zmodyfikowanego podłoża Eagle (DMEM) firmy Dulbecco uzupełnionego 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 1% penicyliny/streptomycyny (P / S). Inkubować w temperaturze 37 °C i przy 5 % CO2 O/N.</li>
	<li>Usuń pożywkę z monowarstwy komórek i umyj komórki dwukrotnie 1x solą fizjologiczną buforowaną fosforanem (PBS), która została przefiltrowana lub autoklawowana.</li>
	<li>Dodać 200 μl roztworu MβCD o pożądanym stężeniu (10 mM lub 30 mM w PBS) lub 1x PBS jako kontrolę i inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem. Natychmiast po zabiegu usunąć supernatant i odłożyć w RT do analizy ilościowej za pomocą dostępnego w handlu zestawu.</li>
	<li>Przemyć komórki dwa do trzech razy 1x PBS lub DMEM bez surowicy i kontynuować infekcję lub lizować komórki, pipetując dwa do trzech razy dejonizowanymH2Odo analizy za pomocą chromatografii cienkowarstwowej lub zestawu. 
	UWAGA: Po wyczerpaniu poziomu cholesterolu można użyć dostępnego na rynku zestawu do oznaczania ilościowego cholesterolu. Szczegółowe informacje można znaleźć w sekcji materiałów. Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta, jak napisano.</li>
</ol>
2. Obserwacja zawartości cholesterolu metodą chromatografii cienkowarstwowej (TLC)
<ol>
	<li>Umyć zbiornik TLC dwukrotnie acetonem i raz roztworem eteru naftowego: eteru dietylowego i kwasu octowego (65:30:1 objętościowo). Nasycić zbiornik roztworem eteru naftowego: eteru dietylowego: kwasu octowego (65:30:1 objętościowo) i pozostawić O/N. 
	UWAGA: Rozpuszczalniki organiczne należy zawsze stosować pod wyciągiem, aby zapobiec wdychaniu pary. Przez cały czas należy nosić rękawice i fartuch laboratoryjny. Kwas octowy jest mocnym kwasem i należy go stosować ostrożnie.</li>
	<li>W sterylnej komorze bezpieczeństwa biologicznego wysiać 106 komórek podobnych do makrofagów J774A.1 na studzienkę na 6-dołkowej płytce do hodowli komórkowej w objętości 5 ml ciepłego DMEM uzupełnionego 10% FBS i 1% P / S. Inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 O / N.</li>
	<li>Zubożyć makrofagi cholesterolu, wykonując kroki 1.2 - 1.4, zastępując 1 ml 200 μl, jeśli ma to zastosowanie, aby uwzględnić większy rozmiar studzienki.</li>
	<li>Dodać 500 μl trypsyny-EDTA do każdego dołka, inkubować przez 3 minuty w temperaturze 37 °C i delikatnie zeskrobać komórki za pomocą skrobaka do komórek.</li>
	<li>Przenieś do probówki do mikrofuge i dodaj dodatkowe 500 μl ciepłego DMEM uzupełnionego 10% FBS i 1% P/S.</li>
	<li>Wirować komórki przez 5 minut w temperaturze 300 x g i usunąć supernatant.</li>
	<li>Dodaj dodatkowe 500 μl ciepłego DMEM uzupełnionego 10% FBS i 1% P/S do osadu komórkowego i ostrożnie ponownie zawiesij, pipetując w górę iw dół.</li>
	<li>Usuń 10 μl komórek i policz komórki na hemocytometrze. Znormalizować stężenia komórek w każdej próbce i dodać równą liczbę komórek do szklanych probówek. 
	UWAGA: Na tym etapie można zdecydować się na połączenie komórek z tych samych grup terapeutycznych, aby uzyskać bardziej skoncentrowany końcowy ekstrakt lipidowy.</li>
	<li>Odwirować komórki przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i usunąć pożywkę.</li>
	<li>Dodać 2 ml metanolu i odwirować. Następnie dodaj 1 ml chloroformu i odwiruj. Sprawdź stan fazy, aby upewnić się, że roztwór jest w monophasic. 
	UWAGA: Probówki można przechowywać w temperaturze 4 °C O/N.</li>
	<li>Wirować przy 1 700 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej i przenieść supernatant do nowej probówki</li>
	<li>Dodać dodatkowo 1 ml chloroformu, a następnie 1 mldH2O. Wirować dwukrotnie przez 30 sekund. Wirować przy 1 700 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Zważyć szklaną probówkę na czułej wadze i za pomocą szklanej pipety Pasteura przenieść dolną fazę do szklanej probówki o znanej masie.</li>
	<li>Wysuszyć lipidy w parowniku odśrodkowym do wyschnięcia (około 2 godziny). Zważyć probówkę z wysuszonymi lipidami i obliczyć masę suchego lipidu. 
	UWAGA: Suche lipidy można przechowywać w temperaturze -20 °C do momentu przygotowania do wykonania TLC.</li>
	<li>Rozcieńczyć wysuszone lipidy w wystarczającej ilości chloroformu, aby znormalizować stężenie lipidów (zwykle 20 - 50 μl) i załadować 20 μl rozcieńczonego lipidu na płytkę TLC z krzemionki. Standardowo załadować 20 μg cholesterolu rozcieńczonego w 20 μl chloroformu.</li>
	<li>Dodaj wysuszoną płytkę TLC do nasyconego zbiornika TLC i pozwól rozpuszczalnikowi migrować do 1 cm przed krawędzią płytki. Wyjmij płytkę TLC ze zbiornika i pozostaw do wyschnięcia na około 5 minut.</li>
	<li>Wizualizuj lipidy, umieszczając je w zbiorniku z parami jodu, aby sprawdzić migrację. Usuń plamy i pozwól im zniknąć przez około 10 - 15 minut pod maską. 
	UWAGA: Jod stanowi zagrożenie wdychania. Zawsze używaj pod wyciągiem.</li>
	<li>Przygotować roztwór do barwienia obojętnymi lipidami, łącząc 60 ml metanolu z 60 ml dejonizowanegoH2O, 4 ml kwasu siarkowego i 630 mg chlorku manganu.</li>
	<li>Ostrożnie i powoli zanurz płytkę TLC w neutralnym roztworze do barwienia lipidów na tacy i usuń bez złuszczania warstwy krzemionki. 
	UWAGA: Neutralny roztwór do barwienia lipidów może być wielokrotnie użyty, dzięki czemu można go wyjąć z tacki i umieścić z powrotem w butelce do późniejszego użycia.</li>
	<li>Pozostaw płytę do wyschnięcia pod maską przy temperaturze pokojowej, aż wszystkie pęcherzyki znikną. Podgrzej płytkę TLC na bloku grzewczym ustawionym na 160 °C i zwęgl do żądanego koloru. 
	UWAGA: Program do densytometrii, taki jak Vision Works LS, może być używany do ilościowego oznaczania zwęglonych prążków w celu porównania próbek lipidów.</li>
</ol>
3. Zakażenie makrofagów C. neoformans (H99)
<ol>
	<li>W sterylnej komorze bezpieczeństwa biologicznego wysiewaj 105 komórek podobnych do makrofagów na basenie na 96-dołkowej płytce do hodowli komórkowej w 200 μl DMEM uzupełnionym 10% FBS i 1% P / S. Inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2, 5% CO2 O/N. 
	UWAGA: Infekcję można również przeprowadzić w naczyniach konfokalnych ze szklanym dnem, co ułatwia obrazowanie; Wszystkie kwoty pozostają bez zmian.</li>
	<li>Wyhodować kulturę C. neoformans (H99) przez zaszczepienie 10 ml YNB jedną kolonią otrzymaną z uderzonej płytki i inkubację O/N w temperaturze 30 °C z wytrząsaniem.</li>
	<li>Umyć i policzyć komórki C. neoformans (H99).
	<ol>
		<li>Odwirować kulturę C. neoformans O/N w temperaturze 1 700 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Wyjmij nośnik i wyrzuć. Umyj komórki 5 ml 1x PBS. Wirować przy 1 700 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Usunąć PBS i przemyć 5 ml przefiltrowanego 1x PBS. Wirować przy 1 700 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Powtórzyć ten krok jeszcze 2 razy.</li>
		<li>Usunąć PBS i ponownie zawiesić w 5 ml 1x PBS.</li>
		<li>Wykonać seryjne rozcieńczenie w PBS, aby uzyskać rozcieńczenie przemytej kultury w stosunku 1:500.
		<ol>
			<li>Dodać 100 μl oryginalnej próbki do 900 μl 1x PBS w celu uzyskania rozcieńczenia 1:10.</li>
			<li>Dodać 100 μl próbki rozcieńczonej w stosunku 1:10 do 900 μl 1x PBS w celu uzyskania rozcieńczenia 1:100.</li>
			<li>Dodać 200 μl próbki rozcieńczonej w stosunku 1:100 do 800 μl 1x PBS w celu uzyskania rozcieńczenia 1:500</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Weź 10 μl rozcieńczenia 1:500 i policz na hemocytometrze, aby obliczyć liczbę komórek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować roztwór roboczy do aktywacji makrofagów i opsonizacji C. neoformans.
	<ol>
		<li>Rozcieńczyć LPS i IFNγ 100x z roztworów podstawowych, dodając 10 μl do 990 μl. 
		UWAGA: LPS i IFNγ są stosowane w celu zwiększenia wychwytu fagocytarnego, ale nie są wymagane do fagocytozy. W przypadku zainteresowania działaniem grzybobójczym makrofagów należy przeprowadzić aktywację O/N w temperaturze 37 °C z wstrząsaniem przed zakażeniem.</li>
		<li>Na próbkę należy dodać 7,5 μl rozcieńczonego LPS, 1,25 μl rozcieńczonego IFNγ, 1,25 μl przeciwciała GXM i objętość kultury C. neoformans, która daje 1,25 x 105 komórek. Doprowadzić objętość do 250 μl pomnożoną przez liczbę próbek za pomocą DMEM uzupełnionego 10% FBS i 1% P/S.</li>
		<li>Wirować i inkubować roztwór przez 20 minut w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem. 
		UWAGA: Obniżenie poziomu cholesterolu (kroki 1.2 - 1.4) może odbywać się równocześnie z etapem opsonizacji. Należy pamiętać o traktowaniu makrofagów przed połączeniem roztworu roboczego, ponieważ opsonizowane komórki powinny być optymalnie używane nie dłużej niż 20 minut po kroku 3.4.3 inkubacji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Infekuj makrofagi
	<ol>
		<li>Umyj makrofagi dwukrotnie DMEM bez surowicy i dodaj 200 μl opsonizowanego roztworu roboczego C. neoformans do każdej studzienki.</li>
		<li>Inkubować przez 2 godziny w temperaturze 37 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Napraw i wybarwiaj komórki
	<ol>
		<li>Usuń pożywkę i umyj komórki 2 razy za pomocą DMEM.</li>
		<li>Wysuszyć monowarstwę komórek na powietrzu przez 10 minut i dodać 200 μl lodowatego metanolu, aby utrwalić komórki.</li>
		<li>Inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej i usunąć pozostały metanol.</li>
		<li>Dodać 200 μl 10x Giemsa i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Umyć 2 - 3 razy wodą dejonizowaną i osuszyć O/N bez nakrętki. 
		UWAGA: Obrazowanie można wykonać następnego dnia lub do tygodnia po barwieniu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wizualizacja i liczenie
	<ol>
		<li>Za pomocą mikroskopu policz 300 komórek na punkt danych (jeśli są 2 z tego samego zabiegu, policz 150 na studzienkę) i zanotuj liczbę zakażonych makrofagów i liczbę pochłoniętych komórek Cryptococcus. 
		UWAGA: Aby zapewnić równomierne próbkowanie na punkt danych, użyj 2 płytek na warunek, wybierz 3 nienakładające się obszary na płytkę i policz 50 komórek na obszar.</li>
		<li>Oblicz indeks fagocytarny, mnożąc procent zakażonych makrofagów przez średnią liczbę C. neoformans na makrofaga. Normalizuj indeks fagocytarny, wyrażając wartości jako procent kontroli traktowanej 1x PBS. Po kilku próbach oblicz średnią wartość i odchylenie standardowe średniej, aby określić trendy indeksu fagocytarnego. Użyj testu t-Studenta, aby określić istotność.</li>
		<li>Zrób mikrofotografie komórek w powiększeniu 1,000x lub 400x.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Test błękitu trypanowego
<ol>
	<li>W sterylnej komorze bezpieczeństwa biologicznego wysiewać 106 komórek podobnych do makrofagów na studzienkę na 6-dołkowej płytce do hodowli komórek w objętości 5 ml minimalnej pożywki egzogennej (DMEM) firmy Dulbecco, uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą i 1% penicyliną/streptomycyną. Inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 O/N.</li>
	<li>Zubożyć makrofagi cholesterolu, wykonując kroki 1.2 - 1.4, zastępując 2 ml 200 μl, jeśli ma to zastosowanie, aby uwzględnić większy rozmiar studzienki. 
	UWAGA: Pamiętaj, aby dołączyć kontrolę potraktowaną 1x PBS, a także kontrolę, która jest zeskrobywana przed jakimkolwiek zabiegiem.</li>
	<li>Dodaj 500 μl 1x PBS do każdej studzienki i delikatnie zeskrob komórki za pomocą skrobaka do komórek. Przenieś do probówki do mikrofuge i zawieś komórki, delikatnie pipetując w górę iw dół.</li>
	<li>Usuń 10 μl komórek i zabarwij 1 μl 4% błękitu trypanowego.</li>
	<li>Policz komórki na hemocytometrze i oblicz żywotność, korzystając z następującego równania: % żywotności = [1 - (Niebieskie komórki / całkowita liczba komórek)] x 100. Normalizowanie wartości do kontrolki, która nie była traktowana. Po kilku próbach oblicz wartość średnią i odchylenie standardowe, aby określić trendy w żywotności. Użyj testu t-Studenta, aby określić istotność.</li>
</ol>

<ol><li>Sarantis, H., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subversion+of+phagocytosis+for+pathogen+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+%26+Microbe%22%5BJournal%5D)">Subversion of phagocytosis for pathogen survival.</a> Cell Host & Microbe. 12 (4), 419-431 (2012).</li>
<li>Rougerie, P., Miskolci, V., Cox, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+Of+Membrane+Structures+During+Phagocytosis+And+Chemotaxis+Of+Macrophages%3A+Role+And+Regulation+Of+The+Actin+Cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Immunological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Generation Of Membrane Structures During Phagocytosis And Chemotaxis Of Macrophages: Role And Regulation Of The Actin Cytoskeleton.</a> Immunological Reviews. 256 (1), 222-239 (1111).</li>
<li>Liu, T., Perlin, D. S., Xue, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Mechanisms+Of+Cryptococcal+Meningitis%5BTitle%5D)+AND+%22Virulence%22%5BJournal%5D)">Molecular Mechanisms Of Cryptococcal Meningitis.</a> Virulence. 3, 173(2012).</li>
<li>Abadi, J., Pirofski, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Antibodies+Reactive+With+The+Cryptococcal+Capsular+Polysaccharide+Glucuronoxylomannan+Are+Present+In+Sera+From+Children+With+And+Without+Human+Immunodeficiency+Virus+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+Of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">A Antibodies Reactive With The Cryptococcal Capsular Polysaccharide Glucuronoxylomannan Are Present In Sera From Children With And Without Human Immunodeficiency Virus Infection.</a> The Journal Of Infectious Diseases. 180 (3), 915-919 (1999).</li>
<li>Kechichian, T. B., Shea, J., Del Poeta, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depletion+Of+Alveolar+Macrophages+Decreases+The+Dissemination+Of+A+Glucosylceramide-Deficient+Mutant+Of+Cryptococcus+Neoformans+In+Immunodeficient+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+And+Immunity%22%5BJournal%5D)">Depletion Of Alveolar Macrophages Decreases The Dissemination Of A Glucosylceramide-Deficient Mutant Of Cryptococcus Neoformans In Immunodeficient Mice.</a> Infection And Immunity. 75 (10), 4792-4798 (2007).</li>
<li>Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryptococci+At+The+Brain+Gate%3A+Break+And+Enter+Or+Use+A+Trojan+Horse%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+Of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Cryptococci At The Brain Gate: Break And Enter Or Use A Trojan Horse.</a> The Journal Of Clinical Investigation. 120 (5), 1389-1692 (1172).</li>
<li>Chrétien, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+Of+Cerebral+Cryptococcus+Neoformans+Infection+After+Fungemia%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+Of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis Of Cerebral Cryptococcus Neoformans Infection After Fungemia.</a> The Journal Of Infectious Diseases. 186 (4), 522-530 (2002).</li>
<li>Luberto, C., Martinez-Mariño, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+Of+App1+As+A+Regulator+Of+Phagocytosis+And+Virulence+Of+Cryptococcus+Neoformans%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+Of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Identification Of App1 As A Regulator Of Phagocytosis And Virulence Of Cryptococcus Neoformans.</a> The Journal Of Clinical Investigation. 112 (7), 1080-1094 (1172).</li>
<li>Mcquiston, T. J., Williamson, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paradoxical+Roles+Of+Alveolar+Macrophages+In+The+Host+Response+To+Cryptococcus+Neoformans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Of+Infection+And+Chemotherapy%3A+Official+Journal+Of+The+Japan+Society+Of+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Paradoxical Roles Of Alveolar Macrophages In The Host Response To Cryptococcus Neoformans.</a> Journal Of Infection And Chemotherapy: Official Journal Of The Japan Society Of Chemotherapy. 18 (1), 1-9 (2012).</li>
<li>García-Rodas, R., Zaragoza, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catch+Me+If+You+Can%3A+Phagocytosis+And+Killing+Avoidance+By+Cryptococcus+Neoformans%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Immunology+And+Medical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Catch Me If You Can: Phagocytosis And Killing Avoidance By Cryptococcus Neoformans.</a> FEMS Immunology And Medical Microbiology. 64 (2), 147-161 (2012).</li>
<li>Coelho, C., Bocca, A. L., Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Intracellular+Life+Of+Cryptococcus+Neoformans%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+Of+Pathology.+9%22%5BJournal%5D)">The Intracellular Life Of Cryptococcus Neoformans.</a> Annual Review Of Pathology. 9. 219, 10-1146 (2014).</li>
<li>Rao, M., Peachman, K. K., Alving, C. R., Rothwell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depletion+Of+Cellular+Cholesterol+Interferes+With+Intracellular+Trafficking+Of+Liposome-Encapsulated+Ovalbumin%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+And+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Depletion Of Cellular Cholesterol Interferes With Intracellular Trafficking Of Liposome-Encapsulated Ovalbumin.</a> Immunology And Cell Biology. 81, Doi. 415-423 (2003).</li>
<li>Sein, K. K., Aikawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Prime+Role+Of+Plasma+Membrane+Cholesterol%5BTitle%5D)+AND+%22In+The+Pathogenesis+Of+Immune+Evasion+And+Clinical+Manifestations+Of+Falciparum+Malaria.+Medical+Hypotheses%22%5BJournal%5D)">The Prime Role Of Plasma Membrane Cholesterol.</a> In The Pathogenesis Of Immune Evasion And Clinical Manifestations Of Falciparum Malaria. Medical Hypotheses. 51 (2), 10-1016 (1998).</li>
<li>Pucadyil, T. J., Tewary, P., Madhubala, R., Chattopadhyay, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholesterol+Is+Required+For+Leishmania+Donovani+Infection%3A+Implications+In+Leishmaniasis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+And+Biochemical+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Cholesterol Is Required For Leishmania Donovani Infection: Implications In Leishmaniasis.</a> Molecular And Biochemical Parasitology. 133, 145-152 (2004).</li>
<li>Tagliari, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+Microdomain+Components+Of+Histoplasma+Capsulatum+Yeast+Forms%2C+And+Their+Role+In%5BTitle%5D)+AND+%22Alveolar+Macrophage+Infectivity.+Biochimica+Et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Membrane Microdomain Components Of Histoplasma Capsulatum Yeast Forms, And Their Role In.</a> Alveolar Macrophage Infectivity. Biochimica Et Biophysica Acta. 1818 (3), 458-466 (2012).</li>
<li>Crane, J. M., Tamm, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+Of+Cholesterol+In+The+Formation+And+Nature+Of+Lipid+Rafts+In+Planar+And+Spherical+Model+Membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Role Of Cholesterol In The Formation And Nature Of Lipid Rafts In Planar And Spherical Model Membranes.</a> Biophysical Journal. 86 (5), 2965-2979 (2004).</li>
<li>Brown, D. A., London, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functions+Of+Lipid+Rafts+In+Biological+Membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+Of+Cell+And+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Functions Of Lipid Rafts In Biological Membranes.</a> Annual Review Of Cell And Developmental Biology. 14, 111-136 (1998).</li>
<li>Simons, K., Toomre, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+Rafts+And+Signal+Transduction+Nature+Reviews%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Lipid Rafts And Signal Transduction Nature Reviews.</a> Molecular Cell Biology. 1 (1), 31-39 (2000).</li>
<li>Ilangumaran, S., Hoessli, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+Of+Cholesterol+Depletion+By+Cyclodextrin+On+The+Sphingolipid+Microdomains+Of+The+Plasma+Membrane%5BTitle%5D)+AND+%22The+Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Effects Of Cholesterol Depletion By Cyclodextrin On The Sphingolipid Microdomains Of The Plasma Membrane.</a> The Biochemical Journal. 335 (Pt 2), 433-440 (1998).</li>
<li>Bligh, E. G., Dyer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Rapid+Method+Of+Total+Lipid+Extraction+And+Purification%29%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Journal+Of+Biochemistry+And+Physiology%22%5BJournal%5D)">A Rapid Method Of Total Lipid Extraction And Purification).</a> Canadian Journal Of Biochemistry And Physiology. 37 (8), 911-917 (1959).</li>
<li>Mukherjee, S., Lee, S., Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+To+Cryptococcus+Neoformans+Glucuronoxylomannan+Enhance+Antifungal+Activity+Of+Murine+Macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Antibodies To Cryptococcus Neoformans Glucuronoxylomannan Enhance Antifungal Activity Of Murine Macrophages.</a> Infect. Immun. 63 (2), 573-579 (1995).</li>
<li>Deshaw, M., Pirofski, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+To+The+Cryptococcus+Neoformans+Capsular+Glucuronoxylomannan+Are+Ubiquitous%5BTitle%5D)+AND+%22In+Serum+From+HIV%2B+And+HIV-+Individuals.+Clinical+And+Experimental+Immunology%22%5BJournal%5D)">Antibodies To The Cryptococcus Neoformans Capsular Glucuronoxylomannan Are Ubiquitous.</a> In Serum From HIV+ And HIV- Individuals. Clinical And Experimental Immunology. 99 (3), 425-432 (1995).</li>
<li>Tripathi, K., Mor, V., Bairwa, N. K., Del Poeta, M., Mohanty, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydroxyurea+Treatment+Inhibits+Proliferation+Of+Cryptococcus+Neoformans+In+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+In+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Hydroxyurea Treatment Inhibits Proliferation Of Cryptococcus Neoformans In Mice.</a> Frontiers In Microbiology. 3, 187(2012).</li>
<li>Chaka, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Analysis+Of+Phagocytosis+And+Killing+Of+Cryptococcus+Neoformans+By+Human+Peripheral+Blood+Mononuclear+Cells+By+Flow+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Diagn.+Lab.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Quantitative Analysis Of Phagocytosis And Killing Of Cryptococcus Neoformans By Human Peripheral Blood Mononuclear Cells By Flow Cytometry.</a> Clin. Diagn. Lab. Immunol. 2 (6), 753-759 (1995).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podczas pracy z tym protokołem ważne jest, aby uzyskać dokładną liczbę komórek podczas posiewu komórek ssaków i opsonizacji komórek C. neoformans . Minimalizuje to różnice między próbami i zapewnia dokładny stosunek celu do efektora 1:1 w całym badaniu. Bardzo ważne jest również skoordynowanie czasu wyczerpania cholesterolu i infekcji, aby zapobiec spoczynkowi opsonizowanych komórek drożdży lub leczonych komórek makrofagów w RT między zabiegami. Długie okresy oczekiwania mogą prowadzić do utraty opsonizacji prze...

Fagocytoza to proces, w którym jednostki zewnątrzkomórkowe są internalizowane przez komórki gospodarza. Jest to kluczowa broń w arsenale układu odpornościowego do obrony przed patogenami, ale proces ten może często zostać zakłócony przez patogeny, aby umożliwić internalizację i rozprzestrzenianie się w organizmie1. Fagocytoza jest pośredniczona przez kilka zdarzeń sygnalizacyjnych, które powodują przyłączanie i pochłanianie poprzez rearanżacje cytoszkieletu komórki gospodarza. "Profesjonalne" fagocyty są w stanie rozpoznać i związać się z opsoninami na powierzchni atakującego patogenu, aby zasygnalizować przyczepienie i utworzenie lamellipodiów, które pochłaniają patogen i tworzą fagosom2. Wśród tak zwanych "profesjonalnych" fagocytów znajdują się makrofagi. Makrofagi to wysoce wyspecjalizowane komórki, które pełnią funkcje ochronne, które obejmują wyszukiwanie i eliminowanie czynników chorobotwórczych, naprawę uszkodzonych tkanek i pośredniczenie w stanie zapalnym, większość z nich w procesie fagocytozy1,2.
Cryptococcus neoformans to gatunek chorobotwórczych drożdży, który powoduje poważną chorobę znaną jako Cryptococosis. Zarodniki Cryptococcus są wdychane przez gospodarza i powodują infekcję płuc, która zwykle przebiega bezobjawowo. Uważa się, że narażenie jest niezwykle powszechne; Próba 61 dzieci z Pediatrycznej Kliniki Chorób Zakaźnych w Bronx-Lebanon Hospital Center wykazała, że wszystkie badane osoby miały przeciwciała przeciwko kryptokokowemu polisacharydowi glukuronoksylomannanu, a inne badania wykazały rozpowszechnienie zarówno u niezakażonych ludzkim wirusem niedoboru odporności (HIV), jak i u zakażonych dorosłych3,4. Makrofagi pęcherzykowe są pierwszą linią odpowiedzi na infekcję płuc i w większości przypadków skutecznie usuwają patogen. Jednak u osób z obniżoną odpornością (np. pacjentów z HIV i AIDS) drożdże są w stanie przetrwać w makrofagach. W takich przypadkach makrofagi mogą służyć jako nisza do replikacji patogenu i mogą ułatwiać jego rozprzestrzenianie się do ośrodkowego układu nerwowego (OUN), gdzie choroba staje się śmiertelna 5-8. Uważa się, że makrofagi mogą nawet dostarczać drożdże bezpośrednio do opon mózgowych, pomagając drożdżom przekroczyć barierę krew-mózg za pośrednictwem modelu "konia trojańskiego"3,9-11. Dlatego ważne jest, aby zrozumieć proces fagocytozy i czynniki, które na nią wpływają, zwłaszcza w infekcjach kryptokokowych.
Poprzednie prace nad innymi systemami patogenów wskazują na to, że cholesterol i tratwy lipidowe tworzone przez cholesterol odgrywają ważną rolę w fagocytozie12–15. Cholesterol jest najliczniejszym gatunkiem lipidów w komórkach ssaków i stanowi 25 - 50% błony komórkowej ssaków16. Stwierdzono, że odgrywa rolę w modulowaniu właściwości biofizycznych membran poprzez zmianę ich sztywności17. Cholesterol i sfingolipidy razem tworzą mikrodomeny lipidowe w błonie znane jako tratwy lipidowe. Stwierdzono, że tratwy lipidowe biorą udział w tworzeniu kaweoli, a także zapewniają izolowaną domenę dla niektórych typów sygnalizacji16-18. Ze względu na ich niewielkie rozmiary trudno jest badać tratwy lipidowe in vivo. Jednym z użytecznych sposobów badania roli tratw lipidowych jest zmiana ich składników. Metylo-β-cyklodekstryna (MβCD) jest związkiem, który, jak stwierdzono, zubaża błony ssaków na poziom cholesterolu i jest powszechnie stosowany do badania roli tratw lipidowych18.
W tym protokole prezentujemy metodę usuwania cholesterolu z błon komórkowych gospodarza i ilościowego określania wpływu wyczerpania na zdolność komórek gospodarza do fagocytozy C. neoformans in vitro. Procedura ta wykorzystuje techniki hodowli komórkowej na unieśmiertelnionej linii komórkowej podobnej do makrofagów (J774A.1) jako modelu infekcji. Zubożenie cholesterolu zostało osiągnięte przez ekspozycję na MβCD, który ma hydrofobowy rdzeń specyficzny dla wielkości steroli i jest w stanie działać jako zlew dla cholesterolu, aby wyciągnąć go z błony19. Niedobór cholesterolu mierzono ilościowo za pomocą dostępnego na rynku zestawu i jakościowo za pomocą zmodyfikowanej ekstrakcji lipidów Bligh-Dyera, a następnie chromatografii cienkowarstwowej (TLC)20. Fagocytozę mierzono poprzez zakażenie linii komórkowej kulturą opsonizowanych drożdży zmieszanych z koktajlem γ interferonu i lipopolisacharydu w celu aktywacji makrofagów. Cryptococcus opsonizowano przy użyciu przeciwciała glukuronoksylomannanu (GXM)21–23. Eksperymenty barwienia i mikroskopii pozwoliły na wizualizację komórek i obliczenie indeksu fagocytarnego w celu oceny stopnia fagocytozy. Podsumowując, protokół ten opisuje podstawową metodę, która integruje zmianę składu lipidów z procesem fizjologicznym.

<table><tbody><tr><td>Szafa bezpieczeństwa biologicznego klasy II typu A2</td><td>Labconco</td><td>3460009</td><td></td></tr><tr><td>linia komórkowa J774A.1</td><td>ATCC</td><td>TIB-67</td><td>przybywa zamrożona. Zapoznaj się z instrukcjami ATCC dotyczącymi hodowli.</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Zmodyfikowany Eagle Medium</td><td>Gibco</td><td>11995-065</td><td>Przechowywać pod adresem 4 & deg; C i ciepły do 37 & deg; C przed użyciem</td></tr><tr><td>HI Płodowa surowica bydlęca Performance Plus</td><td>Gibco</td><td>10082-147</td><td>Przechowywać w stanie zamrożonym w temperaturze -20 stopni; C i rozmrozić przed dodaniem do DMEM</td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna (10 000 U / ml)</td> <td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>Używany do suplementacji Inkubator do</td></tr><tr><td>hodowli komórkowych</td> DMEM <td>Isotemp Fisher Scientific</td><td></td><td>Model # 3530</td></tr><tr><td>96-dołkowe naczynie hodowlane</td><td>Corning Inc. Costar</td><td>3595</td><td></td></tr><tr><td>10x sól fizjologiczna buforowana fosforanem</td><td>Fisher Scientific BioReagents</td><td>BP3994</td><td>Rozcieńczyć do 1x i przefiltrować lub autoklawować przed użyciem.</td></tr><tr><td>Metylo-&beta;-cyklodekstryna</td><td>Sigma Life Science</td><td>C4555-10G</td><td>Rozpuścić w 1x PBS, aby uzyskać roztwory o stężeniach 10 mM i 30 mM</td></tr><tr><td>Wytrząsarka orbitalna</td><td>Labline</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amplex Red Cholesterol Assay Kit</td> Life <td>Technologies Sondy molekularne</td><td>A12216</td><td>Wszystkie odczynniki do oznaczania cholesterolu znajdują się w zestawie. Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta.</td></tr><tr><td>96-dołkowa płytka testowa</td><td>Corning Inc. Costar</td><td>3603</td><td></td></tr><tr><td>Czytnik mikropłytek FilterMax</td> Urządzenia <td></td><td>molekularne</td><td>Model F5</td></tr><tr><td>Komora TLC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z126195-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>650498-4L</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860-2L-R</td><td></td></tr><tr><td>TLC Papier</td><td>Whatman</td><td>3030917</td><td>Przyciąć do rozmiaru potrzebnego do zbiornika TLC</td></tr><tr><td>Okap</td><td></td><td></td> wyciągowy <td>Dowolny wyciąg zgodny z normami AIHA/ANSI</td></tr><tr><td>Płytka 6-dołkowa</td><td>Corning Inc. Costar</td><td>3506</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Skrobak do komórek</td><td>Corning Inc. Costar</td><td>3010</td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometr</td><td>Hausser Scientific</td><td>1490</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>Model Alegra x-30R</td></tr><tr><td>Mieszalnik Votex</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-812</td><td></td></tr><tr><td>Balance</td><td>Mettler Toledo</td><td></td><td>Model # MS104S mierzy do 0,1 mg</td></tr><tr><td>Szklana pipeta Pasteura</td><td>Fisherbrand</td><td>13-678-20A</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>700000</td><td></td></tr><tr><td>Koncentrator SpeedVac</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Model # SPD2010</td></tr><tr><td>Eter naftowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>E139-1</td><td></td></tr><tr><td>Eter dietylowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>309966</td><td></td></tr><tr><td>Kwas octowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320099</td><td></td></tr><tr><td>TLC Żel krzemionkowy 60 ze strefą koncentracji</td><td>Chromatograhy analitycznej Millipore</td><td>1.11845.0001</td><td></td></tr><tr><td>Chipsy jodowe</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>376558-50G</td><td></td></tr><tr><td>Kwas siarkowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320501</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek manganu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>244589</td><td></td></tr><tr><td>UVP EC3 Imaging System</td><td>Ultra-Violet Products Ltd.</td><td></td><td>Użyj oprogramowania Vision Works LS do analizy densytometrycznej</td></tr><tr><td>Szklana dzież konfokalna</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-10C</td><td>www.glassbottomdishes.com</td></tr><tr><td>Cryptococcus neoformans (H99)</td><td></td><td></td><td>Uzyskany z Duke University Medical Center</td></tr><tr><td>YNB</td><td>BD</td><td>239210</td><td>Instrukcja przygotowania znajduje się u producenta. Użyj stężenia glukozy 20 g/l.</td></tr><tr><td>Lipopolisacharyd</td><td>Sigma</td><td>L4391-1MG</td><td>Rozpuścić w 1x PBS, aby uzyskać 1 mg / ml bulionu. Przechowywać w temperaturze -20 stopni Celsjusza.</td></tr><tr><td>Interferon gamma</td><td>Sigma</td><td>I4777</td><td>Rozpuścić w 1x PBS, aby uzyskać 0,1 mg/ml roztworu podstawowego</td></tr><tr><td>Przeciwciało glukuronoksylomannanu (anty-GXM)</td><td></td><td></td><td>Prezent od Arturo Casadevall's Lab stężenie wynosi 1,98 mg/ml</td></tr><tr><td>Giemsa</td><td>MP Biomedicals</td><td>194591</td><td>Rozpuść 0,8 g Giemsy w 25 ml glicerolu i podgrzej do 60 & stopni; C przez 1 godzinę. Dodać 25 ml metanolu do roztworu i pozostawić do leżakowania w temperaturze pokojowej przez co najmniej 1 miesiąc.</td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Mikroskop Zeiss</td><td></td><td>Observer.D1 z AxioCam MRm do robienia zdjęć</td></tr></tbody></table>

zubożenie cholesterolu makrofagów i jego wpływ na fagocytozę cryptococcus neoformans

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

Kryptokokoza to zagrażająca życiu infekcja wywoływana przez chorobotwórcze grzyby z rodzaju Cryptococcus. Do zakażenia dochodzi po wdychaniu zarodników, które są zdolne do replikacji w głębokim płucu. Fagocytoza Cryptococcus przez makrofagi jest jednym ze sposobów, w jaki choroba jest w stanie rozprzestrzenić się do ośrodkowego układu nerwowego, powodując śmiertelne zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych. Dlatego badanie związku między Cryptococcus a makrofagami jest ważne dla zrozumienia postępu infekcji. W niniejszym badaniu opisano krok po kroku protokół badania zakaźności makrofagów przez C. neoformansin vitro. Za pomocą tego protokołu badana jest rola steroli gospodarza w interakcjach gospodarz-patogen. Różne stężenia metylo-cyklodekstryny (MCD) stosowano do zubożenia cholesterolu z linii komórkowej podobnej do makrofagów mięsaka retikulum mysiego J774A.1. Niedobór cholesterolu został potwierdzony i określony ilościowo przy użyciu zarówno dostępnego na rynku zestawu do oznaczania ilościowego cholesterolu, jak i chromatografii cienkowarstwowej. Komórki zubożone w cholesterol aktywowano za pomocą lipopolisacharydu (LPS) i interferonu gamma (IFNγ) i zakażono opsonizowanymi przeciwciałami komórkami H99 typu dzikiego Cryptococcus neoformans w stosunku efektorowym do celu wynoszącym 1:1. Zakażone komórki monitorowano po 2 godzinach inkubacji z C. neoformans i obliczono ich indeks fagocytarny. Niedobór cholesterolu spowodował znaczne obniżenie indeksu fagocytarnego. Przedstawione protokoły oferują wygodną metodę naśladowania inicjacji procesu infekcji w środowisku laboratoryjnym oraz badania roli składu lipidowego gospodarza na zakaźność.

Usuwanie cholesterolu
Analiza supernatantu zachowanego w kroku 1.3 protokołu, przeprowadzona zgodnie z instrukcjami producenta zestawu Amplex Red Cholesterol Assay, wykazuje podwyższone stężenie cholesterolu w próbce traktowanej MβCD w porównaniu z kontrolą w 1x PBS. W zależności od typu komórek i zastosowanego stężenia MβCD stopień usunięcia cholesterolu może być różny. W przypadku komórek J774 traktowanych 10 mM MβCD zaobserwowano usunięcie cholesterolu na poziomie około 50%. Stopień usunięcia ...

W tym artykule opisany jest protokół infekcji makrofagów Cryptococcus neoformans. Wyjaśniono również metodę usuwania steroli z makrofagów. Protokoły te stanowią przewodnik do badania zakażeń grzybiczych in vitro i badania roli steroli w takich infekcjach.

Zubożenie cholesterolu makrofagów i jego wpływ na fagocytozę Cryptococcus neoformans

Cryptococcosis is a life-threatening infection caused by pathogenic fungi of the genus Cryptococcus. Infection occurs upon inhalation of spores, which are ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wyjaśnienie roli cholesterolu w procesie wychwytu Cryptococcus neoformans przez makrofagi. Jest to realizowane poprzez uprzednie usunięcie cholesterolu z linii komórkowej makrofagów mysich przy użyciu metylo-beta-cyklodekstryny. Następnie usunięcie cholesterolu jest potwierdzane i ilościowo oznaczane z wykorzystaniem chromatografii cienkowarstwowej oraz dostępnego komercyjnie zestawu.Następnie komórki Cryptococcus neoformans są opsonizowane przeciwciałami specyficznymi wobec GXM, XLO lub komponentu GXMA kapsułki Cryptococcus. W dalszej kolejności makrofagi pozbawione cholesterolu są infekowane opsonizowanymi komórkami Cryptococcus neoformans. Ostatecznie, do wizualizacji zainfekowanych komórek oraz obliczenia stopnia fagocytozy wykorzystuje się mikroskopię fluorescencyjną i świetlną.Główną zaletą tej techniki jest możliwość jej przeprowadzenia przy użyciu podstawowego sprzętu laboratoryjnego w stosunkowo krótkim czasie, przy jednoczesnym uzyskaniu wyników ilościowych. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu patogenezy grzybów. Na przykład, jaka jest rola lipidów gospodarza w optyce patogenów grzybiczych?Znaczenie tej techniki rozciąga się na terapię lub zapobieganie zakażeniom grzybiczym, ponieważ internalizacja w makrofagach jest krytycznym etapem inicjacji kluczowych procesów. Choć metody te mogą dostarczyć wglądu w zakaźność patogenów grzybiczych, mogą być one również zastosowane do innych organizmów, takich jak obligatoryjne patogeny wewnątrzkomórkowe. W sterylnej komorze z laminarnym przepływem powietrza wysiej 10⁵ komórek makrofagopodobnych J 7 74 A na dołek 96-dołkowej płytki hodowlanej. W 200 µL DMEM uzupełnionego o 10% FBS oraz 1% penicyliny-streptomycyny (PS) inkubuj przez noc w temperaturze 37 °C i 5% CO2 do następnego dnia.Usunąć medium z monowarstwy komórek i użyć filtrowanego lub autoklawowanego PBS do dwukrotnego przemycia komórek. Dodać 200 µL roztworu metylo-beta-cyklodekstryny lub embeta CD o pożądanym stężeniu lub 1x PBS jako kontrolę i inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C przy wytrząsaniu. Usunąć nadsącz i przechowywać go w temperaturze pokojowej do analizy ilościowej z użyciem dostępnego komercyjnie zestawu.Bezpośrednio po zakończeniu tej procedury za pomocą PBS lub DMEM bez surowicy, przemyć komórki dwa do trzech razy przed przeprowadzeniem oznaczania ilości cholesterolu lub przejściem do infekcji. Przenieś proces infekcji makrofagów z usuniętym cholesterolem do sterylnej komory z laminarnym przepływem powietrza. Wysiej 10⁵ komórek makrofagopodobnych na dołek.W płytce 96-dołkowej inkubować przez noc w temperaturze 37 °C i 5% CO2 jednocześnie. Wyhodować kulturę C. neoformans H 99 poprzez wyizolowanie jednej kolonii z płytki z posiewem i zaszczepienie 10 ml YNB; inkubować przez noc w temperaturze 30 °C z wytrząsaniem, a następnie przejść do kolejnego etapu następnego dnia. Odwirować kulturę C. neoformans przy 1 700 ×g i 4 °C przez 10 minut.Usuń nadsącz i dodaj 5 ml 1x PBS przed ponownym wirowaniem. Następnie użyj filtrowanego 1x PBS, aby trzykrotnie przemyć komórki, a potem ponownie zawieś je w 5 ml 1x PBS. W kolejnym kroku, w celu przygotowania rozcieńczeń seryjnych przemytej hodowli, dodaj 100 µl oryginalnej próbki do 900 µl 1x PBS.Aby uzyskać rozcieńczenie 1:10, dodaj 100 µL próbki rozcieńczonej 1:10 do 900 µL 1x PBS, otrzymując rozcieńczenie 1:100. Na koniec dodaj 200 µL próbki rozcieńczonej 1:100 do 800 µL 1x PBS. Aby uzyskać rozcieńczenie 1:500, nanieś 10 µL końcowego rozcieńczenia na hemocytometr i dokonaj odczytu w celu obliczenia liczby komórek. Aby przygotować roztwór roboczy do aktywacji makrofagów i opsonizacji C. neoformans, rozcieńcz LPS oraz interferon gamma 100-krotnie z roztworów zapasowych, rozpuszczając 10 µL każdego związku w 990 µL PBS. Dla każdej próbki połącz 7,5 µL LPS, 1,25 µL interferonu gamma, 1,25 µL przeciwciała GXM oraz 1,25 × 10⁵.Należy przygotować komórki *C. neoformans*, a następnie, używając pożywki DMEM uzupełnionej o FBS i Ps, doprowadzić objętość do 250 mikrolitrów na próbkę. Roztwór należy wymieszać w wirówce laboratoryjnej (vortex) i inkubować przez 20 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza w warunkach wytrząsania przed zakażeniem makrofagów. Po usunięciu cholesterolu można przeprowadzić procesy dalsze. Należy dwukrotnie przemyć komórki pożywką DMEM bez surowicy przed dodaniem 200 mikrolitrów roboczego roztworu opsonizowanych komórek *C. neoformans* do każdej z nich.Inkubujemy przez dwie godziny w temperaturze 37°C. Następnie przystępujemy do utrwalania i barwienia komórek. Po dwukrotnym przemyciu komórek medium DMEM i wysuszeniu monowarstwy komórek przez 10 minut, dodajemy 200 µL lodowatego metanolu w celu utrwalenia na 15 minut w temperaturze pokojowej, a następnie usuwamy pozostały metanol.Następnie dodaj 200 µL 10 x giza i inkubuj przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Następnie przemyj dwa lub trzy razy wodą dejonizowaną, pozostaw nakrętkę otwartą i wysusz przez noc lub do tygodnia później pod mikroskopem. Policz 300 komórek na punkt danych i odnotuj liczbę zainfekowanych makrofagów oraz liczbę pochłoniętych komórek cryptococcus.Oblicz indeks kwasowości PHA, mnożąc procent zainfekowanych makrofagów przez średnią liczbę C neoformans na makrofag. Znormalizuj indeks kwasowości F, wyrażając wartości jako procent w stosunku do kontroli traktowanej XPBS. Po przeprowadzeniu kilku prób oblicz wartość średnią oraz odchylenie standardowe średniej, aby określić trendy w indeksie kwasowości F.Użyj testu t-Studenta, aby określić istotność statystyczną, zgodnie z przedstawionym tutaj schematem. Analiza supernatantu pobranego z komórek traktowanych M beta CD wykazała podwyższony poziom cholesterolu w porównaniu z supernatantanem wyizolowanym z komórek kontrolnych w PBS, co wskazuje na wyższy poziom usuwania cholesterolu w komórkach traktowanych M beta CD. Stopień usunięcia można obliczyć, korzystając z wartości cholesterolu uzyskanych z supernatantu i lizatu komórkowego, jak zilustrowano tutaj, aby potwierdzić wyniki usuwania cholesterolu.Lizat komórkowy analizowany za pomocą TLC wykazuje wyraźny spadek zabarwienia cholesterolu w komórkach traktowanych zwiększającymi się stężeniami M beta CD cytometry. Analiza TLC wykazuje trend podobny do analizy ilościowej; po infekcji komórki pozostają przyległe i nienaruszone, a morfologia komórek w zainfekowanych komórkach C. neoformans pozostaje niezmieniona w porównaniu z nieleczonymi komórkami kontrolnymi. Mikrografie optymalnie zainfekowanych komórek wyraźnie pokazują C. neoformans pochłonięte przez komórki ssaków.Wykres ten pokazuje, że przy obliczeniach przeprowadzonych dla 300 makrofagów na grupę badawczą, w komórkach pozbawionych cholesterolu odnotowano obniżenie indeksu kwasowego F. Po opanowaniu technika ta może zostać wykonana w około pięciu godzinach. Czas ten nie obejmuje okresów inkubacji, które muszą odbywać się przez noc po zakończeniu procedury. W celu udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak to, czy pozbawienie cholesterolu redukuje optykę cryptococcus poprzez wpływ na gospodarcze grafty lipidowe po jego rozwoju, można zastosować inne metody, np. ekstrakcję błon odpornych na detergenty z makrofagów.Techniki te utorują drogę badaczom z dziedziny biologii błon i immunologii do zrozumienia mechanizmów fagocytozy przez makrofagi oraz interakcji z patogennymi grzybami. Należy pamiętać, że praca z patogenami może być niezwykle niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania tej procedury zawsze należy przestrzegać środków ostrożności, takich jak stosowanie odzieży ochronnej.

macrophage-cholesterol-depletion-its-effect-on-phagocytosis

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Czyszczenie cholesterolu z makrofagów i jego wpływ na fagocytozę Cryptococcus neoformans

Makrofagi odgrywają centralną rolę w homeostazie i patologii wielu tkanek. Przedstawiony tutaj protokół opisuje metody usuwania makrofagów in vivo, otrzymywania spolaryzowanych makrofagów z aspiratów szpiku kostnego oraz adoptywnego transferu makrofagów do myszy. Techniki te pozwalają na określenie roli, jaką spolaryzowane makrofagi odgrywają w zdrowiu i chorobie.

Wyczerpanie i rekonstytucja makrofagów u myszy

W tym filmie demonstrujemy test cytotoksyczności do oceny infekcji Cryptococcus neoformans, grzyba chorobotwórczego, u makrofagów. Cytotoksyczność jest określana przez uwalnianie enzymu cytoplazmatycznej dehydrogenazy mleczanowej w wyniku lizy makrofagów spowodowanej zakażeniem Cryptococcus neoformans.

Test uwalniania dehydrogenazy mleczanowej w celu wykrycia infekcji Cryptococcus neoformans w makrofagach

Ten film prezentuje metodę oceny wpływu aspiryny i ibuprofenu, przy ich minimalnych stężeniach hamujących, na fagocytozę makrofagów przy użyciu wrażliwych na pH komórek grzybów barwionych barwnikiem fluorescencyjnym. Leki hamują cyklooksygenazę-2, zmniejszając tworzenie prostaglandyn i zwiększając fagocytozę makrofagów, co obserwuje się za pomocą pomiarów fluorescencji barwnika wrażliwego na pH.

Wpływ aspiryny i ibuprofenu na zdolność fagocytarną makrofagów

Opisujemy metody wideomikroskopii żywych komórek fagocytozy Candida albicans za pomocą makrofagów.  Metody te umożliwiają specyficzną dla danego etapu analizę migracji, rozpoznawania, pochłaniania i dojrzewania fagosomów oraz ujawniają nowe aspekty fagocytozy.

Mikroskopia wideo żywych komórek fagocytozy patogenów grzybowych

Metoda oceny zdolności izolowanych makrofagów pęcherzykowych myszy do kontrolowania wzrostu fagocytozowanych zarodników Aspergillus za pomocą mikroskopii konfokalnej.

Ocena aktywności przeciwgrzybiczej izolowanych makrofagów pęcherzykowych za pomocą mikroskopii konfokalnej

Opisujemy, jak wizualizować interakcje makrofagów-C. neoformansów (Cn) w czasie rzeczywistym, ze szczególnym naciskiem na proces egzocytozy nielitycznej za pomocą cyfrowej mikroskopii świetlnej. Za pomocą tej techniki można badać indywidualnie zakażone makrofagi w celu ustalenia różnych aspektów tego zjawiska.

Wizualizacja egzocytozy nielitycznej Cryptococcus neoformans z makrofagów przy użyciu cyfrowej mikroskopii świetlnej

Tutaj prezentujemy protokół ilościowego oznaczania fagocytozy cząstek fluorescencyjnych za pomocą przylegającej linii komórkowej makrofagów przy użyciu metody fluorometrycznej. Metoda ta ułatwia wysokoprzepustową kwantyfikację internalizacji cząstek, a także wynikającą z niej polimeryzację aktyny.

Wysokoprzepustowa technika fluorometryczna do oceny fagocytozy makrofagów i polimeryzacji aktyny

Przedstawiono protokół dla hodowli komórkowej makrofagów makrofagów stymulujących tworzenie kolonii (M-CSF) zróżnicowanych ludzkich makrocytów pochodzących z monocytów. Protokół wykorzystuje krioprezerwację monocytów w połączeniu z ich masowym różnicowaniem do makrofagów. Następnie zebrane makrofagi można następnie wysiać w studzienkach hodowlanych o wymaganej gęstości komórek do przeprowadzenia eksperymentów.

Posiew czynnika stymulującego tworzenie kolonii makrofagów Zróżnicowane ludzkie makrofagi pochodzące z monocytów

Opisujemy metodę pomiaru prędkości fagosomów przemieszczających się w kierunku centrum komórki w żywych komórkach zakażonych lub bez ludzkiego wirusa niedoboru odporności (HIV) typu 1, używając konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej z wirującym dyskiem do identyfikacji fluorescencyjnych zakażonych komórek i mikroskopii jasnego pola do wykrywania fagosomów.

Migracja i prędkość fagosomów mierzona w żywych pierwotnych ludzkich makrofagach zakażonych wirusem HIV-1

Wiadomo, że lipidy odgrywają ważną rolę w funkcjach komórkowych. W tym miejscu opisujemy metodę określania składu lipidowego neutrofili, z naciskiem na poziom cholesterolu, przy użyciu zarówno HPTLC, jak i HPLC, aby lepiej zrozumieć mechanizmy leżące u podstaw tworzenia pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili.

Metody badania zmian lipidowych w neutrofilach i późniejszego tworzenia pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili

Prezentowany tutaj jest protokół do ilościowego określania i tworzenia dynamicznych obrazów regulacji makrofagów (MΦ) za pośrednictwem mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC) fagocytozy nieopsonizowanych cząsteczek drożdży (zymosan), które są sprzężone z cząsteczką fluorescencyjną wrażliwą na pH.

Mezenchymalne komórki macierzyste regulują fagocytozę makrofagów; Kwantyfikacja i obrazowanie

Poznaj metodę zubożenia cholesterolu w makrofagach i jego wpływ na fagocytozę Cryptococcus neoformans. Technika ta pozwala badać rolę steroli w infekcjach grzybiczych in vitro.

Zubożenie cholesterolu makrofagów i jego wpływ na fagocytozę Cryptococcus neoformans

Przeglądaj więcej filmów