Name: Test elektroforezy za pośrednictwem wyżarzania nukleokapsydu (NAME) umożliwia szybką identyfikację inhibitorów nukleokapsydu HIV-1 (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: Poznaj metodę NAME do szybkiej identyfikacji inhibitorów białka nukleokapsydu HIV-1 za pomocą elektroforezy. Technika ta umożliwia badaczom odkrywanie nowych związków terapeutycznych bez konieczności stosowania izotopów promieniotwórczych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Ministero degli Affari Esteri (MAE, DRPG, Unità per la cooperazione scientifica e tecnologica, Grant: PGR Italy-USA) oraz przez MIUR, Progetti di Ricerca di Interesse Nazionale (Grant: 2010W2KM5L_006).

<ol><li>Druillennec, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mimic+of+HIV-1+nucleocapsid+protein+impairs+reverse+transcription+and+displays+antiviral+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">A mimic of HIV-1 nucleocapsid protein impairs reverse transcription and displays antiviral activity.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 96, 4886-4891 (1999).</li>
<li>Darlix, J. L., Garrido, J. L., Morellet, N., Mely, Y., de Rocquigny, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties%2C+functions%2C+and+drug+targeting+of+the+multifunctional+nucleocapsid+protein+of+the+human+immunodeficiency+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Properties, functions, and drug targeting of the multifunctional nucleocapsid protein of the human immunodeficiency virus.</a> Adv Pharmacol. 55, 299-346 (2007).</li>
<li>Thomas, J. A., Gorelick, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleocapsid+protein+function+in+early+infection+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Virus+Res%22%5BJournal%5D)">Nucleocapsid protein function in early infection processes.</a> Virus Res. 134, 39-63 (2008).</li>
<li>Mirambeau, G., Lyonnais, S., Gorelick, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Features%2C+processing+states%2C+and+heterologous+protein+interactions+in+the+modulation+of+the+retroviral+nucleocapsid+protein+function%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biol%22%5BJournal%5D)">Features, processing states, and heterologous protein interactions in the modulation of the retroviral nucleocapsid protein function.</a> RNA Biol. 7, 724-734 (2010).</li>
<li>Zeng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+nucleation%2C+reverse+annealing%2C+and+chaperone+function+along+the+reaction+path+of+HIV-1+single-strand+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Probing nucleation, reverse annealing, and chaperone function along the reaction path of HIV-1 single-strand transfer.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 104, 12651-12656 (2007).</li>
<li>Basu, V. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strand+transfer+events+during+HIV-1+reverse+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Virus+Res%22%5BJournal%5D)">Strand transfer events during HIV-1 reverse transcription.</a> Virus Res. 134, 19-38 (2008).</li>
<li>Guo, J., Henderson, L. E., Bess, J., Kane, B., Levin, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+immunodeficiency+virus+type+1+nucleocapsid+protein+promotes+efficient+strand+transfer+and+specific+viral+DNA+synthesis+by+inhibiting+TAR-dependent+self-priming+from+minus-strand+strong-stop+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Human immunodeficiency virus type 1 nucleocapsid protein promotes efficient strand transfer and specific viral DNA synthesis by inhibiting TAR-dependent self-priming from minus-strand strong-stop DNA.</a> J Virol. 71, 5178-5188 (1997).</li>
<li>Godet, J., Mely, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biophysical+studies+of+the+nucleic+acid+chaperone+properties+of+the+HIV-1+nucleocapsid+protein%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biol%22%5BJournal%5D)">Biophysical studies of the nucleic acid chaperone properties of the HIV-1 nucleocapsid protein.</a> RNA Biol. 7, 687-699 (2010).</li>
<li>Darlix, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flexible+nature+and+specific+functions+of+the+HIV-1+nucleocapsid+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Flexible nature and specific functions of the HIV-1 nucleocapsid protein.</a> J Mol Biol. 410, 565-581 (2011).</li>
<li>Lapadat-Tapolsky, M., Pernelle, C., Borie, C., Darlix, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+nucleic+acid+annealing+activities+of+nucleocapsid+protein+from+HIV-1%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Analysis of the nucleic acid annealing activities of nucleocapsid protein from HIV-1.</a> Nucleic Acids Res. 23, 2434-2441 (1995).</li>
<li>Vo, M. -N., Barany, G., Rouzina, I., Musier-Forsyth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanistic+studies+of+mini-TAR+RNA%2FDNA+annealing+in+the+absence+and+presence+of+HIV-1+nucleocapsid+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanistic studies of mini-TAR RNA/DNA annealing in the absence and presence of HIV-1 nucleocapsid protein.</a> J Mol Biol. 363, 244-261 (2006).</li>
<li>Beltz, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+determinants+of+HIV-1+nucleocapsid+protein+for+cTAR+DNA+binding+and+destabilization%2C+and+correlation+with+inhibition+of+self-primed+DNA+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Structural determinants of HIV-1 nucleocapsid protein for cTAR DNA binding and destabilization, and correlation with inhibition of self-primed DNA synthesis.</a> J Mol Biol. 348, 1113-1126 (2005).</li>
<li>Mori, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleocapsid+Protein%3A+a+Desirable+Target+for+Future+Therapies+against+HIV-1%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Microbiol+Immunol%22%5BJournal%5D)">Nucleocapsid Protein: a Desirable Target for Future Therapies against HIV-1.</a> Curr Top Microbiol Immunol. , Forthcoming Forthcoming.</li>
<li>Sosic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design%2C+synthesis+and+biological+evaluation+of+TAR+and+cTAR+binders+as+HIV-1+nucleocapsid+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22MedChemComm%22%5BJournal%5D)">Design, synthesis and biological evaluation of TAR and cTAR binders as HIV-1 nucleocapsid inhibitors.</a> MedChemComm. 4, 1388-1393 (2013).</li>
<li>Tabarrini, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+of+Anti-HIV+Transcription+Inhibitor+Quinolones%3A+Identification+of+Potent+N1-Vinyl+Derivatives%5BTitle%5D)+AND+%22Chemmedchem%22%5BJournal%5D)">Studies of Anti-HIV Transcription Inhibitor Quinolones: Identification of Potent N1-Vinyl Derivatives.</a> Chemmedchem. 5, 1880-1892 (2010).</li>
<li>Hagan, N., Fabris, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+mass+spectrometric+determination+of+the+stoichiometry+and+binding+affinity+of+the+complexes+between+nucleocapsid+protein+and+RNA+stem-loop+hairpins+of+the+HIV-1+Psi-recognition+element%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Direct mass spectrometric determination of the stoichiometry and binding affinity of the complexes between nucleocapsid protein and RNA stem-loop hairpins of the HIV-1 Psi-recognition element.</a> Biochemistry. 42, 10736-10745 (2003).</li>
<li>Ivanyi-Nagy, R., Davidovic, L., Khandjian, E. W., Darlix, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disordered+RNA+chaperone+proteins%3A+from+functions+to+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sciences%3A+CMLS%22%5BJournal%5D)">Disordered RNA chaperone proteins: from functions to disease.</a> Cell Mol Life Sciences: CMLS. 62, 1409-1417 (2005).</li>
<li>Zagotto, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuning+G-quadruplex+vs+double-stranded+DNA+recognition+in+regioisomeric+lysyl-peptidyl-anthraquinone+conjugates%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjug+Chem%22%5BJournal%5D)">Tuning G-quadruplex vs double-stranded DNA recognition in regioisomeric lysyl-peptidyl-anthraquinone conjugates.</a> Bioconjug Chem. 22, 2126-2135 (2011).</li>
<li>Carlson, C. B., Vuyisich, M., Gooch, B. D., Beal, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preferred+RNA+binding+sites+for+a+threading+intercalator+revealed+by+in+vitro+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Preferred RNA binding sites for a threading intercalator revealed by in vitro evolution.</a> Chem Biol. 10, 663-672 (2003).</li>
<li>Gooch, B. D., Beal, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition+of+duplex+RNA+by+helix-threading+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Recognition of duplex RNA by helix-threading peptides.</a> J Am Chem Soc. 126, 10603-10610 (2004).</li>
<li>Kanevsky, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+determinants+of+TAR+RNA-DNA+annealing+in+the+absence+and+presence+of+HIV-1+nucleocapsid+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Structural determinants of TAR RNA-DNA annealing in the absence and presence of HIV-1 nucleocapsid protein.</a> Nucleic Acids Res. 39, 8148-8162 (2011).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

NAME to test, który pozwala szybko ocenić hamowanie aktywności opiekuńczej białka nukleokapsydu HIV-1, interesującego celu w poszukiwaniu nowych leków anty-HIV. NC wyżarzają szybko i w temperaturze pokojowej kwasy nukleinowe, których stabilne fałdowanie w przeciwnym razie wymagałoby denaturacji termicznej w wysokiej temperaturze, a następnie ostrożnego wyżarzania. Test można przeprowadzić zarówno z NC o pełnej długości, jak i ze skróconym (12-55)NC: w obu przypadkach dwa kwasy nukleinowe (RNA i jego komplementarna kopia DNA) są szybko wyżarzane. Jest to zgodne z obserwacją literaturową dotyczącą skróconego peptydu NC: wyżarzanie jest inicjowane przez efektywne stopienie trzonu cTAR, po którym następuje interakcja jego komplementarnej pętli wierzchołkowej, która jest słabym miejscem wiązania NC, z komplementarną sekwencją pętli wierzchołkowej TAR, kończąc się przez kilka niestabilnych produktów pośrednich do wydłużonej wyżarzonej hybrydy. 21
NC jest bardzo stabilnym białkiem i może wystąpić niewiele problemów podczas wykonywania NAME. Bardzo ważne jest jednak, aby dodać świeżo wytworzony SDS do buforu ładującego żel służącego do zatrzymania reakcji: jeśli nie zostanie to osiągnięte, żel nie pokaże pasm kwasu nukleinowego we właściwych pozycjach. W rzeczywistości NC jest białkiem wiążącym kwasy nukleinowe, więc aby prawidłowo uwidocznić heterodupleks TAR / cTAR za pomocą elektroforezy żelowej, SDS musi być obecny w buforze ładującym żel, aby denaturować białko i uwolnić je z jego ścisłego kompleksu z kwasami nukleinowymi. Jest to również możliwe rozwiązanie problemu, tj. powstawania przesuniętych pasm podczas przebiegu żelowego. Efekt ten jest szczególnie widoczny, gdy zastosowano NC o pełnej długości, jak na rysunku 2, i jest związany z obecnością wysoce zasadowego N-końcowego ogona, mającego silny wpływ agregujący na kwasy nukleinowe.
Obecność końcowego ogona podstawowego sprawia, że reakcja wyżarzania jest trudniejsza do zahamowania, jak pokazano na rysunku 3 przy użyciu związku 1, reprezentatywnego interkalatora gwintowego, tj. interkalatora szczególnie skutecznego w stabilizacji struktur pętli trzpieniowych TAR i cTAR. W rzeczywistości ten rodzaj interakcji z kwasami nukleinowymi jest preferowany, gdy wybrzuszenia i pętle przerywają ciągłość podwójnej helisy, co pozwala na łatwiejsze nawlekanie masywnych podstawników w pary zasad. Stabilizacja TAR i cTAR przez te spoiwa kwasów nukleinowych była wcześniej analizowana przez określenie wzrostu temperatury topnienia dwóch oligonukleotydów. 14 Co więcej, wzrost temperatury topnienia koreluje z hamowaniem wyżarzania katalizowanego przez HIV-1 NC, co prowadzi do zmniejszenia tworzenia heterodupleksu TAR/cTAR i wskazuje, że interkalatory gwintujące są interesującą klasą spoiw dla dynamicznych struktur RNA, takich jak pierwiastek TAR. 14
Mechanizm działania wywoływany dla tych związków może być dalej zwalidowany, wykonując test NAME w różnych alternatywnych formatach, jak pokazano na rysunku 4: w przypadku interkalatorów hamowanie wyżarzonego heterodupleksu jest wzmocnione, gdy lek jest inkubowany z dwoma pofałdowanymi olikwinuklepami. Związki działające o różnym mechanizmie działania, takie jak bezpośrednie spoiwa białka NC, byłyby mniej dotknięte różnymi trybami preinkubacji. Test NAME przeprowadzony w obu metodach może być zatem wykorzystany do badań przesiewowych bibliotek związków w celu identyfikacji inhibitorów NC, a także do oceny przypuszczalnego mechanizmu działania pozytywnych trafień podczas poszukiwania leków anty-HIV ukierunkowanych na NC. Oczywiste jest, że samo zastosowanie tych technik w przypadku twierdzenia o specyficznym mechanizmie działania zidentyfikowanych inhibitorów NC nie jest wystarczające i potrzebne są inne odpowiednie testy biochemiczne, aby podtrzymać hipotezę roboczą. 14
Na koniec należy podkreślić, że w projekcie NAME zastosowano wysoko oczyszczone enzymy, zarówno rekombinowane, jak i syntetyczne, co dostarcza cennych informacji na temat inhibicji NC "in vitro" przez badane związki. Na tym polega "mocna i słaba strona" testu: NAME może dobrze uzupełniać wirtualne badania przesiewowe i podejścia do modelowania molekularnego we wstępnych etapach programów odkrywania leków, umożliwiając szybkie budowanie i analizowanie zależności między strukturą a aktywnością i ostatecznie przekierowując syntezę i projektowanie leków. Jednakże, podobnie jak w przypadku innych testów biochemicznych stosowanych w projektach rozwoju leków na HIV, NAME nie dostarczy informacji na temat wpływu przypuszczalnych inhibitorów w komórkach zakażonych wirusem.

Białko nukleokapsydu NCp7 (NC) ludzkiego wirusa niedoboru odporności typu 1 (HIV-1) jest małym, podstawowym białkiem, które jest ściśle związane z genomowym RNA w dojrzałym zakaźnym wirusie, odgrywając kluczową rolę w replikacji wirusa jako kofaktor podczas odwrotnej transkrypcji, rozpoznawania genomu i pakowania. 1-3 NC działa jako chaperon kwasu nukleinowego, katalizując destabilizację stabilnych struktur kwasów nukleinowych i wyżarzanie sekwencji komplementarnych. Jego aktywność agregująca kwasy nukleinowe znajduje się głównie w domenie N-końcowej 11 aminokwasów, podczas gdy aktywność destabilizująca dupleksu została zmapowana na struktury palca cynkowego (peptyd 12-55). 4 Dodatnio naładowane białko obniża barierę elektrostatyczną reakcji wyżarzania i zwiększa szybkość, z jaką łączą się dwie oddzielne komplementarne sekwencje.
Kwasy nukleinowe złożone w stabilną konformację wymagają aktywności opiekuńczej NC, aby ułatwić ich wyżarzanie. 5 Jest to szczególnie ważne w odwrotnej transkrypcji, gdzie NC ma kluczowe znaczenie w zdarzeniach przenoszenia nici: w transferze nici ujemnej, DNA zatrzymane nici ujemnej, właśnie retrotranskrybowane, musi zostać przeniesione i wyżarzane do komplementarnej sekwencji w regionie R na końcu 3' matrycy genomu RNA. 6 Chociaż preferowana termodynamicznie, reakcja ta nie zachodzi w znacznym stopniu przy braku NC ze względu na obecność stabilnej struktury RNA regionu reagującego na aktywację trans (TAR) w regionach R, które muszą być związane z jego kopią DNA (DNA cTAR). 7 cTAR i TAR są w rzeczywistości wysoce ustrukturyzowanymi regionami o charakterystycznej konformacji pnia-pętli. Białko NC denaturuje te spinki do włosów i wspomaga transfer nici ujemnej poprzez zwiększenie szybkości wyżarzania międzycząsteczkowego między komplementarnymi pasmami kwasu nukleinowego. Mechanizm wyżarzania NC TAR i cTAR został dokładnie zbadany i opisany jako test wyżarzania TAR w kilku pracach naukowych, a proponowany schemat został przedstawiony w doskonałych recenzjach. 8-11 Podsumowując, NC destabilizuje drugorzędową strukturę stabilnego RNA, takiego jak TAR-RNA, destabilizuje drugorzędową strukturę jego komplementarnej sekwencji, cTAR-DNA, i promuje reakcję wyżarzania RNA / DNA prowadzącą do tworzenia heterodupleksu TAR / cTAR. 10,11 W rezultacie, etap transferu nici podczas replikacji HIV jest faworyzowany. 12
NC jest atrakcyjnym celem dla rozwoju nowych środków przeciwwirusowych, ponieważ potencjalna interferencja indukowana przez małe cząsteczki w kierunku NC spowodowałaby zmniejszenie odwrotnej transkrypcji genomu wirusa w wyniku osłabionej aktywności NC. 2,13 Takie podejście może ostatecznie doprowadzić do opracowania skutecznych środków przeciw HIV. W trakcie badań przesiewowych w kierunku inhibitorów NC14 opracowaliśmy test opierający się na dobrze znanych właściwościach nukleokapsydu do skutecznej destabilizacji i wyżarzania komplementarnych oligonukleotydów. 10,11 Nazwaliśmy to testem Nucleokapsydu Annealing-M ediated Electrophoresis (NAZWA). Test NAME wykorzystuje NC do pośredniczenia w wyżarzaniu między stabilnie ustrukturyzowanymi kopiami komplementarnych kwasów nukleinowych, w naszym przypadku oligonukleotydu odpowiadającego wierzchołkowej części sekwencji TAR-RNA z jej komplementarną sekwencją DNA (cTAR) w celu uzyskania hybrydowego heterodupleksu TAR / cTAR. Analizę reakcji wyżarzania TAR/cTAR w obecności NC można zbadać za pomocą natywnej elektroforezy w żelu poliakrylamidowym (PAGE).
Ten protokół pokazuje, jak przeprowadzić test NAME w celu szybkiego wyżarzania w temperaturze pokojowej oligonukleotydów złożonych w stabilne struktury spinki do włosów, jak analizować wynik reakcji i możliwe rozwiązywanie problemów eksperymentu. Znakowanie radioaktywne kwasu nukleinowego nie jest wymagane, a wykrywanie prążków oligonukleotydowych można przeprowadzić za pomocą konwencjonalnych metod barwienia. Test, który wykorzystuje albo rekombinowane białko o pełnej długości, albo skróconą syntetyczną wersję NC, pozwala na identyfikację interkalatorów wątkowych hamujących NC, aktywność, która jak wykazano, koreluje z silnym wiązaniem z RNA i DNA. 14

<table><tbody><tr><td>cTAR, 29-merowy oligo DNA. Solone. Oczyszczony HPLC.</td><td>Metabion International AG</td><td></td><td>Przechowuj roztwór magazynowy pod kątem -20 stopni; C&nbsp;</td></tr><tr><td>TAR, 29-merowy oligonuligo RNA. Solone. Oczyszczony HPLC.&nbsp; &nbsp;</td><td>Metabion International AG</td><td></td><td>Przechowuj podwielokrotność magazynową na poziomie -80 & deg; C&nbsp;</td></tr><tr><td>(12-55)Peptyd NC</td><td>EspiKem srl</td><td></td><td>Przechowywać roztwór podstawowy w temperaturze -20 & stopni; C</td></tr><tr><td>Probówki 1,5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>0030 120 086</td><td>Autoklaw przed użyciem</td></tr><tr><td>Probówki 0,5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>0030 121 023</td><td>Autoklaw przed użyciem</td></tr><tr><td>Końcówki filtrujące Biosphere 0,1-10 i mikro; l</td><td>Sarstedt</td><td>701,130,210</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki filtrów biosfery 2-20 i mikro; l</td><td>Sarstedt</td><td>70,760,213</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki filtrów biosfery 200&nbsp; &mikro; l</td><td>Filtr strzykawkowy Sarstedt</td><td>70,760,213</td><td></td></tr><tr><td>0,22&nbsp; &mikro; m</td><td>Biosigma srl</td><td>51,798</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Carlo Erba</td><td>414631</td><td></td></tr><tr><td>Dodecylosiarczan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71725-50G</td><td></td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418-1L</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71376-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Kwas borowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0252-2.5KG</td><td></td></tr><tr><td>Kwas etylenodiaminotetraoctowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5134-500G</td><td></td></tr><tr><td>Nadchloran magnezu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>222283-100G</td><td>Przechowuj 1&nbsp; Roztwór M przy -20&nbsp; &deg; C</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>49770-1L</td><td></td></tr><tr><td>Błękit bromofenolowy</td><td>GE Opieka zdrowotna Nauki przyrodnicze</td><td>17-1329-01</td><td></td></tr><tr><td>N,N,N&prime;,N&prime; -Tetrametyloetylenodiamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9281-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Nadsiarczan amonu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7460-500G</td><td>Przygotuj 10% roztwór świeżo przed użyciem</td></tr><tr><td>Akrylamid-bis gotowy do użycia roztwór 40% (19:1)</td><td>Merck Millipore</td><td>1006401000</td><td>Poliakryloamid jest wysoce neurotoksyczny: podczas odlewania żelu należy nosić rękawice</td></tr><tr><td>Tris ultrapure</td><td>Applichem</td><td>A1086, Wirówka</td> Ambion AM9922 z wodą uzdatnioną 1000 <td></td></tr><tr><td>DEPC</td><td></td><td></td> 5415R Eppendorf 22,621,408 Spektrometr NanoDrop 1000 Spektrometr UV-VIS Thermo Scientific Lambda 20 Perkin Elmer Protean II xi Cell Bio-Rad 165-1803 Zasilacz podstawowy PowerPac <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Bio-Rad</td><td>164-5050</td><td></td></tr><tr><td>SybrGreen II Barwienie w żelu RNA</td><td>Lonza</td><td>50523</td><td>Rozcieńczyć 1/10 000 w TBE 1x. Przechowywać w ciemności w temperaturze 4&nbsp; &deg; C przez dwa tygodnie.</td></tr><tr><td>System obrazowania Geliance 600</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

test elektroforezy za pośrednictwem wyżarzania nukleokapsydu (name) umożliwia szybką identyfikację inhibitorów nukleokapsydu hiv-1

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis (NAME) Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

RNA lub DNA złożone w stabilne trójwymiarowe fałdowanie są interesującymi celami w rozwoju leków przeciwnowotworowych lub przeciwwirusowych. W przypadku HIV-1 białka wirusowe biorące udział w regulacji aktywności wirusa rozpoznają kilka kwasów nukleinowych. Białko nukleokapsydu NCp7 (NC) jest kluczowym białkiem regulującym kilka procesów podczas replikacji wirusa. NC jest w rzeczywistości chaperonem destabilizującym drugorzędowe struktury RNA i DNA oraz ułatwiającym ich wyżarzanie. Inaktywacja NC jest nowym podejściem i interesującym celem terapii anty-HIV. Test Nukleokapsydu Annealing-M ediated E lectropforezy (NAME) został opracowany w celu identyfikacji cząsteczek zdolnych do hamowania topnienia i wyżarzania RNA i DNA złożonych w termodynamicznie stabilnych trójwymiarowych konformacjach, takich jak struktury spinki do włosów elementów TAR i cTAR HIV, przez białko nukleokapsydu HIV-1. Nowy test wykorzystuje zarówno rekombinowane, jak i syntetyczne białko oraz oligonukleotydy bez konieczności ich wcześniejszego znakowania. Analizę wyników uzyskuje się za pomocą standardowej elektroforezy w żelu poliakrylamidowym (PAGE), a następnie konwencjonalnego barwienia kwasami nukleinowymi. Protokół opisany w tej pracy opisuje, jak przeprowadzić test NAME z białkiem o pełnej długości lub jego skróconą wersją pozbawioną podstawowej domeny N-końcowej, które są kompetentne jako białka opiekuńcze kwasów nukleinowych, oraz jak ocenić hamowanie aktywności białka opiekuńczego NC przez interkalator wątkowy. Co więcej, NAME może być wykonywany w dwóch różnych trybach, co jest przydatne do uzyskania wskazówek dotyczących przypuszczalnego mechanizmu działania zidentyfikowanych inhibitorów NC.

Rysunek 1 przedstawia reprezentacyjny wynik testu elektroforezy wspomaganej hybrydyzacją nukleokapsydu (NAME), przeprowadzonego i) z pełnowymiarowym białkiem rekombinowanym, ii) bez białka, t.j. poprzez zmieszanie cTAR + TAR i inkubację do 1 h w RT oraz iii) ten sam test przeprowadzony z (12-55)NC, syntetycznym peptydem pozbawionym 11 aminokwasów domeny N-końcowej. Wstępnie sfałdowane TAR i cTAR zmieszano, a tworzenie się zhybrydyzowanego heterodupleksu TAR/cTAR monitorowano w obecności pełnowymiarowego rekombinowanego NC (lewe ścieżki na Rysunku 1), w obecności białka (środkowe ścieżki na Rysunku 1) oraz w obecności skróconego peptydu (12-55)NC (prawe ścieżki na Rysunku 1). Kontrolami są: sfałdowany cTAR, sfałdowany TAR oraz zhybrydyzowany hybryda (TAR/cTAR), uzyskana poprzez denaturację termiczną stabilnie sfałdowanych struktur TAR do cTAR, a następnie ich powolną hybrydyzację.14
Zdolność NC do denaturacji dwóch stabilnych sekwencji kwasów nukleinowych w rozciągniętą helisę heterodupleksu jest wyraźnie widoczna: pełnowymiarowe białko NC prowadzi do natychmiastowego powstania hybrydy TAR/cTAR: 0’ oznacza minimalny czas upływający między dodaniem NC do próbek a dodaniem buforu do ładowania żelu, który zatrzymuje reakcję; pełne utworzenie zostaje osiągnięte już po 15’ czasie inkubacji. Wzrost intensywności wyżarzonego heterodupleksu przebiega równolegle do spadku intensywności sfałdowanych oligonukleotydów cTAR i TAR. Formowanie heterodupleksu zachodzi również w obecności formy skróconej, i.e. (12-55)NC, co potwierdza aktywność biologiczną syntetycznego peptydu. W przypadku braku białka lub peptydu nie obserwuje się tworzenia heterodupleksu, a oligonukleotydy TAR i cTAR nie wyżarzają się w temperaturze pokojowej w heterodupleks (Rycina 1). We wszystkich eksperymentach obserwuje się szybkie tworzenie niestabilnych produktów pośrednich („kompleksy pośrednie” na Rycini 1), których ilość zmniejsza się z czasem, co jest zgodne z zaproponowanym mechanizmem wymiany nici poprzez spinki do włosów cTAR i TAR aż do prawidłowego sfałdowania kwasów nukleinowych.17
Możliwym problemem podczas przeprowadzania eksperymentu jest brak SDS w buforze do ładowania żelu. W przypadku braku SDS w buforze GLB wynik reakcji przedstawiono na Rysunku 2 i zestawiono go z wynikiem uzyskanym przy użyciu GLB + SDS. Wstępnie sfałdowane TAR i cTAR zmieszano i inkubowano przez 3 hr w temperaturze pokojowej lub przez 3 hr w 37 °C z rekombinowanym białkiem NC o pełnej długości. Po inkubacji próbki podzielono na dwie części: do jednej połowy dodano bufor do ładowania żelu bez SDS (GLB), natomiast do drugiej połowy dodano GLB z SDS (GLBSDS). Próbki naniesiono na żel, a położenie prążków kwasów nukleinowych zwizualizowano po elektroforezie za pomocą barwnika. Gdy obecne było białko NC, a próbki naniesiono z użyciem GLB, wszystkie prążki kwasów nukleinowych przesunęły się w górę: jest to wynik oczekiwany i wskazuje na silne wiązanie białka z kwasami nukleinowymi. Wyniki z użyciem GLBSDS przedstawiono po prawej stronie żelu: dodatek SDS denaturuje białko i uwalnia kwasy nukleinowe ze stabilnego kompleksu z białkiem, co umożliwia porównanie z kontrolami.
Analiza NAME służy do oceny zdolności interkalatorów typu „threading” do stabilizacji dynamicznych struktur kwasów nukleinowych oraz hamowania aktywności białek opiekuńczych (chaperonów) NC.14 Interkalatory tego typu to płaskie cząsteczki aromatyczne podstawione objętościowymi łańcuchami bocznymi, znajdującymi się po przeciwnych stronach układu pierścieniowego, takimi jak antrachinon przedstawiony na Rysunku 3A.18 Interkalatory te są w stanie przechodzić przez podwójną helisę kwasów nukleinowych, lokując ostatecznie swoje łańcuchy boczne w każdej z bruzd podwójnej helisy.19,20
Rysunek 3B przedstawia wynik testu NAME w obecności związku 1, znanego interkalatora typu threading,18 w obecności pełnowymiarowego białka NC lub skróconego peptydu. W obu przypadkach tworzenie hybrydy TAR/cTAR przez NC jest ograniczane wraz ze wzrostem stężenia interkalatora, podczas gdy jednocześnie zwiększa się ilość wolnego TAR i cTAR. Skrócona forma białka pozbawiona końca N-terminalnego (12-55NC) wykazuje większą wrażliwość na inhibicję swojej aktywności: różnica ta została zweryfikowana dla wszystkich dotychczas przetestowanych związków.
Analizę NAME można przeprowadzić na dwa sposoby: poprzez preinkubację związku testowego z NC, a następnie dodanie sfałdowanych oligonukleotydów (tryb preinkubacji z NC), lub poprzez preinkubację związku testowego przez 15 min ze sfałdowanymi substratami kwasów nukleinowych, a następnie dodanie NC i dalszą inkubację przez 15 min (tryb preinkubacji z oligo). Chociaż całkowity czas inkubacji jest taki sam w obu trybach, preinkubacja ze sfałdowanymi oligonukleotydami przed dodaniem NC pozwala na dłuższy czas wprowadzania interkalatorów do sfałdowanego kwasu nukleinowego. Skutkuje to silniejszą stabilizacją ich struktur dynamicznych i łatwiejszym hamowaniem aktywności chaperonowej NC. Analiza NAME w tych dwóch trybach pozwala zatem uwydatnić różnice w mechanizmie działania inhibitorów NC, co pokazano na Rysunku 4: gdy związek 1 był analizowany metodą NAME w trybie preinkubacji z oligo (Rysunek 4, ścieżki po lewej stronie), wykazano silne hamowanie hybrydyzacji pośredniczonej przez NC, podczas gdy w trybie preinkubacji z NC zaobserwowano znacznie słabsze hamowanie (Rysunek 4, ścieżki po prawej stronie). Należy pamiętać, że w celu wyznaczenia stężeń hamujących podczas przesiewania zestawów związków pokrewnych za pomocą tej analizy i w tych warunkach, każdy eksperyment musi być przeprowadzony co najmniej w trzech powtórzeniach przy użyciu blisko rozmieszczonych stężeń (szczególnie w okolicy wartości IC50).14
<img alt="Wynik elektroforezy żelowej; hybrydyzacja DNA-RNA z inkubacją; wpływ białka na cTAR/TAR." src="/files/ftp_upload/52474/52474fig1highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Analiza NAME z pełnowymiarowym NC oraz z uciętym (12-55)NC. Sfałdowane TAR i cTAR, każde w stężeniu 1 µM, inkubowano z rekombinowanym NC lub z (12-55)NC (stosunek oligos/NC=1/8) przez 0 min, 15 min, 30 min i 1 hr. Jako kontrolę negatywną wykorzystano TAR i cTAR inkubowane w obecności białka (0 min, 15 min, 30 min i 1 hr). Jako kontrole zastosowano sfałdowane TAR, sfałdowane cTAR oraz hybrydę TAR/cTAR otrzymaną po denaturacji termicznej, a następnie wyżarzaniu in vitro. Reakcje zatrzymano za pomocą GLBSDS. Próbki rozdzielono na 12% żelu poliakryloamidowym w TBE 1x; po elektroforezie kwasy nukleinowe na żelu zabarwiono i uwidoczniono na transiluminatorze.
<img alt="Wynik elektroforezy; analiza hybrydyzacji DNA; warunki GLB; oddziaływania cTAR, TAR." src="/files/ftp_upload/52474/52474fig2highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Wpływ SDS w buforze do ładowania żelu (GLB) podczas analizy hybrydyzacji TAR/cTAR za pośrednictwem NC. TAR i cTAR, uprzednio sfałdowane w TNMg 1x, inkubowano z pełnowymiarowym rekombinowanym NC (oligonukleotydy/NC = 1/8) przez 3 h w temperaturze pokojowej lub w 37 °C. Następnie do próbek inkubowanych z NC dodano GLB lub GLBSDS. Kontrole: TAR, cTAR oraz zhybrydyzowany kompleks TAR/cTAR (każdy 1 µM). Elektroforezę przeprowadzono na 12% żelu poliakryloamidowym w TBE 1x; po elektroforezie kwasy nukleinowe na żelu zabarwiono i wykryto na transiluminatorze. Rycina została zmodyfikowana na podstawie Ryciny S4 z: Sosic, A. et al. Design, synthesis and biological evaluation of TAR and cTAR binders as HIV-1 nucleocapsid inhibitors. MedChemComm 4, 1388-1393, doi:10.1039/c3md00212h (2013).
<img alt="Struktura chemiczna i wykres elektroforezy żelowej; stężenie związku, analiza hybrydyzacji RNA." src="/files/ftp_upload/52474/52474fig3highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: (A) Struktura chemiczna interkalatora przemieszczającego 1. (B) Wpływ interkalatora przemieszczającego 1 oceniony za pomocą testu NAME. Zfałdowane TAR oraz cTAR, każde w stężeniu 1 µM, inkubowano w obecności wskazanych stężeń związku 1 z pełną wersją NC lub z (12-55)NC, każde w stężeniu 8 µM. Jako kontrole zastosowano zfałdowane TAR, zfałdowane cTAR oraz wydłużony heterodupleks TAR/cTAR. Reakcje zatrzymano za pomocą GLBSDS. Próbki rozdzielono na 12% żelu poliakryloamidowym w buforze TBE 1x; po elektroforezie kwasy nukleinowe na żelu zabarwiono i wykryto na transiluminatorze.
<img alt="Wyniki elektroforezy; hybrydyzacja RNA, wpływ NC, preinkubacja oligo, interakcje TAR." src="/files/ftp_upload/52474/52474fig4highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Tryby preinkubacji oligo w porównaniu z preinkubacją NC: efekty w teście NAME.Tryb preinkubacji oligo: sfałdowany TAR i sfałdowany cTAR, każdy w stężeniu 1 µM, inkubowano wstępnie z wskazanymi stężeniami interkalatora przechodzącego 1 przez 15 min, a następnie przez dodatkowe 15 min w obecności pełnowymiarowego NC (8 µM). Tryb preinkubacji NC: wskazane stężenia interkalatora przechodzącego 1 inkubowano wstępnie z pełnowymiarowym NC (8 µM) przez 15 min, a następnie przez dodatkowe 15 min w obecności sfałdowanego TAR i sfałdowanego cTAR, każdy w stężeniu 1 µM. Sfałdowany TAR, sfałdowany cTAR oraz rozszerzony heterodupleks TAR/cTAR posłużyły jako kontrole. Wszystkie reakcje zatrzymano ostatecznie przy użyciu GLBSDS. Próbki rozdzielono na żelu poliakrylamidowym 12% w TBE 1x; po elektroforezie kwasy nukeinowe na żelu zabarwiono i wykryto na transiluminatorze.

Ten protokół opisuje NAZWĘ, test, który pozwala na szybką identyfikację cząsteczek zdolnych do hamowania in vitro aktywności opiekuńczej białka nukleokapsydu HIV-1.

Test elektroforezy za pośrednictwem wyżarzania nukleokapsydu (NAME) umożliwia szybką identyfikację inhibitorów nukleokapsydu HIV-1

RNA or DNA folded in stable tridimensional folding are interesting targets in the development of antitumor or antiviral drugs. In the case of HIV-1, viral ...

Ogólnym celem eksperymentu jest szybka identyfikacja cząsteczek zdolnych do hamowania aktywności chaperonowej białka nukleokapsydu HIV-1. In vitro NC jest małym i silnie zasadowym białkiem, którego struktura charakteryzuje się elastyczną domeną terminalną oraz dwoma wysoce konserwowanymi palcami cynkowymi, które biorą udział w oddziaływaniwaniu z wirusowymi kwasami nukleinowymi. NC oddziałuje z spinką RNA tar oraz jej komplementarną sekwencją DNA CT A r i promuje topnienie ich struktur drugorzędowych, aby umożliwić tworzenie hybrydy tar-tar.Protokół wykonuje się przy użyciu części apikalnej sekwencji TAR i SITAR, które po zmieszaniu są inkubowane z NC. Hybryda powstaje w wyniku oddziaływania nici i cyrkularnych cząsteczek; oligonukleotydy oddziałujące z nimi hamują katalityczną formację hybrydy przez NC. Wynik reakcji analizuje się za pomocą standardowej elektroforezy w żelu poliakrylamidowym; TAR i CA wykazują w żelu inną mobilność niż hybryda.Zwiększanie stężeń nici w interkolatorze prowadzi do zmniejszenia hybrydy równolegle z pojawieniem się wolnej tar i CT A. Główną zaletą tej techniki w stosunku do istniejących protokołów, takich jak analiza przesunięcia w żelu lub tar kneeling, jest to, że nie wymaga ona wstępnej manipulacji kwasami nukleinowymi, np. znakowania radioaktywnego. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie opracowywania leków, takie jak inhibitory HIV-1 i C u osób. Osoby rozpoczynające pracę z tą metodą mogą mieć trudności z ogólną organizacją protokołu, w szczególności z seryjnym rozcieńczaniem każdego roztworu zapasowego, dokładnym czasem inkubacji oraz prawidłową procedurą zatrzymania reakcji.Aby rozpocząć tę procedurę, należy przygotować 10 µL roztworu zapasu TAR z oligonukleotydem o stężeniu 1 µM oraz 10 µL CT A o stężeniu 1 µM w buforze TNMG 1X. Próbówki należy podgrzać do około 95°C przez pięć minut, a następnie schłodzić do temperatury pokojowej, aby TAR i CT A mogły odtworzyć swoje struktury pętli wybrzuszenia łodygi. W celu przygotowania kontrolnego roztworu hybrydy TAR-CT A o stężeniu 1 µM, należy zmieszać 1 µL TAR o stężeniu 10 µM z 1 µL CT A o stężeniu 10 µM w buforze TNMG 1X.Dopełnij probówkę wodą z DEPC do całkowitej objętości 10 µL. Następnie zdenaturowaj oligonukleotydy, podgrzewając probówkę do 95 °C przez pięć minut. Pozostaw ją do powolnego ochłodzenia do temperatury pokojowej, aby tar mógł przyłączyć się do swojej komplementarnej sekwencji, CT A, i utworzyć dwuniciowy hybrydowy tar CT A. Po ochłodzeniu wszystkich roztworów do temperatury pokojowej przeprowadź krótkie wirowanie, a następnie dodaj trzy µL buforu GLB z SDS do każdego roztworu i wymieszaj go w probówce trzykrotnie poprzez pipetowanie.Próbki należy przechowywać w lodzie do momentu nakładania. W tej procedurze przygotować 10 µL rozcieńczeń związku one o stężeniach 500 µM, 250 µM, 50 µM oraz 5 µM w wodzie milli Q. Następnie przygotować 27,5 µL roztworu tar o stężeniu 4 µM oraz 27,5 µL roztworu CTA o stężeniu 4 µM w buforze TNMG 1X.Podgrzewaj obie probówki do około 95 °C przez pięć minut w celu sfałdowania struktur, a następnie użyj 2,5 µL tych sfałdowanych roztworów oligonukleotydów w kolejnych krokach. Następnie rozcieńcz w wodzie roztwory stokowe białka NC oraz peptydów NC 12 do 55 do stężenia 80 µM. Po ochłodzeniu roztworów TAR i CAR do temperatury pokojowej krótko odwiruj obie probówki w wirówce, a następnie przygotuj 20 pustych autoklawowanych probówek i umieść dwa rzędy po 10 probówek w statywie na próbki laboratoryjne.Następnie do każdej probówki w pierwszym rzędzie dodaj 2,5 µL złożonego tar. W dalszej kolejności do każdej probówki dodaj 2,5 µL złożonego CT A. W drugim rzędzie dodaj dwa mikrolitry odpowiedniego związku, jedno rozcieńczenie do tar i CT A r.Zastąp związek wodą w próbkach przeznaczonych do analizy NC oraz peptydów NC 12-55 w kontrolach. Inkubuj próbki przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Po 15 minutach wymieszaj próbki CT A R z odpowiadającymi im próbkami tar.Do próbek przeznaczonych do analizy NC dodaj 1 µL 80 µM NC, lub do próbek przeznaczonych do analizy peptydy NC 12-55 dodaj 1 µL 80 µM peptydy NC 12-55. Po kolejnych 15 minutach inkubacji w temperaturze pokojowej zatrzymaj reakcję, dodając do każdej próbki 3 µL GLB z SDS. Przemieszaj zawartość każdej probówki pipetując trzy razy, a następnie umieść je w lodzie.Powtórz ten krok dla próbek do analizy NC oraz peptydu NC 12 do 55, przechowując próbki w lodzie do momentu ich nakładania. Następnie zdejmij pokrywę aparatury do elektroforezy. Nanieś 13 µL każdej próbki do studzienek.Przed włączeniem urządzenia załóż pokrywę aparatury do elektroforezy. Prowadź elektroforezę przez 2 godziny i 30 minut przy stałym napięciu 200 V, aż barwnik przemieści się na odległość 1,5 cm powyżej dolnej krawędzi żelu. Następnie umieść żel w odpowiednim pojemniku z wybranym roztworem do barwienia kwasów nukleinowych na 30 do 45 minut przy ciągłym mieszaniu.Umieść żel na systemie obrazowania z transluminatorem, aby wykryć kwasy nukleinowe za pomocą sygnału fluorescencyjnego. Przedstawiony test służy do oceny zdolności interkalatorów przeplatających (threading intercollators) do stabilizacji dynamicznych struktur kwasów nukleinowych i hamowania aktywności chaperonów NC. Interkalatory przeplatające to płaskie cząsteczki aromatyczne podstawione objętościowymi łańcuchami bocznymi znajdującymi się po przeciwnych stronach układu pierścieniowego, takimi jak pokazana tutaj antrachinon.Rysunek ten przedstawia wynik analizy w obecności związku jednego, znanego interkalatora wsuwanego, w obecności pełnowymiarowego NC lub skróconego peptydu. W obu przypadkach tworzenie tar ct, hybrydy by NC, jest ograniczane wraz ze wzrostem stężenia interkalatora. Jednocześnie zwiększa się ilość wolnego tar oraz CT A R.Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o zastosowaniu buforu do ładowania JA z SDS. Jest to krytyczny krok dla optymalnego sukcesu tej metody. Jeśli ten krok zostanie pominięty, nie będzie możliwe rozróżnienie prążków kwasów nukleinowych w systemie żelowym.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć, jak przeprowadzić MSA dla dowolnych oligonukleotydów w temperaturze pokojowej, zwiniętych w stabilne struktury, oraz jak analizować wynik reakcji, wykorzystując albo rekombinowane pełnowymiarowe białko NC, albo skrócony syntetyczny peptyd NC, aby zidentyfikować interpolatory hamujące NC. Pamiętaj, że praca z akrylamidem i poliakrylamidem może być niezwykle niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania tego protokołu należy zawsze przestrzegać środków ostrożności, takich jak noszenie fartucha laboratoryjnego, rękawiczek i okularów ochronnych.

nucleocapsid-annealing-mediated-electrophoresis-name-assay-allows

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Test elektroforezy pośrednio pośredniczący w hybrydyzacji nukleokapsydowej (NAME) umożliwia szybkie zidentyfikowanie inhibitorów nukleokapsydu HIV-1

Odsłonięcie (uncoating) jest kluczowym etapem wczesnej fazy cyklu życiowego HIV-1 i definiuje się je jako rozpad otoczki kapsydu oraz uwolnienie wirusowego kompleksu rybonukleoproteinowego (vRNP). W niniejszej pracy prezentujemy techniki izolacji nienaruszonych rdzeni z wirionów HIV-1 oraz metody ilościowego oznaczania ich odsłaniania in vitro.

In vitro rozpakowywanie rdzeni HIV-1

Source: Manocheewa, S., et al. Pairwise Growth Competition Assay for Determining the Replication Fitness of Human Immunodeficiency Viruses. J. Vis. Exp. (2015)The video demonstrates the procedure for a growth competition assay to measure the relative replication fitness of two viral strains by comparing their replication in human immune cells.

An Assay for Measuring the Relative Replication Fitness of Viral Strains

Tutaj opisujemy cytotoksyczność komórkową i testy zakaźności w pojedynczej rundzie, które pozwalają na szybkie i dokładne badanie przesiewowe związków w celu określenia ich cytotoksyczności komórkowej (CC50) i wartości IC50 przeciwko WT i lekoopornemu HIV-1.

Szybkie badania przesiewowe w kierunku inhibitorów odwrotnej transkryptazy i integrazy HIV

Zrozumienie konformacji antygenów powierzchniowych wirusa jest niezbędne do oceny neutralizacji przeciwciał i kierowania projektem skutecznych immunogenów szczepionkowych. W tym miejscu opisujemy komórkowy test ELISA, który umożliwia badanie rozpoznawania trimerycznego HIV-1 Env ulegającego ekspresji na powierzchni transfekowanych komórek przez specyficzne przeciwciała anty-Env.

Ocena konformacyjna glikoprotein otoczki trymerowej HIV-1 przy użyciu komórkowego testu ELISA

Konkurencja wzrostu między prawie izogenicznymi wirusami dostarcza czułego pomiaru do określenia względnej zdolności replikacji. Opisane tutaj protokoły obejmują budowę rekombinowanych klonów HIV-1, rozmnażanie wirusa i konkurencję wzrostu oraz metody analizy zoptymalizowane w celu uzyskania czułych i spójnych wyników.

Test konkurencji wzrostu parami do określania zdolności replikacji ludzkich wirusów niedoboru odporności

Opisujemy tutaj prostą i szybką metodę ekstrakcji DNA prowirusa HIV z pełnej krwi, wykrywaną metodą ilościowego PCR. Protokół ten może zostać rozszerzony do wykorzystania w wykrywaniu innych markerów genetycznych lub przy użyciu alternatywnych metod amplifikacji.

Filtracja izolacji kwasów nukleinowych: prosta i szybka metoda ekstrakcji DNA

Rutynowe metody wykrywania wykorzystujące amplifikację genomu wirusa są ograniczone przez ich niezdolność do odróżnienia cząsteczek zakaźnych od niezakaźnych. Celem tego artykułu jest przedstawienie szczegółowych protokołów alternatywnych metod wspomagających dyskryminację zakaźnych cząstek norowirusa za pomocą wiązania aptamerów, dynamicznego rozpraszania światła i transmisyjnej mikroskopii elektronowej.

Alternatywne metody in vitro do oznaczania integralności strukturalnej kapsydu wirusa

Opisujemy test oparty na komórkach, który informuje o fuzji HIV-1 poprzez ekspresję białka zielonej fluorescencji wykrywalnego za pomocą cytometrii przepływowej lub mikroskopii fluorescencyjnej. Może być stosowany do testowania inhibitorów wnikania wirusa (szczególnie na etapie fuzji) w systemach infekcji bezkomórkowych i międzykomórkowych.

Wysokoprzepustowy test fuzji błony wirusowej aktywowanej Cre-Lox w celu identyfikacji inhibitorów fuzji błony wirusowej HIV-1

Tutaj opisujemy immunoprecypitację Rev w obecności replikacji HIV-1 dla spektrometrii mas. Opisane metody mogą być stosowane do identyfikacji czynników jąderkowych zaangażowanych w cykl zakaźny HIV-1 i mają zastosowanie do innych modeli chorób w celu scharakteryzowania niedostatecznie zbadanych szlaków.

Identyfikacja czynników jąderkowych podczas replikacji HIV-1 poprzez immunoprecypitację Rev i spektrometrię mas

Tutaj prezentujemy protokół wykrywania epitopów neutralizacji na cząsteczkach wirusopodobnych wyświetlających antygen (VLP). Immunoprecypitację VLP pochodzących z ludzkiego wirusa niedoboru odporności (HIV) przeprowadza się przy użyciu przeciwciał monoklonalnych specyficznych dla glikoprotein otoczkowych sprzężonych z kulkami magnetycznymi sprzężonymi z białkiem G. Przechwycone VLP są następnie poddawane analizie SDS-PAGE i Western blot przy użyciu przeciwciał specyficznych dla białka rdzenia...

Wykrywanie epitopów wrażliwych na neutralizację w antygenach wyświetlanych na szczepionkach opartych na cząsteczkach wirusopodobnych (VLP) za pomocą testu wychwytywania

Ten artykuł przedstawia uproszczoną metodę przygotowania 4 jednostek hemagglutynacji antygenu do testów serologicznych wirusa rzekomego pomoru drobiu. Dzięki dokładnemu określeniu miana hemaglutynacji antygenu, w połączeniu z bardziej rygorystyczną metodą miareczkowania wstecznego i dobrze zdefiniowanym procesem regulacji, zwiększa wydajność testu, zmniejsza liczbę wyników fałszywie dodatnich i poprawia nadzór nad chorobami u drobiu.

Optymalizacja preparatu antygenowego do oznaczania hamowania hemaglutynacji wirusa rzekomego pomoru drobiu

Poznaj metodę NAME do szybkiej identyfikacji inhibitorów białka nukleokapsydu HIV-1 za pomocą elektroforezy. Technika ta umożliwia badaczom odkrywanie nowych związków terapeutycznych bez konieczności stosowania izotopów promieniotwórczych.

Test elektroforezy za pośrednictwem wyżarzania nukleokapsydu (NAME) umożliwia szybką identyfikację inhibitorów nukleokapsydu HIV-1 (Wideo) | JoVE Journal

Test elektroforezy za pośrednictwem wyżarzania nukleokapsydu (NAME) umożliwia szybką identyfikację inhibitorów nukleokapsydu HIV-1

Przeglądaj więcej filmów