Name: Obrazowanie lokalnych sygnałów Ca2+ w hodowanych komórkach ssaków (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: Poznaj metodę obrazowania lokalnych sygnałów wapniowych w komórkach ssaków przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej i algorytmu automatycznej analizy. Technika ta umożliwia badanie sygnalizacji IP3 z dużą rozdzielczością czasową i przestrzenną.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez National Institutes of Health, które przyznały GM 100201 dla I.F.S, oraz GM 048071 i GM 065830 dla I.P.

Przedstawiamy szczegółowe procedury obrazowania lokalnych zdarzeń Ca2+ w ludzkich komórkach nerwiaka zarodkowego SH-SY5Y. Procedury te można dostosować do obrazowania wewnątrzkomórkowych sygnałów Ca2 + w wielu typach komórek8-10.
1. Przygotowanie komórek
<ol>
	<li>Hoduj komórki, które mają być zobrazowane, zgodnie z instrukcjami podanymi na stronie internetowej dostawcy.</li>
	<li>Na kilka dni przed obrazowaniem należy pobrać komórki wyhodowane w kolbie do hodowli tkankowej, używając 1 ml 0,25% trypsyny/EDTA (2-3 min). Po oderwaniu dodaj równą objętość pożywki hodowlanej, aby dezaktywować trypsynę.</li>
	<li>Przeprowadź liczenie komórek za pomocą hemocytometru i komórek nasiennych w naczyniach obrazowych ze szklanym dnem o gęstości 3-7 x 104 komórek na szalkę. Wybierz komórki do eksperymentów obrazowych, gdy osiągną 60% konfluencji (2-3 dni).</li>
</ol>
2. Przygotowanie roztworów i odczynników
<ol>
	<li>Przygotować buforowany roztwór soli HEPES zawierający Ca2+ (Ca2+-HBSS) składający się z (mM): 135 NaCl, 5,4 KCl, 2 CaCl2, 1 MgCl2, 10 HEPES i 10 glukozy; pH = 7,4 w temperaturze pokojowej (RT) z NaOH. Przygotować Ca2+-HBSS bez dodatku glukozy i przechowywać w temperaturze 4 °C; Dodać glukozę do roztworu bezpośrednio przed użyciem.</li>
	<li>Rozpuszczaj przepuszczalne przez błonę formy fluorescencyjnego wskaźnika Ca2+ Cal-520 (1 mM), ci-IP3 (200 μM) i EGTA (100 mM) w dimetylosulfotlenku (DMSO) zawierającym 20% pluronu F-127. Odczynniki te należy rozmieścić w probówkach Eppendorfa i przechowywać w temperaturze -20 °C, w osłonie przed wilgocią i światłem.</li>
</ol>
3. Ładowanie komórek za pomocą membrany Cal-520, ci-IP3 i EGTA
<ol>
	<li>Przygotować "bufor ładujący" przez rozcieńczenie roztworów podstawowych membranowych Cal-520 i ci-IP3 do końcowego stężenia odpowiednio 5 μM i 1 μM w Ca2+-HBSS.</li>
	<li>Odessać pożywkę hodowlaną i przepłukać komórki, zastępując pożywkę trzykrotnym Ca2+-HBSS.</li>
	<li>Usunąć Ca2 + -HBSS i inkubować komórki w buforze ładującym przez 60 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.</li>
	<li>Usuń bufor ładujący i przepłucz komórki, zastępując pożywkę Ca2 + -HBSS trzy razy.
	<ol>
		<li>W razie potrzeby, na tym etapie, załaduj komórki EGTA/AM, rozcieńczając roztwór podstawowy do końcowego stężenia 5 μM w Ca2+-HBSS, a następnie inkubuj komórki przez 30-60 minut w temperaturze pokojowej w ciemności. Po tej inkubacji przepłukać komórki trzykrotnie Ca2 + -HBSS przed przejściem do kroku 3.5.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inkubować komórki w Ca2 + -HBSS przez 30 minut, aby umożliwić deestryfikację załadowanych odczynników.</li>
	<li>Bezpośrednio przed obrazowaniem należy zastąpić Ca2+-HBSS "świeżym" Ca2+-HBSS w celu usunięcia barwnika, który mógł przedostać się do kąpieli podczas końcowej inkubacji.</li>
</ol>
4. Akwizycja obrazu Ca2+
<ol>
	<li>Umieść małą kroplę olejku immersyjnego na obiektywie 100X APO TIRF (NA 1.49).</li>
	<li>Zamontuj czaszę obrazowania na stoliku mikroskopu odwróconego i ustaw ostrość komórek za pomocą światła przechodzącego. Ważne jest, aby zabezpieczyć miskę obrazowania, aby zapobiec przesuwaniu się podczas nagrywania.</li>
	<li>Oświetl komórki laserem o długości fali 488 nm w celu wzbudzenia Cal-520 i zebrania emitowanej fluorescencji (λ >510 nm) za pomocą szybkiej kamery EMCCD. 
	UWAGA: Pakiet oprogramowania obsługującego mikroskop umożliwia użytkownikowi translację soczewki skupiającej, co pozwala na wprowadzenie wiązki laserowej na skrajną krawędź tylnej apertury obiektywu (w przypadku wzbudzenia TIRF) lub bardziej centralnie (w przypadku wzbudzenia "WF").</li>
	<li>Korzystając z oprogramowania EMCCD, zmniejsz pole obrazowania z pełnych 512 x 512 pikseli, aby zebrać dane w niezbędnej rozdzielczości czasowej do uchwycenia lokalnych zdarzeń Ca2+. 
	UWAGA: Na przykład akwizycja w trybie poczwórnego centrum o wymiarach 256 x 256 pikseli przyspiesza szybkość akwizycji do 66 kl./s. Możliwe jest również dalsze zwiększenie liczby klatek na sekundę w kamerze EMCCD do 500 kl./s za pomocą funkcji trybu izolowanego kadrowania.</li>
	<li>Skonfiguruj oprogramowanie tak, aby automatycznie rejestrowało kilka sekund podstawowej aktywności, dostarczało błysk UV do komórek i kontynuowało nagrywanie przez kolejne 10-30 sek. 
	UWAGA: Lampa błyskowa UV jest dostarczana za pomocą ksenonowego źródła światła łukowego wprowadzanego przez odbijające promieniowanie UV zwierciadło dichroiczne w tylnym porcie mikroskopu. Czas trwania i intensywność błysku UV jest dostosowywany empirycznie, aby wywołać pożądaną częstotliwość lokalnych zdarzeń Ca2+.</li>
	<li>Zapisywanie plików jako stosów obrazów do analizy w trybie off-line.</li>
</ol>
5. Zautomatyzowana analiza obrazu Ca2+
UWAGA: Możliwe jest przeglądanie, przetwarzanie i analizowanie przechwyconych danych za pomocą wielu komercyjnych pakietów oprogramowania. Opracowaliśmy jednak algorytm, który szybko automatyzuje identyfikację i analizę lokalnych sygnałów Ca2+. Szczegółowy opis filtrów przestrzennych i czasowych stosowanych w tym algorytmie, generowania ΔF/F0 oraz procedur identyfikacji/analizy można znaleźć w11. Algorytm ten został opracowany do działania na platformie oprogramowania open source Python i można go uzyskać, wraz z przykładowymi danymi eksperymentalnymi i szczegółowymi instrukcjami użytkownika, wysyłając wiadomość e-mail do autora korespondencyjnego (ismith@uci.edu).
<ol>
	<li>Konwertuj pliki do zaimportowania do niestandardowego algorytmu na format pliku .tiff wielopłaszczyznowego.</li>
	<li>Zlokalizuj folder zawierający algorytm analizy i kliknij dwukrotnie run.exe.</li>
	<li>Wybierz plik .tiff, który ma zostać przeanalizowany.</li>
	<li>Wybierz parametry analizy w otwartym oknie dialogowym. Zobacz rysunek 2A, aby zapoznać się z parametrami domyślnymi dla przykładowych danych.</li>
	<li>Określ poziom czerni, który ma zostać odsunięty od stosu obrazów, przesuwając kursor do części pola widzenia, która nie zawiera komórki (patrz Rysunek 2B) lub ręcznie wprowadzając poziom czerni za pomocą monitu "Ustaw poziom czerni".</li>
	<li>Obserwuj cztery okna na ekranie po analizie przez oprogramowanie (Rysunek 2C-F). C jest monochromatycznym obrazem spoczynkowej fluorescencji z analizowanych komórek. Białe kwadraty nałożone na ten obraz to lokalizacje zdarzeń, wyznaczone jako pozycje środka ciężkości dwuwymiarowych funkcji Gaussa dopasowanych do zdarzeń.</li>
	<li>Kliknij każdą lokalizację wydarzenia lub naciśnij kursora, aby przełączać się między wydarzeniami. Po wykonaniu tej czynności odjęte tło, wygładzone Gaussowskie zmiany współczynnika fluorescencji (ΔF/F0) w każdym z tych miejsc są aktualizowane w oknie D. 
	UWAGA: Zdarzenia wyróżnione na czerwono są określane jako pochodzące z tej konkretnej witryny, a nie z "przebijania" aktywności zlokalizowanej w sąsiednich witrynach. Dolna niebieska ścieżka wskazuje, gdzie sygnał fluorescencji w wybranym miejscu przekroczył próg detekcji, natomiast linia identyfikuje zdarzenia pochodzące z tego konkretnego miejsca (odpowiadające zdarzeniom podświetlonym na czerwono).</li>
	<li>Kliknij zdarzenie podświetlone na czerwono, aby zaktualizować okno E, w którym wyświetlana jest ewolucja czasowa zdarzenia, oraz okno F, w którym wyświetlany jest profil przestrzenny zdarzenia uśredniony w czasie jego przebiegu wraz z profilem przestrzennym dopasowanej funkcji Gaussa.</li>
	<li>Ręcznie przejrzyj zdarzenia, które zostały zidentyfikowane, aby artefakty mogły zostać odrzucone z analizy. Usuń takie zdarzenia, klikając prawym przyciskiem myszy podświetlone na czerwono zdarzenia. 
	UWAGA: W naszych rękach strumień Ca2+ przez pojedyncze kanały IP3R wywołuje sygnały o ΔF/F0 około 0,11, więc wszelkie wykryte "zdarzenia" znacznie mniejsze niż to prawdopodobnie będą fałszywie dodatnie.</li>
	<li>Eksportuj dane, wybierając opcję "Zapisz w programie Excel" lub eksportuj dane dla każdej komórki, rysując wokół interesującej Cię komórki i wybierając opcję "Zapisz komórkę". 
	UWAGA: Dane są zapisywane w tym samym folderze, w którym znajduje się oryginalny stos obrazów.</li>
</ol>

<ol><li>Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+versatility+and+universality+of+calcium+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The versatility and universality of calcium signalling.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 1 (1), 11-21 (2000).</li>
<li>Hill-Eubanks, D. C., Werner, M. E., Heppner, T. J., Nelson, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signaling+in+smooth+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Calcium signaling in smooth muscle.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (9), a004549(2011).</li>
<li>Hagenston, A. M., Bading, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signaling+in+synapse-to-nucleus+communication%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Calcium signaling in synapse-to-nucleus communication.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (11), a004564(2011).</li>
<li>Berridge, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elementary+and+global+aspects+of+calcium+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Elementary and global aspects of calcium signalling.</a> J Physiol. 499 (Pt 2), 291-306 (1997).</li>
<li>Lipp, P., Niggli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hierarchical+concept+of+cellular+and+subcellular+calcium+signalling%29%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Biophys+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">A hierarchical concept of cellular and subcellular calcium signalling).</a> Prog Biophys Mol Biol. 65 (3), 265-296 (1996).</li>
<li>Parker, I., Yao, Y., Ilyin, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+kinetics+of+calcium+liberation+induced+in+Xenopus+oocytes+by+photoreleased+inositol+trisphosphate%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Fast kinetics of calcium liberation induced in Xenopus oocytes by photoreleased inositol trisphosphate.</a> Biophys J. 70 (1), 222-237 (1996).</li>
<li>Minta, A., Kao, J. P., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+indicators+for+cytosolic+calcium+based+on+rhodamine+and+fluorescein+chromophores%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Fluorescent indicators for cytosolic calcium based on rhodamine and fluorescein chromophores.</a> J Biol Chem. 264 (14), 8171-8178 (1989).</li>
<li>Demuro, A., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+activity+and+localization+of+single+voltage-gated+Ca%282%2B%29+channels+by+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Imaging the activity and localization of single voltage-gated Ca(2+) channels by total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Biophys J. 86 (5), 3250-3259 (2004).</li>
<li>Smith, I. F., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+quantal+substructure+of+single+inositol+trisphosphate+receptor+channel+activity+during+calcium+puffs+in+intact+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Imaging the quantal substructure of single inositol trisphosphate receptor channel activity during calcium puffs in intact mammalian cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (15), 6404-6409 (2009).</li>
<li>Reissner, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+postsynaptic+mechanism+for+heterosynaptic+sharing+of+short-term+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A novel postsynaptic mechanism for heterosynaptic sharing of short-term plasticity.</a> J Neurosci. 30 (26), 8797-8806 (2010).</li>
<li>Ellefson, K. S., Parker, B., Smith, I., F, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+algorithm+for+automated+detection%2C+localization+and+measurement+of+local+calcium+signals+from+camera-based+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">An algorithm for automated detection, localization and measurement of local calcium signals from camera-based imaging.</a> Cell Calcium. , (2014).</li>
<li>Smith, I. F., Wiltgen, S. M., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+puff+sites+adjacent+to+the+plasma+membrane%3A+Functional+and+spatial+characterization+of+calcium+signaling+in+SH-SY5Y+cells+utilizing+membrane-permeant+caged+inositol+trisphosphate%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Localization of puff sites adjacent to the plasma membrane: Functional and spatial characterization of calcium signaling in SH-SY5Y cells utilizing membrane-permeant caged inositol trisphosphate.</a> Cell Calcium. 45, 65-76 (2009).</li>
<li>Shuai, J., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+single-channel+recording+by+imaging+calcium+flux+through+individual+ion+channels%3A+theoretical+considerations+and+limits+to+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Optical single-channel recording by imaging calcium flux through individual ion channels: theoretical considerations and limits to resolution.</a> Cell Calcium. 37 (4), 283-299 (2005).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Opisujemy tutaj protokoły obrazowania lokalnych zdarzeń Ca2+ w hodowanych komórkach ssaków przy użyciu fluorescencyjnych wskaźników Ca2+ . Ponadto opisujemy algorytm z intuicyjnym interfejsem użytkownika, który automatyzuje identyfikację i analizę pozyskanych danych. Opisana tutaj procedura wykorzystuje fluorescencyjny wskaźnik Ca2 + Cal-520, ale wiele innych barwników wrażliwych na Ca2 + , takich jak Fluo-3, Fluo-4, Fluo-8 i Oregon Green BAPTA-1 działa wystarczająco dobrze, ab...

Jony wapnia (Ca2+) regulują różnorodne procesy biologiczne, w tym ekspresję genów, wydzielanie i długotrwałe zmiany plastyczności synaptycznej1. Jednym ze sposobów, w jaki Ca2+ może działać w tak różnorodny sposób, są różne przestrzenne i czasowe wzorce sygnałów Ca2+, które komórka może generować. Na przykład globalne zwiększenie cytozolu [Ca2+] wywołuje skurcz w tkance mięśni gładkich2, podczas gdy mniejsze, zlokalizowane przejściowe wzrosty (lokalne mikrodomeny Ca2 +) stymulują ekspresję genów niezbędnych do uczenia się i zapamiętywania3.
Wolny cytozol [Ca2+] jest utrzymywany na poziomie ~100 nM w spoczynku, ale może szybko wzrosnąć do kilku mikromolowców po napływie Ca2+ do cytozolu przez przepuszczalne dla Ca2+ kanały jonowe znajdujące się w błonie komórkowej i przez uwolnienie Ca2+ z wewnątrzkomórkowych magazynów. Nasze laboratorium koncentruje się na receptorze 1,4,5-trifosforanu inozytolu (IP3R), który tworzy kanał uwalniania Ca2+ zlokalizowany w błonie retikulum endoplazmatycznego (ER). Po związaniu zarówno IP3, jak i Ca2 + z cytozolowymi miejscami aktywującymi receptora, kanał IP3R otwiera się, aby uwolnić Ca2 + sekwestrowany w świetle ER. Uwalnianie Ca2 + może pozostać ograniczone przestrzennie do małego klastra IP3R w celu wytworzenia lokalnej mikrodomeny cytozolowej Ca2+ (Ca2 + puff4) lub, w zależności od bliskości sąsiednich klastrów IP3Rs, może rozprzestrzeniać się w komórce poprzez rekrutację wielu miejsc zaciągnięcia w procesie uwalniania Ca2+ indukowanego przez Ca2+ (CICR)5,6.
Wprowadzenie fluorescencyjnych drobnocząsteczkowych barwników wskaźnikowych Ca2+ opracowanych przez Rogera Tsiena7, w połączeniu z zaawansowanymi technikami obrazowania mikroskopowego, znacznie ułatwiło nam zrozumienie sygnalizacji Ca2+. Najnowsze postępy w dziedzinie kamer używanych w mikroskopii pozwalają obecnie na obrazowanie przejściowych lokalnych zdarzeń Ca2+, takich jak zaciągnięcia, z niespotykaną rozdzielczością przestrzenną i czasową. Obecnie dostępne kamery EMCCD umożliwiają obrazowanie z rozdzielczością 128 x 128 pikseli przy >500 klatkach sec-1 (kl./s), a nowa generacja kamer z komplementarnym półprzewodnikiem metalowo-tlenkowym (CMOS) zapewnia wyższą rozdzielczość pikseli i jeszcze większą prędkość kosztem nieco wyższego poziomu szumów. W połączeniu z mikroskopią całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF) możliwe jest teraz obrazowanie pojedynczych zdarzeń kanału Ca2+ 8,9. Takie podejście pozwala na obrazowanie setek kanałów/zdarzeń jednocześnie, przy jednoczesnym generowaniu dużych zbiorów danych (ok. 1 GB na minutę), które uniemożliwiają ręczne przetwarzanie, identyfikację wizualną i analizę i nakładają nacisk na rozwój zautomatyzowanych algorytmów.
Tutaj prezentujemy procedury i protokoły obrazowania lokalnych sygnałów Ca2+ w nienaruszonych komórkach ssaków za pomocą fluorescencyjnych wskaźników Ca2+. Następnie demonstrujemy algorytm opracowany w środowisku open source Python, który automatyzuje identyfikację i analizę lokalnych zdarzeń Ca2+ obrazowanych zarówno za pomocą TIRF, jak i konwencjonalnej mikroskopii epifluorescencyjnej (WF) o szerokim polu. Chociaż opisujemy te podejścia w kontekście sygnałów Ca2 + generowanych przez IP3, są one łatwo podatne na badanie lokalnych zmian w cytozolowym [Ca2 +] pochodzących z różnych kanałów jonowych przepuszczalnych dla Ca2 + znajdujących się w błonie powierzchniowej lub organellach wewnątrzkomórkowych8-10.

<table><tbody><tr><td>Ludzkie komórki nerwiaka zarodkowego SH-SY5Y</td><td>ATCC</td><td>CRL-2266</td><td></td></tr><tr><td>Cal-520 / AM</td><td>AAT Bioquest Inc.</td><td>21130</td><td></td></tr><tr><td>ci-IP3 (D-23-O-Isopropylidene-6-O-(2-nitro-4,5-dimetoksy)benzylo-myo-inozytol 1,4,5-trisfosforan-heksakis(propionoksymetyl) ester</td><td>SiChem</td><td>cag-iso-2-145-10</td><td></td></tr><tr><td>DMSO/20% pluronowy F127</td><td>Invitrogen</td><td>P-3000MP</td><td></td></tr><tr><td>EGTA/AM</td><td>Invitrogen</td><td>E-1219</td><td></td></tr><tr><td>Talerze obrazowe 35 mm ze szklanym dnem</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr></tbody></table>

obrazowanie lokalnych sygnałów ca2+ w hodowanych komórkach ssaków

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Cytozolowe jony Ca2+ regulują liczne aspekty aktywności komórkowej w prawie wszystkich typach komórek, kontrolując procesy tak szerokie, jak transkrypcja genów, pobudliwość elektryczna i proliferacja komórek. Różnorodność i specyficzność sygnalizacji Ca2 + wynika z mechanizmów, za pomocą których sygnały Ca2 + są generowane do działania w różnych skalach czasowych i przestrzennych, począwszy od oscylacji i fal obejmujących całą komórkę i fal występujących w ciągu kilku minut, aż po lokalne przejściowe mikrodomeny Ca2+ (Ca2+ zaciągnięcia) trwające milisekundy. Ostatnie postępy w dziedzinie kamer CCD z pomnożonymi elektronami (EMCCD) pozwalają teraz na obrazowanie lokalnych sygnałów Ca2+ z rozdzielczością przestrzenną 128 x 128 pikseli z szybkością >500 klatek sec-1 (fps). Podejście to jest wysoce równoległe i umożliwia jednoczesne monitorowanie setek kanałów lub miejsc zaciągania się w jednym eksperymencie. Jednak ogromna ilość generowanych danych (ok. 1 Gb na min) sprawia, że identyfikacja wizualna i analiza lokalnych zdarzeń Ca2+ jest niewykonalna. Tutaj opisujemy i demonstrujemy procedury pozyskiwania, wykrywania i analizy lokalnych sygnałów Ca2 + za pośrednictwem IP3 w nienaruszonych komórkach ssaków obciążonych wskaźnikami Ca2 + przy użyciu zarówno mikroskopii epi-fluorescencji (WF), jak i całkowitej fluorescencji wewnętrznego odbicia (TIRF). Ponadto opisujemy algorytm opracowany w środowisku oprogramowania open source Python, który automatyzuje identyfikację i analizę tych lokalnych sygnałów Ca2+. Algorytm lokalizuje miejsca uwolnienia Ca2+ z rozdzielczością subpikselową; umożliwia użytkownikowi przeglądanie danych; i wyprowadza sekwencje czasowe sygnałów współczynnika fluorescencji wraz z danymi amplitudowymi i kinetycznymi w tabeli zgodnej z programem Excel.

Rycina 1A przedstawia obraz WF fluorescencji spoczynkowej Cal-520 w ludzkich komórkach neuroblastoma SH-SY5Y, które zostały również załadowane ci-IP3. Poddanie tych komórek 100 ms błyskowi UV w celu fotoutzwolnienia i-IP3 wywołało przejściowe puffsy Ca2+ w odrębnych miejscach (oznaczonych białymi okręgami na Rycynie 1A). Przebiegi fluorescencji mierzone w tych miejscach wykazały szybką fazę wzrostu wynikającą z przejściowego otwarcia receptorów IP3</...

Tutaj prezentujemy techniki obrazowania lokalnych zdarzeń Ca2+ za pośrednictwem IP3 za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej w nienaruszonych komórkach ssaków załadowanych wskaźnikami Ca2+ wraz z algorytmem, który automatyzuje identyfikację i analizę tych zdarzeń.

Obrazowanie lokalnych sygnałów Ca2+ w hodowanych komórkach ssaków

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zademonstrowanie akwizycji, detekcji i analizy lokalnych sygnałów wapniowych pośredniczonych przez IP₃ w nienaruszonych komórkach ssaków z wykorzystaniem obrazowania kamerowego. Zostaje to osiągnięte poprzez uprzednie wysianie komórek na szkiełka podstawowe z dna szklanego oraz załadowanie ich przepuszczalnymi przez błonę komórkową formami fluorescencyjnego wskaźnika wapnia CAL-520 oraz klatkowanego IP₃.Drugim krokiem jest umieszczenie szkiełka nakrywkowego na stole mikroskopu odwróconego i oświetlenie próbki światłem o długości 488 nanometrów w celu wzbudzenia Cal five 20, fluorescencyjnego barwnika wrażliwego na wapń. Następnie indukuje się lokalne sygnały wapniowe poprzez poddanie komórek krótkiemu impulsowi światła UV. Powoduje to fotolizę IP3 z klatkowanego prekursora, dzięki czemu może on teraz związać się z receptorem trifosforanu acetolu i pośredniczyć w uwalnianiu wapnia z retikulum endoplazmatycznego.Ostatnim krokiem jest zaimportowanie stosu obrazów do specjalistycznego algorytmu w celu rozpoczęcia zautomatyzowanej analizy zarejestrowanych danych. W rezultacie algorytm szybko lokalizuje miejsca uwalniania wapnia z rozdzielczością s

imaging-local-ca2-signals-in-cultured-mammalian-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Obrazowanie lokalnych sygnałów Ca2+ w hodowlach komórek ssaków

Siatkowka śródplazmatyczna odgrywa kluczową rolę w biogenezie białek oraz w homeostazie wapnia. Opracowaliśmy system eksperymentalny, który pozwala nam zbadać rolę kanałów przecieku Ca2+ oraz scharakteryzować ich domniemane mechanizmy regulacyjne. System ten obejmuje wyciszanie genów za pomocą siRNA oraz obrazowanie Ca2+ w żywych komórkach.

Obrazowanie poziomu wapnia w żywych komórkach połączone z wyciszaniem genów za pomocą siRNA identyfikuje kanały przecieku Ca2+ w błonie ER i ich mechanizmy regulacyjne

Właściwości i funkcje wewnątrzkomórkowych sygnałów Ca2+ astrocytów w prążkowiu pozostają niew pełni zbadane. Opisujemy metody ekspresji genetycznie kodowanych wskaźników wapnia w astrocytach prążkowia przy użyciu wirusów związanych z adenowirusami serotypu 2/5 (AAV2/5), a także procedury wiarygodnego obrazowania sygnałów Ca2 + w astrocytach prążkowia in situ.

Obrazowanie wewnątrzkomórkowych sygnałów Ca2+ w astrocytach prążkowia od dorosłych myszy przy użyciu genetycznie kodowanych wskaźników wapnia

Ten artykuł przedstawia protokół wykrywania jednego lub więcej białek plazmy i/lub błony wewnątrzkomórkowej za pomocą mikroskopii superrozdzielczej GSD (Ground State Depletion) w komórkach ssaków. W tym miejscu omawiamy korzyści i rozważania dotyczące stosowania takich podejść do wizualizacji i kwantyfikacji białek komórkowych.

Obrazowanie w superrozdzielczości zubożenia stanu podstawowego w komórkach ssaków

Tutaj prezentujemy protokół obrazowania sygnalizacji wapniowej w populacjach poszczególnych typów komórek w mysim złączu nerwowo-mięśniowym.

Ex vivo Obrazowanie specyficznej dla komórki sygnalizacji wapniowej w trójdzielnej synapsie przepony myszy

Genetycznie kodowane wskaźniki Ca2+ (GECI) radykalnie zmieniły sposób wykonywania obrazowania in situ Ca2+. Aby zmaksymalizować odzysk danych z takich nagrań, wymagana jest odpowiednia analiza sygnałów Ca2+. Protokoły przedstawione w tym artykule ułatwiają kwantyfikację sygnałów Ca2+ zarejestrowanych in situ przy użyciu mapowania czasoprzestrzennego i analizy opartej na cząstkach.

Zastosowania technik mapowania czasoprzestrzennego i analizy cząstek do ilościowego określania wewnątrzkomórkowej sygnalizacji Ca2+ in situ

Tutaj prezentujemy protokół obrazowania Ca2+ w neuronach i komórkach glejowych, który umożliwia analizę sygnałów Ca2+ w rozdzielczości subkomórkowej. Proces ten ma zastosowanie do wszystkich typów komórek, które umożliwiają ekspresję genetycznie kodowanych wskaźników Ca2 +.

Analiza lokalnych sygnałów Ca2 + w hodowanych komórkach za pomocą ukierunkowanych na błonę wskaźników Ca2 +

Obecny protokół opisuje wykonanie dużego (6 x 3 mm2) okna czaszki przy użyciu folii spożywczej, przezroczystego silikonu i szkła nakrywkowego. To okno czaszkowe pozwala na eksperymenty in vivo z obrazowaniem wapnia w szerokim polu i z dwoma fotonami na tej samej myszy.

In vivo (in vivo) Szerokokątne i dwufotonowe obrazowanie wapnia za pomocą myszy przy użyciu dużego okna czaszki

Obecne metody opisują nieratiometryczne podejście do wysokorozdzielczego, subkompartmentowego obrazowania wapnia in vivo u Caenorhabditis elegans przy użyciu łatwo dostępnych genetycznie kodowanych wskaźników wapnia.

Subkomórkowe obrazowanie neuronalnej obsługi wapnia in vivo

Ten protokół szczegółowo opisuje procedurę obrazowania reakcji wapnia w górnym wzgórku (SC) obudzonych myszy, w tym obrazowanie aktywności pojedynczego neuronu za pomocą mikroskopii dwufotonowej przy jednoczesnym pozostawieniu nienaruszonej kory mózgowej u myszy typu dzikiego, oraz obrazowanie całego SC za pomocą mikroskopii szerokiego pola u myszy z mutacją częściowej kory  mózgowej.

Obrazowanie wapnia u myszy Superior Colliculus

Tutaj udostępniamy kompleksowy protokół do rozwiązywania początkowych lokalnych sygnałów Ca2+, znanych jako mikrodomeny Ca2+, w pierwotnych mysich i ludzkich limfocytach T za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Protokół ten służy jako cenne źródło informacji dla naukowców badających szlaki sygnałowe Ca2+ w komórkach odpornościowych i do dalszego odkrywania ich funkcji.

Obrazowanie początkowych mikrodomen Ca2+ w pierwotnych limfocytach T

Ten artykuł przedstawia metodę ilościowego monitorowania stężenia jonów wapnia (Ca2+) w komórkach w czasie rzeczywistym za pomocą jednokomórkowego obrazowania Ca2+ barwnikiem Fura-2/AM. Technika ta umożliwia efektywne ładowanie barwnika i dokładne obliczanie poziomów Ca2+ za pomocą współczynników intensywności fluorescencji, dzięki czemu jest to proste i szybkie podejście do zastosowań badawczych.

Obrazowanie wapnia w pojedynczych komórkach do badania aktywacji kanałów jonowych wapnia

Poznaj metodę obrazowania lokalnych sygnałów wapniowych w komórkach ssaków przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej i algorytmu automatycznej analizy. Technika ta umożliwia badanie sygnalizacji IP3 z dużą rozdzielczością czasową i przestrzenną.

Obrazowanie lokalnych sygnałów Ca²⁺ w hodowanych komórkach ssaków

Przeglądaj więcej filmów