Dwufotonowe obrazowanie dynamiki komórkowej w rdzeniu kręgowym myszy
February 22nd, 2015
Nowy preparat ex vivo do obrazowania rdzenia kręgowego myszy. Protokół ten pozwala na obrazowanie dwufotonowe żywych interakcji komórkowych w całym rdzeniu kręgowym.
Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest zobrazowanie w czasie rzeczywistym znakowanych fluorescencyjnie, przeszczepionych, nerwowych komórek prekursorowych lub interakcji NPC z fluorescencyjnymi aksonami w rdzeniu kręgowym myszy. Osiąga się to poprzez ostrożne usunięcie i osadzenie rdzenia kręgowego u myszy przeszczepionych z NPC do 5%aros i przymocowanie go do szkiełka nakrywkowego. Orientację rdzenia kręgowego można zmienić, aby wyświetlić fluorescencję w dowolnym obszarze rdzenia kręgowego.
W drugim etapie preparat rdzenia kręgowego umieszcza się na stoliku do obrazowania dwufotonowego w celu zobrazowania żywych NPC, podczas gdy jest on super połączony ciepłym natlenionym medium RPMI przez okres do 10 godzin. Odpowiedni jednoostrzowy rozdzielacz wiązki dicznej służy do separacji emisji YFP i GFP. Ostatecznie, obrazowanie dwufotonowe pozwala na wizualizację oddziaływań NPC wyrażających GFP z aksonami wyrażającymi YFP w uszkodzonym rdzeniu kręgowym w czasie rzeczywistym.
Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie neurogeneracji, takie jak to, jakie są sygnały sygnalizacji molekularnej i komórkowej niezbędne do przeszczepionej remielinizacji uszkodzonych aksonów NPC i jaka jest kinetyka tych zdarzeń remielinizacji? Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak obrazowanie międzypływowe dwóch fotonów, które można wykorzystać tylko do obrazowania grzbietowego rdzenia kręgowego, jest to, że metoda ta umożliwia obrazowanie przeszczepionych NPC, które migrowały głęboko w brzusznym obszarze rdzenia kręgowego. Po potwierdzeniu eutanazji przez przecięcie kręgosłupa, zwilż mysz 70% etanolem, a następnie użyj ostrych, cienkich nożyczek, aby usunąć sierść i skórę z grzbietu zwierzęcia, odsłaniając kręgosłup od około blaszki szyjnej jednej lub C jeden do blaszki krzyżowej czwartej lub S czterech.
Następnie za pomocą skalpela z ostrzem numer 10 wykonaj nacięcia po lewej i prawej stronie kręgosłupa, aby oddzielić go od otaczającej tkanki mięśniowej i tłuszczowej, a także odciąć nadmiar tkanki wokół i na szczycie kręgosłupa. Pozwoli to na łatwiejsze usunięcie kręgów. Następnie, trzymając górną część kręgów kręgosłupa ząbkowanymi szarymi kleszczami, włóż tytanowe zakrzywione nożyczki van zakrzywioną stroną do góry do odsłoniętego kręgosłupa w C jeden, uważając, aby nie dotknąć rdzenia kręgowego.
Przesuń nożyczki maksymalnie w prawo i wykonaj jedno małe cięcie. Powinien być słyszalny i odczuwalny cichy dźwięk chrupania, gdy nożyczki przecinają kręgi. Powtórz to cięcie po lewej stronie sznurka, uważając, aby nie pracować zbyt szybko ani nie wykonać zbyt dużego cięcia, ponieważ grozi to uszkodzeniem przewodu.
Po przecięciu boków kręgów pojedyncze lamini powinny być w stanie zostać podniesione za pomocą kleszczy. Powtarzaj lewe i prawe cięcie dla każdej blaszki, aż do osiągnięcia S czterech. Dalsze przytrzymywanie i odciąganie kręgów rdzenia kręgowego.
Kręgi powyżej przeszczepu mogą odpaść po przecięciu kręgosłupa do miejsca przeszczepu. Gdy kręgi zostaną przycięte do S czterech, połóż kręgi, aby pomóc sobie wyobrazić, gdzie znajduje się miejsce przeszczepu i przytnij około 20 milimetrów rostralu i rozpieszczaj do miejsca przeszczepu. Teraz użyj skalpela z ostrzem numer 11, aby ostrożnie przeciąć zwoje po prawej i lewej stronie brzusznej strony rdzenia kręgowego, zaczynając od końca rostralnego.
Następnie odwróć i przytrzymaj zwierzę tak, aby rdzeń kręgowy był skierowany w dół i użyj zamkniętych, ząbkowanych kleszczy grobowych, aby ostrożnie oderwać rdzeń kręgowy od końca rozpieszczonego. Następnie, nie nacinając rdzenia kręgowego, ostrożnie odetnij pozostałe zwoje, aby umożliwić wyniesienie rdzenia kręgowego w jednym nienaruszonym kawałku, i umieść rdzeń kręgowy w podłożu na lodzie, aby przygotować rdzeń kręgowy do obrazowania. Przenieś tkankę nerwową na arkusz paramu stroną brzuszną skierowaną do góry.
Następnie odpipetuj około pięciu mililitrów świeżo przygotowanego 5% roztworu agro o temperaturze 37 stopni Celsjusza na sznurku i pozwól mu zastygnąć w temperaturze pokojowej. Po około pięciu minutach nałóż cienką warstwę kleju tkankowego na 22-milimetrowy kwadratowy szkiełko nakrywkowe i odwróć osadzoną brzuszną stronę rdzenia kręgowego w dół na nowy kawałek perfilu. Przyklej szkiełko nakrywkowe do odsłoniętej strony grzbietowej i zanurz cały preparat w świeżym podłożu w celu zestalenia kleju.
Następnie za pomocą żyletki usuń nadmiar zastygłej róży aga. Następnie włóż rurkę podłączoną do pompy rurkowej do butelki z mediami, przechowywanej w łaźni wodnej, aby uzyskać super stopnie 37 stopni Celsjusza. Dość podgrzane media przez specjalnie zbudowaną studnię obrazowania na stoliku mikroskopowym z prędkością trzech mililitrów na minutę.
Następnie umieść preparat rdzenia kręgowego w studzience stroną brzuszną skierowaną do góry w kierunku celu zanurzenia 25 razy. Aby zobrazować brzuszny rdzeń kręgowy za pomocą mikroskopii dwufotonowej, użyj ultratytanowego lasera szafirowego dostrojonego do 900 nanometrów z mocą lasera osłabioną w próbce do mniej niż 5%, aby zapewnić minimalną fototoksyczność. Następnie za pomocą okularu i źródła światła w jasnym polu ustaw ostrość soczewkę zanurzeniową na brzusznej krawędzi rdzenia kręgowego.
Aby ustawić punkt odniesienia, upewnij się, że źródło światła otoczenia jest wyłączone. Następnie otwórz migawkę lasera, aby przełączyć dwa cytaty fotoniczne, jeśli są dostępne. Przeszukując tkankę w poszukiwaniu obszarów zainteresowania, użyj niższej rozdzielczości, ustawiając większą głośność bez zoomu cyfrowego i wyższą szybkość skanowania niż podczas uzyskiwania ostatecznych obrazów.
Aby znaleźć komórki, najlepiej skupić się na próbce w jasnym oświetleniu pola na krawędzi tkanki, najpierw w miejscu przeszczepu, a następnie przełączyć się na fluorescencję. Duże pole X i Y o niskiej rozdzielczości może być następnie użyte, aby umożliwić szybkie oglądanie dużego obszaru, gdy ostrość przesuwa się w głąb tkanki. Obserwuj aksony EYFP w pobliżu brzusznej krawędzi rdzenia kręgowego.
Drugi sygnał harmoniczny z kolagenu obserwowany tutaj na niebiesko będzie najjaśniejszy na krawędzi tkanki rdzenia kręgowego. Teraz użyj odpowiedniego oprogramowania do przechwytywania obrazu, aby uzyskać końcowe obrazy o wyższej rozdzielczości w sekwencyjnych płaszczyznach ogniskowych w krokach co 2,5 mikrona, aby skompilować stosy Z. W tej reprezentacji NPC GFP są obserwowane jako niebieskie i uszkodzone aksony YFP są obserwowane jako żółte pseudokolorowanie, które można wykonać później za pomocą oprogramowania do edycji, a następnie wykonać skanowanie dwukierunkowe z odpowiednim przesunięciem nakładki, aby zapewnić szybką kwantyfikację wszelkich migrujących obiektów w rdzeniu kręgowym, zapewniając, że idealna szybkość akwizycji w celu określenia prędkości komórkowej w rdzeniu kręgowym jest ustawiona na około 1,7 klatki na sekundę.
Na koniec przeanalizuj wygładzone przycięcie i pseudo pokoloruj pliki obrazów za pomocą odpowiedniego oprogramowania i użyj zautomatyzowanych procesów do przeczesania kolejnych objętości obrazowania w celu wytworzenia ostatecznych filmów poklatkowych. Podczas gdy ten protokół obrazowania eksplantowanego rdzenia kręgowego może być używany do wizualizacji dowolnej fluorescencji w rdzeniu kręgowym, obrazy te pokazują reprezentatywne interakcje neuronalnych komórek prekursorowych EGFP z aksonami EYFP w pojedynczym stosie Z w brzusznym rdzeniu kręgowym. Akwizycja kolejnych Zacków może być następnie skompilowana w celu wytworzenia filmów poklatkowych do analizy dynamiki komórkowej w czasie rzeczywistym w nienaruszonej tkance.
Rzeczywiście, użycie 520-nanometrowego jednokrawędziowego dichroicznego rozdzielacza wiązki i 560-nanometrowego jednokrawędziowego dichroicznego rozdzielacza wiązki może oddzielić sygnały EGFP i EYFP, umożliwiając pseudo kolorowanie poszczególnych kanałów na zielono i żółto za pomocą oprogramowania do obrazowania, jak pokazano tutaj, Próbując tej procedury, ważne jest, aby pamiętać o prawidłowym usunięciu rdzenia kręgowego z myszy bez nadmiernego rozciągania, ucisk lub przypadkowe przecięcie tkanki nerwowej. Dzięki tej procedurze dowolna kombinacja znakowanych fluorescencyjnie komórek lub aksonów może być obrazowana w czasie rzeczywistym, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, w tym jaka jest kinetyka migracji lub remielinizacji w różnych terapiach lub warunkach farmakologicznych.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
To badanie przedstawia nową preparację ex vivo do obrazowania rdzenia kręgowego myszy, umożliwiającą dwufotonowe obrazy interakcji żywych komórek. Protokół pozwala na obserwację w czasie rzeczywistym fluorescencyjnie oznaczonych komórek prekursorowych neuronów (NPC) wchodzących w interakcje z aksonami w rdzeniu kręgowym.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Biologia komórki
- Techniki obrazowania
Tło
- Rozumienie interakcji komórkowych w rdzeniu kręgowym jest kluczowe dla badań neuronaukowych.
- Dwufotonowe obrazy zapewniają wysoką rozdzielczość wizualizowaniu żywych komórek.
- Komórki prekursorowe neuronów (NPC) są ważne do badania mechanizmów naprawy rdzenia kręgowego.
- Fluorescencyjne oznaczanie pozwala na śledzenie określonych typów komórek podczas obrazowania.
Cel badania
- Opracowanie metody obrazowania interakcji NPC w rdzeniu kręgowym.
- Wizualizacja interakcji w czasie rzeczywistym między NPC a aksonami.
- Zgłębienie zrozumienia dynamiki komórkowej w modelach uszkodzeń rdzenia kręgowego.
Stosowane metody
- Ex vivo preparacja rdzenia kręgowego myszy.
- Zakłączanie tkanki rdzenia kręgowego w 5% agarose.
- Ustawienia dwufotonowego obrazowania z odpowiednim działem wiązki do detekcji fluorescencji.
- Napełnianie nadtlenowanym środowiskiem RPMI podczas obrazowania.
Główne wyniki
- Udane obrazy NPC i aksonów w czasie rzeczywistym.
- Wykazane interakcje między NPC ekspresującymi GFP a aksonami ekspresującymi YFP.
- Utrzymanie żywotności NPC do 10 godzin podczas obrazowania.
- Dostarczenie wglądu w zachowanie komórkowe w uszkodzonym środowisku rdzenia kręgowego.
Wnioski
- Opracowana metoda jest skuteczna do badania interakcji komórkowych w rdzeniu kręgowym.
- Dwufotonowe obrazy są cennymi narzędziami do obserwacji w czasie rzeczywistym żywych komórek.
- Ta metoda może pomóc w zrozumieniu procesów naprawy i regeneracji rdzenia kręgowego.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Two-photon imaging of live neural precursor cell (NPC) dynamics in the mouse spinal cord enables direct visualization of cellular migration, differentiation, and interaction with damaged axons. This capability provides mechanistic insight into remyelination processes relevant to neuroinflammatory demyelinating disorders, supporting predictive confidence in early-stage therapeutic hypotheses. The method addresses a critical gap in real-time, deep-tissue imaging for translational neuroscience and regenerative medicine portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct observation of NPC migration and differentiation in disease-relevant tissue environments.
- Supports mechanistic de-risking by visualizing cellular responses to axonal damage in real time.
- Facilitates functional target validation for cell-based therapies addressing demyelination.
- Provides quantitative data on NPC-axon interactions to inform portfolio triage.
Screening & Assay Development
- Establishes validated ex vivo spinal cord systems for reproducible imaging workflows.
- Delivers quantitative outputs such as migration kinetics and remyelination events.
- Enables assay standardization for evaluating candidate cell populations or interventions.
- Supports reliable compound or cell therapy evaluation in a controlled environment.
Translational & Preclinical Research
- Aligns imaging outputs with disease-relevant models of neuroinflammation and demyelination.
- Provides continuity from discovery-stage mechanistic studies to preclinical validation of cell therapies.
- Enables risk-adjusted advancement decisions based on real-time cellular behavior in intact tissue.
- Supports translational biomarker identification through dynamic imaging of cellular processes.
Pipeline & Workflow Integration
This imaging method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling hypothesis testing, mechanistic de-risking, and quantitative assessment of cell-based interventions in the spinal cord.
- Discovery Biology: Supports interrogation of NPC behavior and remyelination mechanisms in situ.
- Screening: Provides reproducible, quantitative imaging outputs for comparative analysis of interventions.
- Analytics: Delivers high-resolution, time-lapse data on cell migration and interaction dynamics.
- Translational Research: Bridges discovery findings to preclinical models of neurodegeneration and repair.
- Enterprise Reuse: Offers a platform for diverse studies of transplanted or endogenous cell populations in the spinal cord.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in cell therapy mechanisms and target engagement.
- Operational Value: Standardizes imaging protocols for reproducibility and scalability across studies.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by providing real-time evidence of therapeutic cell function.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of regenerative medicine and neurorepair programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in advanced microscopy and ex vivo tissue preparation.
- Demands access to two-photon imaging systems and fluorescence detection infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization of imaging and analysis protocols.
- Adaptable to various fluorescently labeled cell types and spinal cord regions.
- Limited by tissue viability and imaging duration constraints (up to 10 hours ex vivo).
