Name: Dwufotonowe obrazowanie dynamiki komórkowej w rdzeniu kręgowym myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-22T16:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: Poznaj metodę dwufotonowego obrazowania komórek prekursorowych nerwowych w rdzeniu kręgowym myszy. Technika umożliwia obserwację interakcji komórek z aksonami w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była częściowo wspierana przez National Institutes of Health (NIH) Granty R01 GM-41514 (dla M.D.C.), R39 GM-048071 (dla I.P.) i R01 NS-074987 (dla T.E.L.) oraz National Multiple Sclerosis Society (NMSS) Collaborative Center Research Award CA1058-A-8 (dla C.M.W., T.E.L. i M.D.C.), NMSS Grant RG4925, NIH Training Grant T32-AI-060573 (dla M.L.G.), Stypendium podoktorskie NMSS FG 1960-A-1 (dla J.G.W.) oraz finansowanie z Fundacji George'a E. Hewitta na rzecz Badań Medycznych (M.P.M.).

UWAGA: Oświadczenie etyczne: Protokół postępowania ze zwierzętami został zatwierdzony przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Kalifornijskiego w Irvine, protokół #2010-2943.
1. Usunięcie rdzenia kręgowego
<ol>
	<li>Umieść ręczniki papierowe zwilżone ~100% płynnym izofluranem, USP w komorze eutanazji, a na wierzchu połóż suche ręczniki papierowe. Umieść mysz w komorze na suchych ręcznikach papierowych, aby mysz nie dotykała izofluranu i upewnij się, że komora jest przykryta. Odczekaj co najmniej minutę po ustaniu oddychania, aby upewnić się, że mysz została poddana eutanazji.</li>
	<li>Wykonaj przekrój kręgosłupa szyi, aby upewnić się, że mysz została poddana eutanazji. Nie należy wykonywać zwichnięcia szyjki macicy, ponieważ może to spowodować uszkodzenie rdzenia kręgowego.</li>
	<li>Spryskaj mysz 70% etanolem, aby zwilżyć włosy.</li>
	<li>Użyj ostrych, cienkich nożyczek, aby usunąć włosy i skórę z grzbietu myszy, aby odsłonić kręgosłup od mniej więcej blaszki szyjnej 1 (C1) do blaszki krzyżowej 4 (S4).</li>
	<li>Za pomocą skalpela z ostrzem #10 wykonaj nacięcia po lewej i prawej stronie kręgosłupa, aby oddzielić go od mięśni i tłuszczu. To znacznie ułatwi usunięcie rdzenia kręgowego.</li>
	<li>opcjonalnie: zakrzywiony rongeurs Luer może być użyty do nabrania dodatkowego miąższu.</li>
	<li>Trzymając górną część kręgów kręgosłupa ząbkowanymi kleszczami Graefe'a, włóż tytanowe zakrzywione nożyczki Vannas zakrzywioną stroną do góry do odsłoniętego kręgosłupa w C1, uważając, aby nie dotknąć rdzenia kręgowego.</li>
	<li>Przesuń tytanowe zakrzywione nożyczki Vannas maksymalnie w prawo i wykonaj jedno małe cięcie. Powinien być słyszalny i odczuwalny cichy dźwięk chrupnięcia, gdy nożyczki przecinają kręgi. Powtórz to cięcie po lewej stronie sznurka. Uważaj, aby nie iść zbyt szybko ani nie wykonać zbyt dużego cięcia, ponieważ grozi to uszkodzeniem przewodu nożyczkami.</li>
	<li>Pojedyncza blaszka powinna być możliwa do podniesienia za pomocą kleszczy po przecięciu boków kręgów. Powtórz ten krok dla każdej blaszki do S4, kontynuując przytrzymywanie i odciąganie kręgów rdzenia kręgowego. 
	UWAGA: kręgi powyżej miejsca przeszczepu prawdopodobnie odpadną po przycięciu do miejsca przeszczepu. Kontynuuj procedurę, zaczynając tuż pod miejscem przeszczepu.</li>
	<li>Opcjonalnie: Połóż kręgi, aby zobaczyć, gdzie znajduje się miejsce przeszczepu, a następnie zmierz i przytnij ~20 mm rostral i ogon do miejsca przeszczepu. 
	UWAGA: Podczas przesadzania NPC więcej nie będzie potrzebne, ponieważ przeszczepione NPC zazwyczaj nie migrują dalej niż 15 mm. Ilość potrzebnego rdzenia kręgowego będzie zależała od charakterystyki eksperymentu i migracji przeszczepionego typu komórki. Wykonywanie nacięć rostralnych i ogonowych, które znajdują się w równej odległości od miejsca przeszczepu, umożliwi łatwiejsze zlokalizowanie miejsca przeszczepu podczas obrazowania.</li>
	<li>Używając skalpela z ostrzem #11, ostrożnie przetnij zwoje po prawej i lewej stronie brzusznej strony rdzenia kręgowego, zaczynając od końca rostralnego. Umożliwi to łatwiejsze usunięcie rdzenia kręgowego z kręgów brzusznych. 
	UWAGA: Wykonane szybko (kroki 1.7-1.11), rdzeń kręgowy nie wyschnie. Jednak 1x PBS można podawać do pępowiny, aby była wilgotna.</li>
	<li>Odwróć mysz i przytrzymaj ją w górze, tak aby rdzeń kręgowy był skierowany w dół. Ostrożnie odklej rdzeń kręgowy za pomocą zamkniętych, ząbkowanych kleszczy Graefe. Nie nacinając rdzenia kręgowego, ostrożnie odetnij pozostałe zwoje kręgowe, aby umożliwić wyniesienie rdzenia kręgowego w jednym nienaruszonym kawałku.</li>
	<li>Upewnij się, że rdzeń kręgowy znajduje się w RPMI-1640 i umieść go na lodzie w celu transportu do mikroskopu 2P.</li>
</ol>
2. Przygotowanie rdzenia kręgowego do obrazowania
<ol>
	<li>Osadzanie rdzenia kręgowego w agarozie
	<ol>
		<li>Izolowany rdzeń kręgowy należy przechowywać w schłodzonym RPMI-1640 na lodzie przed obrazowaniem.</li>
		<li>Odważyć agarozę (niska temperatura żelowania) i przygotować 5% roztwór w 5 ml 1x PBS. 5% roztwór agarozy należy podgrzewać w kuchence mikrofalowej przez 15 sekund w celu rozpuszczenia agarozy i pozostawić roztwór do ostygnięcia do temperatury 37 °C.</li>
		<li>Przygotuj rdzeń kręgowy, umieszczając go na arkuszu Parafilm stroną brzuszną skierowaną do góry.</li>
		<li>Odmierzyć pipetą około 5 ml 5% roztworu agarozy na brzuszną stronę rdzenia kręgowego. Pozwól agarozie zestalić się, schładzając do temperatury pokojowej. Pełne krzepnięcie trwa około 5 minut.</li>
		<li>Nałożyć cienką warstwę kleju tkankowego na kwadratowe szkiełko nakrywkowe o średnicy 22 mm.</li>
		<li>Odwróć osadzony rdzeń kręgowy, umieszczając brzuszną stronę na Parafilm. Strona grzbietowa będzie teraz skierowana do góry. Przyklej szkiełko nakrywkowe do strony grzbietowej i zanurz preparat rdzenia kręgowego/szkiełka nakrywkowego zatopiony w agarozie w RMPI, aby zestalić klej. Usuń nadmiar zestalonej agarozy za pomocą żyletki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Montaż rdzenia kręgowego na stoliku mikroskopu
	<ol>
		<li>Nałóż wazelinę na spód szkiełka nakrywkowego. Ustabilizuje to preparat podczas perfuzji.</li>
		<li>Umieść preparat rdzenia kręgowego w studzience obrazowej na stoliku mikroskopowym stroną brzuszną skierowaną do góry w kierunku obiektywu zanurzającego 25X. Wykonana na zamówienie studnia obrazowania ma około 20 mm głębokości, 50 mm długości i 50 mm średnicy.</li>
		<li>Obraz podczas superfuzji preparatu z podgrzaną (37 °C), natlenioną (95:5 tlen:dwutlenek węgla-karbogen) pożywką RPMI-1640 bez surowicy.
		<ol>
			<li>Podgrzej wstępnie media do 37 °C w łaźni wodnej i podłącz je do pompy rurowej, wkładając rurkę do butelki z mediami.</li>
			<li>Utrzymuj temperaturę medium na poziomie 37 °C za pomocą urządzenia grzewczego przy podłączeniu rurki do komory. Przepłucz media przez studnię z prędkością 3 ml/min za pomocą rurki podłączonej do pompy rurki (Rysunek 1B).</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Obrazowanie 2P brzusznego rdzenia kręgowego
<ol>
	<li>Konfiguracja mikroskopu
	<ol>
		<li>Uzyskuj obrazy z rdzenia kręgowego Thy1-eYFP za pomocą lasera Chameleon Ultra Ti: Sapphire dostrojonego do 900 nm. Osłabić moc lasera w próbce do <5%, aby zapewnić minimalną fototoksyczność16. Utrzymuj temperaturę poprzez perfuzję perfuzji tlenu RPMI-1640 na stałym poziomie 37 °C przy użyciu pojedynczej grzałki roztworu w linii, aby zapewnić stabilne obrazowanie i zapobiec dryfowaniu tkanek i uszkodzeniom komórek.</li>
		<li>Aby oddzielić sygnał fluorescencyjny eGFP i eYFP, należy umieścić szeregowo jednokrawędziowy dichroiczny rozdzielacz wiązki 520 nm i jednokrawędziowy dichroiczny 560 nm, aby rozdzielić emisję 2P na trzy kanały, celowo rozdzielając zieloną emisję w celu poprawy widoczności. 
		UWAGA: Kanały te są określane jako niebiesko-zielone (emisja <520 nm), zielono-żółte (520–560 nm) i czerwone (emisja >560 nm). Lampy fotopowielacza wykrywają emitowane światło w każdym kanale.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Lokalizowanie obszarów zainteresowania związanych z obrazowaniem
	<ol>
		<li>Używając okularu i źródła światła w jasnym polu, ustaw obiektyw zanurzeniowy na brzusznej krawędzi rdzenia kręgowego, aby ustawić punkt odniesienia.</li>
		<li>Upewnij się, że źródło światła otoczenia jest wyłączone i przełącz się na wzbudzenie 2P, otwierając migawkę lasera.</li>
		<li>Jeśli to możliwe, podczas przeszukiwania tkanek w poszukiwaniu obszarów zainteresowania należy użyć ustawienia niższej rozdzielczości, większej głośności bez zoomu cyfrowego i większej szybkości skanowania niż w przypadku uzyskiwania ostatecznych obrazów. Typowe ustawienia tego systemu podczas przeszukiwania tkanki w poszukiwaniu obszaru zainteresowania to: rozdzielczość: 256 pikseli; Objętość: X = 600 μm, Y = 600 μm, Z = 0-300 μm.</li>
		<li>Obserwuj aksony eYFP w pobliżu brzusznej krawędzi rdzenia kręgowego. Drugi sygnał harmoniczny z kolagenu (niebieski) będzie najjaśniejszy na krawędzi tkanki rdzenia kręgowego. Zlokalizuj aksony eYFP tuż grzbietowo do drugiego sygnału harmonicznej z kolagenu, a sygnał eYFP jest wizualizowany w kanale zielono-żółtym.</li>
		<li>Zlokalizuj miejsce przeszczepu w podłużnym środku preparatu rdzenia kręgowego14. W przypadku myszy 1 dzień po przeszczepie eGFP-NPC zlokalizuj miejsce przeszczepu, skupiając ścieżkę wiązki w płaszczyźnie z głęboko w tkance. Miejsce przeszczepu będzie się nieznacznie różnić u poszczególnych zwierząt, ale na ogół znajduje się ~200 μm od krawędzi brzusznej. Obserwuj skupiska eGFP-NPC w drogach istoty białej, bliżej krawędzi brzusznej i bocznej u myszy po 1 dniu po przeszczepie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pozyskiwanie ostatecznych obrazów
	<ol>
		<li>Uzyskaj rozdzielczość obrazu 512 pikseli; objętość: x = 270 μm, y = 212 μm i z = 100 μm za pomocą oprogramowania Slidebook 6. Kompiluj stosy z, uzyskując sekwencyjne płaszczyzny ogniskowych w krokach co 2,5 μm.</li>
		<li>Wykonaj skanowanie dwukierunkowe z odpowiednim przesunięciem przeplotu, aby zapewnić szybką kwantyfikację wszelkich migrujących obiektów w rdzeniu kręgowym. Upewnij się, że idealna szybkość akwizycji w celu określenia prędkości komórkowej w rdzeniu kręgowym wynosi około 1 klatki/sek. 
		UWAGA: Ustawienia obrazowania można zmienić zgodnie z indywidualnymi preferencjami użytkownika, takimi jak liczba klatek na sekundę, rozdzielczość obrazu i objętość obrazu. Uzyskanie większych objętości obrazu przy danej rozdzielczości będzie zazwyczaj trwało dłużej.</li>
		<li>Analizuj, przycinaj, wygładzaj i pseudokoloruj pliki obrazów Slidebook za pomocą oprogramowania do analizy obrazu, takiego jak Bitplane Imaris 7.7. Twórz końcowe filmy poklatkowe, łącząc kolejne objętości obrazowania za pomocą zautomatyzowanego procesu w Slidebook i Imaris.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Robinson, A. P., Harp, C. T., Noronha, A., Miller, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+%28EAE%29+model+of+MS%3A+utility+for+understanding+disease+pathophysiology+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Handb+Clin+Neurol%22%5BJournal%5D)">The experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) model of MS: utility for understanding disease pathophysiology and treatment.</a> Handb Clin Neurol. 122, 173-189 (2014).</li>
<li>Pluchino, S., Zanotti, L., Brini, E., Ferrari, S., Martino, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+and+repair+in+multiple+sclerosis%3A+the+role+of+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">Regeneration and repair in multiple sclerosis: the role of cell transplantation.</a> Neurosci Lett. 456 (3), 101-106 (2009).</li>
<li>Hatch, M. N., Schaumburg, C. S., Lane, T. E., Keirstead, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endogenous+remyelination+is+induced+by+transplant+rejection+in+a+viral+model+of+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">Endogenous remyelination is induced by transplant rejection in a viral model of multiple sclerosis.</a> J Neuroimmunol. 212 (1-2), 74-81 (2009).</li>
<li>Totoiu, M. O., Nistor, G. I., Lane, T. E., Keirstead, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remyelination%2C+axonal+sparing%2C+and+locomotor+recovery+following+transplantation+of+glial-committed+progenitor+cells+into+the+MHV+model+of+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Remyelination, axonal sparing, and locomotor recovery following transplantation of glial-committed progenitor cells into the MHV model of multiple sclerosis.</a> Exp Neurol. 187 (2), 254-265 (2004).</li>
<li>Tirotta, E., Carbajal, K. S., Schaumburg, C. S., Whitman, L., Lane, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+replacement+therapies+to+promote+remyelination+in+a+viral+model+of+demyelination%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">Cell replacement therapies to promote remyelination in a viral model of demyelination.</a> J Neuroimmunol. 224 (1-2), 101-107 (2010).</li>
<li>Greenberg, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+imaging+of+remyelination+of+spinal+cord+axons+by+engrafted+neural+precursor+cells+in+a+viral+model+of+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Two-photon imaging of remyelination of spinal cord axons by engrafted neural precursor cells in a viral model of multiple sclerosis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (22), E2349-E2355 (2014).</li>
<li>Whitman, L. M., Blanc, C. A., Schaumburg, C. S., Rowitch, D. H., Lane, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olig1+function+is+required+for+remyelination+potential+of+transplanted+neural+progenitor+cells+in+a+model+of+viral-induced+demyelination%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Olig1 function is required for remyelination potential of transplanted neural progenitor cells in a model of viral-induced demyelination.</a> Exp Neurol. 235 (1), 380-387 (2012).</li>
<li>Pluchino, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injection+of+adult+neurospheres+induces+recovery+in+a+chronic+model+of+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Injection of adult neurospheres induces recovery in a chronic model of multiple sclerosis.</a> Nature. 422 (6933), 688-694 (2003).</li>
<li>Weinger, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MHC+mismatch+results+in+neural+progenitor+cell+rejection+following+spinal+cord+transplantation+in+a+model+of+viral-induced+demyelination%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">MHC mismatch results in neural progenitor cell rejection following spinal cord transplantation in a model of viral-induced demyelination.</a> Stem Cells. 30 (11), 2584-2595 (2012).</li>
<li>Vogel, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+in+inflammatory+multiple+sclerosis+lesions+have+an+intermediate+activation+status%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Macrophages in inflammatory multiple sclerosis lesions have an intermediate activation status.</a> J Neuroinflammation. 10, 35(2013).</li>
<li>Coyle, P. K. Ch. 3. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCoyle%2C+PK+%22Clinical+Neuroimmunology%3A+Multiple+Sclerosis+and+Related+Disorders%22">Clinical Neuroimmunology: Multiple Sclerosis and Related Disorders</a>. Rizvi, S. A., Coyle, P. K. 3, Springer. 43-70 (2011).</li>
<li>McManus, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MCP-1%2C+MCP-2+and+MCP-3+expression+in+multiple+sclerosis+lesions%3A+an+immunohistochemical+and+in+situ+hybridization+study%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">MCP-1, MCP-2 and MCP-3 expression in multiple sclerosis lesions: an immunohistochemical and in situ hybridization study.</a> J Neuroimmunol. 86 (1), 20-29 (1998).</li>
<li>Calderon, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+CXCL12+%28SDF-1alpha%29+in+the+pathogenesis+of+multiple+sclerosis%3A+regulation+of+CXCL12+expression+in+astrocytes+by+soluble+myelin+basic+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">A role for CXCL12 (SDF-1alpha) in the pathogenesis of multiple sclerosis: regulation of CXCL12 expression in astrocytes by soluble myelin basic protein.</a> J Neuroimmunol. 177 (1-2), 27-39 (2006).</li>
<li>Carbajal, K. S., Weinger, J. G., Whitman, L. M., Schaumburg, C. S., Lane, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surgical+transplantation+of+mouse+neural+stem+cells+into+the+spinal+cords+of+mice+infected+with+neurotropic+mouse+hepatitis+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Surgical transplantation of mouse neural stem cells into the spinal cords of mice infected with neurotropic mouse hepatitis virus.</a> J Vis Exp. 53, e2834(2011).</li>
<li>Feng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).</li>
<li>Nguyen, Q. T., Callamaras, N., Hsieh, C., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+a+two-photon+microscope+for+video-rate+Ca%282%2B%29+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Construction of a two-photon microscope for video-rate Ca(2+) imaging.</a> Cell Calcium. 30 (6), 383-393 (2001).</li>
<li>Nikic, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reversible+form+of+axon+damage+in+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+and+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">A reversible form of axon damage in experimental autoimmune encephalomyelitis and multiple sclerosis.</a> Nat Med. 17 (4), 495-499 (2011).</li>
<li>Fenrich, K. K., Weber, P., Rougon, G., Debarbieux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implanting+glass+spinal+cord+windows+in+adult+mice+with+experimental+autoimmune+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Implanting glass spinal cord windows in adult mice with experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> J Vis Exp. 82, e50826(2013).</li>
<li>Farrar, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+in+vivo+imaging+in+the+mouse+spinal+cord+using+an+implanted+chamber%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Chronic in vivo imaging in the mouse spinal cord using an implanted chamber.</a> Nat Methods. 9 (3), 297-302 (2012).</li>
<li>Pakan, J. M., McDermott, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+to+investigate+radial+glia+cell+behavior+using+two-photon+time-lapse+microscopy+in+an+ex+vivo+model+of+spinal+cord+development%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neuroanat%22%5BJournal%5D)">A method to investigate radial glia cell behavior using two-photon time-lapse microscopy in an ex vivo model of spinal cord development.</a> Front Neuroanat. 8, 22(2014).</li>
<li>Fenrich, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+in+vivo+imaging+of+normal+and+pathological+mouse+spinal+cord+with+subcellular+resolution+using+implanted+glass+windows%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Long-term in vivo imaging of normal and pathological mouse spinal cord with subcellular resolution using implanted glass windows.</a> J Physiol. 590 (Pt 16), 3665-3675 (2012).</li>
<li>Germain, R. N., Robey, E. A., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+decade+of+imaging+cellular+motility+and+interaction+dynamics+in+the+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A decade of imaging cellular motility and interaction dynamics in the immune system.</a> Science. 336, 1676-1681 (2012).</li>
<li>Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+imaging+of+lymphocyte+motility+and+antigen+response+in+intact+lymph+node%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node.</a> Science. 296 (6089), 1869-1873 (2002).</li>
<li>Dzhagalov, I. L., Melichar, H. J., Ross, J. O., Herzmark, P., Robey, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+imaging+of+the+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cytom%22%5BJournal%5D)">Two-photon imaging of the immune system.</a> Curr Protoc Cytom. Chapter 12 (Unit12 26), (2012).</li>
<li>Matheu, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toll-like+receptor+4-activated+B+cells+out-compete+Toll-like+receptor+9-activated+B+cells+to+establish+peripheral+immunological+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Toll-like receptor 4-activated B cells out-compete Toll-like receptor 9-activated B cells to establish peripheral immunological tolerance.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (20), E1258-E1266 (2012).</li>
<li>Matheu, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+phases+of+CD8+T+cell+response+in+the+lung+following+H1N1+influenza+infection+and+sphingosine+1+phosphate+agonist+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Three phases of CD8 T cell response in the lung following H1N1 influenza infection and sphingosine 1 phosphate agonist therapy.</a> PLoS One. 8 (3), e58033(2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają sprzecznych interesów.

Obrazowanie 2P w czasie rzeczywistym nienaruszonej tkanki jest wymagane do zbadania kinetyki i interakcji NPC po przeszczepie do zdemielinizowanego rdzenia kręgowego myszy. Obrazowanie 2P w trybie przyżyciowym jest powszechnie stosowane do określania dynamiki komórkowej po grzbietowej stronie rdzenia kręgowego u żywych myszy i było wykorzystywane do badania demielinizacji grzbietowej w chorobie demielinizacyjnej17-19. Ponieważ jednak przeszczepione NPC migrują do brzusznej istoty białej, która leży zbyt głębok...

Mysie modele demielinizacji, w tym eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia (EAE) oraz wewnątrzczaszkowe zakażenie neuroadaptowanym wirusem zapalenia wątroby myszy (MHV), są doskonałymi narzędziami do badania szlaków molekularnych i interakcji komórkowych związanych z chorobą. Doprowadziły one do powstania i wsparły skuteczność terapii farmaceutycznych zatwierdzonych przez FDA, głównie ukierunkowanych na ustanie autoimmunizacji i stanu zapalnego1. Jednak gdy endogenna remielinizacja zakończy się niepowodzeniem, obecnie zatwierdzone terapie nie naprawiają skutecznie zmian demielinizacyjnych w ośrodkowym układzie nerwowym. Dlatego terapie skoncentrowane na naprawie na tym etapie choroby mają kluczowe znaczenie dla złagodzenia przewlekłych objawów i poprawy jakości życia. Ostatnio na pierwszy plan wysunęły się neuronalne komórki prekursorowe (NPC) jako potencjalna metoda terapii regeneracyjnej, która celuje w obszary zapalenia i demielinizacji. Kilka badań podkreśliło zdolność NPC do indukowania endogennej remielinizacji i bezpośredniego udziału w remielinizacji2-8. Ponieważ NPC biorą udział w bezpośredniej remielinizacji, konieczne jest zrozumienie ich kinetyki i interakcji z komórkami endogennymi po przeszczepie. Po przeszczepieniu NPC migrują brzusznie do obszarów uszkodzenia istoty białej, a następnie rostralnie i doogonowo względem miejsca przeszczepu5,9. Kinetyka migracji różni się w odpowiedzi na sygnały środowiskowe; NPC przeszczepieni do nieuszkodzonego rdzenia kręgowego mają większe prędkości niż NPC przeszczepieni do uszkodzonego rdzenia kręgowego6. Po okresie migracji przenoszone NPC namnażają się w dużym stopniu, w większym stopniu w uszkodzonym rdzeniu kręgowym niż w nienaruszonym rdzeniu kręgowym6. Wreszcie, większość NPC różnicuje się w oligodendrocyty i inicjuje bezpośrednią remielinizację4,6,9.
Zmiana zdemielinizowana jest złożona i może obejmować zróżnicowaną populację komórek na różnych etapach aktywacji. Na przykład aktywna zmiana w stwardnieniu rozsianym (SM) może obejmować znaczną populację aktywowanych limfocytów T, mikrogleju M1 i makrofagów M1, ale przewlekła cicha zmiana w stwardnieniu rozsianym może składać się głównie z reaktywnych astrocytów z niewielką liczbą komórek zapalnych10-13. Ze względu na różnorodność komórek efektorowych, obrazowanie dwufotonowe (2P) w mysich modelach demielinizacji jest niezwykle przydatnym narzędziem pomagającym zrozumieć lokalne interakcje komórkowe w obrębie zmiany. W stwardnieniu rozsianym i wielu szeroko stosowanych modelach badawczych stwardnienia rozsianego większość zmian znajduje się po brzusznej stronie rdzenia kręgowego, regionie niedostępnym do przyżyciowego obrazowania 2P ze względu na głębokość zmiany i wysoką zawartość lipidów w rdzeniu kręgowym. Aby obejść te problemy i zbadać interakcje komórka-komórka w obrębie zmian wzdłuż brzusznego rdzenia kręgowego, opracowaliśmy prosty preparat do obrazowania ex vivo 2P 6.
To badanie jest kontynuacją poprzedniej publikacji metod, która pokazała procedurę przeszczepiania NPC z ekspresją wzmocnionego białka zielonej fluorescencji (eGFP) do rdzenia kręgowego myszy po szczepie JHMV wywołanej demielinizacjąMHV 14. Pięciotygodniowe myszy są zakażone JHMV i przeszczepiane eGFP-NPC na poziomie klatki piersiowej 9 w 14 dniu po zakażeniu. Przedstawiony tutaj protokół zawiera szczegółowe instrukcje dotyczące ekstrakcji rdzenia kręgowego, przygotowania agarozy ex vivo i obrazowania przeszczepionych interakcji eGFP-NPC ze wzmocnionymi aksonami eksprymującymi żółte białka fluorescencyjne (eYFP). W tej procedurze wykorzystano myszy wykazujące ekspresję eYFP pod specyficznym dla neuronów promotorem Thy115. Tylko niektóre aksony wyrażają eYFP, co czyni go przydatnym do obrazowania pojedynczych aksonów. Tutaj pokazujemy rdzeń kręgowy usunięty po 7 dniach od przeszczepu; Jednak rdzeń kręgowy można pobrać w dowolnym momencie po przeszczepie. Podczas gdy pokazujemy interakcje NPC z uszkodzonymi aksonami, nasz protokół może być stosowany w połączeniu z genetycznymi markerami fluorescencyjnymi innych typów komórek do badania wielu interakcji komórkowych zachodzących w rdzeniu kręgowym myszy.

<table><tbody><tr><td>Isoflurane, USP</td><td>Piramal Critical Care, Inc</td><td>Nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>Drobne nożyczki</td><td>Fine Science Tools</td><td>14060-09</td><td>Ostre</td></tr><tr><td>ostrze skalpela #10</td><td>Fine Science Tools</td><td>10010-00</td><td></td></tr><tr><td>rękojeść skalpela</td><td>Fine Science Tools</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>Luer rongeurs</td><td>Fine Science Tools</td><td>16001-15</td><td></td></tr><tr><td>Graefe kleszcze</td><td>Fine Science Tools</td><td>11052-10</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki Vannas</td><td>Fine Science Tools</td><td>15615-08</td><td></td></tr><tr><td>ostrze skalpela #11</td><td>Fine Science Tools</td><td>10011-00</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Gibco</td><td>12-115F</td><td></td></tr><tr><td>agaroza, niska temperatura żelowania</td><td>Sigma</td><td>A9414-25G</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-374-12</td><td></td></tr><tr><td>Vetbond (klej tkankowy)</td><td>3M</td><td>1469SB</td><td></td></tr><tr><td>22 mm kwadratowe szkiełko nakrywkowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-547</td><td></td></tr><tr><td>25-krotny obiektyw do zanurzania, 1,1 NA</td><td>Nikon</td><td>CFI Apo LWD 25XW</td><td></td></tr><tr><td>Pojedynczy grzejnik liniowy</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0102</td><td></td></tr><tr><td>520 nm jednokrawędziowy rozdzielacz wiązki</td><td>Semrock</td><td>FF520-Di02-25x36</td><td></td></tr><tr><td>Jednokrawędziowy dichroiczny rozdzielacz wiązki Brightline 560 nm</td><td>Semrock</td><td>FF560-FDi01-25x36</td><td></td></tr><tr><td>Lampy fotopowielacza Brightline Pompa</td> rurowa o zmiennej prędkości <td>Hamamatsu</td><td>R928</td><td></td></tr><tr><td>C/L</td> Termometr cyfrowy <td>Masterflex</td><td>77122-22</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Comar Instruments</td><td>3501</td><td></td></tr><tr><td>Chameleon Ultra Ti:Szafirowy laser&nbsp;</td><td>Coherent</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Slidebook 6 oprogramowanie</td><td>3i</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Imaris 7.7 oprogramowanie</td><td>Bitplane</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

dwufotonowe obrazowanie dynamiki komórkowej w rdzeniu kręgowym myszy

Two-photon Imaging of Cellular Dynamics in the Mouse Spinal Cord

Mikroskopia dwufotonowa (2P) jest wykorzystywana do ujawnienia dynamiki komórkowej i interakcji głęboko w żywych, nienaruszonych tkankach. W tym artykule przedstawiono metodę obrazowania żywych komórek w mysim rdzeniu kręgowym. Technika ta jest wyjątkowo odpowiednia do analizy dynamiki neuronalnych komórek prekursorowych (NPC) po przeszczepie do rdzenia kręgowego ulegającego neurozapalnym zaburzeniom demielinizacyjnym. NPC migrują do miejsc uszkodzenia aksonów, namnażają się, różnicują w oligodendrocyty i uczestniczą w bezpośredniej remielinizacji. NPC są zatem obiecującą terapią leczniczą łagodzącą przewlekłe choroby demielinizacyjne. Ponieważ przeszczepione NPC migrują do uszkodzonych obszarów po brzusznej stronie rdzenia kręgowego, tradycyjne obrazowanie 2P w obrębie funkcji przyżyciowych jest niemożliwe, a przy użyciu metod barwienia histochemicznego dostępne były wcześniej tylko informacje na temat interakcji statycznych. Chociaż metoda ta została opracowana w celu zobrazowania przeszczepionych NPC w brzusznym rdzeniu kręgowym, można ją zastosować do licznych badań przeszczepionych i endogennych komórek w całym rdzeniu kręgowym. W tym artykule pokazujemy przygotowanie i obrazowanie rdzenia kręgowego ze wzmocnionymi aksonami wykazującymi ekspresję białka żółtej fluorescencji i przeszczepionymi NPC z ulepszoną ekspresją białka zielonej fluorescencji.

Chociaż protokół obrazowania wypreparowanego rdzenia kręgowego może być stosowany do wizualizacji dowolnej fluorescencji w obrębie rdzenia kręgowego, nasze reprezentatywne wyniki demonstrują interakcje eGFP-NPC z aksonami eYFP. Najpierw przedstawiamy preparat osadzonego brzusznego rdzenia kręgowego na Rysunku 1A. Następnie pokazujemy konfigurację mikroskopu 2P oraz jego kluczowe komponenty na Rysunku 1B. Rysunek 2 prezentuje fluorescencję eGFP i eYFP w pojedynczym stosie...

Nowy preparat ex vivo do obrazowania rdzenia kręgowego myszy. Protokół ten pozwala na obrazowanie dwufotonowe żywych interakcji komórkowych w całym rdzeniu kręgowym.

Dwufotonowe obrazowanie dynamiki komórkowej w rdzeniu kręgowym myszy

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for ...

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest obrazowanie w czasie rzeczywistym interakcji fluorescencyjnie znakowanych przeszczepionych neuralnych komórek prekursorowych (NPC) z fluorescencyjnymi aksonami w rdzeniu kręgowym myszy. Osiąga się to poprzez ostrożne usunięcie rdzenia kręgowego z myszy, którym przeszczepiono NPC, i zatopienie go w 5% aros, a następnie przymocowanie do szkiełka podstawowego. Orientację rdzenia kręgowego można zmieniać, aby obserwować fluorescencję w dowolnym obszarze rdzenia kręgowego.W drugim kroku preparat rdzenia kręgowego umieszcza się na platformie do obrazowania dwufotonowego w celu obrazowania żywych NPC, podczas gdy są one perfundowane ciepłym, natlenionym medium RPMI przez okres do 10 godzin. Do rozdzielenia emisji YFP i GFP używa się odpowiedniego dichroicznego dzielnika wiązki z pojedynczą krawędzią. W rezultacie obrazowanie dwufotonowe pozwala na wizualizację w czasie rzeczywistym oddziaływań NPC wykazujących ekspresję GFP z aksonami wykazującymi ekspresję YFP w uszkodzonym rdzeniu kręgowym.Metoda ta może pomóc w uzyskaniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie neurodegeneracji, takie jak: jakie sygnały molekularne i komórkowe są niezbędne

two-photon-imaging-of-cellular-dynamics-in-the-mouse-spinal-cord

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Dwufotonowe obrazowano dynamiki komórkowej w rdzeniu kręgowym myszy

Opisano małoinwazyjny protokół stabilizacji kręgosłupa myszy oraz wykonywania powtarzalnego obrazowania rdzenia kręgowego in vivo z wykorzystaniem mikroskopii dwufotonowej. Metoda ta łączy urządzenie do stabilizacji kręgosłupa z reżimem anestezjologicznym w celu zminimalizowania ruchów wywołanych oddychaniem i uzyskania surowych danych obrazowych, które nie wymagają wyrównania ani innego przetwarzania końcowego.

Obrazowanie in vivo rdzenia kręgowego myszy z wykorzystaniem mikroskopii dwufotonowej

Źródło: Maruoka, H., et. al. Jednoczesne obrazowanie dynamiki mikrogleju i aktywności neuronalnej u obudzonych myszy. J. Vis. Exp. (2022) Ten film przedstawia procedurę mikroskopii dwufotonowej do obrazowania aktywności neuronalnej i dynamiki mikrogleju u obudzonej myszy podczas stymulacji wzrokowej, podkreślając stany przejściowe wapnia i interakcje komórkowe.

Jednoczesne obrazowanie dynamiki mikrogleju i aktywności neuronalnej u wybudzonej myszy

Obrazowanie poklatkowe u żywego zwierzęcia dostarcza cennych informacji na temat reorganizacji strukturalnej w nienaruszonym mózgu. Tutaj wprowadzamy preparat z rozcieńczoną czaszką, który umożliwia przezczaszkowe obrazowanie znakowanych fluorescencyjnie struktur synaptycznych w żywej korze myszy za pomocą mikroskopii dwufotonowej.

Dwufotonowe obrazowanie in vivo kolców dendrytycznych w korze myszy przy użyciu preparatu z rozrzedzoną czaszką

W tym filmie opisujemy procedurę wszczepienia przewlekłej komory obrazowania optycznego do grzbietowego rdzenia kręgowego żywej myszy. Komora, zabieg chirurgiczny i przewlekłe obrazowanie są oceniane i demonstrowane.

Procedura wszczepienia komory rdzeniowej do podłużnego obrazowania in vivo rdzenia kręgowego myszy

Dwufotonowe obrazowanie przyżyciowe może być użyte do zbadania interakcji między różnymi typami komórek w rdzeniu kręgowym w ich naturalnym środowisku tkankowym u chimerycznego zwierzęcia szpiku kostnego z urazowym uszkodzeniem rdzenia kręgowego w kolumnie grzbietowej.

Przyżyciowe obrazowanie interakcji aksonalnych z mikroglejem i makrofagami w urazie zmiażdżenia kolumny grzbietowej myszy

Ten film pokazuje procedurę kraniotomii, która umożliwia przewlekłe obrazowanie neuronów w korze zaśledziony myszy za pomocą mikroskopii dwufotonowej in vivo w linii transgenicznej Thy1-GFP. Podejście to łączy się z wstrzyknięciem do grzbietowego hipokampa wirusa związanego z ekspresją mCherry. Techniki te pozwalają na długoterminowe monitorowanie plastyczności strukturalnej zależnej od doświadczenia w RSC.

Jednoczesne dwufotonowe obrazowanie in vivo wejść synaptycznych i celów postsynaptycznych w korze zaśledzinowej myszy

Wprowadzamy metodę obrazowania in vivo przy użyciu dwóch różnych barwników fluorescencyjnych do śledzenia dynamicznych zmian naczyniowych kręgosłupa po kontuzji rdzenia kręgowego u dorosłych szczurów Sprague-Dawley.

Badanie in vivo Dwukolorowa metoda obrazowania dynamiki naczyń krwionośnych po kontuzyjnym urazie rdzenia kręgowego

Ten protokół opisuje wszczepienie szklanego okienka do rdzenia kręgowego myszy w celu ułatwienia wizualizacji za pomocą mikroskopii przyżyciowej.

Laminektomia i implantacja okienka rdzenia kręgowego u myszy

Mikroskopia stymulowanego rozpraszania Ramana (SRS) umożliwia bezznacznikowe obrazowanie biomolekuł na podstawie ich wewnętrznej wibracji określonych wiązań chemicznych. W tym protokole opisano instrumentalną konfigurację zintegrowanego mikroskopu SRS i dwufotonowego mikroskopu fluorescencyjnego w celu wizualizacji struktur komórkowych w rdzeniu kręgowym żywych myszy.

In vivo (in vivo) Obrazowanie tkanek biologicznych za pomocą połączonej mikroskopii fluorescencji dwufotonowej i wymuszonego rozpraszania Ramana

Tutaj opisujemy protokół łączący wstrzyknięcie wirusa związanego z adenowirusem z implantacją okna czaszkowego w celu jednoczesnego obrazowania dynamiki mikrogleju i aktywności neuronalnej u obudzonych myszy.

Jednoczesne obrazowanie dynamiki mikrogleju i aktywności neuronalnej u obudzonych myszy

Poznaj metodę dwufotonowego obrazowania komórek prekursorowych nerwowych w rdzeniu kręgowym myszy. Technika umożliwia obserwację interakcji komórek z aksonami w czasie rzeczywistym.

Dwufotonowe obrazowanie dynamiki komórkowej w rdzeniu kręgowym myszy

Przeglądaj więcej filmów