Name: Przygotowanie zawiesin jednokomórkowych do analizy cytofluorymetrycznej z różnych obszarów skóry myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 58 s
Description: Naucz się przygotowywać zawiesiny jednokomórkowe z różnych obszarów skóry myszy do analizy cytofluorymetrycznej populacji komórek odpornościowych. Ta metoda zachowuje markery powierzchniowe komórek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty z Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (AIRC, IG14593, MFAG13235), Fondazione Cariplo (Grant 2010-0678 i NANOVAC) oraz Fondazione Regionale per la Ricerca Biomedica.

Zatwierdzenie badania: Protokoły eksperymentalne zostały zatwierdzone przez włoskie Ministerstwo Zdrowia (Rzym, Włochy) zgodnie z Decreto legislativo 27 gennaio 1992, n. 116 "Attuazione della Direttiva n. 86/609/CEE in materia di protezione degli animali utilizzati a fini sperimentali o ad altri fini scientifici."
1. Pobieranie próbek skóry
<ol>
	<li>Poddaj mysz eutanazji przez zwichnięcie szyjki macicy.</li>
	<li>ucho:
	<ol>
		<li>Wytnij bezwłosą część uszu myszy.</li>
		<li>Oddziel stronę grzbietową i brzuszną, rozsuwając je kleszczami. Usuń wszelkie pozostałe chrząstki, delikatnie zeskrobując wewnętrzną część uszu kleszczami.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Skóra tułowia:
	<ol>
		<li>Ogol całą skórę zwierzęcia zarówno elektryczną maszynką do golenia, jak i delikatnym balsamem do depilacji.</li>
		<li>Odetnij żądaną próbkę skóry (od 2cm2 do całej skóry zwierzęcia).
		<ol>
			<li>Jeśli odcinasz całą grzbietową i brzuszną skórę myszy, wykonaj pionowe nacięcie na środku pleców myszy, a następnie przetnij wzdłuż granic ogolonych obszarów wokół ciała myszy.</li>
			<li>Delikatnie oddziel skórę od otrzewnej i mięśni grzbietu, trzymając próbkę skóry nieruchomo kleszczami, jednocześnie oddzielając próbkę skóry zamkniętymi zaokrąglonymi końcówkami nożyczek chirurgicznych lub skalpela.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Przygotować płytkę do hodowli komórkowej o średnicy 100 mm zawierającą 10 ml lodowatego PBS.</li>
		<li>Usunąć podskórny tłuszcz, zanurzając próbkę skóry w PBS w płytce przygotowanej w kroku 1.3.3 i zeskrobując próbkę skóry kleszczami.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>ogon:
	<ol>
		<li>Odetnij ogon myszy.</li>
		<li>Wykonaj pionowe cięcie na ogonie nożyczkami chirurgicznymi lub skalpelem chirurgicznym, zaczynając od podstawy ogona i sięgając do czubka ogona.</li>
		<li>Użyj kleszczy, aby oderwać skórę od ogona. Chwyć krawędź nacięcia u podstawy ogona i delikatnie pociągnij w kierunku końcówki, trzymając ciało ogona kleszczami.</li>
		<li>Usuń nadmiar tłuszczu, delikatnie zeskrobując próbkę skóry.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Podnóżek
	<ol>
		<li>Wytnij całą stopę myszy nożyczkami chirurgicznymi. Unikanie cięcia owłosionej skóry.</li>
		<li>Przetnij skórę stopy wzdłuż od kostki do początku palców.</li>
		<li>Chwyć kości skokowe kleszczami lub ręką, chwytając skórę kleszczami i pociągnij skórę w kierunku palców, tak jakby zdejmował rękawiczkę.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Trawienie
<ol>
	<li>Przygotuj koktajl wytrawiający z roztworu podstawowego (przygotowanego zgodnie z wykazem materiałów) według następującego przepisu: Mieszanka enzymów (specyfikacja znajduje się w wykazie materiałów) 300 μg/ml, DNAse1 50 U/ml. Rozcieńczyć w RPMI 5% FBS.</li>
	<li>Pokrój próbki skóry nożyczkami na małe kawałki na szalce Petriego o średnicy 35 mm z 2 ml koktajlu trawiennego (w przypadku skóry tułowia: 2 ml koktajlu trawiącego na każde 2 cm2 skóry, łącznie do 3 ml).</li>
	<li>Inkubować w temperaturze 37 °C przez 90 minut. Podczas inkubacji delikatnie wstrząsnąć szalką Petriego 1-2 razy.</li>
	<li>Wylać strawione próbki skóry na sitko o średnicy 70 μm na płytce Petriego o średnicy 66 mm zawierającej 1 ml RPMI1640 5% FBS.</li>
	<li>Umyj sitko 5 ml RPMI 1640 5% FBS.</li>
	<li>Przecisnąć próbkę przez sitko do komórek za pomocą tłoka strzykawki.</li>
	<li>Tłok do płukania, szalkę Petriego i sitko z 20 ml RPMI1640 5% FBS, przenieść do probówki o pojemności 50 ml.</li>
</ol>
3. Przeciwciała i etykietowanie
<ol>
	<li>Otrzymaną zawiesinę przemyć dwukrotnie 5 ml PBS 1% FBS (lub BSA).</li>
	<li>Oznacz otrzymaną zawiesinę komórkową pożądanymi przeciwciałami.
	<ol>
		<li>Zawiesić próbki w 100 μl/próbkę mieszaniny zawierającej 2 μg/ml aCD16/CD32 (klon 2,4G2) rozcieńczonej w PBS 1% FBS.</li>
		<li>Inkubować przez 15 minut w temperaturze 4 °C w celu zablokowania nieswoistego wiązania pożądanych przeciwciał poprzez receptory Fc.</li>
		<li>Dodać przeciwciała wskazane w tabeli 1.
		<ol>
			<li>Przygotować mieszaninę rozcieńczającą pożądane przeciwciała w 100 μl/próbkę PBS 1% FBS w stężeniu 4 μg/ml.</li>
			<li>Dodać 100 μl mieszaniny przygotowanej w kroku 3.2.3.1 do każdej próbki, tak aby w probówce znajdowała się objętość 200 μl mieszaniny przeciwciał o końcowym stężeniu 2 μg/ml.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Inkubować przez 30 minut w temperaturze 4 °C i przykryć światłem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przemyć 1 ml PBS 1% FBS, odwirować przez 5 minut przy 400 x g, odrzucić supernatant i ponownie zawiesić w 300 μl PBS 1% FBS.</li>
	<li>Dodać DAPI w końcowym stężeniu 2 μg/ml i inkubować w temperaturze 4 °C, chronić przed światłem przez 10 minut.</li>
	<li>Przeanalizować próbki uzyskane za pomocą FACS.
	<ol>
		<li>Aby wyizolować leukocyty, użyj następującej strategii bramkowania:
		<ol>
			<li>Najpierw wyeliminuj wszelkie martwe komórki poprzez bramkowanie na populacji DAPI-.</li>
			<li>Wybierz podkoszulki na wykresie FSC-A vs. FSC W, jak pokazano na rysunku 1.</li>
			<li>Bramka komórek na podstawie wielkości i ziarnistości typowych dla leukocytów będących przedmiotem zainteresowania.</li>
			<li>Wybierz komórki CD45+ na wykresie FSC-A CD45, jak pokazano na rysunku 1.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Rozróżnij różne populacje leukocytów na podstawie ekspresji markerów powierzchniowych w następujący sposób:
		<ol>
			<li>Zidentyfikuj DC jako komórki CD11c+ MHC II+. Można je później przeanalizować pod kątem ekspresji CD207 w celu odróżnienia komórek Langerhansa i skórnych DC CD207 + od CD207 - skórnych DC.</li>
			<li>Zidentyfikuj makrofagi jako komórki CD64 + F4 / 80 +.</li>
			<li>Zidentyfikuj limfocyty B jako komórki MHCII + CD19 +.</li>
			<li>Zidentyfikuj limfocyty T jako komórki CD8 + lub CD4 +.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Streilein, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circuits+and+signals+of+the+skin-associated+lymphoid+tissues+%28SALT%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Circuits and signals of the skin-associated lymphoid tissues (SALT).</a> Journal of Investigative Dermatology. 85 (1 Suppl), 10s-13s (1985).</li>
<li>Tay, S. S., Roediger, B., Tong, P. L., Tikoo, S., Weninger, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Skin-Resident+Immune+Network%5BTitle%5D)+AND+%22Current+dermatology+reports%22%5BJournal%5D)">The Skin-Resident Immune Network.</a> Current dermatology reports. 3, 13-22 (2014).</li>
<li>Shen, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptive+immunity+to+murine+skin+commensals%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Adaptive immunity to murine skin commensals.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (29), E2977-E2986 (2014).</li>
<li>Broggi, A., Zanoni, I., Granucci, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Migratory+conventional+dendritic+cells+in+the+induction+of+peripheral+T+cell+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+leukocyte+biology%22%5BJournal%5D)">Migratory conventional dendritic cells in the induction of peripheral T cell tolerance.</a> Journal of leukocyte biology. 94 (5), 903-911 (2013).</li>
<li>Pan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DCs+metabolize+sunlight-induced+vitamin+D3+to%27program%27T+cell+attraction+to+the+epidermal+chemokine+CCL27%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">DCs metabolize sunlight-induced vitamin D3 to'program'T cell attraction to the epidermal chemokine CCL27.</a> Nature Immunology. 8 (3), 285-293 (2007).</li>
<li>Vitali, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Migratory%2C+and+not+lymphoid-resident%2C+dendritic+cells+maintain+peripheral+self-tolerance+and+prevent+autoimmunity+via+induction+of+iTreg+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Migratory, and not lymphoid-resident, dendritic cells maintain peripheral self-tolerance and prevent autoimmunity via induction of iTreg cells.</a> Blood. 120 (6), 1237-1245 (2012).</li>
<li>Azukizawa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Steady+state+migratory+RelB%2B+langerin%2B+dermal+dendritic+cells+mediate+peripheral+induction+of+antigen-specific+CD4%2B+CD25%2B+Foxp3%2B+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22European+journal+of+immunology%22%5BJournal%5D)">Steady state migratory RelB+ langerin+ dermal dendritic cells mediate peripheral induction of antigen-specific CD4+ CD25+ Foxp3+ regulatory T cells.</a> European journal of immunology. 41 (5), 1420-1434 (2011).</li>
<li>Idoyaga, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specialized+role+of+migratory+dendritic+cells+in+peripheral+tolerance+induction%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+clinical+investigation%22%5BJournal%5D)">Specialized role of migratory dendritic cells in peripheral tolerance induction.</a> The Journal of clinical investigation. 123 (2), 844-854 (2013).</li>
<li>Boyman, O., Conrad, C., Tonel, G., Gilliet, M., Nestle, F. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pathogenic+role+of+tissue-resident+immune+cells+in+psoriasis%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+immunology%22%5BJournal%5D)">The pathogenic role of tissue-resident immune cells in psoriasis.</a> Trends in immunology. 28 (2), 51-57 (2007).</li>
<li>Di Meglio, P., Perera, G. K., Nestle, F. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+multitasking+organ%3A+recent+insights+into+skin+immune+function%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The multitasking organ: recent insights into skin immune function.</a> Immunity. 35 (6), 857-869 (2011).</li>
<li>Rosenblum, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Response+to+self+antigen+imprints+regulatory+memory+in+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Response to self antigen imprints regulatory memory in tissues.</a> Nature. 480 (7378), 538-542 (2011).</li>
<li>Rosenblum, M. D., Truong, H. A., Abbas, A. K., Gratz, I. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((177%3A+Maintenance+of+memory+regulatory+T+cells+in+peripheral+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine%22%5BJournal%5D)">177: Maintenance of memory regulatory T cells in peripheral tissues.</a> Cytokine. 63 (3), 284-285 (2013).</li>
<li>Kim, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TSLP+elicits+IL-33-independent+innate+lymphoid+cell+responses+to+promote+skin+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Science+translational+medicine%22%5BJournal%5D)">TSLP elicits IL-33-independent innate lymphoid cell responses to promote skin inflammation.</a> Science translational medicine. 5 (170), (2013).</li>
<li>Gopinathan, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+skin+structure%3A+scratching+the+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+drug+delivery+reviews%22%5BJournal%5D)">New insights into skin structure: scratching the surface.</a> Advanced drug delivery reviews. 54 (Suppl 1), S3-S17 (2002).</li>
<li>Sandrine, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD207%2B+CD103%2B+dermal+dendritic+cells+cross-present+keratinocyte-derived+antigens+irrespective+of+the+presence+of+Langerhans+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">CD207+ CD103+ dermal dendritic cells cross-present keratinocyte-derived antigens irrespective of the presence of Langerhans cells.</a> The Journal of Experimental Medicine. 207 (1), 189-206 (2010).</li>
<li>Bernard, M., Samira, T., Sandrine, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origins+and+functions+of+dendritic+cells+and+macrophages+in+the+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">The origins and functions of dendritic cells and macrophages in the skin.</a> Nature Reviews Immunology. 14 (6), 417-428 (2014).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Opisaliśmy metodę przygotowania zawiesin jednokomórkowych z różnych regionów skóry myszy. Przyjęta przez nas metoda trawienia nie tylko daje wysokie plony, ale także zachowuje ekspresję markerów powierzchniowych, co ma fundamentalne znaczenie dla późniejszej analizy FACS.
Zastosowanie koktajlu kolagenazy I i II oraz termolizyny gwarantuje minimalne różnice w aktywności enzymatycznej między partiami, dzięki czemu metoda ta jest wysoce powtarzalna. Inne opublikowane metody opierają się na różnyc...

Skóra jest jednym z największych organów ciała, a jej duża powierzchnia jest stale wystawiona na działanie środowiska zewnętrznego. Dlatego skóra musi chronić organizm przed potencjalnymi zagrożeniami, aby utrzymać homeostazę, zarówno za pomocą środków fizycznych, jak i poprzez aktywną ochronę przed potencjalnym wnikaniem patogenu. Podobnie jak błona śluzowa jelit i płuc, skóra jest domem dla różnych komórek odpornościowych, które w sposób ciągły wchodzą w interakcje z nabłonkiem w celu utrzymania nadzoru immunologicznego. Ten złożony system, który obejmuje zarówno komórki odpornościowe, jak i nieimmunologiczne skóry, jest znany od początków immunologii, kiedy to w 1978 roku po raz pierwszy ukuto termin "tkanka limfatyczna związana ze skórą" (SALT) 1 w celu opisania takiej złożoności. 
Duża liczba komórek odpornościowych znajdujących się w skórze pomaga organizmowi nie tylko zwalczać potencjalne inwazje, ale także koordynować gojenie się ran i utrzymać tolerancję na antygeny własne i mikrobiotę skóry 2,3. 
Wśród komórek odpornościowych rezydujących w skórze, komórki dendrytyczne (DC) odgrywają kluczową rolę w kształtowaniu odpowiedzi immunologicznej i utrzymaniu homeostazy 4. Skórne DC i komórki Langerhansa łatwo reagują na inwazje patogenów, a po migracji do węzłów chłonnych aktywują limfocyty T i indukują ekspresję receptorów naprowadzających skórę na nowo wytworzonych efektorowych limfocytach T 5. DC odgrywają również fundamentalną rolę w regulacji homeostazy skóry. DC migrujące ze skóry właściwej do węzłów chłonnych w warunkach homeostazy transportują antygeny sekwestrowane przez skórę w celu wywołania tolerancji limfocytów T, głównie poprzez różnicowanie limfocytów T regulatorowych (Treg) specyficznych dla antygenów skóry 6-8. 
T limfocyty T reprezentują najliczniejszą populację komórek odpornościowych w skórze. Nie tylko przenikają one do skóry podczas infekcji, ale także stanowią stabilną populację wśród limfocytów rezydujących w skórze 9,10. Zarówno limfocyty T pamięci rezydentnej CD8 +, jak i CD4 + znajdują się w skórze i po zakażeniu mogą reagować na długo przed rekrutacją efektorowych limfocytów T z krwi. W skórze znajduje się również populacja rezydujących w tkankach limfocytów Treg zdolnych do utrzymania tolerancji na antygeny skórne i homeostazę tkanek. Komórki te są szybko i silnie aktywowane po ekspozycji na pokrewny im antygen i dlatego zostały zdefiniowane jako limfocyty pamięci 11,12. 
Wraz z DC i limfocytami T, wiele wrodzonych komórek odpornościowych, takich jak komórki NK, limfocyty T gamma delta, ILC grupy 2 13, komórki tuczne i makrofagi, zasiedlają skórę i przyczyniają się do ochrony gospodarza. Aby przeanalizować tak złożone środowisko, konieczne jest uzyskanie zawiesin jednokomórkowych z próbek skóry z wysoką wydajnością, przy jednoczesnym zachowaniu ekspresji markerów powierzchniowych do analizy cytofluorymetrycznej przepływowej lub sortowania. 
Mysia skóra przedstawia zewnętrzną warstwę naskórka, składającą się głównie z keratynocytów, komórek Langerhansa i dendrytycznych komórek T naskórka; oraz warstwę skórną pod spodem. W skórze właściwej znajduje się większość komórek odpornościowych i jest wytwarzana przez macierz zewnątrzkomórkową, w której najliczniej występują włókna kolagenowe, zwłaszcza kolagen-I i kolagen-IV. W przeciwieństwie do ludzkiej skóry, skóra myszy jest pokryta futrem, a tym samym bardziej wypełniona mieszkami włosowymi. Jest również znacznie cieńszy niż ludzka skóra i zawiera warstwę mięśniową, panniculus carnosus, która wspomaga gojenie się ran 14. Te cechy utrudniają skuteczne przerwanie siatki kolagenowej skóry właściwej w celu wydostania komórek odpornościowych.
W tym artykule przedstawiamy odpowiednią metodę trawienia macierzy zewnątrzkomórkowej, która opiera się na koktajlu wysokiej czystości kolagenazy 1 i 2 oraz termolizyny. Ponadto, ponieważ analiza skóry z różnych regionów wymaga różnych procedur eksperymentalnych, pokażemy różne metody skutecznego pozyskiwania próbek skóry z poduszki stopy, ogona, ucha i tułowia. Następnie oznaczymy próbki w celu oceny obecności makrofagów DC (MHCII + CD11c + CD45 +), makrofagów (CD11b + F4 / 80 + CD45 +), limfocytów T CD8 + i CD4 +.

<table><tbody><tr><td colspan="4"><silne>odczynniki</td></tr><tr><td>Uzupełnione RPMI 1640 medium&nbsp;</td><td></td><td></td><td>RPMI1640 uzupełniony w/ L-glu, pen-strep bez beta merkapto etanolu</td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Liberase TM (Enzyme Mix)</td><td>Roche</td><td>5401119001</td><td>zawiesiny [2.5&nbsp; mg/ml] w dH2O; Przechowuj podwielokrotności na poziomie -20&nbsp; &deg; C</td></tr><tr><td>Dnase I</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>Ponowne zawieszenie D4263-1VL</td><td>w RPMI 1640 bez surowicy [1,000&nbsp; U/ml]</td></tr><tr><td colspan="4">Materials</td></tr><tr><td>Nożyczki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>chirurgiczne Kleszcze</td><td></td><td></td><td></td>chirurgiczne</tr><tr><td>Skalpel</td><td></td><td></td><td></td>chirurgiczny</tr><tr><td>35 mm Szalki</td><td></td><td></td><td></td>Petriego</tr><tr><td>66 mm Szalki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Petriego 100 mm Szalki</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr>Petriego<td>70 &mikro; m Sitka komórkowe</td><td>BD</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Koktajl trawienny</mocny></td><td></td><td></td><td>Rozcieńczony w RPMI 5%</td></tr><tr><td>FBS LIberase TM</td><td></td><td></td><td>300 &micro; g/ml</td></tr><tr><td>DNAse1</td><td></td><td></td><td>50 U/ml</td></tr><tr><td colspan="4">Przeciwciała</td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>klon</td><td>Label</td></tr><tr><td>aCD45.2</td><td></td><td>104</td><td>PE-Cy5.5</td></tr><tr><td>aCD11c</td><td></td><td>N418</td><td>PE-Cy7</td></tr><tr><td>CD11b</td><td></td><td>M1/70</td><td>FITC</td></tr><tr><td>F4/80</td><td></td><td>A 3-1</td><td>APC-CY7</td></tr><tr><td>aCD4</td><td></td><td>Gk1.5</td><td>APC-Cy7</td></tr><tr><td>aCD8</td><td></td><td>53-6.7</td><td>PE</td></tr><tr><td>aCD64</td><td></td><td>X54-5/7.1</td><td>PE-CY7</td></tr><tr><td>aCD207</td><td></td><td>4C7</td><td>APC</td></tr></tbody></table>

przygotowanie zawiesin jednokomórkowych do analizy cytofluorymetrycznej z różnych obszarów skóry myszy

Preparation of Single-cell Suspensions for Cytofluorimetric Analysis from Different Mouse Skin Regions

Skóra jest organem barierowym, który oddziałuje ze środowiskiem zewnętrznym. Będąc stale narażonym na potencjalną inwazję drobnoustrojów, skóra właściwa i naskórek są domem dla różnych komórek odpornościowych zarówno w stanach homeostatycznych, jak i zapalnych. Narzędzia do uwalniania komórek skóry do analiz cytofluorymetrycznych są zatem bardzo przydatne w celu badania złożonej sieci komórek odpornościowych znajdujących się w skórze i ich odpowiedzi na bodźce mikrobiologiczne. W tym miejscu opisujemy skuteczną metodologię trawienia skóry myszy w celu szybkiego i skutecznego uzyskania zawiesin jednokomórkowych. Protokół ten pozwala na utrzymanie maksymalnej żywotności komórek bez uszczerbku dla powierzchniowej ekspresji antygenu. Opisujemy również, jak pobierać i trawić próbki skóry z różnych miejsc anatomicznych, takich jak ucho, tułów, ogon i poduszka stopy. Otrzymane zawiesiny są następnie barwione i analizowane za pomocą cytometrii przepływowej w celu rozróżnienia różnych populacji leukocytów.

Skórę z różnych regionów ciała trawiono zgodnie z opisanym protokołem i barwiono wskazanymi przeciwciałami. Strategia bramkowania przedstawiona jest na Rysunku 1. W pierwszej kolejności wybrano żywe komórki (komórki DAPI⁻), następnie wyznaczono bramkę dla singletów (FSC-A vs. FSC-W) oraz komórek o morfologii limfocytów (FSC-A vs. SSC-A). W określonych przypadkach wybrano komórki CD45+ pochodzenia krwiotwórczego.
<p class="jove_content" fo:keep-together.with...

Skóra jest domem dla złożonej sieci komórek odpornościowych. Opisujemy skuteczną metodologię trawienia skóry myszy z różnych części ciała zwierzęcia w celu uzyskania zawiesiny jednokomórkowej i analizy różnych populacji leukocytów znajdujących się w skórze za pomocą cytometrii przepływowej.

Przygotowanie zawiesin jednokomórkowych do analizy cytofluorymetrycznej z różnych obszarów skóry myszy

The skin is a barrier organ that interacts with the external environment. Being continuously exposed to potential microbial invasion, the dermis and ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest przygotowanie zawiesiny pojedynczych komórek ze skóry myszy w celu identyfikacji różnych populacji rezydentnych komórek odpornościowych za pomocą analizy cytofluorymetrycznej oraz ich wyizolowania. Dzięki zastosowaniu tej techniki badacze mogą w łatwy sposób trawić próbki z różnych obszarów skóry myszy bez uszkadzania interesujących ich markerów powierzchniowych komórek odpornościowych.Aby pobrać próbki skóry z ucha myszy, odetnij unbezwłosione części małżowin usznych, a następnie za pomocą pęsety rozdziel strony grzbietową i brzuszną narządów. Następnie delikatnie zeskrob wnętrze ucha, aby usunąć pozostałości chrząstki. W celu pobrania większych fragmentów skóry, ogól zwierzę maszynką do strzyżenia, a następnie zastosuj lotion depilacyjny.Po kilku minutach należy usunąć lotion i wykonać nacięcie pionowe na środku grzbietu myszy, kontynuując cięcie wzdłuż krawędzi obszarów wygolonych wokół ciała myszy. Używając pęsety do unieruchomienia skóry i oddzielając próbkę za pomocą zamkniętych, zaokrąglonych końcówek nożyczek chirurgicznych lub skalpela, należy delikatnie oddzielić skórę od otrzewnej i mięśni grzbietu. Następnie skórę zanurza się w 100mm płytce do hodowli komórek zawierającej 10ml lodowatego PBS i za pomocą pęsety zdrapuje tkankę tłuszczową podskórną.Aby pobrać próbkę skóry z ogona, należy odciąć ogon, a następnie za pomocą nożyczek chirurgicznych wykonać nacięcie pionowe od nasady aż do samego końca ogona. Używając pęsety, należy uchwycić krawędź nacięcia u nasady ogona, a następnie, trzymając korpus ogona drugą pęsetą, delikatnie odciągnąć skórę w stronę końca ogona. Nadmiar tkanki tłuszczowej należy usunąć poprzez delikatne zeskrobanie próbki skóry.Odcinamy stopę myszy, a następnie, aby uzyskać próbkę skóry z opuszki stopy, używamy nożyczek chirurgicznych do nacięcia skóry stopy wzdłuż, od kostki do początku palców, dbając o to, aby nie przeciąć włosów. Następnie chwytamy kości kostki pęsetą, jednocześnie trzymając skórę drugą pęsetą i odciągamy skórę w stronę palców, podobnie jak podczas zdejmowania rękawiczki. Aby oznakować komórki skóry, kolejno każdą próbkę tkanki przenosimy do 35 milimetrowej szalki Petriego zawierającej 2 mililitrów świeżo przygotowanego koktajlu trawiennego.Za pomocą nożyczek posiekaj próbkę na małe kawałki i inkubuj fragmenty tkanki w temperaturze 37 °C przez 90 minut, delikatnie potrząsając naczyniem raz lub dwa razy w trakcie inkubacji. Następnie przelej strawioną tkankę skórną przez sitko komórkowe o gęstości 70 µm umieszczone w 66 mm szalce Petriego zawierającej 1 mL pożywki RPMI 1640 uzupełnionej o FBS na każdą szalkę. Przepłucz sitko 5 mL świeżej pożywki, a następnie za pomocą tłoka strzykawki przeciśnij próbki przez siatkę sitka.Przepłucz tłok, naczynie i sito 20 mililitrami świeżej pożywki, a następnie przenieś zawiesinę tkankową do stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów. Po przetworzeniu wszystkich próbek odwiruj komórki i resuspenduj osady w 100 mikrolitrach na próbkę przeciwciała blokującego anty-CD16 CD32 w stężeniu dwóch mikrogramów na mililitr w PBS z dodatkiem 1% FBS. Po 15 minutach w temperaturze czterech stopni Celsjusza dodaj do odpowiednich próbek 100 mikrolitrów przeciwciała zgodnie ze wskazaniami w tabeli i inkubuj przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, chroniąc przed światłem.Po zakończeniu inkubacji przemyć komórki w 1 ml PBS z dodatkiem FBS, a następnie zawiesić osady w 300 µl PBS z FBS. Następnie znakować komórki, stosując DAPI w stężeniu 2 µg/ml przez 10 minut w temperaturze 4 °C, chroniąc próbki przed światłem. Aby wyizolować leukocyty, w pierwszej kolejności należy wyznaczyć bramkę dla populacji DAPI-dodatniej, aby wyeliminować martwe komórki.Następnie należy wybrać singlety na wykresie obszaru rozproszenia przedniego (forward scatter area) względem szerokości rozproszenia przedniego (forward scatter width) i wyznaczyć bramkę dla komórek na podstawie wielkości i ziarnistości interesujących nas leukocytów. W kolejnym kroku należy wybrać komórki CD45-dodatnie, a następnie dla każdej próbki zidentyfikować populacje dendrytycznych komórek skóry na podstawie ekspresji CD11C i MHC klasy II. Makrofagi należy zidentyfikować na podstawie ekspresji CD64 i F480, limfocyty B na podstawie ekspresji CD19 i MHC klasy II, a limfocyty T na podstawie ekspresji CD4 lub CD8.Izolacja komórek odpornościowych skóry, zaprezentowana powyżej, pozwala na uzyskanie populacji o żywotności przekraczającej 50% ze wszystkich obszarów skóry, z czego od 5 000 do 15 000 komórek na centymetr kwadratowy wykazuje pozytywną ekspresję CD45. Z jednego centymetra kwadratowego skóry myszy można również uzyskać wystarczającą liczbę komórek dendrytycznych, makrofagów, limfocytów B oraz limfocytów T do dalszych analiz, zgodnie z tym, co zostało wskazane. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak przeprowadzić trawienie nieza GIFstkowanej tkanki skóry oraz jak wyizolować leukocyty do analizy FACS.

preparation-single-cell-suspensions-for-cytofluorimetric-analysis

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Przygotowanie pojedynczych zawiesin komórkowych do analizy cytofluorymetrycznej z różnych obszarów skóry myszy

Fibroblasty związane z nowotworem (CAFs) wspomagają inicjację, wzrost i progresję guza poprzez sygnalizację promującą proliferację, angiogenezę i stan zapalny. W niniejszej pracy opisujemy metodę izolacji czystych populacji prawidłowych fibroblastów oraz CAFs z pobranych na świeżo tkanek mysich i ludzkich za pomocą sortowania komórek, wykorzystując PDGFRα jako marker powierzchniowy.

Izolacja fibroblastów prawidłowych i związanych z nowotworem z tkanek świeżych za pomocą sortowania komórek aktywowanego fluorescencją (FACS)

Ten film opisuje szybką metodę jednoczesnego izolowania i hodowli melanocytów i fibroblastów ze skóry pourodzeniowego szczeniaka myszy. Komórki te mogą być utrzymywane i manipulowane in vitro w celu badania biologii komórek skóry, gojenia się ran i czerniaka.

Szybka hodowla pierwotnych mysich melanocytów i fibroblastów: Izolowanie melanocytów i fibroblastów z próbki całej mysiej skóry

Film demonstruje przygotowanie jednokomórkowej zawiesiny komórek odpornościowych z mysiej tkanki mózgowej. Obejmuje trawienie enzymatyczne w celu uwolnienia komórek z tkanki mózgowej, a następnie wirowanie w gradiencie gęstości w celu wyizolowania komórek odpornościowych na podstawie ich gęstości w celu uzyskania zawiesiny pojedynczej komórki.

Przygotowanie jednokomórkowej zawiesiny komórek odpornościowych z mysiej tkanki mózgowej

Opisujemy protokół skutecznego izolowania limfocytów T rezydujących w skórze z biopsji ludzkiej skóry. Protokół ten zapewnia wystarczającą liczbę żywotnych limfocytów rezydentnych w ludzkiej skórze do analizy cytometrii przepływowej i hodowli ex vivo.

Izolacja limfocytów z ludzkiej skóry w celu analizy fenotypowej i hodowli komórkowej ex vivo

Zachowanie fibroblastów leży u podstaw całego spektrum jednostek klinicznych, ale pozostają one słabo scharakteryzowane, głównie ze względu na ich wrodzoną heterogeniczność. Tradycyjne badania nad fibroblastami opierają się na manipulacji in vitro, maskowaniu zachowania fibroblastów in vivo. Opisujemy oparty na FACS protokół izolacji fibroblastów skóry myszy, który nie wymaga hodowli komórkowej.

Izolacja fibroblastów skórnych myszy metodą FACS

Idealnym modelem do badania biologii dorosłych komórek macierzystych jest mieszek włosowy myszy. W tym miejscu przedstawiamy protokół izolacji różnych populacji mieszków włosowych, komórek macierzystych i keratynocytów naskórka, wykorzystujący trawienie enzymatyczne skóry grzbietowej myszy, a następnie analizę FACS.

Izolowanie komórek macierzystych mieszków włosowych i keratynocytów naskórka z grzbietowej skóry myszy

Ten raport opisuje protokół CUBIC do wyjaśniania pełnej grubości biopsji skóry myszy i wizualizacji wzorców ekspresji białek, proliferujących komórek i sebocytów w rozdzielczości pojedynczej komórki w 3D. Metoda ta umożliwia dokładną ocenę anatomii i patologii skóry oraz nieprawidłowych fenotypów naskórka w genetycznie zmodyfikowanych liniach myszy.

Protokół CUBIC wizualizuje ekspresję białek w rozdzielczości pojedynczej komórki w preparatach skórnych z całego montażu

Ten protokół opisuje, jak izolować keratynocyty skóry od modeli mysich, barwić przeciwciałami znakowanymi metalem oraz analizować barwione komórki za pomocą cytometrii masowej w celu profilowania wzorca ekspresji interesujących białek w różnych fazach cyklu komórkowego.

Izolacja i barwienie keratynocytów skóry myszy do specyficznej dla cyklu komórkowego analizy ekspresji białek komórkowych za pomocą cytometrii masowej

Prezentowany tutaj jest skuteczny protokół do izolacji komórek satelitarnych mięśni kończyn myszy aktywowanym fluorescencyjnie (FACS), przystosowany do badania regulacji transkrypcji we włóknach mięśniowych poprzez rozszczepienie pod tarczami i uwolnienie za pomocą nukleazy (CUT&amp;RUN).

Wydajny protokół do analizy CUT&RUN mysich komórek satelitarnych izolowanych od FACS

Opisujemy protokoły przygotowania zawiesiny pojedynczej komórki nabłonka grasicy myszy oraz barwienia cząsteczek wewnątrzkomórkowych do analizy cytometrycznej przepływowej.

Przygotowanie jednokomórkowej zawiesiny mysich komórek nabłonka grasicy i barwienie cząsteczek wewnątrzkomórkowych do analizy cytometrii przepływowej

Protokół ten przedstawia szczegółową metodę izolowania wysokiej jakości zawiesin pojedynczych komórek zarówno ze zdrowej, jak i z guzowymi tkankami płuc myszy. Protokół ten może być stosowany w scRNA-seq, analizie cytometrii przepływowej oraz izolacji komórek pierwotnych.

Optymalizacja przygotowania całej tkanki płucnej z guzem myszy do cytometrii przepływowej i sekwencjonowania RNA pojedynczego komórkowego

Naucz się przygotowywać zawiesiny jednokomórkowe z różnych obszarów skóry myszy do analizy cytofluorymetrycznej populacji komórek odpornościowych. Ta metoda zachowuje markery powierzchniowe komórek.

Przygotowanie zawiesin jednokomórkowych do analizy cytofluorymetrycznej z różnych obszarów skóry myszy

Przeglądaj więcej filmów