Przygotowanie zawiesin jednokomórkowych do analizy cytofluorymetrycznej z różnych obszarów skóry myszy
20 kwietnia 2016
Skóra jest domem dla złożonej sieci komórek odpornościowych. Opisujemy skuteczną metodologię trawienia skóry myszy z różnych części ciała zwierzęcia w celu uzyskania zawiesiny jednokomórkowej i analizy różnych populacji leukocytów znajdujących się w skórze za pomocą cytometrii przepływowej.
Ogólnym celem tej procedury jest przygotowanie zawiesiny pojedynczej komórki ze skóry myszy w celu zidentyfikowania różnych populacji rezydentnych komórek odpornościowych za pomocą analizy cytofluorymetrycznej. W celu zidentyfikowania i wyizolowania różnych populacji komórek odpornościowych rezydujących w skórze. Korzystając z tej techniki, naukowcy mogą łatwo trawić próbki z różnych regionów skóry myszy bez uszkadzania komórek odpornościowych, które są przedmiotem zainteresowania.
Aby uzyskać próbki skóry z ucha myszy, odetnij bezwłose części uszu i użyj kleszczy, aby rozsunąć grzbietową i brzuszną stronę narządów. Następnie delikatnie zeskrob ucho wewnętrzne, aby usunąć pozostałą chrząstkę. Aby uzyskać próbki skóry, zgol wszystkie włosy zwierzęcia za pomocą maszynki do strzyżenia, a następnie nałóż balsam do depilacji.
Po kilku minutach usuń balsam i wykonaj pionowe nacięcie na środku pleców myszy, kontynuując nacięcie wzdłuż granic ogolonych obszarów wokół ciała myszy. Używając kleszczy do przytrzymywania skóry na miejscu podczas oddzielania próbki za pomocą zamkniętych, zaokrąglonych końcówek nożyczek chirurgicznych lub skalpela, delikatnie oddziel skórę od otrzewnej i mięśni pleców. Następnie zanurz skórę w 100-milimetrowej płytce do hodowli komórkowej zawierającej 10 ml lodowatego PBS i użyj kleszczy, aby zeskrobać podskórny tłuszcz
.Aby uzyskać próbkę skóry ogona, odetnij ogon i użyj nożyczek chirurgicznych, aby wykonać pionowe cięcie, zaczynając od podstawy ogona w dół do czubka. Za pomocą kleszczy chwyć krawędź nacięcia u podstawy ogona, a następnie chwytając tułów ogona kolejną parą kleszczy, delikatnie pociągnij skórę w kierunku końcówki. Usuń nadmiar tłuszczu, delikatnie zeskrobując próbkę skóry.
Stopa myszy jest cięta, a następnie, aby uzyskać próbkę skóry z opuszki stopy, użyj nożyczek chirurgicznych, aby przeciąć skórę stopy wzdłużnie od kostki do początku palców, uważając, aby nie obciąć włosów. Następnie chwyć kości skokowe kleszczami, jednocześnie chwytając skórę drugą i pociągnij skórę w kierunku palców, tak jak podczas zdejmowania rękawicy. Aby oznaczyć komórki skóry, dla każdej próbki po kolei przenieś tkankę na 35-milimetrową szalkę Petriego zawierającą 2 mililitry świeżo przygotowanego koktajlu trawiennego.
Za pomocą nożyczek pokrój próbkę na małe kawałki i inkubuj fragmenty tkanki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 90 minut, wykonując jeden lub dwa delikatne wstrząsy w okresie inkubacji. Następnie przelej strawioną tkankę skórną na sitko do komórek o grubości 70 mikronów na 66-milimetrowej szalce Petriego zawierającej 1 mililitr RPMI 1640 uzupełnionej FBS na miskę. Umyć sitko pięcioma mililitrami świeżej pożywki, a następnie użyć tłoka strzykawki, aby przecisnąć próbki przez siatkę sitka.
Przepłukać tłok, naczynie i sitko 20 mililitrami świeżej pożywki i przenieść zawiesinę tkankową do stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów. Po przetworzeniu wszystkich próbek odwirować komórki i ponownie zawiesić granulki w 100 mikrolitrach na próbkę, po dwa mikrogramy na mililitr przeciwciała blokującego anty CD16 CD32 w PBS plus 1% FBS. Po 15 minutach w temperaturze czterech stopni Celsjusza dodać 100 mikrolitrów przeciwciała, jak wskazano w tabeli, do odpowiednich próbek przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, chronionych przed światłem.
Pod koniec inkubacji umyj komórki w jednym mililitrze PBS plus FBS i ponownie zawiesij granulki w 300 mikrolitrach FBS PBS. Następnie oznacz komórki 2 mikrogramami na mililitr DAPI przez 10 minut w czterech stopniach Celsjusza, chroniąc je przed światłem. Aby wyizolować leukocyty, najpierw przeprowadź bramkę populacji DAPI dodatniej, aby wyeliminować martwe komórki.
Następnie wybierz podkoszulki w obszarze rozproszenia do przodu za pomocą wykresu szerokości rozproszenia do przodu i bramkują komórki na podstawie wielkości i ziarnistości leukocytów będących przedmiotem zainteresowania. Następnie wybierz komórki CD45 dodatnie, a następnie dla każdej próbki zidentyfikuj populacje komórek dendrytycznych skóry na podstawie ich ekspresji CD11C i MHC klasy drugiej. Zidentyfikuj makrofagi na podstawie ich ekspresji CD64 i F480, limfocyty B na podstawie ekspresji CD19 i MHC klasy drugiej, a limfocyty T na podstawie ekspresji CD4 lub CD8.
Izolacja komórek odpornościowych skóry, jak właśnie wykazano, daje populację ponad 50% żywotnych komórek ze wszystkich regionów skóry, z których od 5 000 do 15 000 na centymetr kwadratowy jest CD45-dodatnich. Wystarczającą liczbę komórek dendrytycznych, makrofagów, limfocytów B i limfocytów T można również uzyskać do dalszej analizy z jednego centymetra kwadratowego skóry myszy, jak wskazano. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak trawić tkankę skórną bez stanu zapalnego i izolować leukocyty do analizy faksowej.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia metodologię przygotowania zawiesiny pojedynczych komórek ze skóry myszy w celu analizy populacji rezydentnych komórek odpornościowych. Technika ta umożliwia trawienie próbek skóry z różnych regionów bez uszkadzania markerów powierzchniowych komórek odpornościowych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Immunologia
- Biologia komórki
- Cytometria przepływowa
Wstęp
- Skóra zawiera zróżnicowaną sieć komórek odpornościowych.
- Zrozumienie tych populacji jest kluczowe dla badania odporności skóry.
- Cytometria przepływowa jest kluczową techniką analizy populacji komórek.
- Efektywne przygotowanie próbek jest niezbędne dla uzyskania dokładnych wyników.
Cel badania
- Opracowanie wiarygodnej metody izolacji komórek odpornościowych ze skóry myszy.
- Ułatwienie identyfikacji różnych populacji leukocytów.
- Udoskonalenie analizy odpowiedzi immunologicznych w skórze.
Zastosowane metody
- Pobieranie próbek z różnych obszarów skóry myszy.
- Wykorzystanie pęsety i technik skrobania do przygotowania próbek.
- Zastosowanie lotionu depilacyjnego w celu usunięcia owłosienia.
- Analiza cytometryczna w celu identyfikacji populacji komórek odpornościowych.
Główne wyniki
- Skuteczne otrzymanie zawiesin pojedynczych komórek ze skóry mysiej.
- Identyfikacja odrębnych populacji rezydentnych komórek odpornościowych.
- Zachowanie markerów powierzchniowych podczas procesu trawienia.
- Pogłębienie wiedzy na temat dynamiki komórek odpornościowych skóry.
Wnioski
- Opisana metodologia jest skuteczna w badaniu odporności skóry.
- Cytometria przepływowa dostarcza cennych informacji na temat populacji komórek odpornościowych.
- Podejście to można zastosować w różnych kontekstach badawczych w immunologii.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Efektywne przygotowanie zawiesin pojedynczych komórek z różnych regionów skóry myszy umożliwia wysokiej wierności profilowanie komórek odpornościowych, co ma kluczowe znaczenie dla wczesnego odkrywania i walidacji celów w badaniach dermatologicznych i immunologicznych. Metodologia ta wspiera rzetelny screening fenotypowy oraz analizę ilościową populacji leukocytów rezydujących w skórze, bezpośrednio przyczyniając się do mechanistycznej minimalizacji ryzyka i zwiększenia pewności predykcyjnej w kluczowych punktach zwrotnych procesu badawczego. Niezawodna izolacja komórek i zachowanie markerów ułatwiają prowadzenie badań nad odpowiedziami immunologicznymi na bodźce środowiskowe i mikrobiologiczne w skali przedsiębiorstwa.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia badanie heterogeniczności komórek odpornościowych w różnych obszarach skóry w celu walidacji celu terapeutycznego.
- Wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez zachowanie ekspresji antygenów powierzchniowych podczas izolacji komórek.
- Ułatwia ilościową ocenę subpopulacji komórek odpornościowych, zapewniając wiarygodność predykcyjną w programach we wczesnej fazie.
Przesiewy i opracowanie testów
- Zapewnia zestandaryzowane zawiesiny pojedynczych komórek, odpowiednie do późniejszej cytometrii przepływowej i przesiewu fenotypowego.
- Gwarantuje powtarzalność i skalowalność w obrębie różnych obszarów anatomicznych, wspierając procesy opracowywania testów analitycznych.
- Zapewnia wysoką żywotność komórek i integralność markerów, co umożliwia wiarygodną ocenę związków chemicznych lub biomarkerów.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Umożliwia powiązanie profilowania komórek odpornościowych z modelami skóry istotnymi dla danej choroby w celu prowadzenia translacyjnych badań nad biomarkerami.
- Zapewnia ciągłość od etapu odkrycia po walidację przedkliniczną dzięki możliwości spójnego monitorowania układu odpornościowego.
- Wspiera podejmowanie decyzji o dalszym rozwoju projektu w oparciu o analizę ryzyka i rzetelną kwantyfikację komórek odpornościowych.
Integracja potoków i przepływu pracy
Niniejszy protokół wpisuje się w kontinuum od etapu odkryć do badań przedklinicznych, umożliwiając standaryzowaną izolację komórek odpornościowych z wielu obszarów skóry do analizy cytometrycznej.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych poprzez umożliwienie szczegółowej analizy subpopulacji komórek odpornościowych.
- Przesiewanie: Dostarcza gotowych do analizy zawiesin pojedynczych komórek z zachowanymi markerami powierzchniowymi dla powtarzalnych procesów przesiewowych.
- Analityka: Zapewnia ilościowe odczyty populacji leukocytów, wspierając analizy porównawcze pomiędzy różnymi warunkami i regionami.
- Badania translacyjne: Ułatwia dopasowanie do modeli istotnych dla danej choroby oraz strategii biomarkerów podczas badania odporności skóry.
- Wykorzystanie w przedsiębiorstwach: Oferuje reużywalny, zestandaryzowany protokół, który można dostosować do różnych obszarów skóry i kontekstów eksperymentalnych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną i walidację celów poprzez umożliwienie precyzyjnego profilowania komórek odpornościowych.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje procesy izolacji i barwienia komórek w celu zapewnienia powtarzalności i skalowalności.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go i redukuje ryzyko biologiczne na późnych etapach dzięki rzetelnemu monitorowaniu układu odpornościowego.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój programów dermatologicznych i immunologicznych.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie sekcji tkanek, trawienia enzymatycznego oraz analizy cytometrią przepływową.
- Wymaga dostępu do cytometrów przepływowych oraz zwalidowanych paneli przeciwciał do identyfikacji komórek odpornościowych.
- Wymaga standaryzacji procesowania próbek i strategii bramkowania między zespołami.
- Metoda jest możliwa do zastosowania w różnych obszarach skóry myszy, jednak może wymagać optymalizacji w przypadku tkanek zapalnych lub chorobowo zmienionych.
- Wydajność i żywotność komórek mogą różnić się w zależności od miejsca anatomicznego i muszą zostać określone empirycznie.
