Przygotowanie zawiesin jednokomórkowych do analizy cytofluorymetrycznej z różnych obszarów skóry myszy
April 20th, 2016
Skóra jest domem dla złożonej sieci komórek odpornościowych. Opisujemy skuteczną metodologię trawienia skóry myszy z różnych części ciała zwierzęcia w celu uzyskania zawiesiny jednokomórkowej i analizy różnych populacji leukocytów znajdujących się w skórze za pomocą cytometrii przepływowej.
Ogólnym celem tej procedury jest przygotowanie zawiesiny pojedynczej komórki ze skóry myszy w celu zidentyfikowania różnych populacji rezydentnych komórek odpornościowych za pomocą analizy cytofluorymetrycznej. W celu zidentyfikowania i wyizolowania różnych populacji komórek odpornościowych rezydujących w skórze. Korzystając z tej techniki, naukowcy mogą łatwo trawić próbki z różnych regionów skóry myszy bez uszkadzania komórek odpornościowych, które są przedmiotem zainteresowania.
Aby uzyskać próbki skóry z ucha myszy, odetnij bezwłose części uszu i użyj kleszczy, aby rozsunąć grzbietową i brzuszną stronę narządów. Następnie delikatnie zeskrob ucho wewnętrzne, aby usunąć pozostałą chrząstkę. Aby uzyskać próbki skóry, zgol wszystkie włosy zwierzęcia za pomocą maszynki do strzyżenia, a następnie nałóż balsam do depilacji.
Po kilku minutach usuń balsam i wykonaj pionowe nacięcie na środku pleców myszy, kontynuując nacięcie wzdłuż granic ogolonych obszarów wokół ciała myszy. Używając kleszczy do przytrzymywania skóry na miejscu podczas oddzielania próbki za pomocą zamkniętych, zaokrąglonych końcówek nożyczek chirurgicznych lub skalpela, delikatnie oddziel skórę od otrzewnej i mięśni pleców. Następnie zanurz skórę w 100-milimetrowej płytce do hodowli komórkowej zawierającej 10 ml lodowatego PBS i użyj kleszczy, aby zeskrobać podskórny tłuszcz
.Aby uzyskać próbkę skóry ogona, odetnij ogon i użyj nożyczek chirurgicznych, aby wykonać pionowe cięcie, zaczynając od podstawy ogona w dół do czubka. Za pomocą kleszczy chwyć krawędź nacięcia u podstawy ogona, a następnie chwytając tułów ogona kolejną parą kleszczy, delikatnie pociągnij skórę w kierunku końcówki. Usuń nadmiar tłuszczu, delikatnie zeskrobując próbkę skóry.
Stopa myszy jest cięta, a następnie, aby uzyskać próbkę skóry z opuszki stopy, użyj nożyczek chirurgicznych, aby przeciąć skórę stopy wzdłużnie od kostki do początku palców, uważając, aby nie obciąć włosów. Następnie chwyć kości skokowe kleszczami, jednocześnie chwytając skórę drugą i pociągnij skórę w kierunku palców, tak jak podczas zdejmowania rękawicy. Aby oznaczyć komórki skóry, dla każdej próbki po kolei przenieś tkankę na 35-milimetrową szalkę Petriego zawierającą 2 mililitry świeżo przygotowanego koktajlu trawiennego.
Za pomocą nożyczek pokrój próbkę na małe kawałki i inkubuj fragmenty tkanki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 90 minut, wykonując jeden lub dwa delikatne wstrząsy w okresie inkubacji. Następnie przelej strawioną tkankę skórną na sitko do komórek o grubości 70 mikronów na 66-milimetrowej szalce Petriego zawierającej 1 mililitr RPMI 1640 uzupełnionej FBS na miskę. Umyć sitko pięcioma mililitrami świeżej pożywki, a następnie użyć tłoka strzykawki, aby przecisnąć próbki przez siatkę sitka.
Przepłukać tłok, naczynie i sitko 20 mililitrami świeżej pożywki i przenieść zawiesinę tkankową do stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów. Po przetworzeniu wszystkich próbek odwirować komórki i ponownie zawiesić granulki w 100 mikrolitrach na próbkę, po dwa mikrogramy na mililitr przeciwciała blokującego anty CD16 CD32 w PBS plus 1% FBS. Po 15 minutach w temperaturze czterech stopni Celsjusza dodać 100 mikrolitrów przeciwciała, jak wskazano w tabeli, do odpowiednich próbek przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, chronionych przed światłem.
Pod koniec inkubacji umyj komórki w jednym mililitrze PBS plus FBS i ponownie zawiesij granulki w 300 mikrolitrach FBS PBS. Następnie oznacz komórki 2 mikrogramami na mililitr DAPI przez 10 minut w czterech stopniach Celsjusza, chroniąc je przed światłem. Aby wyizolować leukocyty, najpierw przeprowadź bramkę populacji DAPI dodatniej, aby wyeliminować martwe komórki.
Następnie wybierz podkoszulki w obszarze rozproszenia do przodu za pomocą wykresu szerokości rozproszenia do przodu i bramkują komórki na podstawie wielkości i ziarnistości leukocytów będących przedmiotem zainteresowania. Następnie wybierz komórki CD45 dodatnie, a następnie dla każdej próbki zidentyfikuj populacje komórek dendrytycznych skóry na podstawie ich ekspresji CD11C i MHC klasy drugiej. Zidentyfikuj makrofagi na podstawie ich ekspresji CD64 i F480, limfocyty B na podstawie ekspresji CD19 i MHC klasy drugiej, a limfocyty T na podstawie ekspresji CD4 lub CD8.
Izolacja komórek odpornościowych skóry, jak właśnie wykazano, daje populację ponad 50% żywotnych komórek ze wszystkich regionów skóry, z których od 5 000 do 15 000 na centymetr kwadratowy jest CD45-dodatnich. Wystarczającą liczbę komórek dendrytycznych, makrofagów, limfocytów B i limfocytów T można również uzyskać do dalszej analizy z jednego centymetra kwadratowego skóry myszy, jak wskazano. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak trawić tkankę skórną bez stanu zapalnego i izolować leukocyty do analizy faksowej.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten artykuł przedstawia metodologię przygotowania pojedynczej suspensji komórkowej ze skóry myszy w celu analizy populacji komórek odpornościowych stałych. Technika ta umożliwia trawienie próbek skóry z różnych regionów bez uszkodzenia markerów powierzchniowych komórek odpornościowych.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Immunologia
- Biologia komórki
- Cytometria przepływowa
Tło
- Skóra zawiera zróżnicowaną sieć komórek odpornościowych.
- Rozumienie tych populacji jest kluczowe dla badań nad odpornością skóry.
- Cytometria przepływowa jest kluczową techniką do analizy populacji komórek.
- Skuteczne przygotowanie próbek jest niezbędne dla dokładnych wyników.
Cel badania
- Opracowanie niezawodnej metody izolowaniu komórek odpornościowych ze skóry myszy.
- Ułatwienie identyfikacji różnych populacji leukocytów.
- Poprawa analizy odpowiedzi odpornościowych w skórze.
Stosowane metody
- Zbieranie próbek ze różnych regionów skóry myszy.
- Zastosowanie kleszczy i technik skrobywania do przygotowania próbek.
- Zastosowanie środka do depilacji do usuwania włosów.
- Analiza cytometria przepływowa do identyfikacji populacji komórek odpornościowych.
Główne wyniki
- Udana generacja pojedynczych suspensji komórkowych ze skóry myszy.
- Identyfikacja odrębnych populacji stałych komórek odpornościowych.
- Zachowanie markerów powierzchniowych podczas procesu trawienia.
- Lepsze zrozumienie dynamiki komórek odpornościowych skóry.
Wnioski
- Opisana metodologia jest skuteczna w badaniu odporności skóry.
- Cytometria przepływowa dostarcza cennych informacji o populacjach komórek odpornościowych.
- To podejście może być zastosowane w różnych kontekstach badań w dziedzinie immunologii.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Efficient preparation of single-cell suspensions from distinct mouse skin regions enables high-fidelity immune cell profiling critical for early discovery and target validation in dermatological and immunological research. This methodology supports robust phenotypic screening and quantitative analysis of skin-resident leukocyte populations, directly informing mechanistic de-risking and predictive confidence at key pipeline inflection points. Reliable cell isolation and marker preservation facilitate enterprise-scale studies of immune responses to environmental and microbial stimuli.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of immune cell heterogeneity across skin regions for target validation.
- Supports mechanistic de-risking by preserving surface antigen expression during cell isolation.
- Facilitates quantitative assessment of immune cell subsets for predictive confidence in early-stage programs.
Screening & Assay Development
- Provides standardized single-cell suspensions suitable for downstream flow cytometry and phenotypic screening.
- Ensures reproducibility and scalability across anatomical sites, supporting assay development pipelines.
- Delivers high cell viability and marker integrity, enabling reliable compound or biomarker evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Aligns immune cell profiling with disease-relevant skin models for translational biomarker studies.
- Maintains continuity from discovery through preclinical validation by enabling consistent immune monitoring.
- Supports risk-adjusted advancement decisions based on robust immune cell quantification.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling standardized immune cell isolation for flow cytometric analysis from multiple skin regions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling detailed immune cell subset analysis.
- Screening: Provides assay-ready single-cell suspensions with preserved surface markers for reproducible screening workflows.
- Analytics: Delivers quantitative readouts of leukocyte populations, supporting comparative analyses across conditions and regions.
- Translational Research: Facilitates alignment with disease-relevant models and biomarker strategies when studying skin immunity.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable, standardized protocol adaptable to various skin regions and experimental contexts.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances predictive confidence and target validation by enabling precise immune cell profiling.
- Operational Value: Standardizes cell isolation and staining workflows for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk through robust immune monitoring.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of dermatological and immunological programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue dissection, enzymatic digestion, and flow cytometry analysis.
- Needs access to flow cytometers and validated antibody panels for immune cell identification.
- Demands cross-team standardization of sample processing and gating strategies.
- Adaptable to various mouse skin regions but may require optimization for inflamed or diseased tissues.
- Cell yield and viability may vary by anatomical site and must be empirically determined.
