Normalny i złośliwy przeszczep komórek mięśniowych dorosłym danio pręgowanym z obniżoną odpornością

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zaprezentowanie sposobu przygotowania i transplantacji zdrowej oraz nowotworowej tkanki mięśniowej z transgenicznych rybek zebrafish będących dawcami do biorców — rybek zebrafish z deficytem odporności linii rag2. Transplantacja mięśni polega najpierw na wyizolowaniu fluorescencyjnie znakowanych mięśni poprzez wycięcie mięśni grzbietowych.

Po homogenizacji komórki mięśniowe danio-pręgowca są filtrowane i przekształcane w zawiesinę pojedynczych komórek. Następnie komórki są przeszczepiane domięśniowo do zmutowanych ryb danio-pręgowca rag2; w dalszej kolejności wykorzystuje się mikroskopię epifluorescencyjną do śledzenia przyżycia przeszczepu w organizmach biorców już 10 dni po transplantacji. Analogicznie, można pobrać pierwotnego rabdomyosarcoma embrionalnego, przygotować z niego zawiesinę i przeszczepić go doszczelnie do jamy brzusznej zmutowanych ryb danio-pręgowca rag2.

Następnie wykorzystuje się mikroskopię do śledzenia przyjęcia się przeszczepu tkanki, a namnożone komórki nowotworowe mogą być wykorzystane w dalszych analizach. Główną zaletą transplantacji komórek do dorosłych zebrafish z niedoborem odporności jest stworzenie uniwersalnej platformy do alloprzeszczepów różnych tkanek i typów nowotworów. Tkanki mogą być przeszczepiane z różnorodnych genetycznych tło dawców bez konieczności stosowania immunosupresji u ryb biorców.

Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu biologii komórek macierzystych i biologii regeneracyjnej, takie jak zdolność do samoodnowy komórek progenitorowych. Metody te możemy również wykorzystać do wszczepiania guzów rybom zmutowanym rag dwa, a następnie do identyfikacji nowych związków chemicznych, które na przykład hamują wzrost guza. Przygotowanie oraz transplantacja prawidłowych i złośliwych komórek mięśniowych zostaną przeprowadzone przez chin, tang i anes. 10 utalentowanych studentów studiów magisterskich w laboratorium LAL. Rozpocznij od uśmiercenia ryb donora zebra fish z fluorescencyjnie znakowanymi mięśniami. Jeden.

Typowe dorosłe ryby dawcy RFP typu alpha dostarczają od 500 000 do 2 milionów komórek mięśniowych. W naszym przykładowym eksperymencie wykorzystujemy 30 ryb dawców do transplantacji do 20 ryb biorców, po milion komórek dla każdej z nich. Po eutanazji ryb dawców należy osuszyć zwierzę, kładąc je na jednorazowym ręczniku papierowym.

Użyj żyletki do pobrania mięśni grzbietowych. Cięcie należy wykonać pod kątem 45 stopni w części tylnej względem obszaru odbytu, obejmując kości i tkankę skórną. Przenieś 10 pobranych sekcji mięśni grzbietowych do czystej szalki Petriego. Następnie dodaj 500 µL schłodzonego buforu zawiesiny 0.9 XPBS 5%FBS.

Następnie rozdrobnij tkankę do uzyskania jednorodnej zawiesiny, w pełni homogenizując ją za pomocą pipety serologicznej o pojemności 5 ml, dodaj 2 ml buforu do zawiesin do homogenatu, a następnie 20 razy przeciągnij zawiesinę przez pipetę. Następnie przefiltruj zawiesinę przez sito o oczkach 40 µm i zbierz komórki do probówki stożkowej o pojemności 50 ml na lodzie. Przez resztę procedury utrzymuj komórki w niskiej temperaturze.

Przemyj pozostałą tkankę w sitku 2,5 ml buforu zawiesiny i przefiltruj ją do 50 ml probówki stożkowej. Następnie określ całkowitą liczbę żywych komórek przy użyciu błękitu trypanu i zagęść je poprzez wirowanie przy 1000 G przez 10 minut w temperaturze 4°C. Następnie resuspenduj komórki w 0,9X PBS z 5% FBS w stężeniu 333 000 komórek na µL.

Jeśli liczba komórek dawcy jest ograniczona, nawet 50 000 wstrzykniętych komórek może doprowadzić do udanego przeszczepienia. Rozpocznij od znieczulenia ryb z niedoborem rag2 w wieku od dwóch do czterech miesięcy w tricainie. Gdy ruchy opercularne są spowolnione i ryba jest nieruchoma, przenieś ją na wilgotny ręcznik lewą stroną ciała do góry.

Następnie, używając uprzednio oczyszczonej mikrosyringi o rozmiarze 26 s i pojemności 10 µL, wstrzyknij 3 µL przygotowanej zawiesiny komórek mięśniowych. Iniekcje należy wykonywać pod kątem 45 stopni, wstrzykując zawiesinę bezpośrednio do mięśni grzbietowo-bocznych ryby biorcy. Należy pamiętać, że podczas transplantacji domięśniowej całkowita objętość wstrzyknięta do ryby biorcy powinna być mniejsza niż 3 µL. Następnie ostrożnie przenieś rybę biorcy do zbiornika regeneracyjnego zawierającego czystą wodę z systemu hodowlanego.

Należy kontynuować wstrzykiwanie pozostałych ryb i umieścić je w jednym zbiorniku regeneracyjnym. Następnie, w 10., 20. i 30. dniu po transplantacji, należy ocenić stopień engraftmentu za pomocą mikroskopii w świetle przechodzącym oraz epi-fluorescencyjnej, przetwarzając każdy guz oddzielnie.

Uśmierć rybę z zarodkowym rabdomyosarkomą. Umieść rybę w czystej szalce Petriego i wypreparuj guz z tkanek niezłośliwych, używając żyletki i precyzyjnych pęset. Staranne wypreparowanie obszaru wokół guza pozwoli uzyskać zawiesinę komórkową o wyższej czystości i minimalnym zanieczyszczeniu otaczającą tkanką mięśniową. Przenieś wypreparowany guz do nowej szalki i dodaj 100 µL schłodzonego buforu XPBS 0,9% z 5%FBS.

Następnie posiekaj tkankę żyletką, aż do uzyskania jednorodnej zawiesiny. Potem, używając pipety o objętości jednego mililitra, dodaj kolejne 900 µL buforu, a następnie przemieśzaj zawiesinę, wielokrotnie przepuszczając ją przez pipetę w celu dysocjacji komórek.

Następnie przefiltruj komórki przez sitko komórkowe o oczkach 40 µm. Przepłucz płytkę, dodając dodatkowe dwa do czterech mililitrów zawiesiny i buforu, a następnie przefiltruj przez to samo sitko komórkowe. Skoncentruj komórki w sposób opisany wcześniej.

Przechowywać komórki w lodzie. Następnie resuspender komórki w 100 µL buforu i policzyć żywe komórki przy użyciu błękitu trypanu. Dostosować stężenie zawiesiny komórkowej do 5 000 komórek na µL.

Następnie znieczulić dwa immunokompromitowane zebrafish biorców i położyć je na czystym ręczniku papierowym stroną brzuszną do góry. Za pomocą czystej igły od strzykawki o rozmiarze 26 G wstrzyknąć odpowiednią objętość do jamy otrzewnej zebrafish biorcy w tym miejscu.

Wstrzykuje się 25 000 komórek w pięciu mikrolitrach. Można jednak z powodzeniem wstrzyknąć do 10 mikrolitrów. Pozostaw wstrzyknięte ryby w zbiorniku regeneracyjnym do czasu ich rekonwalescencji przed powrotem do głównego systemu.

Następnie monitoruj proces zaprawiania u ryb biorców za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej epi i pobierz komórki do dalszych badań. Stosując opisaną procedurę, komórki mięśni szkieletowych od transgenicznych dawców alpha actin RFP przeszczepiono do immunokompromitowanych homozygotycznych mutantów rag dwa danio pręgowany. Tkanka mięśni szkieletowych pozwoliła na otrzymanie zawiesiny pojedynczych komórek zawierającej 84,3% żywych komórek, co oceniono metodą wykluczania DPI.

Po analizie cytometrycznej przepływowej stwierdzono, że komórki RFP-dodatnie stanowiły 35,3% tej zawiesiny komórek dawcy. Transplantacja komórek do grzbietowej muskulatury szkieletowej ryb biorców z homozygotyczną mutacją RAG2 doprowadziła do spójnego i silnego przeżycia przeszczepu. Potwierdzono to poprzez powstanie wielojądrowych fluorescencyjnych włókien mięśniowych u ryb biorców; u ryb biorców typu dzikiego nie odnotowano implantacji włókien mięśniowych.

Jednakże do 10. dnia po transplantacji u dziewięciu z 14 mutantów danio pręgowanego stwierdzono obecność włókien mięśniowych RFP-dodatnich w pobliżu miejsca wstrzyknięcia. Co istotne, wszczepione mięśnie RFP-dodatnie utrzymywały się co najmniej do 30. dnia po transplantacji. Podobnie, silne przyjęcie przeszczepu uzyskano po transplantacji komórek rabdomyosarcoma embrionalnego (ERMS) do ryb mutantów RAG2.

Przeszczepiony ERMS wykazywał cechy histologiczne wspólne z pierwotnym guzem ERMS; heterogeniczność komórek nowotworowych została zachowana, co oceniono za pomocą analizy fluorescencyjnej. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć sposób przeprowadzania transplantacji mięśniowej oraz transplantacji wewnątrzbrzusznej tkanek prawidłowych i nowotworowych u dorosłych ryb odbiorców z niedoborem odporności. Następnie można zastosować inne metody, takie jak sortowanie komórek aktywowane fluorescencją, analiza transplantacji z ograniczonym rozcieńczeniem oraz qPCR w czasie rzeczywistym, aby ocenić różnice funkcjonalne i molekularne pomiędzy różnymi subpopulacjami nowotworu.

Ogólnie rzecz biorąc, nasze podejście umożliwia trwałe i długoterminowe przeszczepienie fluorescencyjnej tkanki mięśniowej oraz tkanki nowotworowej do ryb z mutacją RAG2 z niedoborem odporności. Zaletą tej metody jest to, że przeszczepienie zachodzi bez konieczności wcześniejszej immunosupresji ryby biorcy i nie wymaga dopasowania immunologicznego zwierząt dawcy i biorcy.