Wykorzystanie mysich indukowanych alleli telomerazy w badaniach nad degeneracją/regeneracją tkanek i rakiem

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest manipulowanie dwoma indukowanymi przez myszy allelami pukania mase in vivo i in vitro do badań nad degeneracją i regeneracją tkanek oraz badań nad rakiem. Osiąga się to poprzez wszczepienie zwierzętom tabletek hydroksytamoksyfenu w celu reaktywacji mase in vivo. W drugim etapie izoluje się nerwowe komórki macierzyste od zwierząt, które następnie poddaje się działaniu hydroksytamoksyfenu w celu reaktywacji mase in vitro.

Następnie fluorescencja telomerów w hybrydyzacji C dwóch lub rybach jest wykonywana zarówno na hodowanych komórkach, jak i formalnych i utrwalonych tkankach mózgowych zatopionych w parafinie w celu sprawdzenia aktywności mase. Wyniki wykazały, że leczenie hydroksytamoksyfenem może silnie reaktywować aktywność mase, co może zarówno łagodzić fenotypy starzenia, jak i sprzyjać powstawaniu nowotworów w oparciu o badanie histopatologiczne. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie starzenia się i raka, takie jak to, czy możemy spowolnić proces starzenia się poprzez modulowanie aktywności traumy TH lub jak konkretnie ukierunkować Thomasa na leczenie raka.

Tę procedurę zademonstrują instruktor dr Takashi Shingu i technik April Un z mojego laboratorium. Rozpocznij tę procedurę od wygenerowania Turt ER i lock stop blokuje allele Turt zgodnie z opisem w protokole tekstowym, wysterylizuj wszystkie narzędzia chirurgiczne przed wstrzyknięciem, przystąp do znieczulenia myszy zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Po osiągnięciu głębokiego znieczulenia należy wyjąć znieczulone zwierzę z komory indukcyjnej i trzymać jego głowę w rurce podłączonej do komory fluorowej iso.

Ściśnij opuszki stóp myszy, aby upewnić się, że zwierzę jest głęboko znieczulone. Nałóż również maść na oba oczy Aby zapobiec wyciąganiu oczu, przetrzyj tył myszy roztworem jodu powidonu. Następnie wstrzyknąć wolno uwalniający się hydroksyl tamoksyfenu za pomocą precyzyjnego trokaru pod skórę pleców.

I wepchnij śrut aż do linii środkowej między dwoma ramionami. Uszczelnij nacięcie za pomocą aplikatora do spinania ran i monitoruj myszy pod kątem powrotu do zdrowia. Do znieczulenia.

Wyjmij jednodniowe mózgi myszy i zachowaj cztery mózgi, usuwając opuszki węchowe i móżdżek. Trzymaj cztery tkanki mózgowe w jednym mililitrze zimnej pożywki hodowlanej i przechowuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Upewnij się, że przetworzyłeś tkankę nerwową w ciągu godziny.

Określ masę tkanki, aby upewnić się, że limit 400 miligramów na trawienie nie został przekroczony. Umieść mózg na pokrywie szalki Petriego o średnicy 35 milimetrów i zmiażdż mózg skalpelem. Używając jednomililitrowej końcówki do pipet, dodaj jeden mililitr roztworu soli wagi Hanka lub HBSS.

Następnie odpipetować kawałki z powrotem do 15-mililitrowej probówki po spłukaniu wirówką HBSS o temperaturze 300 razy G przez dwie minuty w temperaturze pokojowej. Po ostrożnym usunięciu supernatantu dodać 1 950 mikrolitrów podgrzanego enzymu. Wymieszaj jeden na maksymalnie 400 miligramów tkanki.

Inkubować próbkę w 15-mililitrowej probówce przez 15 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Wymieszać próbkę, odwracając lub potrząsając probówką co pięć minut. Następnie przygotuj 30 mikrolitrów enzymu Wymieszaj dwa na próbkę tkanki, dodając 20 mikrolitrów roztworu, od trzech do 10 mikrolitrów roztworu cztery.

Następnie dodaj do próbki, delikatnie odwracając, aby wymieszać, mechanicznie zdysocjuj tkankę za pomocą pipety z pastą polerowaną ogniowo z szeroką końcówką, pipetując w górę iw dół 10 razy, powoli unikając tworzenia się pęcherzyków powietrza. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 minut, odwracając probówkę co trzy minuty. Następnie nałóż zawiesinę komórek na sitko o wielkości 70 mikronów umieszczone na 50-mililitrowej probówce.

Nałóż 10 mililitrów soli fizjologicznej buforowanej fosforanami lub PBS przez sitko komórkowe. Następnie wyrzuć sitko do komórek i odwiruj zawiesinę komórek w temperaturze 300 razy G przez 20 minut. Ustawić temperaturę pokojową po odwirowaniu całkowicie zassać supernatant.

Ponownie zawiesić komórki z pożywką z komórkami macierzystymi do wymaganej objętości w celu dalszych zastosowań, aby aktywować tele array w zamkach, zamkach zatrzymujących. Nerwowe komórki macierzyste Turta. Traktuj komórki 100 mikromolowymi hydroksytamoksyfenami przez dwa dni, aby aktywować emazę i tureckie nerwowe komórki macierzyste.

Utrzymuj komórki w pożywce hodowlanej ze 100 mikromolowym hydroksytamoksyfenem w celu wykonania ryb telomerowych. Najpierw przygotuj chromosomy metafazy z hodowanych komórek do skrawków tkanek utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie lub FFPE. Zdeparować próbkę w ksylenie i ponownie uwodnić w serii etanolowej przez pięć minut każda, a następnie w PBS przez pięć minut.

Następnie postfikuj skrawki w stosunku trzy do jednego metanolu do kwasu octowego przez jedną do dwóch godzin. Odwodnić sekcje w zimnej serii etanolu przez pięć minut każda i wyprać na sucho w jednym XPBS w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut. Następne w naturze, chromosomy w 4% formaldehydu w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie minuty.

Odwodnić sekcje w zimnej serii etanolu jak poprzednio i wysuszyć na powietrzu po wyschnięciu, nałożyć od 12 do 25 mikrolitrów mieszaniny hybrydyzacji peptydów z kwasami nukleinowymi na każde szkiełko. Uszczelnij szkiełko nakrywkowe cementem gumowym, umieszczając naturalne preparaty chromosomowe i skrawki tkanek w temperaturze 80 stopni Celsjusza na cztery minuty. Następnie hybrydyzuj w temperaturze pokojowej lub 37 stopni Celsjusza przez dwie do czterech godzin w wilgotnej komorze.

Następnie dwukrotnie przemyć próbki w temperaturze pokojowej buforem do przemywania przez 15 minut. Następnie myj je w temperaturze pokojowej przez pięć minut za pomocą PBS i 23 razy. Na koniec przeciwbarwić szkiełka za pomocą DPI lub dalekiej czerwonej fluorescencji do badania mikroskopowego.

Gdy telomer był przejściowo reaktywowany u myszy z dysfunkcją telomerów, fenotypy zwyrodnieniowe można było poprawić w wielu narządach, takich jak mózg i jądra, aby określić wpływ reaktywacji telomerów na komórki. Hodowane in vitro nerwowe komórki macierzyste wyizolowano od myszy z późnej generacji G z czterema blokadami zatrzymującymi, TURT i G czterema turt ER. Kiedy telomer został reaktywowany w telomerowych dysfunkcyjnych nerwowych komórkach macierzystych, zdolność do samoodnawiania się znacznie wzrosła.

Neurogeneza in vitro została również znacznie wzmocniona w celu określenia wpływu reaktywacji mase na nowotwór w kontekście dysfunkcji telomerów, reaktywację mase przez leczenie tamoksyfenem przeprowadzono w modelu guza gruczołu krokowego. Model chłoniaka z komórek T endotu. Leczenie skutkowało znacznym nasileniem nowotwórstwa w obu modelach.

Na koniec przeprowadzono badania ryb telomerowych na FFPE, tkankach mózgu myszy i chromosomach metafazy. Na tych obrazach kolor czerwony oznacza DNA zielony oznacza barwienie telomerów, a cyjan oznacza barwienie centromerów. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak aktywować aktywność traumy w mTOR ER i zamkach zatrzymujących, zwierzętach mTOR i liniach komórkowych oraz jak ich używać do badania pytań dotyczących raka i czynnika.