Name: Funkcjonalna i morfologiczna ocena unerwienia przepony przez freniczne neurony ruchowe (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: Poznaj metodę oceny czynnościowej i morfologicznej unerwienia przepony przez nerwy przeponowe w modelach gryzoni. Technika łączy rejestrację potencjałów czynnościowych z immunohistochemią całych preparatów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez NINDS (grant #1R01NS079702 dla A.C.L.) oraz program SURP na Uniwersytecie Thomasa Jeffersona (M.M.).

Procedury eksperymentalne zostały zatwierdzone przez instytucjonalny komitet ds. opieki i użytkowania zwierząt na Uniwersytecie Thomasa Jeffersona i przeprowadzone zgodnie z Dyrektywą Rady Wspólnot Europejskich (2010/63/UE, 86/609/EWG i 87-848/EWG), Przewodnikiem NIH dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych oraz Polityką Towarzystwa Neuronauki dotyczącą wykorzystania zwierząt w badaniach neurologicznych.
1. Złożone potencjały czynnościowe mięśni (CMAPs)
<ol>
	<li>Przygotowanie zwierzęcia:
	<ol>
		<li>Znieczulić szczura za pomocą środka wziewnego (izofluranu) w dawce 1-2% dostarczanego do efektu lub we wstrzyknięciu (ketamina, ksylazyna, acepromazyna). Dawkowanie znieczulenia iniekcyjnego jest następujące: 95,0 mg/kg ketaminy, 10,0 mg/kg ksylazyny, 0,075 mg/kg acepromazyny. 
		UWAGA: Podczas przeprowadzania tego protokołu nagrywania CMAP z powodzeniem stosujemy zarówno metody znieczulające wziewne, jak i iniekcyjne, bez żadnych preferencji.</li>
		<li>Zwierzę musi być utrzymywane na odpowiedniej głębokości znieczulenia przed rozpoczęciem zabiegu, do zakończenia operacji i do momentu zadziałania buprenorfiny po operacji. Potwierdź prawidłowe znieczulenie przez krótkie uszczypnięcie palca u nogi, aby ustalić, czy nie wywołuje reakcji odstawienia. Dodatkowo przetestuj odruch rogówkowy wacikiem. Podczas zabiegu chirurgicznego należy stwierdzić, że częstość akcji serca i częstość oddechów nie wzrosły, co sugeruje, że głębokość znieczulenia stała się zbyt mała.</li>
		<li>Nałóż maść weterynaryjną na oczy zwierzęcia, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia.</li>
		<li>Chirurg powinien umyć ręce środkiem dezynfekującym (peeling z chlorheksydyną) przed rozpoczęciem operacji. Chirurg powinien nosić sterylne rękawice, maskę na twarz i fartuch lub czysty fartuch laboratoryjny. Wszystkie narzędzia powinny być umyte i autoklawowane przed zabiegiem. Dodaj pasek wskaźnika sterylizacji do zestawu narzędzi przed autoklawowaniem na poziomie narzędzi, aby sprawdzić, czy sterylizacja została zakończona. Chirurg powinien sprawdzić, czy cała linia na pasku jest przed rozpoczęciem operacji. Zaklej również zewnętrzną część pudełka taśmą wskazującą do autoklawu. Jeśli operacja ma być przeprowadzona na kilku zwierzętach tego samego dnia, wyczyść narzędzia między operacjami i wysterylizuj w sterylizatorze z kulkami szklanymi. W razie potrzeby należy wysterylizować oba końce instrumentu w sterylizatorze z kulkami szklanymi, umieszczając uchwyt narzędzia w sterylizatorze na odpowiedni czas, wyjmując instrument sterylnym hemostatem, schładzając go w sterylnym polu, a następnie umieszczając funkcjonalną końcówkę instrumentu w sterylizatorze z kulkami szklanymi na odpowiedni okres czasu.</li>
		<li>Po znieczuleniu zwierzęcia umieść je na desce operacyjnej powierzchnią grzbietową do dołu i brzuchem skierowanym do góry, tak aby można było użyć taśmy do przymocowania przednich kończyn zwierzęcia do deski chirurgicznej.</li>
		<li>Ogolić powierzchnię brzuszną doogonowo, zaczynając od podstawy czaszki i upewnij się, że obszar wokół brzucha po obu stronach linii środkowej jest ogolony w zależności od tego, która półprzepona przepona jest rejestrowana. Nałóż powidon-jod na ogoloną powierzchnię skóry.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie do nagrań CMAP:
	<ol>
		<li>Po przygotowaniu zwierzęcia umieść elektrodę uziemiającą podskórnie w ogonie (ryc. 1).</li>
		<li>Umieścić elektrodę odniesienia podskórnie w przeciwległym dolnym odcinku brzucha.</li>
		<li>Umieść żel przewodzący na samoprzylepnym pasku powierzchniowym lub elektrodzie rejestrującej dysk (wymiary powierzchniowej elektrody taśmowej: 0,5 x 3 cm), a następnie umieść elektrodę powierzchniową poprzecznie wzdłuż jednostronnego brzegu żebrowego.</li>
		<li>Elektrody stymulujące należy umieścić przezskórnie w odległości 0,5 cm od tchawicy i powyżej obojczyka. Wprowadzić elektrody na głębokość około 1,0 cm przez skórę. Zabezpiecz elektrody ręcznie, aby ich położenie nie zmieniało się wraz z kolejnymi stymulacjami. 
		UWAGA: Elektrody stymulujące kąt 90° względem skóry w miejscu wprowadzenia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zapisy złożonego potencjału czynnościowego mięśni (CMAP):
	<ol>
		<li>Uzyskanie zapisów elektrofizjologicznych za pomocą stymulatora/wzmacniacza, a następnie komputerowa analiza danych.</li>
		<li>Parametry bodźca stymulacji pojedynczym pociągnięciem powinny wynosić 0,5 ms, impulsy supramaksymalne 1,0 Hz. Amplituda bodźca powinna wynosić od 6,0 do 8,0 V (rysunek 2A). 
		UWAGA: W eksperymencie użyj intensywności bodźca o tej samej amplitudzie u zwierząt. Celem jest maksymalizacja amplitudy odpowiedzi poprzez zastosowanie minimalnej amplitudy stymulacji. Ważne jest, aby pamiętać, że początkowa reakcja, która występuje w momencie stymulacji, jest artefaktem stymulacji. Ponadto należy zadbać o uzyskanie odpowiedzi CMAP, która jest poprzedzona stabilną/płaską linią wyjściową po artefakcie stymulacji, po której następuje szybka odpowiedź CMAP. W celu uzyskania takiej odpowiedzi może być konieczna zmiana położenia elektrod stymulacyjnych i/lub rejestrujących.</li>
		<li>Odczekaj 30 sekund między stymulacjami i powtórz 10 stymulacji z rzędu, aby uzyskać średnią odpowiedź (Rysunek 2B-C). Zmierz amplitudę od linii podstawowej do wartości szczytowej (rysunek 2A). Przeprowadzić stymulację nerwu przeponowego w fazie cyklu oddechowego zwierzęcia, kiedy nerw przeponowy/przepona nie jest aktywowany. Procedurę można powtórzyć na tym samym zwierzęciu w przypadku przeciwległej półmembrany.</li>
		<li>Po ostatniej sesji nagrania CMAP należy przeprowadzić perfuzję zwierzęcia, jeśli ma być przeprowadzone barwienie NMJ. Przeprowadzaj zapisy CMAP wielokrotnie na tym samym zwierzęciu mniej więcej raz w tygodniu (lub w wybranych odstępach czasu).</li>
		<li>Po nagraniach CMAP dotyczących przeżycia, pozwól zwierzęciu dojść do siebie na podkładce grzewczej z ciepłą wodą w krążącej ciepłej wodzie i stale monitoruj podczas rekonwalescencji, aż się obudzi i znajdzie się w pozycji rufowej. Nie należy zwracać zwierzęcia, które przeszło operację, do towarzystwa innych zwierząt, dopóki nie wyzdrowieje.</li>
		<li>Po położeniu na rufie należy monitorować zwierzę co 12 godzin przez pierwsze 48 godzin (następnie raz dziennie). Jeśli zwierzę wydaje się być odwodnione (wiotka skóra, apatia), należy podawać płyny (roztwór Ringera z mleczanami; podskórnie; 1-2 ml na wstrzyknięcie, z obróconymi miejscami; 2 razy dziennie) do momentu ustabilizowania się masy ciała i utraty płynów po operacji. W ostrym okresie pooperacyjnym należy podawać zwierzętom zmiękczony pokarm w małych naczyniach, jeśli to konieczne, aby zachęcić do jedzenia, jeśli nie mogą dosięgnąć karmnika z drucianą pokrywą.</li>
		<li>Buprenorfinę należy podawać w dawce 0,05 mg/kg mc. przed zakończeniem zabiegu, a następnie w odstępach 12-godzinnych przez pierwsze 24 godziny (i w zależności od objawów bólu/stresu po zabiegu) we wstrzyknięciu podskórnym (obrócenie miejsca). Jeśli później zauważy się oznaki bólu lub niepokoju, należy leczyć zwierzęta buprenorfiną. Objawy wskazujące na ból/niepokój obejmują brak aktywności, wokalizacje, brak jedzenia lub picia (odwodnienie), nadmierną utratę masy ciała, pilnowanie, nadmierne gryzienie lub drapanie w miejscu nacięcia. Dodatkowe kryteria stosowane w określaniu bólu i dystresu obejmują brak reakcji na bodźce zewnętrzne, przejściową lub niesprowokowaną wokalizację, ciężki lub nieprawidłowy oddech, uporczywą czerwono-brązową wydzielinę z nosa i oka, wyraźną piloerekcję. Monitoruj również dowody złej higieny, które sugerowałyby chore zwierzęta. Jeśli po 72 godzinach leczenia zaobserwuje się, że zwierzę nadal znajduje się w niebezpieczeństwie, (zgodnie z kryteriami bólu/stresu opisanymi powyżej i po otrzymaniu opisanego powyżej protokołu przeciwbólowego), należy je poddać eutanazji.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Analiza połączenia nerwowo-mięśniowego przepony (NMJ)
<ol>
	<li>Sekcja zwierząt:
	<ol>
		<li>Podać zwierzęciu przedawkowanie znieczulenia iniekcyjnego (3-krotność dawki użytej powyżej: ketamina w dawce 285,0 mg/kg, ksylazyna w dawce 30,0 mg/kg, acepromazyna w dawce 0,225 mg/kg; podawana dootrzewnowo). Po przedawkowaniu wszystkie zwierzęta powinny zostać poddane drugiej metodzie eutanazji (torakotomii) w celu zapewnienia śmierci. Zgon powinien być potwierdzony poprzez obserwację zatrzymania akcji serca i oddechu oraz poprzez odnotowanie stałych i rozszerzonych źrenic zwierzęcia.</li>
		<li>Przeprowadź laparotomię skalpelem lub nożyczkami preparacyjnymi, przedłużając wycięcie z wyrostka zyfusowego doogonowo wzdłuż linii środkowej. Ostrożnie oddziel skórę i tkankę łączną od leżących pod nią mięśni za pomocą skalpela i kleszczy.</li>
		<li>Ciągnąc za wyrostek zyfusowy, użyj nożyczek preparacyjnych, aby usunąć całą przeponę, upewniając się, że przepona pozostaje przyczepiona do otaczającej kości. Jest to ważne, ponieważ zapobiegnie uszkodzeniom mięśnia przepony, pozwoli na pomyślne rozwarstwienie całej przepony i pomoże w oczyszczeniu mięśni przed późniejszym barwieniem. 
		UWAGA: W tym momencie zwierzę może być perfranowane, jeśli to konieczne.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Czyszczenie i barwienie membrany:
	<ol>
		<li>Przypnij całą rozciętą membranę, górną powierzchnią skierowaną do góry, do kauczuku silikonowego na szklanej szalce Petriego o średnicy 100 mm w 4% paraformaldehydzie (wykonanym z 1% soli fizjologicznej buforowanej fosforanem - PBS) przez 20 minut za pomocą mikroskopu stereoskopowego. Rozciągnij przeponę, aby ją napiąć, a następnie za pomocą szpilek przeciw owadom przygwoźdź otaczającą tkankę, aby uniknąć przygwożdżenia samego mięśnia przepony (ryc. 3).</li>
		<li>Ostrożnie oczyść tkankę łączną tylko z górnej powierzchni mięśni za pomocą kleszczy #5 i małych nożyczek. 
		UWAGA: Wszystkie kolejne kroki tego protokołu barwienia należy wykonywać powoli, kołysząc się w temperaturze pokojowej osłoniętej od światła, chyba że określono inaczej. Upewnij się, że mięsień przepony jest zawsze całkowicie zanurzony w płynie, aby uniknąć wysuszenia.</li>
		<li>Przed barwieniem przygotuj wszystkie niezbędne odczynniki: 1x PBS, 2% albuminy surowicy bydlęcej (BSA)/PBS, 0,1 M glicyny wykonanej w 2% BSA/PBS, 4% paraformaldehydu (PFA) w 1x PBS i 0,2% TBP (0,2% Triton X100 w 2% BSA/PBS). Należy pamiętać o wstępnym schłodzeniu metanolu w temperaturze -20 °C.</li>
		<li>Prać 3x przez 10 min w 1x PBS.</li>
		<li>Inkubować w 0,1 M glicynie (wytworzonej w 2% BSA/PBS) przez 30 min.</li>
		<li>Inkubować w roztworze RBTX (α-bungarotoksyny sprzężonej z rodaminą) przez 15 minut. Roztwór dla RBTX jest następujący: Sprzężona z rodaminą alfa bungarotoksyna rozcieńczenie 1:400 w 1x PBS. 
		UWAGA: W tym protokole stosuje się rodaminę, ale do barwienia można użyć dowolnego fluoroforu.</li>
		<li>Prać 3x przez 10 min w 1x PBS.</li>
		<li>W zamrażarce o temperaturze -20 °C inkubować z MeOH przez 5 min. 
		UWAGA: Nie dodawaj MeOH przed umieszczeniem mięśni w zamrażarce i natychmiast usuń roztwór po okresie inkubacji.</li>
		<li>Prać 3x przez 10 min w 1x PBS.</li>
		<li>Blokuj 0,2% TBP przez 1 godzinę (0,2% Triton wykonany w 2% BSA/PBS).</li>
		<li>Inkubować z roztworem przeciwciała pierwszorzędowego (w 0,2% TBP) w temperaturze 4 °C przez noc podczas kołysania. Rozcieńczenia przeciwciał w następujący sposób: SV2 (1:10) i SMI-312 (1:1,000).</li>
		<li>Prać 3x przez 10 min z 0,2% TBP.</li>
		<li>Inkubować z przeciwciałem drugorzędowym, stosując rozcieńczenie 1:100 FGM1 (anty-mysia IgG1 kozy sprzężona z FITC; wykonana w 0,2% TBP) podczas kołysania przez 1 godz. 
		UWAGA: Chronić przed światłem przez pozostałą część protokołu barwienia.</li>
		<li>Myć 3x przez 10 min z 1x PBS.</li>
		<li>Ponownie oczyść otaczającą tkankę łączną na górnej (patrz wyżej) powierzchni mięśnia przed montażem i założeniem ślizgu nakrywkowego. 
		UWAGA: Zaleca się oczyszczenie, a następnie zamontowanie próbki natychmiast po zabarwieniu. Jednakże, w razie konieczności, próbka może być pokryta 1 PBS, owinięta w parafilm w celu zapobieżenia parowaniu i przechowywana w temperaturze 4 °C przez okres do 1 tygodnia, z codzienną wymianą PBS.</li>
		<li>Po zamontowaniu na szkiełku nakrywkowym z nietwardą powłoką Vectashield. Uszczelnij krawędzie szkiełka nakrywkowego przezroczystym lakierem do paznokci, aby zapobiec wysychaniu. Szkiełka można przechowywać przez długi czas w pozycji leżącej płasko w kartonowych teczkach na prowadnice w temperaturze -20 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza i obrazowanie konfokalne:
	<ol>
		<li>Przeanalizuj ilościowo morfologię barwionej i zamontowanej półmembrany pod 20-krotnym i 40-krotnym powiększeniem za pomocą pionowego mikroskopu epifluorescencyjnego. 
		UWAGA: Ponieważ przepona jest barwiona i analizowana w sposób całościowy, mięsień jest dość gruby. W związku z tym większość barwień fluorescencyjnych jest całkowicie nieostra, gdy obraz statyczny jest wykonywany przy użyciu niekonfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej. Z tego powodu najlepiej jest przeprowadzać analizę NMJ w czasie rzeczywistym pod mikroskopem, ponieważ pozwala to na ciągłe skupianie się "w górę" i "w dół" przez mięsień, aby prawidłowo zidentyfikować morfologię każdego z poszczególnych NMJ. Korzystając z tego podejścia, można łatwo śledzić trajektorię poszczególnych aksonów ruchowych, gdy poruszają się one w tkance w relacji przestrzennej do klastrów receptorów postsynaptycznych.</li>
		<li>Mierząc długość mięśnia od brzusznej do grzbietowej, podziel mięsień na 3 oddzielne sekcje do analizy w oparciu o topograficzne wzorce unerwienia z określonych poziomów rdzenia kręgowego (ryc. 4H).</li>
		<li>Zaczynając od brzusznego obszaru mięśnia i poruszając się grzbietowo, przeanalizuj wszystkie en face NMJ zlokalizowane na powierzchniowych włóknach mięśniowych. Nie należy analizować włókien mięśniowych głębiej niż pierwsze 3-4 włókna od powierzchni, ponieważ interpretacja może być trudna ze względu na gorszą penetrację przeciwciał (RBTX wnika znacznie głębiej w mięsień ze względu na mały rozmiar toksyny w porównaniu z większymi przeciwciałami używanymi do znakowania neuronów).</li>
		<li>Zidentyfikuj każdy NMJ jako nienaruszony, jeśli przedkońcowy akson neuronu ma grubą średnicę, a wszystkie obszary zakończenia nerwowego całkowicie pokrywają się z leżącymi poniżej receptorami acetylocholiny mięśniowej (AChR).</li>
		<li>Zidentyfikuj każdy NMJ jako częściowo odnerwiony, jeśli jakikolwiek obszar leżącego poniżej mięśnia AChR nie jest zajęty odpowiednim zakończeniem nerwowym.</li>
		<li>Zidentyfikuj każdy NMJ jako całkowicie odnerwiony, jeśli mięśniowe AChR nie mają odpowiadającego mu zakończenia nerwowego (ważne jest również, aby inne NMJ z oznakowanymi neuronami znajdowały się w tym samym polu ostrości, aby można było mieć pewność, że brak zakończenia nerwowego nie jest po prostu spowodowany słabą penetracją przeciwciał w tym obszarze mięśni).</li>
		<li>Zidentyfikuj każdy NMJ jako unerwiony wielokrotnie, jeśli istnieje więcej niż jeden akson przedkońcowy unerwiający pojedynczy NMJ (oznacza to, że nastąpił pewien poziom denerwacji i prawdopodobne próby reinervacji w tym połączeniu).</li>
		<li>Zidentyfikuj każdy NMJ jako cienko unerwiony, jeśli NMJ całkowicie nakłada się na zakończenie nerwowe i leżące poniżej AChR, ale ma cienki akson przedkońcowy (wskazuje to również na pewien poziom denerwacji i prób reinerwacji).</li>
		<li>Przeprowadź analizę dla każdego z 3 zidentyfikowanych regionów dla wszystkich powyższych kategorii NMJ dla każdego zwierzęcia. Uśrednić dane z każdego zwierzęcia z wynikami uzyskanymi od innych zwierząt z tej samej grupy doświadczalnej. Około 200-300 połączeń w mięśniu półprzepony szczura i 150-200 w mięśniu półprzepony myszy należy określić ilościowo u co najmniej 3 (najlepiej 5-6 lub więcej) zwierząt na grupę doświadczalną.</li>
		<li>Uzyskanie obrazów konfokalnych o wysokiej rozdzielczości, wykorzystywanych do publikacji, za pomocą mikroskopu konfokalnego.</li>
		<li>Uzyskaj stosy Z w krokach co 0,3 μm dla głębokości 20-40 μm i zbierz dodatkowe sekcje optyczne powyżej i poniżej każdego złącza, aby upewnić się, że uwzględniony jest cały profil synaptyczny.</li>
		<li>Użyj oprogramowania do akwizycji, aby zrekonstruować obrazy z serii Z w celu uzyskania projekcji o maksymalnej intensywności.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Miller, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practice+parameter%3A+the+care+of+the+patient+with+amyotrophic+lateral+sclerosis+%28an+evidence-based+review%29%3A+report+of+the+Quality+Standards+Subcommittee+of+the+American+Academy+of+Neurology%3A+ALS+Practice+Parameters+Task+Force%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Practice parameter: the care of the patient with amyotrophic lateral sclerosis (an evidence-based review): report of the Quality Standards Subcommittee of the American Academy of Neurology: ALS Practice Parameters Task Force.</a> Neurology. 52, 1311-1323 (1999).</li>
<li>Sandhu, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+recovery+following+high+cervical+hemisection%5BTitle%5D)+AND+%22Respir+Physiol+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Respiratory recovery following high cervical hemisection.</a> Respir Physiol Neurobiol. 169, 94-101 (2009).</li>
<li>Kaplan, L. M., Hollander, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+dysfunction+in+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chest+Med%22%5BJournal%5D)">Respiratory dysfunction in amyotrophic lateral sclerosis.</a> Clin Chest Med. 15, 675-681 (1994).</li>
<li>Holtz, A., Levi, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHoltz%2C+A+%22Spinal+Cord+Injury%22">Spinal Cord Injury</a>. , Oxford. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.alibris.com/
 ">http://www.alibris.com/
 </a> (2010).</li>
<li>Bruijn, L. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ALS-linked+SOD1+mutant+G85R+mediates+damage+to+astrocytes+and+promotes+rapidly+progressive+disease+with+SOD1-containing+inclusions%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">ALS-linked SOD1 mutant G85R mediates damage to astrocytes and promotes rapidly progressive disease with SOD1-containing inclusions.</a> Neuron. 18, 327-338 (1997).</li>
<li>Sharma, H., Alilain, W. J., Sahdu, A., Silver, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatments+to+restore+respiratory+function+after+spinal+cord+injury+and+their+implications+for+regeneration%2C+plasticity+and+adaptation%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Treatments to restore respiratory function after spinal cord injury and their implications for regeneration, plasticity and adaptation.</a> Experimental Neurology. 235, 18-25 (2012).</li>
<li>Gourévitch, B., Mellen, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+preB%C3%B6tzinger+complex+as+a+hub+for+network+activity+along+the+ventral+respiratory+column+in+the+neonate+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroimage%22%5BJournal%5D)">The preBötzinger complex as a hub for network activity along the ventral respiratory column in the neonate rat.</a> Neuroimage. 98, 460-474 (2014).</li>
<li>Strakowski, J. A., Pease, W. S., Johnson, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phrenic+nerve+stimulation+in+the+evaluation+of+ventilator-dependent+individuals+with+C4-+and+C5-level+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Phys+Med+Rehabil%22%5BJournal%5D)">Phrenic nerve stimulation in the evaluation of ventilator-dependent individuals with C4- and C5-level spinal cord injury.</a> Am J Phys Med Rehabil. 86, 153-157 (2007).</li>
<li>Wright, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+muscarinic+acetylcholine+receptor+subtypes+contribute+to+stability+and+growth%2C+but+not+compensatory+plasticity%2C+of+neuromuscular+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Distinct muscarinic acetylcholine receptor subtypes contribute to stability and growth, but not compensatory plasticity, of neuromuscular synapses.</a> J Neurosci. 29, 14942-14955 (2009).</li>
<li>Li, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+the+astrocyte+glutamate+transporter+GLT1+exacerbates+phrenic+motor+neuron+degeneration%2C+diaphragm+compromise%2C+and+forelimb+motor+dysfunction+following+cervical+contusion+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Overexpression of the astrocyte glutamate transporter GLT1 exacerbates phrenic motor neuron degeneration, diaphragm compromise, and forelimb motor dysfunction following cervical contusion spinal cord injury.</a> J Neurosci. 34, 7622-7638 (2014).</li>
<li>Nicaise, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+phrenic+motor+neuron+loss+and+transient+respiratory+abnormalities+after+unilateral+cervical+spinal+cord+contusion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Early phrenic motor neuron loss and transient respiratory abnormalities after unilateral cervical spinal cord contusion.</a> Journal of neurotrauma. 30, 1092-1099 (2013).</li>
<li>Nicaise, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phrenic+motor+neuron+degeneration+compromises+phrenic+axonal+circuitry+and+diaphragm+activity+in+a+unilateral+cervical+contusion+model+of+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Phrenic motor neuron degeneration compromises phrenic axonal circuitry and diaphragm activity in a unilateral cervical contusion model of spinal cord injury.</a> Exp Neurol. 235, 539-552 (2012).</li>
<li>Lepore, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+hyperstimulation+alters+site+of+disease+onset+and+course+in+SOD1+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">Peripheral hyperstimulation alters site of disease onset and course in SOD1 rats.</a> Neurobiol Dis. 39, 252-264 (2010).</li>
<li>Alilain, W. J., Horn, K. P., Hu, H., Dick, T. E., Silver, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+regeneration+of+respiratory+pathways+after+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional regeneration of respiratory pathways after spinal cord injury.</a> Nature. 475, 196-200 (2011).</li>
<li>Zhang, B. M. F., Cummings, K. J., Frappell, P. B., Wilson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+method+for+conscious+airway+resistance+and+ventilation+estimation+in+neonatal+rodents+using+plethysmography+and+a+mechanical+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Respir+Physiol+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Novel method for conscious airway resistance and ventilation estimation in neonatal rodents using plethysmography and a mechanical lung.</a> Respir Physiol Neurobiol. 201, 75-83 (2014).</li>
<li>Ngo, S. T., Bellingham, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurophysiological+recording+of+the+compound+muscle+action+potential+for+motor+unit+number+estimation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neuromethods%22%5BJournal%5D)">Neurophysiological recording of the compound muscle action potential for motor unit number estimation in mice.</a> Neuromethods. 78, 225-235 (2013).</li>
<li>Nicaise, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Degeneration+of+phrenic+motor+neurons+induces+long-term+diaphragm+deficits+following+mid-cervical+spinal+contusion+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Degeneration of phrenic motor neurons induces long-term diaphragm deficits following mid-cervical spinal contusion in mice.</a> Journal of neurotrauma. 29, 2748-2760 (2012).</li>
<li>Lepore, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+glial-restricted+progenitor+transplantation+into+cervical+spinal+cord+of+the+SOD1G93A+mouse+model+of+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Human glial-restricted progenitor transplantation into cervical spinal cord of the SOD1G93A mouse model of ALS.</a> PLoS One. 6, (2011).</li>
<li>Lepore, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focal+transplantation-based+astrocyte+replacement+is+neuroprotective+in+a+model+of+motor+neuron+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Focal transplantation-based astrocyte replacement is neuroprotective in a model of motor neuron disease.</a> Nature neuroscience. 11, 1294-1301 (2008).</li>
</ol>

Nie mamy nic do ujawnienia.

Ponieważ funkcja oddechowa jest upośledzona zarówno w urazowym SCI, jak i ALS, opracowanie terapii ukierunkowanych na oddychanie, a konkretnie unerwienie przepony, jest klinicznie istotne5,6. W celu kompleksowego zbadania funkcji układu oddechowego należy zastosować metodę podejścia łączonego. CMAP mierzą stopień funkcjonalnego unerwienia przepony za pomocą zewnętrznej stymulacji nerwu przeponowego, ale nie endogennego opuszkowo-rdzeniowego napędu oddechowego8. Ponadto zapisy te nie pozwalają na bad...

Stwardnienie zanikowe boczne (ALS) jest wyniszczającą chorobą neuronu ruchowego związaną z utratą zarówno górnych, jak i dolnych neuronów ruchowych i w konsekwencji paraliżem mięśni. W momencie rozpoznania przeżycie pacjenta wynosi średnio tylko 2-5lat1. Utrata przeponowego neuronu ruchowego (PhMN) jest krytycznym elementem patogenezy ALS. Pacjenci ostatecznie umierają z powodu utraty unerwienia przepony PhMN, głównego mięśnia wdechu2,3. Urazowy uraz rdzenia kręgowego (SCI) jest również poważnym problemem, z towarzyszącymi trudnościami w oddychaniu. Każdego roku dochodzi do około 12 000 nowych przypadków SCI, 4 z powodu urazowego uszkodzenia rdzenia kręgowego. Pomimo niejednorodności choroby pod względem lokalizacji, rodzaju i ciężkości, większość przypadków SCI wiąże się z urazem rdzenia kręgowego w odcinku szyjnym, co często prowadzi do wyniszczającego i trwałego upośledzenia oddychania. Oprócz ALS i SCI, inne choroby ośrodkowego układu nerwowego (OUN) mogą być związane z dysfunkcją przeponowejoddychalności 5,6.
Nerw przeponowy to odprowadzający nerw ruchowy, który unerwia półprzeponę ipsilateralną i która pochodzi z ciał komórkowych PhMN znajdujących się na poziomach C3-C5 ipsilateralnej szyjki rdzenia kręgowego. Wyjście PhMN jest kontrolowane przez zstępujący wkład opuszkowo-rdzeniowy z pnia mózgu w obszarze znanym jako rostralna brzuszna grupa oddechowa (rVRG)7. Obwód membranowy rVRG-PhMN ma kluczowe znaczenie dla kontroli oddychania wdechowego, a także innych niewentylacyjnych zachowań przepony. Różne urazy urazowe i zaburzenia neurodegeneracyjne, które wpływają na ten obwód, mogą prowadzić do głębokiego pogorszenia funkcji oddechowych i jakości życia pacjenta. Zstępujący dopływ do PhMN z rVRG, przeżycie PhMN, integralność nerwu przeponowego i prawidłowe unerwienie w połączeniu nerwowo-mięśniowym przepony (NMJ) są niezbędne do prawidłowego funkcjonowania przepony. Dlatego ważne jest, aby zastosować techniki, które mogą ilościowo ocenić ten obwód in vivo w modelach gryzoni z ALS, SCI i innymi chorobami OUN.
Celem tego protokołu jest opisanie eksperymentalnych narzędzi do oceny unerwienia przepony PhMN zarówno na poziomie elektrofizjologicznym, jak i morfologicznym. Złożone potencjały czynnościowe mięśni (CMAP) są rejestrowane poprzez stymulację wszystkich odprowadzających aksonów neuronów ruchowych danego nerwu ruchowego, a następnie analizę wywołanej odpowiedzi depolaryzacyjnej docelowych włókien mięśniowych. Technika ta może być stosowana in vivo u znieczulonych szczurów i myszy w celu ilościowego określenia funkcjonalnego unerwienia półprzepony przez PhMN8. Ze względu na fakt, że CMAP reprezentują jednoczesny zapis wszystkich (lub przynajmniej wielu/większości) włókien mięśniowych całej półmembrany, przydatne jest również zbadanie fenotypów poszczególnych aksonów ruchowych i włókien mięśniowych w przeponie NMJ w celu śledzenia zmian morfologicznych istotnych dla choroby i terapii, takich jak częściowe i całkowite odnerwienie, kiełkowanie regeneracyjne i ponowne unerwienie. Można to osiągnąć za pomocą immunohistochemii całego montażu (IHC) przepony, a następnie szczegółowej oceny morfologicznej poszczególnych NMJ w całym mięśniu9. Połączenie CMAP i analizy NMJ zapewnia skuteczne podejście do ilościowego badania unerwienia przepony w modelach chorób OUN i PNS u gryzoni.

<table><tbody><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Fisher</td><td>T353-500</td><td>Najpierw przygotować 10% roztwór w dejonizowanej wodzie destylowanej; zrobić 4% za pomocą 1x PBS, dostosować pH do 7,4</td></tr><tr><td>1x sól fizjologiczna buforowana fosforanami, pH 7,4</td><td>Invitrogen</td><td>10010049</td><td></td></tr><tr><td>2% albumina surowicy bydlęcej (2% BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3059-100g</td><td>Rozpuścić 2 g BSA w 100 ml 1x PBS</td></tr><tr><td>0,2% Triton X100 w 2% BSA/PBS (bufor blokujący)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284-100mL</td><td>Rozpuścić 0,2 ml/100 ml 2% BSA/PBS</td></tr><tr><td>0,1 M Glicyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G-7126</td><td>Dodać 0,185 g do 25 ml 2% BSA/</td></tr><tr><td>PBS&alpha;-bungarotoxin</td><td>Invitrogen</td><td>T1175</td><td>Stężenie 1:400</td></tr><tr><td>SMI-312</td><td>Sternberger Monoklonale</td><td>SMI312</td><td>Stężenie 1:1,000</td></tr><tr><td>SV2</td><td>Badania rozwojowe Bank hybrydoma</td><td>SV2-Supernatant</td><td>Stężenie 1:10</td></tr><tr><td>FITC koza anty-mysie IgG1</td><td>Roche</td><td></td><td>3117731001 Stężenie 1:100</td></tr><tr><td>Kauczuk silikonowy</td><td>Sylgard, Dow Corning</td><td>Część # 184</td><td>Postępuj zgodnie z instrukcjami dołączonymi do zestawu: można używać różnych rozmiarów naczyń hodowlanych (30 mm, 60 mm, 100 mm) w zależności od potrzeb</td></tr><tr><td>Fluorescencyjne medium montażowe Vectashield</td><td>Laboratoria wektorowe</td><td>H-1000</td><td>Nie jest to sztywny nośnik. Szkiełko nakrywkowe należy zabezpieczyć przezroczystym lakierem do paznokci.</td></tr><tr><td>Małe nożyczki sprężynowe</td><td>Fine Science Tools</td><td>15002-08</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze preparacyjne</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-51</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do nagrań CMAP</td><td>Zakres 3.5.6; ADI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Elektrody powierzchniowe dysku</td><td>Natus neurology</td><td>019-409000</td><td></td></tr><tr><td>Podskórne elektrody igłowe</td><td>Natus neurologia</td><td>019-453100</td><td></td></tr><tr><td>Żel przewodzący</td><td>Aquasonic</td><td>122-73720</td><td></td></tr><tr><td>Stymulator/system rejestracji do zapisów CMAP</td><td>Stymulator</td><td></td><td></td>ADI Powerlab 8SP</tr><tr><td>Wzmacniacz do nagrań</td> <td>CMAPWzmacniacz biologiczny (BioAMP</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>)

funkcjonalna i morfologiczna ocena unerwienia przepony przez freniczne neurony ruchowe

Functional and Morphological Assessment of Diaphragm Innervation by Phrenic Motor Neurons

Ten protokół skupia się w szczególności na narzędziach do oceny unerwienia przepony przez przeponowy neuronu ruchowego (PhMN) zarówno na poziomie elektrofizjologicznym, jak i morfologicznym. Zapis złożonego potencjału czynnościowego mięśni (CMAP) po stymulacji nerwu przeponowego można wykorzystać do ilościowej oceny funkcjonalnego unerwienia przepony przez PhMN rdzenia kręgowego szyjki macicy in vivo u znieczulonych szczurów i myszy. Ponieważ CMAP reprezentują jednoczesny zapis wszystkich włókien mięśniowych całej półmembrany, przydatne jest również zbadanie fenotypów poszczególnych aksonów ruchowych i włókien mięśniowych w przeponie NMJ w celu śledzenia zmian morfologicznych istotnych dla choroby i terapii, takich jak częściowe i całkowite odnerwienie, kiełkowanie regeneracyjne i reinerwacja. Można to osiągnąć za pomocą immunohistochemii całego mocowania (IHC) przepony, a następnie szczegółowej oceny morfologicznej poszczególnych NMJ w całym mięśniu. Połączenie CMAP i analizy NMJ zapewnia skuteczne podejście do ilościowego badania unerwienia przepony w modelach chorób OUN i PNS u gryzoni.

Dorosłe szczury Sprague-Dawley poddano laminektomii (kontrolne zwierzęta nieuszkodzone) lub jednostronnemu zmiażdżeniu rdzenia kręgowego (SCI) na poziomie C410-12. W 5. tygodniu po operacji szczytowa amplituda CMAP rejestrowana z półprzepony po stronie ipsilateralnej do miejsca laminektomii/urazu była znacznie obniżona u szczurów z SCI (Rycina 2C) w porównaniu z kontrolą po samej laminektomii (Rycina 2B). Wszystkie NMJ w półprzeponie były całkowicie nienaruszone u zdrowych szc...

Złożony zapis potencjału czynnościowego mięśni ilościowo ocenia funkcjonalne unerwienie przepony przez przeponowe neurony ruchowe. Immunohistochemia przepony pełnej polega na ocenie unerwienia morfologicznego w poszczególnych połączeniach nerwowo-mięśniowych. Celem tego protokołu jest pokazanie, w jaki sposób te dwie potężne metodologie mogą być wykorzystane w różnych modelach choroby rdzenia kręgowego u gryzoni.

Funkcjonalna i morfologiczna ocena unerwienia przepony przez freniczne neurony ruchowe

This protocol specifically focuses on tools for assessing phrenic motor neuron (PhMN) innervation of the diaphragm at both the electrophysiological and ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest ilościowa ocena unerwienia czynnościowego i morfologicznego przepony przez motoneurony nerwu przeponowego w szyjnym odcinku rdzenia kręgowego. Jest to realizowane poprzez rejestrację złożonego potencjału czynnościowego mięśnia z połowy przepony u znieczulonych zwierząt po supramaksymalnej stymulacji jednostronnego nerwu przeponowego. Kolejnym krokiem jest przeprowadzenie immunohistochemii całego preparatu przepony w celu morfologicznej oceny unerwienia poszczególnych złącz neuromięśniowych.W ostatecznym rozrachunku połączenie analizy złożonego potencjału czynnościowego mięśnia i złącza nerwowo-mięśniowego stanowi potężne podejście do ilościowego badania unerwienia przepony w modelach gryzoni w chorobach OUN i OUNobwodowego. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie urazów rdzenia kręgowego, takie jak to, czy interwencje terapeutyczne mogą zostać skutecznie wykorzystane do przywrócenia funkcji przepony. Zastosowania tej techniki rozciągają się na terapię chorób takich jak urazowy uraz rdzenia kręgowego i ILS, ponieważ funkcja oddechowa przepony odgrywa kluczową rolę w rokowaniach pacjentów w obu tych wyniszczających stanach. Procedurę zaprezentują dr Kali, stażysta podoktorski w moim laboratorium, Melanie Martin, studentka studiów licencjackich w laboratorium dr. Wrighta oraz Tamara Holla, technik badawczy w moim laboratorium.Po znieczuleniu zwierzęcia należy umieścić je na stole operacyjnym w pozycji brzusznej i przymocować przednie kończyny do stołu. Następnie należy ogolić powierzchnię brzuszną od podstawy czaszki w kierunku brzucha po obu stronach linii środkowej. Po oczyszczeniu skóry należy ustawić elektrody, mocując elektrodę uziemiającą do ogona, a elektrodę referencyjną umieścić podskórnie w przeciwległej dolnej części brzucha.Elektrodę rejestrującą należy przygotować, nakładając żel przewodzący na część samoprzylepną, a następnie przymocować ją wzdłuż jednostronnego brzegu żebrowego. Następnie należy umieścić elektrody stymulujące, przezskórnie w odstępach pół centymetra, bocznie względem tchawicy i powyżej obojczyka. Powinny one wnikać prostopadle do skóry na głębokość około jednego centymetra.Elektrody te muszą być dobrze zamocowane, co najlepiej zrobić ręcznie. Podłącz wszystkie elektrody do odpowiednich stymulatorów i wzmacniaczy. Zebrane dane należy zapisać w komputerze.Do analizy ustaw parametry stymulacji jednobiegunowej na 0,5 milisekundy, impulsy supermaksymalne o częstotliwości 1 Hz. Amplituda może wynosić od 6 do 8 V. Ustaw czas stymulacji na 30 sekund i oblicz średnią z odpowiedzi z 10 kolejnych stymulacji, wykorzystując zapis amplitudy od linii bazowej do szczytu dla każdego zwierzęcia, wykonując pomiar około raz w tygodniu, jeśli jest to wymagane.Postępowanie ze zwierzętami zostało szczegółowo opisane w protokole tekstowym. Po uśmierceniu zwierzęcia poprzez podanie przedawkowanej dawki znieczulenia dożylnego, należy przeprowadzić laparotomię za pomocą skalpela lub nożyczek. Wykonać nacięcie od wyrostka mieczykowatego wzdłuż linii pośrodkowej.Następnie, używając skalpela i pęsety, ostrożnie oddziel skórę i tkankę łączną od muskulatury. Usuń przeponę, odciągając wyrostek xifoideus i wycinając przeponę z otaczających ją kości. Należy uważać, aby nie uszkodzić mięśnia przepony.Przenieść przeponę stroną górną do góry do szalki z silikonową linią wypełnionej 4%paraform aldehyde w PBS, korzystając ze stereoskopu. Przymocuj szpilkami tkankę otaczającą przeponę, rozciągając ją naprężenie. Następnie usuń tkankę łączną z powierzchni górnej za pomocą pęsety i nożyczek.Pozostaw utrwalacz na 20 minut, a następnie usuń go, wykonując trzy 10-minutowe przemycia w PBS. Następnie zastosuj 0,1 M glicynę z 2% BSA w PBS przez 30 minut. Po tym czasie inkubuj przeponę w roztworze sprzężonego z rod Domine przeciwciała alpha bungalow toin przez 15 minut.Zmyć toksynę bungalow za pomocą PBS w taki sam sposób, jak w przypadku utrwalacza. Następnie wymienić roztwór w kąpieli na zimny metanol i chłodzić tkankę przez pięć minut w temperaturze -20 °C. Po pięciu minutach bezzwłocznie usunąć metanol i przemyć tkankę PBS, analogicznie jak poprzednio.Następnie przeprowadź blokowanie, stosując 0,2% roztwór TBP przez jedną godzinę. Wymień roztwór na przeciwciało pierwszorzędowe w 0,2% TBP i inkubuj tkankę przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza przy łagodnym mieszaniu. Następnego dnia wykonaj trzy 10-minutowe płukania w 0,2% TBP w celu usunięcia przeciwciała pierwszorzędowego, a następnie inkubuj tkankę w roztworze przeciwciała drugorzędowego przez godzinę w ciemności, stosując kołysanie; na koniec wykonaj trzy płukania w PBS, aby usunąć przeciwciało drugorzędowe, i przechowuj tkankę w ciemności.Następnie, korzystając ze stereomikroskopu, usuń pozostałą tkankę łączną z górnej powierzchni mięśnia. Po oczyszczeniu zamocuj tkankę i wykonaj obrazowanie za pomocą odwróconego mikroskopu epifluorescencyjnego, aby ilościowo przeanalizować morfologię zabarwionej połowy przepony. Użyj powiększenia 20 i 40 x, ponieważ przepona jest analizowana w formie preparatu całego organu.Większość barwień fluorescencyjnych znajduje się poza płaszczyzną ostrości. Przy użyciu standardowego mikroskopu najlepiej przeprowadzić analizę w czasie rzeczywistym. Aby prawidłowo ocenić morfologię poszczególnych NM js, należy podzielić mięsień na trzy sekcje analityczne w oparciu o topograficzne wzorce unerwienia rdzenia kręgowego.Zaczynając od najbardziej brzusznego regionu, należy przeanalizować wszystkie widoczne NMJ wzdłuż włókien mięśniowych; nie należy analizować głębiej niż pierwsze trzy do czterech włókien od powierzchni, ponieważ penetracja przeciwciał nigdy nie jest całkowita. Nienaruszone NMJ posiada gruby akson przedterminalny, a wszystkie regiony zakończenia nerwowego całkowicie pokrywają się z leżącymi poniżej receptorami acetylocholiny w mięśniu. Częściowo odnerwione NMJ będzie wykazywać obszary, w których leżące poniżej receptory acetylocholiny pozostają nieobsadzone.Całkowicie odnerwiony złącze nerwowo-mięśniowe (NMJ) nie wykaże korelacji z receptorami acetylocholiny w zakończeniu nerwowym. Inne NMJ w tym obszarze powinny wykazywać inną morfologię, a w przypadku, gdy więcej niż jeden akson przedterminalny unerwia NMJ, skuteczność penetracji przeciwciał byłaby wątpliwa. NMJ jest wielokrotne.W tym przypadku mogło dojść do denerwacji, a następnie do reinnerwacji. Jeśli w obrębie zakończenia nerwowego występuje nakładanie się na znajdujące się poniżej receptory acetylocholiny, a akson przedterminalny jest bardzo cienki, wówczas połączenie nerwowo-mięśniowe (NMJ) jest słabo unerwione. Jest to również oznaka reakcji.W eksperymencie z udziałem dorosłych szczurów linii Sprague-Dawley grupa kontrolna została poddana laminektomii, natomiast pozostałe osobniki otrzymały jednostronny kontuzyjny uraz rdzenia kręgowego (SCI). Po upływie 4,5 tygodnia zarejestrowano szczytową amplitudę CMAP z przepony po stronie ipsilateralnej do laminektomii lub miejsca urazu.W innym eksperymencie z udziałem szczurów wykazujących ekspresję zmutowanego ludzkiego białka SOD1, służących jako model ALS, wartość ta była znacząco obniżona u szczurów z SCI w porównaniu z grupą kontrolną poddaną wyłącznie laminektomii. Morfologia NMJ w połowie przepony była całkowicie zachowana u zwierząt kontrolnych typu dzikiego. Jednakże u szczurów transgenicznych w NMJ zaobserwowano znaczną patologię. W niektórych przypadkach stwierdzono całkowitą denrawację, oznaczoną grotami strzałek.Inne złącza nerwowo-mięśniowe były częściowo odnerwione, co zaznaczono grotem strzałki, a jak widać na złączu NMJ po prawej stronie, inne złącza były wielokrotnie unerwione, natomiast jeszcze inne posiadały cienkie aksony przedterminalne, tutaj oznaczone grotem strzałki. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak ilościowo ocenić unerwienie czynnościowe i morfologiczne przepony przez motoneurony nerwu przeponowego. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia we wszystkich eksperymentach.

functional-morphological-assessment-diaphragm-innervation-phrenic

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Funkcjonalna i morfologiczna ocena unerwienia przepony przez neurony ruchowe nerwu przeponowego

Ten film opisuje rejestrowanie złożonych potencjałów czynnościowych mięśni (CMAP) we włóknach mięśniowych przepony u szczura poprzez stymulację nerwu przeponowego. Stymulacja impulsem elektrycznym nerwu przeponowego o dużej intensywności generuje potencjały czynnościowe we włóknach mięśniowych przepony, które obserwuje się poprzez uzyskanie krzywej odpowiedzi.

Pomiar złożonych potencjałów czynnościowych mięśni poprzez stymulację nerwu przeponowego u szczura

Ocena funkcjonalna połączenia nerwowo-mięśniowego (NMJ) może dostarczyć istotnych informacji na temat komunikacji między mięśniem a nerwem. W tym miejscu opisujemy protokół kompleksowej oceny zarówno NMJ, jak i funkcjonalności mięśni przy użyciu dwóch różnych preparatów mięśniowo-nerwowych, tj. płaszczkowato-kulszowego i przeponowo-przeponowego.

Pomiar funkcjonalności połączenia nerwowo-mięśniowego

Tutaj opisujemy protokół identyfikacji frenicznych neuronów ruchowych u myszy po doopłucnowym dostarczeniu podjednostki beta sprzężonej z fluoroforem toksyny. Porównano dwie techniki wstrzykiwania do jamy opłucnej: podejście przezprzeponowe i przezklatkowe podejście.

Wsteczne neuroanatomiczne śledzenie frenicznych neuronów ruchowych u myszy

W tym badaniu prezentujemy metodę in vivo do szacowania liczby i wielkości jednostek motorycznych w celu ilościowego określenia połączenia jednostki motorycznej membrany szczura. Opisano podejście krok po kroku do tych technik.

Ocena miar wyników łączności przepony przeponowej jednostki motorycznej szczura jako ilościowych biomarkerów zwyrodnienia i kompensacji neuronów ruchowych frenii

Powikłania oddechowe są główną przyczyną zgonów u osób z uszkodzeniem rdzenia kręgowego w odcinku szyjnym (cSCI). Modele zwierzęce cSCI są niezbędne do oceny mechanistycznej i badań przedklinicznych. W tym miejscu wprowadzamy powtarzalną metodę oceny funkcjonalnego przywrócenia aktywności mięśnia przepony (DIAm) po jednostronnej hemisekcji rdzenia kręgowego C2 (C2SH) u szczurów.

Ocena funkcjonalnego przywrócenia aktywności eupeicznej przepony po jednostronnej hemisekcji rdzenia kręgowego w odcinku szyjnym u szczurów

Ultrasonografia przyłóżkowa (POCUS) jest niezbędną techniką do badań przesiewowych w kierunku dysfunkcji przepony ze względu na jej przenośność, nieinwazyjność i możliwości obrazowania w czasie rzeczywistym. Chociaż istnieją obecnie protokoły membranowego POCUS, cierpią one z powodu niskiej niezawodności między operatorami i brakuje jednolitych wytycznych. Tutaj opisujemy technikę, która jest powtarzalna i prosta do wykonania.

USG przeponowe u dorosłych: akwizycja i interpretacja obrazu

Deficyty w obrębie precyzyjnej koordynacji ruchowej można ocenić za pomocą testu na belce równowagi. Wynik testu określa się na podstawie prędkości przejścia przez belkę oraz liczby ześlizgnięć myszy z belki.

Ocena równowagi ruchowej i koordynacji u myszy z wykorzystaniem belki równowagi

Opisano technikę pozwalającą na ilościowe określenie odpowiedzi fizjologicznej neuronów ssaków in vivo podczas ruchu oraz korelację fizjologii neuronu z jego morfologią, fenotypem neurochemicznym i mikroobwodami synaptycznymi.

Charakterystyka fizjologiczna, morfologiczna i neurochemiczna neuronów modulowanych przez ruch

U zwierząt z dużymi zidentyfikowanymi neuronami (np.), analiza puli motorycznej odbywa się za pomocą technik wewnątrzkomórkowych1,2,3,4. Niedawno opracowaliśmy technikę zewnątrzkomórkowej stymulacji i zapisu pojedynczych neuronów w Aplysia californica5. Opisujemy teraz protokół wykorzystania tej techniki do unikalnej identyfikacji i scharakteryzowania neuronów ruchowych w puli motorycznej.

Zewnątrzkomórkowa identyfikacja neuronów ruchowych w puli motorycznej mięśni u Aplysia californica

Ten manuskrypt opisuje eksperymentalny protokół oceny cech morfologicznych i statusu funkcjonalnego synaps wstęgowych u normalnych myszy. Prezentowany model nadaje się również do modeli z ograniczeniami synaptopatii ślimakowej wywołanych hałasem i związanych z wiekiem. Omówiono również korelacyjne wyniki poprzednich badań na myszach.

Ocena morfologiczna i funkcjonalna synaps wstęgowych w określonych obszarach częstości ślimaka myszy

Poznaj metodę oceny czynnościowej i morfologicznej unerwienia przepony przez nerwy przeponowe w modelach gryzoni. Technika łączy rejestrację potencjałów czynnościowych z immunohistochemią całych preparatów.

Funkcjonalna i morfologiczna ocena unerwienia przepony przez freniczne neurony ruchowe

Przeglądaj więcej filmów