Funkcjonalna i morfologiczna ocena unerwienia przepony przez freniczne neurony ruchowe

Ogólnym celem tej procedury jest ilościowa ocena zarówno funkcjonalnego, jak i morfologicznego unerwienia przepony przez przeponowe neurony ruchowe rdzenia kręgowego szyjnego. Osiąga się to poprzez prowadzenie złożonego zapisu potencjału czynnościowego mięśni z przepony hemi u znieczulonych zwierząt po ponadmaksymalnej stymulacji ipsilateralnego nerwu przeponowego. Kolejnym krokiem jest przeprowadzenie immunohistochemii całej przepony w celu morfologicznej oceny unerwienia poszczególnych połączeń nerwowo-mięśniowych.

Ostatecznie, połączenie złożonych analiz potencjału czynnościowego mięśni i połączeń nerwowo-mięśniowych stanowi skuteczne podejście do ilościowego badania unerwienia przepony w modelach choroby OUN i PNS u gryzoni. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie urazów rdzenia kręgowego, takie jak: czy interwencje terapeutyczne mogą być stosowane w celu skutecznego przywrócenia funkcji przepony? Implikacje tej techniki rozciągają się na terapię chorób, takich jak urazowe uszkodzenie rdzenia kręgowego i ILS, ponieważ przeponowa funkcja oddechowa odgrywa kluczową rolę w wynikach pacjenta w obu tych wyniszczających stanach, Procedurę zademonstruje dr Kali, doktor habilitowany w moim laboratorium, Melanie Martin, studentka studiów licencjackich w laboratorium dr Wrighta, i Tamara Holla, technik badawczy w moim laboratorium.

Po znieczuleniu zwierzęcia należy położyć je na tablicy operacyjnej grzbietem do dołu i przymocować kończyny przednie do deski. Następnie ogol powierzchnię brzuszną od podstawy czaszki w kierunku brzucha po obu stronach linii środkowej. Po oczyszczeniu skóry umieść elektrody przymocuj ziemię do ogona i umieść elektrodę odniesienia w przeciwległym podbrzuszu podskórnie.

Elektrodę rejestrującą należy przygotować z żelem przewodzącym na części samoprzylepnej, a następnie przymocować wzdłuż jednostronnego brzegu żebrowego. Teraz umieść elektrody stymulujące, przezskórne w odległości pół centymetra od siebie, po bokach tchawicy i powyżej obojczyka. Powinny wchodzić prostopadle do skóry i wchodzić na głębokość około jednego centymetra.

Elektrody te muszą być dobrze zabezpieczone, najlepiej wykonane ręcznie. Podłącz wszystkie elektrody do odpowiednich stymulatorów i wzmacniaczy. Zebrane dane muszą zostać zapisane na komputerze.

Do analizy ustaw parametry bodźca stymulacji jednobiegunowej na 0,5 milisekundy, super maksymalne impulsy o częstotliwości jednego herca. Amplituda może wynosić od sześciu do ośmiu woltów. Ustaw czas stymulacji zainteresowania na 30 sekund i uśrednij odpowiedź z 10 kolejnych stymulacji, używając zapisu amplitudy od linii bazowej do szczytu od każdego zwierzęcia mniej więcej raz w tygodniu, jeśli jest to pożądane.

Postępowanie ze zwierzętami jest szczegółowo opisane w protokole tekstowym. Po eutanazji zwierzęcia za pomocą przedawkowania znieczulenia iniekcyjnego należy przeprowadzić laparotomię za pomocą skalpela lub nożyczek. Wykonaj nacięcie od wyrostka mieczykowatego wzdłuż linii środkowej.

Następnie za pomocą skalpela i kleszczy ostrożnie oddziel skórę i tkankę łączną od mięśni. Usuń przeponę, pociągając wyrostek mieczykowaty i wycinając przeponę z otaczającej kości. Uważaj, aby nie uszkodzić mięśnia przepony.

Przenieś membranę górną stroną do naczynia z silikonową linią wypełnioną 4% aldehydem paraform w PBS pod stereoskopem. Przypnij tkankę otaczającą przeponę, rozciągając przeponę. Następnie usuń tkankę łączną z górnej powierzchni za pomocą kleszczy i nożyczek.

Pozwól utrwalaczowi działać przez 20 minut, a następnie usuń go, wykonując trzy 10-minutowe płukania w PBS. Następnie nałóż 0,1 glicyny molowej z 2% BSA w PBS przez 30 minut. Następnie inkubuj przeponę w sprzężonym roztworze dominki alfa bungalow z prętem Domine przez 15 minut.

Zmyj toksynę bungalowu za pomocą PBS, tak jak to zrobiono w przypadku utrwalacza. Następnie zmień kąpiel na zimny metanol i schładzaj tkankę przez pięć minut w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Niezwłocznie po pięciu minutach usuń metanol i przemyj chusteczkę PBS jak poprzednio.

Teraz nałóż blok za pomocą 0,2% roztworu TBP na jedną godzinę. Zmień roztwór na przeciwciało pierwszorzędowe w 0,2% TBP i pozwól tkance inkubować się przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza z delikatnym mieszaniem. Następnego dnia użyj trzech 10-minutowych płukań w 0,2% TBP, aby usunąć przeciwciało pierwotne, a następnie inkubuj tkankę w roztworze przeciwciała drugorzędowego przez godzinę z kołysaniem, a później w ciemności użyj trzech płukań w PBS, aby usunąć przeciwciało drugorzędowe i utrzymać tkankę w ciemności.

Następnie pod stereoskopem usuń więcej tkanki łącznej na górnej powierzchni mięśnia. Po oczyszczeniu zamontuj i zobrazuj tkankę pod pionowym mikroskopem fluorescencyjnym epi, ilościowo przeanalizuj morfologię barwionej membrany hemi. Użyj powiększenia 20 i 40x, ponieważ membrana jest analizowana jako całe mocowanie.

Większość barwień fluorescencyjnych jest nieostra. Korzystając ze standardowego mikroskopu, najlepiej jest przeprowadzać analizę w czasie rzeczywistym. Aby prawidłowo ocenić morfologię poszczególnych NM js, podziel mięsień na trzy sekcje do analizy w oparciu o topograficzne wzorce unerwienia rdzenia kręgowego.

Zaczynając od brzusznego obszaru mostu, przeanalizuj wszystkie widoczne nj wzdłuż włókien mięśniowych, nie analizuj głębiej niż pierwsze trzy do czterech włókien od powierzchni, ponieważ penetracja przeciwciał nigdy nie jest zakończona. Nienaruszony NMJ ma akson przedkońcowy, który jest gruby, a wszystkie obszary zakończenia nerwowego całkowicie pokrywają się z leżącymi poniżej receptorami acetylocholiny mięśniowej. Częściowo zdenerwowany NMJ będzie miał niektóre regiony leżących u podstaw receptorów acetylocholiny niezajęte.

Całkowicie odnerwiony NMJ nie będzie wykazywał zgodności z receptorami acetylocholiny na końcu nerwowym. Inne nj w regionie powinny wykazywać inną morfologię lub sukces przeciwciał Penetracja byłaby wątpliwa, gdyby więcej niż jeden akson przedkońcowy unerwia NMJ. NMJ jest zwielokrotniony.

W tym przypadku mogło dojść do unerwionego odnerwienia, po którym nastąpiło ponowne unerwienie. Jeśli na końcu nerwowym występuje nakładanie się na leżące poniżej receptory acetylocholiny, a akson przedkońcowy jest bardzo cienki, oznacza to, że NMJ jest cienko unerwiony. Jest to również oznaka reacji.

W eksperymencie z udziałem dorosłych spra, szczury Dolly z grupy kontrolnej otrzymały laminektomię, podczas gdy inne otrzymały jednostronne stłuczenie krwi SCI. Na C cztery. Pięć tygodni później zarejestrowano szczytową amplitudę cmap od przepony półkrwi ipsilateralnej do miejsca laminektomii lub urazu.

Było ono znacznie zmniejszone u szczurów SCI w porównaniu z samymi szczurami kontrolnymi po laminektomii w innym eksperymencie z udziałem szczurów wykazujących ekspresję zmutowanego białka ludzkiego, czyli D, które służyło jako model LS. Morfologia NMJ w przeponie hemi była całkowicie nienaruszona u zwierząt kontrolnych typu dzikiego. Jednak u transgenicznych szczurów njs wykazywały znaczną patologię. Niektóre wykazywały całkowite odnerwienie zaznaczone grotem strzały.

Inne nj były częściowo odnerwione, jak oznaczono grotem strzały, i jak widać w NMJ po prawej, inne nj były wielokrotnie unerwione, a inne miały cienkie aksony przedkońcowe oznaczone tutaj grotem strzały. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak ilościowo ocenić zarówno funkcjonalne, jak i morfologiczne unerwienie przepony przez przeponowe neurony ruchowe. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia we wszystkich eksperymentach.