Długoterminowe przyżyciowe obrazowanie mikroskopii wielofotonowej komórek odpornościowych w zdrowej i chorej wątrobie przy użyciu myszy reporterowych CXCR6.Gfp

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest śledzenie migracji i interakcji leukocytów w postępującej chorobie zapalnej wątroby. Aby lepiej zrozumieć sekwencję zdarzeń leżących u podstaw rekrutacji tych komórek do tkanki wątroby i ich potencjalny udział w immunopatologii. Osiąga się to poprzez wykonanie najpierw tracheotomii w celu uzyskania kontroli nad oddychaniem myszy, co jest kluczowym krokiem w celu zapewnienia długoterminowego przeżycia zwierzęcia.

Drugim krokiem myszy jest laparotomia w celu chirurgicznego odsłonięcia wątroby, dając dostęp do narządu za pomocą mikroskopu wielofotonowego. Następnie wątroba jest ustalana i pozycjonowana poprzez osadzenie jej w powstałym w celu zminimalizowania artefaktów ruchowych. Obrazowanie może być wykonywane przez kilka godzin, co prowadzi do uzyskania sekwencji poklatkowych o wysokiej rozdzielczości, które podążają za zmianami w rekrutacji, pozycjonowaniu i interakcji poszczególnych leukocytów.

W procesie powstawania zapalenia wątroby, Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu ostrego i przewlekłego zapalenia wątroby, takie jak rekrutacja leukocytów, interakcje komórkowe czy mechanizmy immunopatologii. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z konwencjonalną mikroskopią jest to, że mikroskopia wieloogniskowa umożliwia długotrwałe obrazowanie praktycznie bez zakłóceń próbki z niskim blaknięciem źrebiąt lub fototoksycznością, a także plastry optyczne do 100 mikrometrów w głąb tkanki, a to dzięki unikalnej fizyce lasera dalekiego czerwonego światła laserowego. Cóż, ta metoda może zapewnić wgląd w choroby wątroby.

Można go łatwo zaadaptować do innych systemów. Ponieważ metoda stabilizacji i utrwalania, tkanka może być stosowana do praktycznie wszystkich pytań mikroskopii przyżyciowej, dzięki czemu może łatwo obrazować narządy, takie jak śledziona, nerki, a nawet guzy podskórne za pomocą płynnie spokrewnionych komórek. Możliwe jest również uwidocznienie wszystkich podzbiorów leukocytów i wysłanie ich interakcji i zapalenia wątroby.

Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają korzystać z tej metody, będą miały trudności z powodu ekstremalnej złożoności chirurgii małych zwierząt. Jednak z naszego własnego doświadczenia wynika, że jest to czynnik ograniczający tylko przez kilka tygodni i wymaga tylko trochę praktycznej rutyny Ze względu na kruchość tkanki wątroby etapy przygotowania są trudne do nauczenia, a wizualna demonstracja metody jest niezbędna. Po ustawieniu środków znieczulających napełnij scenę myszy 3%aros, wlewając ją pod kątem 40 stopni.

Następnie upewnij się, że obszar roboczy chirurgiczny jest w pełni zdezynfekowany, podobnie jak wszystkie wymagane narzędzia i tak dalej. Następnie znieczulij mysz dootrzewnowym wstrzyknięciem koktajlu znieczulającego. Pięć minut później sprawdź odruchy zwierzęcia, a następnie zdezynfekuj skórę i nałóż maść okulistyczną na oczy.

Teraz przymocuj mysz do stołu przygotowawczego. Za pomocą taśmy ustaw ją tak, aby odsłonić brzuszną stronę, delikatnie nadmiernie rozciągając szyję. Może to osiągnąć gumka przymocowana do siekaczy.

Teraz wykonaj początkowe nacięcie poniżej podbródka o długości około 0,5 do jednego centymetra. Następnie ostrożnie wypreparuj tkankę łączną między gruczołami ślinowymi i znajdź rurkę mięśniową otaczającą tchawicę. Delikatnie rozerwij mięsień, aby odsłonić tchawicę.

Przeciągnij nić pod tchawicą, a następnie otwórz tchawicę mikronożyczkami, wykonując nacięcie w kształcie litery T w nacięciu. Włóż rurkę wentylacyjną na około pół centymetra. Przesuń rurkę za pomocą małych kleszczy anatomicznych.

Następnie zabezpiecz rurkę szwami. Następnie, dla dodatkowego bezpieczeństwa, przymocuj rurkę do skóry, uszczelnij nacięcie w skórze za pomocą cyjanoakrylanu i przymocuj rurkę do głowy zwierzęcia. Za pomocą taśmy klejącej utrzymuj znieczulenie, używając ciągłego przepływu 2% fluoru ISO.

Po przygotowaniu myszy do zabiegu wykonaj małe nacięcie skóry poniżej mostka i przedłuż cięcie na boki poniżej żeber po obu stronach. Kauteryzuj w tym procesie wszystkie odsłonięte naczynia krwionośne. Aby zminimalizować krwawienie, wykonaj małe początkowe cięcie w liniowym łokciu, aby uzyskać dostęp do jamy brzusznej.

Rozciągnij cięcie w poziomie, uszczelniając wszystkie naczynia krwionośne i dając dostęp do wątroby. Teraz przenieś mysz do etapu agro i ułóż slajdy po obu stronach zwierzęcia, aby pomóc utrzymać je na miejscu. Stosy te powinny pasować do wysokości myszy, tak aby scena dla wątroby, która zostanie umieszczona później, nie wywierała nadmiernego nacisku na brzuch.

Teraz, za pomocą szwów w mostku, cofnij żebra. Wystarczą cztery szwy zerowe Po cofnięciu żeber przetnij więzadła łączące wątrobę i przeponę przecięte aż do aorty, ale pracuj ze szczególną ostrożnością, aby nie pęknąć ani nie przeciąć naczynia. Przetnij również więzadło łączące wątrobę i przewód pokarmowy.

Obróć mysz o 45 stopni, aby poprawić dostęp do większego płata wątroby. Weź standardowe szkiełko nakrywkowe i przyklej je taśmą wzdłuż krawędzi, aby nie było ostre. Umieść go nad jamą brzuszną.

Będzie to służyć jako etap dla wątroby, aby ustawić wątrobę na scenie. Ostrożnie wsuń sondę z podwójną kulką lub wyściełaną szpatułkę poniżej wątroby i przytrzymaj górną część narządu. Użycie wilgotnej tkanki mechanicznego ucisku natychmiast uszkodzi tkankę wątroby, dlatego ważne jest, aby obchodzić się z narządem z ostrożnością.

Następnie podnieś krzywkę na zjeżdżalnię i delikatnie pociągnij ją na miejsce. Płat zwykle kończy się zgięciem lub złożeniem delikatnie, spróbuj delikatnie rozłożyć krawędzie, podnosząc tkankę cienką szpatułką lub wilgotną chusteczką. Następnie dodaj boczne podpory w postaci szkiełek nakrywkowych lub prowadnic.

Ułóż szkiełka nakrywkowe tak, aby miały tę samą wysokość co płat wątroby. Ocena stopnia zaawansowania i utrwalenie wątroby jest najważniejszym krokiem w protokole. Każde naprężenie mechaniczne, skręcenie lub ucisk doprowadzą do natychmiastowego uszkodzenia tkanek lub przynajmniej upośledzenia przepływu krwi w naczyniach sinusoidalnych.

Teraz połóż duży szkiełko nakrywkowe z zaklejonymi krawędziami na płat wątroby wsparty na bocznych podporach. Umieść szkiełko nakrywkowe tak poziomo, jak to możliwe. Nie powinien ściskać wątroby.

Biała tkanka wskazuje na upośledzony przepływ krwi, chyba że obrazowanie będzie przebiegać szybko. Obecnie konieczne jest wprowadzenie dwóch niezależnych cewników dootrzewnowych w celu zapewnienia długotrwałego znieczulenia i zastosowania G pięć. Są one składane z igieł o rozmiarze 27 i elastycznych silikonowych rurek.

Następnie uruchom ich przepływ za pomocą pomp strzykawkowych. Wprowadzić cewniki do dolnej części brzucha w pobliżu kończyn tylnych. Po przymocowaniu ważnych monitorów do myszy przygotuj 100 mililitrów 3%aros w jednym XPBS.

Gdy aros ostygnie do 41 stopni Celsjusza, zanurz w nim wątrobę za pomocą pięciomililitrowej strzykawki z igłą o rozmiarze 18. Gdy aeros ostygnie, użyj szpatułki Heidemana, aby usunąć nadmiar i odsłonić pole widzenia wystarczająco duże, aby zeskanować wątrobę. Następnie kontynuuj skanowanie.

Po przygotowaniu pola widzenia należy przesunąć mysz pod mikroskop, aby wybrać odpowiednie obszary skanowania do obrazowania poklatkowego. Tkanka wątroby jest skanowana wzrokowo przy użyciu zewnętrznego źródła światła białego, identyfikując reprezentatywne pola z wystarczającym przepływem krwi i minimalnymi zaburzeniami próbki CXCR sześć heterozygotycznych myszy GFP poddano obrazowaniu przyżyciowemu T-P-L-S-M w ramach eksperymentu. Niektórym podano dootrzewnowe wstrzyknięcie czterochlorku w celu wywołania ostrego uszkodzenia wątroby.

Komórki modalne wykazujące ekspresję GFP były śledzone za pomocą wideo, a ich ścieżki zostały nałożone na siebie, aby uzyskać migawkę mobilności komórkowej. Utwory zostały następnie znormalizowane. Normalne wątroby miały komórki o losowych wzorcach migracji.

Wątroby, którym wstrzyknięto CCI cztery, wykazywały upośledzenie migracji komórkowej. Mierząc całkowite przemieszczenie od ich miejsca pochodzenia, było jasne, że 36 godzin po leczeniu CCI 4 doszło do uwięzienia komórek w miejscu uszkodzenia komórek wątrobowych. Upośledzoną migrację przez uszkodzenie wątroby można również wykazać, wykreślając prędkość migracji poszczególnych komórek w czasie, wykazując częściowe zatrzymanie po 18 godzinach i pełne zatrzymanie migracji po 36 godzinach.

Można również wykazać, że zmniejszenie prędkości migrujących komórek jest statystycznie istotne, gdy komórki porównano jako populacje. Dlatego to podejście jest odpowiednie do śledzenia zmian w migracji komórek i pozycjonowaniu w rozwijającej się chorobie wątroby. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przygotować wątrobę myszy do mikroskopii wielofotograficznej intra vital.

Metoda, którą tutaj zapewniamy, pozwala nam ustabilizować zwierzę w celu długotrwałego przetrwania, a także zminimalizować artefakty ruchowe dzięki dostarczanej przez nas delikatnej metodzie utrwalania. Po zamaskowaniu technikę tę można wykonać w ciągu około godziny, jeśli zostanie wykonana prawidłowo Podczas tej procedury ważne jest, aby kontrolować parametry życiowe zwierząt stabilizujące temperaturę, tętno, poziom tlenu i CO2. Można to osiągnąć, dostosowując głębokość martwicy i oddychania Postępując zgodnie z tą techniką.

Inne procedury, takie jak analiza cytometrii przepływowej lub mikrorozwarstwienie wychwytu laserowego, można wykonać, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak fenotyp naciekających komórek odpornościowych lub mediatory wydzielane przez tkankę lub komórki naciekające po jego rozwoju. Techniki te pozwoliły naukowcom uzyskać wgląd w dynamikę ruchu leukocytów i interakcji komórkowych w wątrobie, co pozwoliło na przeanalizowanie sekwencji zdarzeń prowadzących do zapalnych chorób wątroby. Postępuj zgodnie z wytycznymi dotyczącymi bezpieczeństwa lasera, wykonując obrazowanie za pomocą impulsowego lasera podczerwonego o wysokiej energii, używanego do mikroskopii wielofotograficznej.

Upewnij się, że żadne odbicie promieniowania laserowego nie może stanowić zagrożenia dla oczu i skóry podczas wykonywania tego eksperymentu.