Długoterminowe przyżyciowe obrazowanie mikroskopii wielofotonowej komórek odpornościowych w zdrowej i chorej wątrobie przy użyciu myszy reporterowych CXCR6.Gfp

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest śledzenie migracji i interakcji leukocytów w postępującej chorobie zapalnej wątroby, aby lepiej zrozumieć sekwencję zdarzeń leżących u podstaw rekrutacji tych komórek do tkanki wątroby oraz ich potencjalny udział w immunopatologii. Cel ten realizowany jest poprzez wykonanie w pierwszej kolejności tracheotomii w celu uzyskania kontroli nad oddychaniem myszy, co jest kluczowym krokiem zapewniającym długoterminowe przeżycie zwierzęcia.

W drugim kroku wykonuje się laparotomię u myszy, aby chirurgicznie odsłonić wątrobę, co umożliwia dostęp do narządu za pomocą mikroskopu wielofotonowego. Następnie wątrobę unieruchamia się i pozycjonuje, osadzając ją w rozie, aby zminimalizować artefakty ruchowe. Obrazowanie może być prowadzone przez kilka godzin, co pozwala na uzyskanie wysokorozdzielczych sekwencji time-lapse, ukazujących zmiany w rekrutacji, rozmieszczeniu i interakcjach poszczególnych leukocytów.

W procesie rozwoju stanu zapalnego wątroby metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie ostrego i przewlekłego zapalenia wątroby, takie jak rekrutacja leukocytów, interakcje międzykomórkowe czy mechanizmy immunopatologii. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z konwencjonalną mikroskopią jest to, że mikroskopia wielofokalna umożliwia długotrwałe obrazowanie przy praktycznie braku zaburzeń próbki, niskim poziomie blaknięcia fluorescencji lub fototoksyczności, a także wykonywanie przekrojów optycznych do 100 µm w głąb tkanki, co wynika z unikalnej fizyki dalekiej czerwieni światła laserowego. Tym samym metoda ta może dostarczyć cennych informacji na temat chorób wątroby.

Metodę tę można łatwo zaadaptować do innych układów. Dzięki sposobowi stabilizacji i utrwalania tkanka może być wykorzystana niemal w każdym zagadnieniu związanym z mikroskopią intravitalną, co pozwala na łatwe obrazowanie organów takich jak śledziona, nerka, a nawet guzy podskórne z wykorzystaniem krążących komórek. Możliwa jest również wizualizacja wszystkich subpopulacji leukocytów oraz badanie ich interakcji i stanu zapalnego wątroby.

Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają trudności ze względu na ogromną złożoność chirurgii małych zwierząt. Jednak w naszym doświadczeniu jest to czynnik ograniczający jedynie przez pierwsze kilka tygodni i wymaga jedynie praktycznej rutyny. Ze względu na kruchość tkanki wątroby, etapy przygotowania są trudne do opanowania, dlatego niezbędna jest wizualna demonstracja metody. Po przygotowaniu środków znieczulających, należy napełnić platformę dla myszy 3% roztworem aros, wlewając go pod kątem 40 stopni.

Następnie należy upewnić się, że pole operacyjne jest w pełni zdezynfekowane, podobnie jak wszystkie wymagane instrumenty i pozostałe akcesoria. Następnie mysz znieczula się poprzez podanie dootrzewnowe koktajlu anestetycznego. Po pięciu minutach należy sprawdzić odruchy zwierzęcia, a następnie zdezynfekować skórę i nałożyć maść oftalmiczną do oczu.

Następnie unieruchom mysz na stole preparacyjnym. Za pomocą taśmy ustaw ją tak, aby odsłonić stronę brzuszną, delikatnie rozciągając szyję. Można to osiągnąć, zaczepiając gumkę recepturkę o siekacze.

Następnie wykonaj pierwsze nacięcie pod brodą o długości od 0,5 do 1 cm. Po tym czasie ostrożnie rozdziel tkankę łączną pomiędzy śliniankami i odszukaj rurkę mięśniową otaczającą tchawicę. Delikatnie rozerwij mięśnie, aby odsłonić tchawicę.

Przeciągnij nitkę pod tchawicą, a następnie otwórz tchawicę za pomocą mikronozycyc, wykonując nacięcie w kształcie litery T w obrębie wcześniejszego cięcia. Wprowadź rurkę wentylacyjną na głębokość około pół centymetra. Przesuń rurkę do przodu, używając małych pęsety anatomicznej.

Następnie przymocuj rurkę szwami. Dla zwiększenia stabilności przyszyj rurkę do skóry, zamknij nacięcie w skórze za pomocą cyjanoakrylanu i przymocuj rurkę do głowy zwierzęcia. Używając taśmy klejącej, podtrzymuj znieczulenie przy ciągłym przepływie 2% iso fluorine.

Po przygotowaniu myszy do zabiegu, wykonaj niewielkie nacięcie skóry poniżej mostka i przedłuż je bocznie pod żebrami po obu stronach. W trakcie tego procesu koaguluj wszystkie odsłonięte naczynia krwionośne. Aby zminimalizować krwawienie, wykonaj początkowe niewielkie nacięcie w linii białej w celu uzyskania dostępu do jamy brzusznej.

Przedłuż nacięcie poziomo, zamykając wszystkie naczynia krwionośne i uzyskując dostęp do wątroby. Następnie przenieś mysz na stół agro i ułóż slidami po obu stronach zwierzęcia, aby pomóc w jego stabilizacji. Stosy te powinny odpowiadać wysokości myszy, tak aby platforma pod wątrobę, która zostanie umieszczona w późniejszym etapie, nie wywierała nadmiernego nacisku na jamę brzuszną.

Następnie, używając szwów w obrębie mostka, odsunąć żebra. Wystarczy użyć nici chirurgicznej 4-0. Po odsunięciu żeber przeciąć więzadła łączące wątrobę z przeponą; przecinać aż do aorty, zachowując jednak szczególną ostrożność, aby nie przerwać ani nie przeciąć naczynia. Przeciąć również więzadło łączące wątrobę z przewodem pokarmowym.

Obróć mysz o 45 stopni, aby ułatwić dostęp do większego płata wątroby. Weź standardowe szkiełko nakrywkowe i oklej jego krawędzie taśmą, aby nie były ostre. Umieść je nad jamą brzuszną.

Służyć to będzie jako podstawka do umieszczenia wątroby. Ostrożnie wsuń sondę z podwójną kulką lub wyłożoną szpatułkę pod wątrobę i przytrzymaj górną część narządu. Użycie wilgotnej chusteczki i nacisk mechaniczny natychmiast uszkodzą tkankę wątroby, dlatego niezbędne jest ostrożne obchodzenie się z narządem.

Następnie przenieś płat na szkiełko i delikatnie pociągnij go, aby ustawić w odpowiedniej pozycji. Płat zazwyczaj ulegnie wygięciu lub złożeniu; należy spróbować delikatnie rozprostować jego krawędzie, podnosząc tkankę cienką szpatułką lub wilgotną chusteczką. Następnie dodaj podpory boczne w postaci szkiełek nakrywnych lub przedmiotowych.

Ułóż szkiełka nakrywkowe w stos tak, aby ich wysokość była taka sama jak wysokość płata wątroby. Ustawienie i utrwalenie wątroby jest najistotniejszym krokiem w protokole. Jakikolwiek stres mechaniczny, skręcenie lub nacisk doprowadzą do natychmiastowego uszkodzenia tkanki lub co najmniej do upośledzenia przepływu krwi w naczyniach zatokowych.

Następnie na płacie wątroby, podpartym przez podpory boczne, umieść duże szkiełko nakrywkowe z przyklejonymi krawędziami. Ustaw szkiełko nakrywkowe tak, aby było ono jak najbardziej poziomo. Nie powinno ono uciskać wątroby.

Biała tkanka wskazuje na upośledzony przepływ krwi, chyba że obrazowanie zostanie przeprowadzone szybko. Konieczne jest teraz wprowadzenie dwóch niezależnych cewników dootrzewnowych w celu zapewnienia długotrwałego znieczulenia oraz podaży G pięć. Są one składane z igieł o rozmiarze 27 G i elastycznych rurek silikonowych.

Następnie rozpocznij ich przepływ, używając pomp strzykawkowych. Wprowadź cewniki do dolnej części brzucha w pobliżu kończyn tylnych. Po podłączeniu monitorów funkcji życiowych do myszy, przygotuj 100 mililitrów 3% aros w jednym XPBS.

Gdy aros ostygnie do 41 °C, zatop w nim wątrobę, używając strzykawki o pojemności 5 mL z igłą 18 G. Po ostygnięciu aerosu użyj szpatułki Heidemanna, aby usunąć nadmiar materiału i odsłonić pole widzenia wystarczająco duże, by móc przeskanować wątrobę. Następnie przystąp do skanowania.

Po przygotowaniu pola widzenia, przesuń mysz pod mikroskopem, aby wybrać odpowiednie obszary skanowania do obrazowania time-lapse. Tkankę wątroby skanuje się wzrokowo, używając zewnętrznego źródła białego światła w celu zidentyfikowania reprezentatywnych pól z wystarczającym przepływem krwi i minimalnymi zakłóceniami próbki. W ramach eksperymentu myszy heterozygوطyczne CXCR6-GFP poddano obrazowaniu intravitalnemu T-P-L-S-M. Niektóre z nich otrzymały dożylnie wstrzyknięty tetrachlorek w celu wywołania ostrego uszkodzenia wątroby.

Komórki modalne wykazujące ekspresję GFP śledzono za pomocą wideo, a następnie nałożono na siebie ich trajektorie, aby uzyskać obraz mobilności komórkowej. Trajektorie te zostały następnie znormalizowane. W normalnych wątrbach komórki wykazywały losowe wzorce migracji.

Wątrób wstrzykniętych z CCI four stwierdzono upośledzenie migracji komórkowej. Pomiar całkowitego przemieszczenia z punktu wyjścia wykazał wyraźne uwięzienie komórek w miejscu uszkodzenia hepatocytów 36 godzin po zastosowaniu CCI four. Upośledzenie migracji spowodowane uszkodzeniem wątroby można było również wykazać, analizując prędkość migracji poszczególnych komórek w czasie, co ujawniło częściowe zatrzymanie po 18 godzinach oraz pełny brak migracji po 36 godzinach.

Wykazano również, że zmniejszenie prędkości migrujących komórek było statystycznie istotne w przypadku porównania komórek jako populacji. Zatem podejście to jest odpowiednie do śledzenia zmian w migracji i rozmieszczeniu komórek w rozwijającej się chorobie wątroby. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak przygotować wątrobę myszy do intravitalnej wielofotonowej mikroskopii.

Przedstawiona tutaj metoda pozwala na stabilizację zwierzęcia w celu zapewnienia długoterminowego przeżycia, a także na zminimalizowanie artefaktów ruchowych dzięki zastosowaniu delikatnej metody unieruchomienia. Po nałożeniu maski technika ta, przy prawidłowym wykonaniu, zajmuje około jednej godziny. Podczas procedury ważne jest monitorowanie parametrów życiowych zwierząt: temperatury stabilizacji, tętna oraz poziomu tlenu i CO2. Można to osiągnąć poprzez dostosowanie głębokości narkozy i wentylacji zgodnie z opisaną techniką.

W celu udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak określenie fenotypu naciekających komórek odpornościowych lub mediatorów wydzielanych przez tkankę bądź naciekające komórki po ich rozwoju, można przeprowadzić inne procedury, np. analizę cytometrii przepływowej lub laserową mikrodysekcję przechwytywania. Techniki te pozwoliły badaczom uzyskać wgląd w dynamikę ruchu leukocytów i oddziaływania komórkowe w wątrobie, co umożliwiło przeanalizowanie sekwencji zdarzeń prowadzących do zapalnych chorób wątroby. Podczas obrazowania z użyciem wysokenergetycznego impulsowego lasera podczerwonego stosowanego w mikroskopii wielofotonowej należy przestrzegać wytycznych dotyczących bezpieczeństwa pracy z laserem.

Podczas przeprowadzania tego eksperymentu należy upewnić się, że żadne odbicie promieniowania laserowego nie stanowi zagrożenia dla oczu i skóry.