Wysokoprzepustowy ilościowy test RT-PCR w czasie rzeczywistym do określania profili ekspresji podtypów interferonu typu I i III

Ogólnym celem tej procedury jest przygotowanie i uruchomienie 384 płytek testowych do wysokoprzepustowej analizy wysoce homologicznej grupy genów, takich jak podtypy interferonu typu pierwszego i trzeciego. Osiąga się to poprzez uprzednie przygotowanie standardowego rozcieńczenia seryjnego używanego do uruchamiania płytek testowych. Następnie przygotowuje się sondę startera i bez kontroli szablonu robocze mieszanki wyjściowe używane do wykonania płytek.

Następnie 384 płytki testowe dołków są przygotowywane za pomocą zautomatyzowanego pipetera wielokanałowego i suszone do przechowywania. Na koniec 384 płytki testowe dołków są uruchamiane i analizowane. Ostatecznie wysokoprzepustowy ilościowy test RT PCR R w czasie rzeczywistym jest wykorzystywany do definiowania sygnatur ekspresji interferonu w modelach kultur tkankowych, badaniu patogenów lub w próbkach klinicznych w kontekście chorób zakaźnych lub autozapalnych.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak ilościowy R two PCR, przy użyciu standardowych sond liniowych lub cyberg green, jest to, że sondy fluorescencyjne z molekularną latarnią morską i blokiem kwasu nukleinowego mogą być używane do rozróżniania różnic w pojedynczej parze zasad między bardzo podobnymi sekwencjami Po rozmrożeniu, wirowaniu i krótkim odwirowaniu wzorca i plemnika łososia lub S-S-D-N-A. Przygotuj mieszankę wody SSD NA dla 17 standardowych zestawów rozcieńczania, mieszając 51 mikrolitrów S-S-D-N-A z 20,3 mililitrami wody. Dozuj 190 mikrolitrów mieszanki wodnej SS DNA do pierwszej probówki ośmiorurowego paska PCR i 180 mikrolitrów do następnych pięciu probówek.

Wykonaj rozcieńczenie od 1 do 20, przenosząc 10 mikrolitrów ze standardowego bulionu 50 Picomolar do probówki ze 190 mikrolitrami S-S-D-N-A, mieszaj wodę, mieszaj wir i szybko odwiruj. Pasek PCR wykonać rozcieńczenie od jednego do 10, przenosząc 20 mikrolitrów z ostatnio rozcieńczonej probówki do następnej probówki w serii wirowej i szybko odwirować pasek PCR. Powtarzać rozcieńczenie od jednego do 10 do momentu, aż ostatnia probówka z serii otrzyma wzorzec.

Po oznaczeniu do 17 dwumililitrowych probówek, za pomocą elektronicznej pipety wielokanałowej o pojemności 12,5 mikrolitra dodaj dwa mikrolitry S-S-D-N-A do każdej probówki za pomocą starterów i sond przygotowanych zgodnie z protokołem tekstowym. Do każdego startera dodać odpowiedni starter do przodu, starter do tyłu i sondę. Zestaw sond do pracy rurki magazynowej do przygotowania kontroli bez szablonu lub roboczych mieszanek materiałów NTC.

Przenieś 14.3 mikrolitrów każdej sondy startera do odpowiedniej roboczej probówki mieszania materiałów NTC zgodnie z tą tabelą. Po usunięciu Eloqua z zestawów sond starterów wymaganych dla materiału roboczego NTC, miesza się z 1,5 mililitra wody, aby doprowadzić końcową objętość każdej sondy startera, rurkę roboczą zestawu starterów do 1,7 mililitra. Aby przygotować 96-dołkową płytkę źródłową zestawów sond starterowych i mieszanek NTC.

Umieść nową 96-dołkową płytkę w schłodzonym 96-dołkowym bloku chłodzącym i oznacz studzienki odpowiednim zestawem sond starterowych lub mieszanką NTC za pomocą elektronicznej pipety wielokanałowej o pojemności 250 mikrolitrów. Dodaj 66 mikrolitrów wody do każdego zestawu sond startera. Studnia dozuje 82,5 mikrolitra wody do czterech docelowych 17 studni.

Dozuj 27,5 mikrolitra wody do każdej mieszanki anty C. Następnie dodaj 54 mikrolitry odpowiednich sond starterowych w magazynie roboczym do wyznaczonych sond starterowych przy dozowaniu studzienek. 67,5 mikrolitra zestawu roboczego sondy starterowej target 17 do wyznaczonej sondy starterowej target 17 w studniach.

Dodaj 22,5 mikrolitra odpowiedniej mieszanki roboczej NTC do wyznaczonych studzienek. Następnie użyj samoprzylepnej uszczelki płytkowej, aby uszczelnić płytkę 96-dołkową i odwirować przez jedną minutę w temperaturze 700 Gs, aby upewnić się, że zawartość znajduje się na dnie studzienek za pomocą adaptera 96-dołkowego. Umieść płytkę w mikserze wirowym i mieszaj w temperaturze 1000 RP przez jedną minutę.

Następnie odwirować płytkę w temperaturze 700 g przez pięć minut. Aby przygotować płytki testowe 384 dołków, włącz automatyczny pipeter wielokanałowy i kliknij dwukrotnie ikonę oprogramowania, aby otworzyć protokół tworzenia płytek do testów interferonowych w celu skonfigurowania platformy. Umieść całkowicie wypełnione pudełko na końcówki do pipet w pozycji pierwszej platformy, płytkę źródłową 96 dołków w pozycji czwartej, a nową płytkę 384-dołkową w pozycji szóstej.

Rozpocznij bieg, naciskając przycisk odtwarzania po zakończeniu biegu. Delikatnie postukaj płytką testową 384 dołka o płaską powierzchnię, aby upewnić się, że płyny znajdują się na dnie studzienek i nałóż samoprzylepną uszczelkę płytkową po obracaniu płytki z prędkością 700 G przez jedną minutę. Usuń uszczelkę płytki samoprzylepnej.

Umieścić płytkę testową 384 dołka w suszarce płytkowej i umieścić kolektor 384 dołkowy bezpośrednio nad studzienkami. Gdy 384 dołki oznaczające zawartość płytek wyschną. Nałożyć nową uszczelkę samoprzylepną, szybką etykietę foliową i przechowywać w ciemności w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aż zostanie użyta do załadowania i uruchomienia płytki testowej.

Przygotuj dwie mieszanki genów czystości lub studzienek HKG, rozcieńczając dwa mikrolitry S-S-D-N-A w 84,9 mikrolitrach wody. Następnie dodać dwa mikrolitry rozcieńczonej SSD NA 11,8 mikrolitra wody, 23 mikrolitry mieszanki wzorcowej i 9,2 mikrolitrów właściwej sondy startera 20 XHKG ustawionej do każdej oznakowanej probówki HKG, wirować i krótko odwirować po przygotowaniu próbek i kontroli pozytywnej CDNA w 78,8 mikrolitrach mieszanki głównej i 54,8 mikrolitrów wody do każdej próbki o pojemności 24 mikrolitrów i dodatniej probówki kontrolnej. Aby przygotować wzorce i mieszaniny studzienne NTC, które mają być dodane do wysuszonej płytki testowej 384 dołków, dodaj 165 mikrolitrów wody do 275 mikrolitrów mieszanki wzorcowej w 1,5 mililitrowej probówce do studzienki NTC mieszaj w 52,5 mikrolitrach wody do 52,5 mikrolitrów mieszanki głównej w 1,5 mililitrowej probówce.

Wyjąć wcześniej przygotowaną, wysuszoną płytkę testową 384 dołków z czterech stopni Celsjusza i odwirować w temperaturze 700 GS przez jedną minutę. Elektroniczna pipeta wielokanałowa o pojemności 30 mikrolitrów dozuje 7,5 mikrolitra NTC. Dobrze wymieszaj z każdym NTC.

Dobrze dozuj sześć mikrolitrów wzorców, dobrze wymieszaj i 1,5 mikrolitra wzorca do każdego wzorca. Następnie należy dozować 7,5 mikrolitra próbki do wyznaczonych dołków za pomocą elektronicznej pipety wielokanałowej o pojemności 12,5 mikrolitra. Dozować 2,5 mikrolitra mieszanki startera HKG Sonda do wyznaczonych dołków po użyciu optycznej folii samoprzylepnej do uszczelnienia płytki i odcentrowania w temperaturze 700 G przez jedną minutę wirować zapieczętowaną płytkę 384-dołkową w mieszalniku wirowym przy 2,600 obr./min przez dwie minuty i odwirować przy 700 serze przez pięć minut.

Na koniec umieść zapieczętowaną płytkę testową w maszynie Q-R-T-P-C-R. Otwórz szablon układu testu i użyj następujących warunków reakcji. Rozpocznij bieg, eksportuj i analizuj dane zgodnie z protokołem tekstowym, jak widać na tym rysunku, sygnatury ekspresji interferonu typu ludzkiego typu pierwszego i trzeciego analizowano w komórkach jednojądrzastych krwi obwodowej lub p BMC od sześciu dawców stymulowanych ligandami receptora toll-podobnego.

Dane są prezentowane jako wykresy radarowe w skali logarytmicznej przy użyciu dwóch metod analizy, w tym bezwzględnej wartości CQ znormalizowanej do genu porządkowego i liczby kopii matrycy na mikrogram całkowitego RNA. Dane pokazują, że sygnatury ekspresji interferonu u ludzi wywołane przez agonistów TLR są specyficznymi dla ligandów sygnaturami ekspresji interferonu typu pierwszego i trzeciego w Resus Maccas. W tym eksperymencie były również specyficzne dla ligandów TLR, PBMC od trzech dawców stymulowano trzema ligandami przez trzy godziny.

Ekspresja podtypu interferonu w niestymulowanych komórkach na początku badania była niska, jak pokazano tutaj. Ograniczona liczba podtypów interferonu alfa ulegała ekspresji w odpowiedzi na LPS i poli ic. W przeciwieństwie do tego, ekspresja interferonu w odpowiedzi na imikwimod była wysoka, a ekspresja podtypu obejmowała szeroką ekspresję interferonu beta i interferonu.

Lambda jeden została wzmocniona przez wszystkich trzech agonistów TLR Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przygotować, uruchomić i analyze. 3D czterech płytek testowych do wysokoprzepustowej analizy bardzo podobnej grupy genów, takich jak podtypy interferonu typu pierwszego i trzeciego.