Name: Wysokoprzepustowy ilościowy test RT-PCR w czasie rzeczywistym do określania profili ekspresji podtypów interferonu typu I i III (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-24T16:00:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: Poznaj wysokoprzepustowy test qRT-PCR do analizy ekspresji podtypów interferonu typu I i III. Ta metoda umożliwia rozróżnianie różnic na poziomie pojedynczych par zasad w podobnych sekwencjach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez CBER/FDA-NIAID/NIH Interagency Agreement YI-AI-6153-01, fundusze wewnętrzne FDA/CBER oraz Inicjatywę Medycznych Środków Zaradczych FDA. TCT, MNB, VPM, LMS i KDK otrzymały wsparcie w postaci powołania do Programu Uczestnictwa w Badaniach w Centrum Oceny i Badań Biologicznych zarządzanego przez Oak Ridge Institute for Science Education na mocy umowy międzyagencyjnej między Departamentem Energii Stanów Zjednoczonych a Amerykańską Agencją ds. Żywności i Leków.

1. Przygotowanie standardowych rozcieńczeń seryjnych (Rysunek 3A)
UWAGA: Seria seryjnych rozcieńczeń linearyzowanych plazmidów zawierających sekwencje docelowe przez zestaw Pr/Pb jest używana jako standardy ilościowe dla testu qRT-PCR. Każdy standardowy zestaw do rozcieńczania seryjnego dla podtypów IFN zawiera wystarczającą objętość, aby uruchomić 90 płytek testowych. Cztery punkty wzorcowej krzywej rozcieńczania używanej do oznaczania dobiera się tak, aby obejmowały wartości Ct z zakresu od 20 do 32 (tabela 3).
<ol>
	<li>Rozmrozić, odwirować i krótko odwirować roztwory wzorcowe (50 pM) i roztwory podstawowe DNA plemników łososia (SSDNA, 10 mg/ml).</li>
	<li>Przygotować mieszaninę SSDNA/woda dla 17 standardowych zestawów rozcieńczeń, mieszając 51 μl SSDNA z 20,3 ml wody.</li>
	<li>Oznaczyć jeden 8-probówkowy pasek PCR dla standardowego zestawu do rozcieńczania. 
	UWAGA: Przygotowanie wzorcowych rozcieńczeń seryjnych z roztworów podstawowych zajmie 2-3 godziny.</li>
	<li>Dozować 190 μl mieszanki SSDNA/woda do pierwszej probówki w pasku i 180 μl mieszanki SSDNA/woda do pięciu pozostałych probówek.</li>
	<li>Przeprowadzić rozcieńczenie w stosunku 1:20, przenosząc 10 μl z wywaru wzorcowego 50 pM do probówki ze 190 μl SSDNA/wody, wymieszać; odwirować i szybko odwirować pasek PCR.</li>
	<li>Przeprowadzić rozcieńczenie w stosunku 1:10, przenosząc 20 μl z ostatnio rozcieńczonej probówki do następnej probówki z serii; odwirować i szybko odwirować pasek PCR.</li>
	<li>Powtarzać krok 1.6 do momentu, gdy ostatnia probówka z serii rozcieńczeń otrzyma wzorzec.</li>
	<li>Powtórz kroki 1.3-1.7 dla każdego standardu.</li>
</ol>
Zobacz Tabelę 3 poniżej
2. Przygotowanie startera/sondy (Pr/Pb) i bez kontroli szablonu (NTC) Robocze mieszanki stockowe (Rysunek 3B)
UWAGA: Każdy 1,7 ml zapasu roboczego zestawu Pr/Pb i 128,6 μl mieszanki roboczej NTC (No Template Control) wytworzy 30 płytek testowych.
<ol>
	<li>Przygotuj zestaw Pr/Pb robocze mieszanki zapasów. 
	UWAGA: Przygotowanie zestawu Pr/Pb i roboczych mieszanek towarowych NTC z roztworów podstawowych zajmie 2-3 godziny.
	<ol>
		<li>Zawiesić startery i sondy w temperaturze 100 μM z ultraczystą wodą w celu przygotowania roztworów podstawowych.</li>
		<li>Oznaczyć do siedemnastu probówek o pojemności 2 ml; po jednej dla każdego zestawu Pr/Pb dołączonego do testu.</li>
		<li>Rozmrozić, odwirować i krótko odwirować startery (100 μM), sondy (100 μM) i roztwory podstawowe SSDNA (10 mg/ml).</li>
		<li>Dodaj 2 μl SSDNA do każdej probówki za pomocą elektronicznej pipety wielokanałowej o pojemności 12,5 μl. Dodaj odpowiedni starter do przodu, starter wsteczny i sondę do każdej działającej rurki zestawu Pr / Pb. Patrz Tabela 1 dla zestawów Pr/Pb ukierunkowanych na ludzkie podtypy IFN i Tabela 2 dla zestawów Pr/Pb makaków rezusów. Dodaj wodę, aby zwiększyć objętość każdej działającej rurki zestawu Pr/Pb do 200 μl. 
		UWAGA: Objętość starterów, sondy i wody do dodania zależy od wymaganego końcowego stężenia reakcyjnego zestawu Pr/Pb.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj robocze mieszanki zapasów NTC.
	<ol>
		<li>Oznacz dwa 5-probówkowe paski PCR dla mieszanek zapasów roboczych NTC.</li>
		<li>Przenieś 14,3 μl każdego zestawu Pr/Pb do odpowiedniej probówki do mieszania materiałów roboczych NTC. Patrz Tabela 4, aby zapoznać się z kombinacjami zestawów Pr/Pb dla studni NTC. Dodać wodę do każdej z mieszanin roboczych NTC, aby uzyskać ostateczną objętość do 128,6 μl.</li>
		<li>Odwirować, krótko odwirować i umieścić probówki w ciemności na lodzie lub w temperaturze -20 °C w celu długotrwałego przechowywania.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
Zobacz Tabelę 4 poniżej
<ol start="3">
	<li>Rozcieńczyć zapasy robocze zestawu Pr/Pb.
	<ol>
		<li>Po usunięciu podwielokrotności zestawów Pr/Pb wymaganych dla mieszanin materiałów roboczych NTC, dodać 1,5 ml wody, aby doprowadzić końcową objętość każdej probówki roboczej zestawu Pr/Pb do 1,7 ml.</li>
		<li>Odwirować, krótko odwirować i umieścić probówki w ciemności na lodzie lub w temperaturze -20 °C w celu dłuższego przechowywania.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Przygotowanie 384-dołkowych płytek testowych przy użyciu automatycznego pipetora wielokanałowego
<ol>
	<li>Przygotować 96-dołkową płytkę źródłową z zestawów Pr/Pb i mieszanin NTC do porcjowania na 384-dołkowe płytki testowe. 
	UWAGA: Przygotowanie płyty źródłowej z mieszanek wyrobisk Pr/Pb zajmie mniej niż 1 godzinę. Każda 96-dołkowa płytka źródłowa wystarcza do wytworzenia sześciu 384-dołkowych płytek testowych (rysunek 3C).
	<ol>
		<li>Odwirować i krótko odwirować zapasy robocze zestawu Pr / Pb i mieszanki materiałów roboczych NTC.</li>
		<li>Umieścić nową 96-dołkową płytkę w schłodzonym 96-dołkowym bloku chłodzącym i oznaczyć studzienki dla każdego zestawu Pr/Pb lub mieszanki NTC, którą otrzymują studzienki (patrz rysunek 2).</li>
		<li>Dodać wodę do płytki 96-dołkowej za pomocą elektronicznej pipety wielokanałowej o pojemności 250 μl: Dozować 66 μl wody do każdej studzienki z zestawem Pr/Pb (z wyjątkiem 4 studzienek dla Celu 17). Dozuj 82,5 μl wody do 4 studni Target 17. Dozuj 27,5 μl wody do każdej studzienki NTC.</li>
		<li>Dodaj odpowiedni zapas roboczy zestawu Pr/Pb do wyznaczonych dołków płytki 96-dołkowej: Dozuj 54 μl odpowiedniego zapasu roboczego zestawu Pr/Pb do wyznaczonych dołków zestawu Pr/Pb (z wyjątkiem 4 dołków dla Celu 17). Dozować 67,5 μl materiału roboczego z zestawu Target 17 Pr/Pb do wyznaczonych studzienek zestawu Target 17 Pr/Pb. Do wyznaczonych dołków dodać 22,5 μl odpowiedniej mieszanki roboczej NTC.</li>
		<li>Uszczelnić 96-dołkową płytkę z płytką samoprzylepną, uszczelnić i odwirować przez 1 minutę przy 700 x g, aby upewnić się, że zawartość znajduje się na dnie studzienek.</li>
		<li>Umieść 96-dołkową płytkę w mieszalniku wirowym za pomocą adaptera do płytki 96-dołkowej i mieszaj przez 1 minutę z prędkością 1,000 obr./min. Odwirować 96-dołkową płytkę przez 5 minut przy 700 x g.</li>
		<li>Przechowywać 96-dołkową płytkę źródłową w ciemności w temperaturze 4 °C, jeśli jest używana tego samego dnia, w przeciwnym razie przechowywać w temperaturze -20 °C do momentu użycia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować 384-dołkowe płytki testowe, dodając zestawy Pr/Pb za pomocą zautomatyzowanego pipetora wielokanałowego. 
	UWAGA: Przygotowanie sześciu płytek testowych z 96-dołkowej płytki źródłowej zajmie 3-4 godziny.
	<ol>
		<li>Przed wykonaniem płyt należy wstępnie schłodzić gniazdo chłodzące do 4 °C i podgrzać parownik płytowy do 125 °C, a dolny blok grzewczy do 80 °C przy przepływie powietrza wydmuchiwanym w zakresie 20-25 litrów na minutę (LPM).</li>
		<li>Włącz automatyczny pipet wielokanałowy i otwórz protokół do wykonywania płytek testowych IFN, klikając dwukrotnie ikonę oprogramowania.</li>
		<li>Aby ustawić platformę, umieść całkowicie wypełnione pudełko z końcówkami do pipet w pozycji 1 platformy, 96-dołkową płytkę źródłową w pozycji 4, a nową 384-dołkową płytkę w pozycji 6. Rozpocznij bieg, naciskając przycisk odtwarzania. 
		UWAGA: Po zakończeniu cyklu każda studzienka będzie zawierała 5 μl mieszanki Pr/Pb. 
		UWAGA: Ostateczna ilość SSDNA dodana na studzienkę z 384-dołkowej płytki testowej wynosi 0,025 μg.</li>
		<li>Delikatnie postukaj 384-dołkową płytką testową o płaską powierzchnię, aby upewnić się, że płyny znajdują się na dnie studzienek i nałóż samoprzylepną uszczelkę płytkową.</li>
		<li>Odwirować płytkę przez 1 minutę przy 700 x g. Usunąć samoprzylepną uszczelkę płytki, umieścić 384-dołkową płytkę testową w suszarce płytkowej i umieścić kolektor 384-dołkowy bezpośrednio nad studzienkami.</li>
		<li>Gdy zawartość 384-dołkowej płytki testowej wyschnie, nałożyć nową uszczelkę z płytki samoprzylepnej, zawinąć w folię, oznaczyć etykietą i przechowywać w ciemności w temperaturze 4 °C do momentu użycia. 
		UWAGA: Płyty można przechowywać w temperaturze 4 °C przez co najmniej 6 miesięcy.</li>
		<li>Powtarzać kroki 3.2.3-3.2.6 do momentu przygotowania 6 384-dołkowych płytek testowych lub wyczerpania cieczy w 96-dołkowej płytce źródłowej.</li>
		<li>Wyłącz gniazdo chłodzące, zamknij oprogramowanie i wyłącz automatyczny pipetor wielokanałowy. Wyłącz suszarkę płytową.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Ładowanie i uruchamianie 384-dołkowej płytki testowej
<ol>
	<li>Przygotuj dwie mieszanki dołków genów porządkowych (HKG), które składają się z zestawu Pr / Pb dla mieszanki głównej HKG, SSDNA, PCR i wody, które zostaną dodane do wysuszonej płytki testowej 384 dołków (ryc. 3D). 
	UWAGA: Przygotowanie mieszanek i załadowanie płytki testowej zajmie 1-2 godziny. Uruchomienie płytki testowej zajmie mniej niż 2 godziny.
	<ol>
		<li>Oznacz probówkę o pojemności 1,5 ml dla każdej mieszanki HKG.</li>
		<li>Rozcieńczyć 2 μl SSDNA (10 mg/ml) w 84,9 μl wody. Dodać 2 μl rozcieńczonego SSDNA, 11,8 μl wody, 23 μl mieszanki głównej i 9,2 μl odpowiedniego zestawu 20x HKG Pr/Pr do każdej probówki, wiru i krótkiej wirówki.</li>
		<li>Należy użyć dehydrogenazy gliceraldehydo-3-fosforanowej (GAPDH) i ubikwityny C (UBC) jako HKG do testu na ludziach (patrz tabela materiałów). Użyj GAPDH i rybosomalnego RNA 18S jako HKG do testu Rh. 
		UWAGA: HKG użyte do przeprowadzenia testu są elastyczne i powinny odzwierciedlać geny odpowiednie dla badanego typu komórki. GAPDH, UBC i 18S to przykłady powszechnie używanych HKG; inne HKG mogą być bardziej odpowiednie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować mieszaniny próbek i studzienek do kontroli dodatniej, które składają się z próbki lub cDNA kontroli dodatniej, mieszaniny wzorcowej i wody, które należy dodać do wysuszonej płytki do oznaczania 384-dołkowego. Przygotować próbkę, a kontrola dodatnia miesza się w ilości wystarczającej do dozowania do 21 dołków płytkowych (rysunek 3D).
	<ol>
		<li>Przed syntezą cDNA postępuj zgodnie z instrukcjami producenta, aby przygotować próbki RNA z etapem trawienia DNazy.</li>
		<li>Przygotować próbki i przeprowadzić kontrolę pozytywną z wyprzedzeniem na podstawie syntezy cDNA co najmniej 500 ng RNA, a następnie poddać działaniu RNazy H (końcowa objętość 24 μl dla każdej próbki) zgodnie z instrukcjami producenta. Przygotowane cDNA należy przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu użycia. Rozmrozić, odwirować i krótko odwirować próbkę cDNA.</li>
		<li>Dodać 78,8 μl mieszanki wzorcowej i 54,8 μl wody do każdej próbki o objętości 24 μl i probówki kontroli pozytywnej.</li>
		<li>Zwirować i krótko odwirować probówki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować wzorce i mieszaniny studzienek NTC, składające się z mieszanki wzorcowej i wody, które zostaną dodane do wysuszonej płytki do oznaczania 384-dołkowego (rysunek 3D). W przypadku studzienki wzorcowej należy dodać 165 μl wody do 275 μl mieszanki wzorcowej w probówce o pojemności 1,5 ml. W przypadku mieszania studzienek NTC dodać 52,5 μl wody do 52,5 μl mieszanki wzorcowej w probówce o pojemności 1,5 ml. Zwirować i krótko odwirować probówki.</li>
	<li>Przygotować wysuszoną 384-dołkową płytkę testową do załadowania mieszanin i próbek.
	<ol>
		<li>Wyjąć wysuszoną 384-dołkową płytkę testową z 4 °C i odwirować przez 1 minutę przy 700 x g.</li>
		<li>Umieścić płytkę na schłodzonym 384-dołkowym bloku chłodzącym, zdjąć samoprzylepną uszczelkę płytki i obrysować dołki płytki, aby wskazać miejsca, w których różne mieszaniny i próbki będą pipetowane (rysunek 1).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Załaduj 384-dołkową płytkę testową standardową mieszanką studzienek, wzorcami, mieszaniną studzienek NTC, próbkami, kontrolą pozytywną i mieszanką HKG (rysunek 3E). Zwirować i krótko odwirować wszystkie roztwory przed dozowaniem do płytki.
	<ol>
		<li>Dozować 6 μl wzorców, dobrze wymieszać z każdym dołkiem wzorcowym za pomocą elektronicznej pipety wielokanałowej o pojemności 30 μl. Dozować 1,5 μl odpowiedniego standardowego rozcieńczenia seryjnego do wyznaczonej studzienki za pomocą elektronicznej pipety wielokanałowej o pojemności 12,5 μl.</li>
		<li>Dozować 7,5 μl studzienki NTC do każdej studzienki NTC za pomocą elektronicznej pipety wielokanałowej o pojemności 30 μl. Dozować 7,5 μl próbki do wyznaczonych studzienek za pomocą elektronicznej pipety wielokanałowej o pojemności 30 μl. Dozować 2,5 μl mieszanin HKG Pr/Pb do wyznaczonych dołków za pomocą elektronicznej pipety wielokanałowej o pojemności 12,5 μl.</li>
		<li>Napełnij puste studzienki 7,5 μl pozostałej wody i wymieszaj mieszaninę wzorcową za pomocą elektronicznej pipety wielokanałowej o pojemności 30 μl; 7,5 μl samej wody również będzie odpowiednie.</li>
		<li>Uszczelnić 384-dołkową płytkę testową optyczną folią adhezyjną i odwirować przez 1 minutę przy 700 x g. Wirować zapieczętowaną płytkę 384-dołkową w mieszalniku wirowym przez 2 minuty przy 2 600 obr./min i wirować przez 5 minut przy 700 x g.</li>
		<li>Umieść zapieczętowaną 384-dołkową płytkę testową w maszynie qRT-PCR, otwórz szablon układu testu i rozpocznij przebieg. 
		UWAGA: Wyniki można wyeksportować jako arkusz kalkulacyjny lub jako plik tekstowy do analizy.</li>
		<li>Do testu należy zastosować następujące optymalne warunki reakcji termocyklera: i) 50 °C przez 2 min, ii) 95 °C przez 10 min, iii) 95 °C przez 25 s, iv) 59 °C przez 1 min. Powtórz kroki iii i iv przez 40 cykli.</li>
		<li>Eksportuj surowe dane z platformy qRT-PCR do oprogramowania aplikacyjnego do arkuszy kalkulacyjnych. Wykreśl każdy 4-punktowy zestaw wzorców jako krzywą standardową, aby zaobserwować liniowość. Przeprowadzić analizę, obliczając ∆Cq lub liczbę kopii na podstawie czteropunktowych krzywych standardowych27.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
Zobacz Rysunek 3 poniżej

<ol><li>Yan, N., Chen, Z. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+antiviral+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Intrinsic antiviral immunity.</a> Nature. 13, 214-222 (2012).</li>
<li>Pestka, S., Krause, C. D., Walter, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferons%2C+interferon-like+cytokines%2C+and+their+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Immunological+reviews%22%5BJournal%5D)">Interferons, interferon-like cytokines, and their receptors.</a> Immunological reviews. 202, 8-32 (2004).</li>
<li>Baum, A., Garcia-Sastre, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+type+I+interferon+by+RNA+viruses%3A+cellular+receptors+and+their+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Amino+acids%22%5BJournal%5D)">Induction of type I interferon by RNA viruses: cellular receptors and their substrates.</a> Amino acids. 38, 1283-1299 (2010).</li>
<li>Kotenko, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IFN-lambdas+mediate+antiviral+protection+through+a+distinct+class+II+cytokine+receptor+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">IFN-lambdas mediate antiviral protection through a distinct class II cytokine receptor complex.</a> Nature. 4, 69-77 (2003).</li>
<li>Hardy, M. P., Owczarek, C. M., Jermiin, L. S., Ejdeback, M., Hertzog, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+type+I+interferon+locus+and+identification+of+novel+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">Characterization of the type I interferon locus and identification of novel genes.</a> Genomics. 84, 331-345 (2004).</li>
<li>Cheon, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IFNbeta-dependent+increases+in+STAT1%2C+STAT2%2C+and+IRF9+mediate+resistance+to+viruses+and+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+journal%22%5BJournal%5D)">IFNbeta-dependent increases in STAT1, STAT2, and IRF9 mediate resistance to viruses and DNA damage.</a> The EMBO journal. 32, 2751-2763 (2013).</li>
<li>Schneider, W. M., Chevillotte, M. D., Rice, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon-stimulated+genes%3A+a+complex+web+of+host+defenses%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+immunology%22%5BJournal%5D)">Interferon-stimulated genes: a complex web of host defenses.</a> Annual review of immunology. 32, 513-545 (2014).</li>
<li>Hiscott, J., Nguyen, T. L., Arguello, M., Nakhaei, P., Paz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manipulation+of+the+nuclear+factor-kappaB+pathway+and+the+innate+immune+response+by+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Manipulation of the nuclear factor-kappaB pathway and the innate immune response by viruses.</a> Oncogene. 25, 6844-6867 (2006).</li>
<li>Alcami, A., Symons, J. A., Smith, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+vaccinia+virus+soluble+alpha%2Fbeta+interferon+%28IFN%29+receptor+binds+to+the+cell+surface+and+protects+cells+from+the+antiviral+effects+of+IFN%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+virology%22%5BJournal%5D)">The vaccinia virus soluble alpha/beta interferon (IFN) receptor binds to the cell surface and protects cells from the antiviral effects of IFN.</a> Journal of virology. 74, 11230-11239 (2000).</li>
<li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+type+I+and+type+III+interferons+by+a+secreted+glycoprotein+from+Yaba-like+disease+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Inhibition of type I and type III interferons by a secreted glycoprotein from Yaba-like disease virus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 9822-9827 (2007).</li>
<li>Bidwell, B. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silencing+of+Irf7+pathways+in+breast+cancer+cells+promotes+bone+metastasis+through+immune+escape%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+medicine%22%5BJournal%5D)">Silencing of Irf7 pathways in breast cancer cells promotes bone metastasis through immune escape.</a> Nature medicine. 18, 1224-1231 (2012).</li>
<li>Di Domizio, J., Cao, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fueling+autoimmunity%3A+type+I+interferon+in+autoimmune+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+review+of+clinical+immunology%22%5BJournal%5D)">Fueling autoimmunity: type I interferon in autoimmune diseases.</a> Expert review of clinical immunology. 9, 201-210 (2013).</li>
<li>Crow, Y. J., Casanova, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STING-Associated+Vasculopathy+with+Onset+in+Infancy+-+A+New+Interferonopathy%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+journal+of+medicine%22%5BJournal%5D)">STING-Associated Vasculopathy with Onset in Infancy - A New Interferonopathy.</a> The New England journal of medicine. , (2014).</li>
<li>Bermel, R. A., Rudick, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon-beta+treatment+for+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotherapeutics+%3A+the+journal+of+the+American+Society+for+Experimental+NeuroTherapeutics%22%5BJournal%5D)">Interferon-beta treatment for multiple sclerosis.</a> Neurotherapeutics : the journal of the American Society for Experimental NeuroTherapeutics. 4, 633-646 (2007).</li>
<li>Kingham, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+HBsAg-positive+chronic+active+hepatitis+with+human+fibroblast+interferon%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Treatment of HBsAg-positive chronic active hepatitis with human fibroblast interferon.</a> Gut. 19, 91-94 (1978).</li>
<li>Heathcote, J., Main, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+hepatitis+C%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+viral+hepatitis%22%5BJournal%5D)">Treatment of hepatitis C.</a> Journal of viral hepatitis. 12, 223-235 (2005).</li>
<li>Donnelly, R. P., Dickensheets, H., O'Brien, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon-lambda+and+therapy+for+chronic+hepatitis+C+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+immunology%22%5BJournal%5D)">Interferon-lambda and therapy for chronic hepatitis C virus infection.</a> Trends in immunology. 32, 443-450 (2011).</li>
<li>Castaigne, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon+alpha+in+the+treatment+of+hairy+cell+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Interferon alpha in the treatment of hairy cell leukemia.</a> Cancer. 57, 1681-1684 (1986).</li>
<li>Kumar, L., Basade, M., Gulati, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+interferon-alpha+in+chronic+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+the+Association+of+Physicians+of+India%22%5BJournal%5D)">Role of interferon-alpha in chronic myeloid leukemia.</a> The Journal of the Association of Physicians of India. 3, 26-32 (1995).</li>
<li>Dai, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon+alpha+on+NZM2328.Lc1R27%3A+Enhancing+autoimmunity+and+immune+complex-mediated+glomerulonephritis+without+end+stage+renal+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+immunology+%28Orlando%2C+Fla.%29%22%5BJournal%5D)">Interferon alpha on NZM2328.Lc1R27: Enhancing autoimmunity and immune complex-mediated glomerulonephritis without end stage renal failure.</a> Clinical immunology (Orlando, Fla.). 154, 66-71 (2014).</li>
<li>Maeda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon-alpha+Acts+on+the+S%2FG2%2FM+Phases+to+Induce+Apoptosis+in+the+G1+Phase+of+an+IFNAR2-Expressing+Hepatocellular+Carcinoma+Cell+Line%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Interferon-alpha Acts on the S/G2/M Phases to Induce Apoptosis in the G1 Phase of an IFNAR2-Expressing Hepatocellular Carcinoma Cell Line.</a> The Journal of biological chemistry. , (2014).</li>
<li>Xia, C. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+IFN-alpha-Producing+Plasmacytoid+Dendritic+Cells+%28pDCs%29+in+Human+Th1-Mediated+Type+1+Diabetes%3A+pDCs+Augment+Th1+Responses+through+IFN-alpha+Production%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunology%22%5BJournal%5D)">Increased IFN-alpha-Producing Plasmacytoid Dendritic Cells (pDCs) in Human Th1-Mediated Type 1 Diabetes: pDCs Augment Th1 Responses through IFN-alpha Production.</a> Journal of immunology. 193, 1024-1034 (2014).</li>
<li>Hervas-Stubbs, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conventional+but+not+plasmacytoid+dendritic+cells+foster+the+systemic+virus-induced+type+I+IFN+response+needed+for+efficient+CD8+T+cell+priming%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunology%22%5BJournal%5D)">Conventional but not plasmacytoid dendritic cells foster the systemic virus-induced type I IFN response needed for efficient CD8 T cell priming.</a> Journal of immunology. 193, 1151-1161 (2014).</li>
<li>Manry, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+genetic+dissection+of+human+interferons%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+experimental+medicine%22%5BJournal%5D)">Evolutionary genetic dissection of human interferons.</a> The Journal of experimental medicine. 208, 2747-2759 (2011).</li>
<li>Chen, J., Baig, E., Fish, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+and+relatedness+among+the+type+I+interferons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+interferon+%26+cytokine+research+%3A+the+official+journal+of+the+International+Society+for+Interferon+and+Cytokine+Research%22%5BJournal%5D)">Diversity and relatedness among the type I interferons.</a> Journal of interferon & cytokine research : the official journal of the International Society for Interferon and Cytokine Research. 24, 687-698 (2004).</li>
<li>Fox, B. A., Sheppard, P. O., O'Hara, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+genomic+data+in+the+discovery%2C+annotation+and+evolutionary+interpretation+of+the+interferon-lambda+family%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">The role of genomic data in the discovery, annotation and evolutionary interpretation of the interferon-lambda family.</a> PloS one. 4, e4933(2009).</li>
<li>Hillyer, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+profiles+of+human+interferon-alpha+and+interferon-lambda+subtypes+are+ligand-+and+cell-dependent%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+and+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Expression profiles of human interferon-alpha and interferon-lambda subtypes are ligand- and cell-dependent.</a> Immunology and cell biology. 90, 774-783 (2012).</li>
<li>Schramm, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+quantitative+real-time+polymerase+chain+reaction+array+for+absolute+and+relative+quantification+of+rhesus+macaque+types+I%2C+II%2C+and+III+interferon+and+their+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+interferon+%26+cytokine+research+%3A+the+official+journal+of+the+International+Society+for+Interferon+and+Cytokine+Research%22%5BJournal%5D)">High-throughput quantitative real-time polymerase chain reaction array for absolute and relative quantification of rhesus macaque types I, II, and III interferon and their subtypes.</a> Journal of interferon & cytokine research : the official journal of the International Society for Interferon and Cytokine Research. 32, 407-415 (2012).</li>
<li>Wang, Q., Chen, L., Long, Y., Tian, H., Wu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+beacons+of+xeno-nucleic+acid+for+detecting+nucleic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Molecular beacons of xeno-nucleic acid for detecting nucleic acid.</a> Theranostics. 3, 395-408 (2013).</li>
<li>Little, S., et al. Amplification-refractory mutation system (ARMS) analysis of point mutations. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLittle%2C+S+%22Current+protocols+in+human+genetics+%2F+editorial+board%2C+Jonathan+L.+Haines+...+%5Bet+al.%5D%22">Current protocols in human genetics / editorial board, Jonathan L. Haines ... [et al.]</a>. 9 (Unit 9 8), (2001).</li>
</ol>

VPM i RLR są współtwórcami technologii do pomiaru ekspresji podtypów IFN i IFN oraz uzyskiwania z niej dochodów z opłat licencyjnych. Pozostali autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

W niniejszym raporcie opisano projekt, produkcję seryjną i podejście do analizy testu w celu pomiaru transkrypcji zestawu bardzo podobnych genów w warunkach laboratorium badawczego. Opisany tutaj wysokoprzepustowy test qRT-PCR mierzy podtypy IFN- i -λ z wysoką swoistością. Metoda ta obejmuje dwa kluczowe aspekty: projektowanie zestawów Pr / Pb, które rozróżniają członków homologicznej rodziny genów oraz opracowanie platformy produkcyjnej do tworzenia wiarygodnych i spójnych 384-dołkowych płytek testowych wstępnie załadowanych zestawami Pr / Pb. Sondy qRT-PCR wykorzystują podejście strukturalne (MB) lub chemiczne (LNA) w celu zwiększenia ich specyficzności29. W przypadku dwóch zestawów starterów w teście rezusów (Tabela 2) system mutacji opornych na amplifikację (ARMS) został włączony do sekwencji starterów, aby jeszcze bardziej zwiększyć swoistość30. Chociaż generalnie najlepiej jest celować w połączenia ekson-ekson w celu zwiększenia swoistości reakcji qRT-PCR, nie było to możliwe, ponieważ geny IFN typu I nie mają intronów. W związku z tym genomowe DNA zostanie amplifikowane w reakcji PCR i musi zostać zdegradowane przez traktowanie DNazą po ekstrakcji RNA.
Region docelowy dla zestawów Pr / Pb był ograniczony do regionów kodujących dojrzały peptyd dla każdego IFN. Ze względu na duże podobieństwo sekwencji między podtypami IFN-α, w szczególności regionu dojrzałego peptydu, czasami konieczne było obniżenie czułości w celu zapewnienia swoistości. Dotyczyło to w szczególności IFN-α17, gdzie transkrypt dojrzałego peptydu ma tylko cztery unikalne zasady w porównaniu z innymi podtypami IFN-α. Celowanie w IFN-α17 wymagało starterów, które wiążą transkrypty wielu podtypów, ograniczając swoistość do sondy. W konsekwencji reakcja PCR amplifikuje podtypy inne niż IFN-α17, zużywając w ten sposób znaczny procent odczynników PCR i obniżając amplitudę sygnału fluorescencji ze specyficznej sondy dla IFN-α17. Dodatkowym wyzwaniem związanym z projektowaniem czułych i specyficznych zestawów Pr/Pb dla bardzo podobnych genów, takich jak IFN, jest możliwość, że sekwencje z adnotacjami w bazie danych GenBank mogą nie być kompletne lub kompleksowe w momencie projektowania. Również w tym przypadku stanowiło to wyzwanie dla IFN-α17, w którym nowo opisane sekwencje nie są idealnie dopasowane do wersji sekwencji w bazie danych w momencie projektowania. Dlatego też, projektując zestawy Pr/Pb dla genów, które nie były intensywnie badane, dobrze jest okresowo sprawdzać najnowszą sekwencję z adnotacjami docelowego genu. Wreszcie, konieczne jest zapewnienie, że zestawy Pr/Pb nie amplifikują pseudogenów, które mogą być transkrybowane, ale nie mogą być translowane.
Po zaprojektowaniu zestawów Pr/Pb, kolejnym wyzwaniem jest optymalizacja warunków PCR siedemnastu różnych zestawów Pr/Pb na jednej płytce 384-dołkowej. Wzorce transkryptu są ważne w testowaniu specyficzności zestawu Pr/Pb i stają się niezbędne do harmonizacji warunków qRT-PCR wielu różnych reakcji PCR. Testowanie zestawu Pr/Pb w stosunku do standardów transkrypcji ustala jego skuteczność i czułość; plazmidy, które wyrażają bardzo podobne pseudogeny, mogą być konieczne, aby zapewnić, że zestaw Pr / Pb selektywnie mierzy transkrypcję funkcjonalnego genu. Standardy transkryptów zapewniają również ilościowe środki analizy (liczba transkryptów), oprócz analizy półilościowej w odniesieniu do genu porządkowego (ΔCq).
Zrobotyzowane pipetowanie wielokanałowe z 96-dołkowej płytki źródłowej do wielu 384-dołkowych płytek testowych poprawia precyzję i spójność wyników międzypłytkowych. DNA plemników łososia (SSDNA) jest używane jako nośnik, który stabilizuje i zachowuje zestawy Pr / Pb do długotrwałego przechowywania, podobnie jak suszenie odczynników dozowanych do płytek. Suszenie płytek zmniejsza również objętość reakcji niezbędnej do uzyskania powtarzalnych wyników, co z kolei pozwala zachować cenne próbki i zmniejszyć zużycie kosztownych odczynników. Na tych etapach montowane są partie płyt, które zapewniają precyzję i spójność przez ponad sześć miesięcy.
Po przygotowaniu płytek kluczowe znaczenie mają środki kontroli jakości, aby sprawdzić konsystencję partii płytek. W tym celu na płycie uruchamiane są dodatkowe cztery zestawy wzorców. Tablica "5x standard" śledzi wydajność i tworzy zestaw danych, z którym porównywane są standardy poszczególnych płyt. Podczas gdy podczas projektowania testu stosuje się dziesięć 10-krotnych rozcieńczeń każdego wzorca, względy przestrzenne wymagają, aby dla krzywej wzorcowej na każdej płytce testowej i dla płytki wzorcowej 5x były używane cztery punkty. Ponadto na każdej tabliczce powinna znajdować się kontrola dodatnia, aby zapewnić jej ważność.
Zazwyczaj przygotowanie sześciu płytek testowych z jednej płytki źródłowej Pr / Pb zajmuje 3-4 godziny; Możliwe jest przygotowanie dwunastu płytek w ciągu jednego dnia w laboratorium badawczym. Ponieważ każda ludzka płytka testowa podtypu IFN bada siedemnaście zestawów Pr / Pb i może pomieścić piętnaście próbek eksperymentalnych, jeden dzień montażu wytwarza partię płytek o zdolności do wygenerowania do 3,060 punktów danych eksperymentalnych. Surowe dane z platformy qRT-PCR mogą być przetwarzane i łączone za pomocą skryptów programistycznych w oprogramowaniu do obsługi arkuszy kalkulacyjnych w celu automatycznego wypełnienia wstępnie zaprojektowanego szablonu analizy. Ta metoda minimalizuje ręczne wprowadzanie danych, zapobiegając w ten sposób błędom kopiowania i pozwala badaczowi skupić się na analizie danych, a nie na ich gromadzeniu. Jak opisano tutaj, ten wysokoprzepustowy test qRT-PCR może być stosowany do pomiaru ekspresji podtypów interferonu w próbkach makaków ludzkich lub rezusów i może być dostosowany do stosowania dla innych gatunków lub homologicznych zestawów genów. Elastyczność układu płytki pozwala użytkownikowi na zmianę zestawów starterów/sond w celu dostosowania interesujących genów do określonego typu komórki lub systemu modelowego. Test ten można zastosować do pomiaru sygnatur ekspresji IFN w modelach hodowli komórkowych badających patogeny lub w próbkach pacjentów w kontekście modeli chorób w celu wyjaśnienia mechanizmów sygnalizacyjnych zaangażowanych w odpowiedź immunologiczną.

Interferony typu I i III (IFN) są kluczowe w odpowiedzi immunologicznej na wirusy i inne bodźce chorobotwórcze i występują u wszystkich kręgowców1. Komórki immunologiczne i nieimmunologiczne wyrażają i wydzielają, a także reagują na IFN2. Wrodzone czujniki immunologiczne, takie jak receptory toll-podobne (TLR), STING i RIG-I, indukują ekspresję IFN typu I i III po wykryciu wzorców molekularnych związanych z patogenem (PAMP)3,4. U ludzi IFN typu I obejmuje IFN-β, -ω, -κ i 12 podtypów IFN-α i wiąże się z kompleksem receptora IFNAR1 / IFNAR22,5. IFN typu III obejmują IFN-λ1, -λ2 i -λ3 i wiążą się z kompleksem receptora IL10RB / IL28RA2. Klasycznie IFN typu I i III wiążą się z odpowiednimi kompleksami receptorowymi, które następnie rekrutują heterodimery STAT1/STAT2 i inicjują transkrypcję genów stymulowanych interferonem (ISG)6. ISG są zaangażowane w różnorodny zakres funkcji, od działania przeciwwirusowego i antyproliferacyjnego po aktywację adaptacyjnej odpowiedzi immunologicznej7.
Liczne mechanizmy, które patogeny wyewoluowały, aby unikać, obalać i przejmować elementy szlaku sygnałowego IFN, pokazują znaczenie IFN we wrodzonej odpowiedzi immunologicznej8. Na przykład wirus krowianki wykazuje ekspresję receptora wabika z homologią IFNAR1, który sekwestruje IFN9 typu I, podczas gdy wirus choroby podobnej do Yaba wydziela glikoproteinę, która hamuje białka IFN typu I i III10. Oprócz ich roli w obronie gospodarza, IFN są również zaangażowane w nadzór nad rakiem i szereg chorób autozapalnych: wyciszenie ekspresji IFN w komórkach raka piersi ogranicza nadzór immunologiczny11, nadprodukcja IFN-α jest mechanizmem rozwoju tocznia rumieniowatego układowego12, a błędna aktywacja STING prowadzi do ogólnoustrojowego zapalenia spowodowanego nadmierną ilością IFN w waskulopatii związanej z STING13. Terapeutycznie IFN są stosowane w leczeniu stwardnienia rozsianego14, przewlekłych infekcji wirusowych, takich jak HBV15 i HCV16,17, oraz nowotworów, takich jak białaczka włochatokomórkowa18 i przewlekła białaczka szpikowa19. Pytania o znaczenie IFN w określonym procesie fizjologicznym nieustannie ujawniają wszechobecny charakter tej rodziny cytokin.
IFN typu I, zwłaszcza podtypy IFN-α, są często uważane za jedną jednostkę20-23, a nie jako grupę blisko spokrewnionych, ale odrębnych białek. Istnienie i utrzymywanie się wielu gatunków IFN, w tym podtypów IFN-α, w trakcie ewolucji kręgowców24 sugeruje, że co najmniej podzbiór tych podtypów ma specyficzne lub unikalne funkcje. Możliwe jest, że zdefiniowanie wzorców wyrażeń IFN rozszyfruje i pomoże scharakteryzować specyficzne funkcje jednego lub więcej podtypów17. Wyzwanie związane z badaniem podtypów IFN typu I i III opiera się na ich wspólnej tożsamości sekwencyjnej: dwanaście podtypów IFN-α ma wspólne >50%25, a podtypy IFN-λ mają 81-96%26 sekwencji aminokwasowych. W opisanym teście qRT-PCR sondy fluorescencyjne z radiolatarnią molekularną (MB) i zablokowanym kwasem nukleinowym (LNA) rozróżniają różnice w pojedynczej parze zasad między bardzo podobnymi sekwencjami podtypu IFN i pozwalają na scharakteryzowanie sygnatury ekspresji IFN. Format 384-dołkowej płytki testu obejmuje zarówno pomiary ilościowe (standardy transkryptów), jak i półilościowe (geny porządkowe (HKG)), co pozwala na analizę odpowiednio według liczby kopii transkryptu i ∆Cq. Montaż wsadowy, ułatwiony dzięki zautomatyzowanemu pipetowaniu wielokanałowemu, oraz długotrwałe przechowywanie, możliwe dzięki suszeniu zestawów starter/sonda (Pr/Pb) na płytkach, zwiększają powtarzalność, użyteczność i praktyczność testu.
Ten protokół opisuje proces przygotowania 384-dołkowych płytek testowych qRT-PCR (Rysunek 1) z maksymalnie siedemnastoma różnymi zestawami Pr/Pb ukierunkowanymi na ludzkie podtypy IFN (Tabela 1). Talerze źródłowe z zestawu roboczego Pr/Pb (rysunek 2) służą do przygotowania wielu 384-dołkowych płytek testowych w procesie, który można zautomatyzować za pomocą zrobotyzowanego pipetora wielokanałowego. Podczas gdy początkowo skupiono się na stworzeniu protokołu do badania sygnatur ekspresji ludzkiego IFN, metoda ta została zastosowana również w przypadku makaków rezusów. Chociaż układy płytek są nieco inne, a zestawy Pr/Pb (Tabela 2) są różne, ogólna metoda przygotowania do tworzenia płytek człowieka i rezusa jest identyczna. Przy minimalnych modyfikacjach protokołu metoda może zostać zrealizowana, aby umożliwić opracowanie testów do badania innych grup blisko spokrewnionych genów.
Zobacz rysunki 1 i 2 poniżej 
Zobacz tabele 1 i 2 poniżej

<table><tbody><tr><td>Paski probówek do PCR 0,2 ml&nbsp;</td><td>Eppendorf (Westbury, NY, USA)</td><td>E0030 124 286</td><td></td></tr><tr><td>12-kanałowa pipeta elektroniczna 384 Equalizer, 0,5-12,5 ul</td><td>Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td><td>14-387-139</td><td>*Wycofana</td></tr><tr><td>z produkcji 12-kanałowa pipeta elektroniczna 384 Equalizer, 1-30 ul</td><td>Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td><td>14-387-137</td><td>*Wycofana</td></tr><tr><td>12-kanałowa pipeta elektroniczna, 5-250 ul</td><td>Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td><td>14-387-118</td><td>*Wycofano</td></tr><tr><td>2,0 ml probówkę do mikrowirówek, sterylne</td><td>Celltreat Scientific Products (Shirley, MA, USA)</td><td>229446</td><td></td></tr><tr><td>8-kanałowa pipeta elektroniczna, 15-1250 ul</td><td>Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td><td>14-387-115</td><td>*</td></tr><tr><td>Wycofane jednorazowe zbiorniki na odczynniki&nbsp;</td><td>VWR International (Radnor, PA, Stany Zjednoczone)</td><td>89094-668</td><td>Zbiorniki 25 ml z 2 przegrodami</td></tr><tr><td>E-wirówka</td><td>Wealtec Corp. (Sparks, NV, USA)</td><td>1090003</td><td></td></tr><tr><td>Eukariotyczny 18S rRNA (18S)</td><td>Applied Biosystems (Foster City, CA, USA)</td><td>Hs99999901_s1</td><td>Rhesus HKG Zestaw podkładów/sond</td></tr><tr><td>Mini Vortexer o stałej prędkości</td><td>Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td><td>02-215-360</td><td></td></tr><tr><td>Uszczelka samoprzylepna przepuszczająca gaz</td><td>Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td><td>AB-0580</td><td>Jednorazowa uszczelka płytowa stosowana podczas procesu przygotowania płyty&nbsp;</td></tr><tr><td>Dehydrogenaza gliceraldehydo-3-fosforanowa (GAPDH)</td><td>FBR (Silver Spring, MD, USA)</td><td>Zamówienie niestandardowe</td><td>Zestaw podkładów/sond Human HKG</td></tr><tr><td>Dehydrogenaza gliceraldehydo-3-fosforanowa (GAPDH)</td><td>Applied Biosystems (Foster City, CA, USA)</td><td>Rh02621745_g1</td><td>Zestaw podkładów/sond Rhesus HKG</td></tr><tr><td>Automatyczny pipeter wielokanałowy Hudson Solo&nbsp;</td><td>Hudson Robotics (Springfield, NJ, USA)</td><td>800200</td><td>Zmodyfikowany z 384-dołkowym gniazdem chłodzącym</td></tr><tr><td>Linearyzowane plazmidy (geny IFN)</td><td>Aldevron (Fargo, ND, USA)</td><td>Na zamówienie</td><td>3000, 3580; Używany do wzorców testowych&nbsp;</td></tr><tr><td>Inhibitory LNA</td><td>Exiqon (Woburn, MA, USA)</td><td>Na zamówienie</td><td>500100</td></tr><tr><td>Sondy LNA</td><td>Sigma-Proligo (St. Louis, MO, USA)</td><td>Zamówienie niestandardowe</td><td>Numer materiału VC00023</td></tr><tr><td>Końcówki do pipet z filtrem matrycowym, 12.5 ul</td><td>Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td><td>14-387-193</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do pipet z filtrem matrycowym, 30 ul</td><td>Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td><td>14-387-196</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do pipet Matrix TallTip o przedłużonej długości, 1,250 ul</td><td>Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td><td>14-387-160</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do pipet Matrix TallTip o przedłużonej długości, 250 ul</td><td>Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td><td>14-387-152</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Opyczna 384-dołkowa płytka reakcyjna z biosystemami stosowanymi za pomocą kodów kreskowych</td><td>(Foster City, CA, USA)</td><td>4309849</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate Applied</td><td>Biosystems (Foster City, CA, USA)</td><td>N8010560</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Optical Adhesive Film</td><td>Applied Biosystems (Foster City, CA, USA)</td><td>4311971</td><td>Folia samoprzylepna używana do uszczelniania płytki przed przebiegiem qRT-PCR&nbsp;</td></tr><tr><td>Arkusz kalkulacyjny Microsoft Excel 2010</td><td>Microsoft (Redmond, WA, Stany Zjednoczone)&nbsp;</td><td>Język programowania Office 2010</td><td>Visual Basic&nbsp;</td></tr><tr><td>MixMate Vortex Mixer</td><td>Eppendorf (Westbury, NY, USA)</td><td>5353 000.014</td><td>2-wymiarowy aparat wirowy z płytką</td></tr><tr><td>Molekularne sondy ostrzegawcze</td><td>FBR (Silver Spring, MD, USA)</td>Chłodnica PCR na <td>zamówienie</td><td></td>niestandardowe</tr><tr><td>, bezlodowy system przechowywania w chłodni na 96-dołkowe płytki i probówki PCR</td><td>Eppendorf (Westbury, NY, USA)</td><td>Z606634-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Suszarka płytkowa (kolektor)</td><td>Produkcja projektów mechanicznych i elektrycznych, Biuro Usług Badawczych NIH (Bethesda, MD, USA)</td><td>Zestawy</td> podkładów na zamówienie <td></td></tr><tr><td></td><td>FBR (Silver Spring, MD, USA)</td><td>Na zamówienie</td><td></td></tr><tr><td>pUC57 plazmidowe DNA</td><td>Genescript (Piscataway, NJ, USA)</td><td>SD1176</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml probówki do mikrofuge bez rnazy</td> Life <td>Technologies (Grand Island, NY, USA)</td><td>AM12400</td><td></td></tr><tr><td>DNaza wolna od RNaz Zestaw (50)</td><td>Qiagen (Walencja, CA, USA)</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>RNase H New</td><td>England Biolabs (Ipswitch, MA, USA)</td><td>M0297L</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit (250)</td><td>Qiagen (Walencja, CA, USA)</td><td>74106</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do robotów (wstępnie sterylizowane końcówki do pipet z przezroczystą końcówką)</td><td>Hudson Robotics (Springfield, NJ, USA)</td><td>800350-S</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór DNA plemników łososia</td><td>Invitrogen (Carlsbad, CA, USA)</td><td>15632-011</td><td></td></tr><tr><td>SoftLinx Version V</td><td>Hudson Robotics (Springfield, NJ, USA)</td><td>Oprogramowanie na zamówienie do</td><td>programowania kroków pipetowania</td></tr><tr><td>TaqMan Fast Universal PCR Master Mix (2x), bez AmpErase UNG</td><td>Life Technologies (Grand Island, NY, USA)</td><td>4352042</td><td></td></tr><tr><td>ABgene Adhesive Plate Seals&nbsp; &nbsp;</td><td>Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td><td>AB0580</td><td></td></tr><tr><td>Ubiquitin C (UBC)</td><td>Applied Biosystems (Foster City, CA, USA)</td><td>Hs01871556_s1</td><td>Human HKG Zestaw starterów/sond</td></tr><tr><td>Zestaw do syntezy Verso cDNA</td><td>Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td><td>AB1453B</td><td></td></tr><tr><td>ViiA 7 Real-Time PCR System</td><td>Applied Biosystems (Foster City, CA, USA)</td><td>4453536</td><td></td></tr><tr><td>Water-Ultra Pure Quality</td><td>Biological, INC. (Gaithersburg, MD, USA)</td><td>351-029-101</td><td></td></tr><tr><td>Zipvap 384 (element grzejny suszarki płytowej)</td><td>Glas-Col LLC (Terre Haute, IN, USA)</td><td>384-109A Suszarka płytowa</td><td></td></tr></tbody></table>

wysokoprzepustowy ilościowy test rt-pcr w czasie rzeczywistym do określania profili ekspresji podtypów interferonu typu i i iii

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

Opisany w tym raporcie jest test qRT-PCR do analizy siedemnastu ludzkich podtypów IFN w formacie płytki 384-dołkowej, który zawiera wysoce specyficzne sondy z zablokowanym kwasem nukleinowym (LNA) i molekularnym sygnalizatorem (MB), standardy transkrypcji, automatyczne pipetowanie wielokanałowe i suszenie płytek. Określenie ekspresji wśród interferonów typu I (IFN), zwłaszcza dwunastu podtypów IFN-α, jest ograniczone przez ich wspólną tożsamość sekwencyjną; podobnie sekwencje IFN typu III, zwłaszcza IFN-λ2 i -λ3, są bardzo podobne. Test ten zapewnia wiarygodny, powtarzalny i stosunkowo niedrogi sposób analizy ekspresji siedemnastu transkryptów podtypu interferonu.

Opisany test qRT-PCR można zastosować do analizy wzorców ekspresji IFN typu I i III w różnych typach komórek i kontekstach. Na przykład sygnatury ekspresji ludzkich IFN typu I i III analizowano w mononuklearnych komórkach krwi obwodowej (PBMC) od 6 dawców stymulowanych ligandami TLR; poly I:C (25 μg/ml), LPS (10 ng/ml), imikimodem (10 μM) oraz oligonukleotydami CpG (1 μM) (Rysunek 4). Dane analizowano przy użyciu oprogramowania arkusza kalkulacyjnego i przedstawiono w formie wykresów radarowych, na których podtypy IFN-α rozmieszczono zgodnie z ruchem wskazówek zegara, opierając się na drzewie filogenetycznym ich sekwencji białkowej27. Wykresy radarowe ekspresji ludzkich IFN przedstawiono w skali logarytmicznej obliczonej za pomocą dwóch różnych metod analizy włączonych do projektu testu: bezwzględnej wartości Cq znormalizowanej do HKG (ΔCq) oraz liczby kopii matrycy na mikrogram (μg) całkowitego RNA. Wartości liczby kopii obliczono na podstawie wyników krzywej wzorcowej transkryptu. Dane wykazują, że sygnatury ekspresji ludzkich IFN wywołane agonistami TLR są specyficzne dla danego ligandu.
Patrz Rysunek 4 poniżej
Podobnie jak wykazano w przypadku sygnatur ekspresji IFN u ludzi, sygnatury ekspresji IFN typu I i III u makaków rezus były również specyficzne dla ligandów TLR. PBMC od 3 dawców stymulowano poly I:C (50 μg/ml), LPS (10 μg/ml) oraz imikimodem (10 μg/ml) przez 3 h (Rycina 5). Ekspresja podtypów IFN w niestymulowanych komórkach w punkcie wyjścia była niska. W odpowiedzi na LPS i poly I:C ekspresjonowano ograniczoną liczbę podtypów IFN. W przeciwieństwie do tego, ekspresja IFN w odpowiedzi na imikimod była wysoka, a profil ekspresji podtypów szeroki. Ekspresja IFN-β oraz IFN-λ1 była zwiększona przez wszystkie trzy agoniści TLR28.
Patrz Rysunek 5 poniżej
<img alt="Analiza ekspresji genów, mapa ciepła, wyniki qPCR, detekcja celu, porównawcza analiza próbek." src="/files/ftp_upload/52650/52650fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Układ płytki testowej 384-dołkowej z siedemnastoma zestawami Pr/Pb. Numer celu odnosi się do zestawu Pr/Pb. Czteropunktowe krzywe wzorcowe (ciemnoszary trójkąt) są dodawane do kolumn 1-5. Zestawy Pr/Pb dla HKG (białe tło) są dodawane do kolumn 6 i 7. Pozostałe kolumny, 8-24, są specyficzne dla jednego z siedemnastu zestawów Pr/Pb. Próbki są dodawane do rzędów A-P, od kolumn 6-24 (czarne strzałki). Dwa dołki (O5, P5) na dole kolumny 5 otrzymują tylko wodę i master mix. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52650/52650fig1highres.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Układ płytki PCR do amplifikacji DNA; schemat z dołkami docelowymi i NTC w celu kontroli zanieczyszczeń." src="/files/ftp_upload/52650/52650fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Układ 96-dołkowej płytki źródłowej z siedemnastoma zestawami Pr/Pb. Numer celu odnosi się do zestawu Pr/Pb. Czarne strzałki wskazują, kiedy zestaw Pr/Pb jest dodawany do wielu dołków. Mieszaniny NTC są dodawane do wyznaczonych dołków (ciemnoszare tło). Dwa dołki (F3, G3) z liniami ukośnymi nie są używane. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52650/52650fig2highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat przepływu konfiguracji PCR, szczegółowo opisujący etapy rozcieńczeń seryjnych, przygotowania mieszaniny starterów i napełniania płytki 384-dołkowej." src="/files/ftp_upload/52650/52650fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Schemat wybranych etapów protokołu analizy qRT-PCR. Diagram A-E przedstawia poszczególne części protokołu. (A) Krok 1: Przygotowanie seryjnych rozcieńczeń standardów. (B) Krok 2: Przygotowanie mieszanin roboczych Pr/Pb i NTC. (C) Krok 3.1: Przygotowanie 96-dołkowej płytki z zapasami roboczymi zestawów Pr/Pb i mieszanin NTC. (D) Kroki 4.1-3: Przygotowanie mieszanin do napełnienia 384-dołkowej płytki analitycznej. (E) Krok 4.5: Napełnianie 384-dołkowej płytki analitycznej. Diagramy należy czytać od lewego górnego do prawego dolnego rogu. Odczynniki do analizy interferonu (IFN) są przechowywane w temperaturze -20 oC i wymienione w lewej kolumnie; linie oddzielają poszczególne czynności w protokole. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52650/52650fig3highres.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Wykresy radarowe ΔCq i liczby kopii analizujące ekspresję genów przy użyciu kontroli, Poly I:C, LPS, imikimodu i CpG." src="/files/ftp_upload/52650/52650fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Sygnatura ekspresji IFN u ludzi w mononuklearnych komórkach krwi obwodowej (PBMC) różni się w zależności od zastosowanych ligandów TLR do stymulacji. Komórki PBMC stymulowano ligandami TLR, a następnie wyizolowano RNA do analizy qRT-PCR. Przedstawiono średnie geometryczne szczytowych odpowiedzi na poly I:C (25 μg/ml) po 8 h (czerwone kwadraty), LPS (10 ng/ml) po 4 h (zielone trójkąty), imikimod (10 μM) po 16 h (fioletowe romby), CpG (1 μM) po 16 h (czarne koła) oraz kontrolę niestymulowaną po 16 h (niebieskie koła) od 6 dawców, w skali log10 jako funkcję ΔCq genu HKG UBC (po lewej) lub jako liczbę kopii na μg RNA (po prawej). Podtypy IFN-α są uporządkowane zgodnie z filogenetycznym wykresem podobieństwa sekwencji aminokwasów. Rysunek ten został pierwotnie opublikowany w czasopiśmie Immunology and Cell Biology27.
<img alt="Wykresy radarowe dla Poly I:C, LPS i imikimodu; ΔCq i liczba kopii; porównanie ekspresji genów." src="/files/ftp_upload/52650/52650fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Sygnatura ekspresji IFN u makaków rezus w monocytach i limfocytach krwi obwodowej (PBMC) różni się w zależności od użytych ligandów TLR do stymulacji. PBMC od trzech makaków rezus (oznaczonych kwadratem, rombem i trójkątem) wyizolowano z krwi pełnej i stymulowano lipopolisacharydem (LPS) (10 μg/ml), poly I:C (50 μg/ml) lub imikimodem (10 μg/ml). Komórki pobrano w czasie 0 h (otwarte kształty) lub po 3 h stymulacji TLR (zamknięte kształty) w celu pomiaru ekspresji IFN. Poziomy transkrypcji IFN typu I, II i III przedstawiono w skali log10 jako funkcję ΔCq HKG GAPDH (lewo) lub jako liczbę kopii/μg RNA (prawo). Rycina ta została pierwotnie opublikowana w Journal of Interferon and Cytokine Research28.
<img alt="Tabela starterów PCR do sekwencjonowania genów interferonu; numery akcesyjne GenBank, sekwencje starterów, pozycje." fo:content-="" fo:content-width="7in" src="/files/ftp_upload/52650/52650table1.jpg" width="700" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Tabela 1"> 
Tabela 1: Sekwencje zestawów starterów/sond IFN człowieka oraz informacje o reakcji. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52650/52650table1.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej tabeli.</a>
<img alt="Tabela projektowania starterów PCR przedstawiająca sekwencje genów, pozycje i stężenia." fo:content-="" fo:content-width="7in" src="/files/ftp_upload/52650/52650table2.jpg" width="700" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Tabela 2"> 
Tabela 2: Sekwencje zestawów starterów/sond IFN dla makaka rezusa oraz informacje o reakcjach. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52650/52650table2.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej tabeli.</a>
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td colspan="4">Stężenie plazmidu (fM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>A</td>
			<td>B</td>
			<td>C</td>
			<td>D</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN-α1</td>
			<td>25</td>
			<td>2.5</td>
			<td>0.25</td>
			<td>0.025</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN-α2</td>
			<td>25</td>
			<td>2.5</td>
			<td>0.25</td>
			<td>0.025</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN-α4</td>
			<td>2500</td>
			<td>250</td>
			<td>25</td>
			<td>2.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN-α5</td>
			<td>25</td>
			<td>2.5</td>
			<td>0.25</td>
			<td>0.025</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN-α6</td>
			<td>250</td>
			<td>25</td>
			<td>2.5</td>
			<td>0.25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN-α7</td>
			<td>250</td>
			<td>25</td>
			<td>2.5</td>
			<td>0.25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN-α8</td>
			<td>250</td>
			<td>25</td>
			<td>2.5</td>
			<td>0.25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN-α10</td>
			<td>25</td>
			<td>2.5</td>
			<td>0.25</td>
			<td>0.025</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN-α14</td>
			<td>25</td>
			<td>2.5</td>
			<td>0.25</td>
			<td>0.025</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN-α16</td>
			<td>250</td>
			<td>25</td>
			<td>2.5</td>
			<td>0.25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN-α17</td>
			<td>25</td>
			<td>2.5</td>
			<td>0.25</td>
			<td>0.025</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN-α21</td>
			<td>25</td>
			<td>2.5</td>
			<td>0.25</td>
			<td>0.025</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN-λ1</td>
			<td>25</td>
			<td>2.5</td>
			<td>0.25</td>
			<td>0.025</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN-λ2</td>
			<td>25</td>
			<td>2.5</td>
			<td>0.25</td>
			<td>0.025</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN-λ3</td>
			<td>250</td>
			<td>25</td>
			<td>2.5</td>
			<td>0.25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN-β</td>
			<td>25</td>
			<td>2.5</td>
			<td>0.25</td>
			<td>0.025</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN-ω</td>
			<td>250</td>
			<td>25</td>
			<td>2.5</td>
			<td>0.25</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 3: Informacje o stężeniach standardowego zestawu rozcieńczeń.
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Dodano zestawy IFN Pr/Pb</td>
			<td>Dodana objętość wody (ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTC 1</td>
			<td>IFN-β, -ω, -λ3</td>
			<td>85.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTC 2</td>
			<td>IFN-α1, -α5</td>
			<td>100.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTC 3</td>
			<td>IFN-α2</td>
			<td>114.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTC 4</td>
			<td>IFN-α4</td>
			<td>114.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTC 5</td>
			<td>IFN-α7</td>
			<td>114.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTC 6</td>
			<td>IFN-α6, -α8, -α10</td>
			<td>85.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTC 7</td>
			<td>IFN-α14, -α16</td>
			<td>100.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTC 8</td>
			<td>IFN-α17</td>
			<td>114.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTC 9</td>
			<td>IFN-α21, -λ1</td>
			<td>100.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTC 10</td>
			<td>IFN-λ2</td>
			<td>114.3</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 4: Informacje o mieszaninach roztworów roboczych NTC.

Ten protokół opisuje wysokoprzepustowy test qRT-PCR do analizy sygnatur ekspresji IFN typu I i III. Test dyskryminuje różnice w pojedynczej parze zasad między bardzo podobnymi transkryptami tych genów. Dzięki montażowi wsadowemu i zrobotyzowanemu pipetowaniu testy są spójne i powtarzalne.

Wysokoprzepustowy ilościowy test RT-PCR w czasie rzeczywistym do określania profili ekspresji podtypów interferonu typu I i III

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest przygotowanie i przeprowadzenie analizy na płytkach testowych z 384 dołkami w celu wysokoprzepustowej analizy grupy genów o wysokiej homologii, takich jak podtypy interferonów typu pierwszego i trzeciego. Realizuje się to najpierw poprzez przygotowanie standardowych rozcieńczeń seryjnych wykorzystywanych do analizy płytek. Następnie przygotowuje się mieszaniny roztworów roboczych starterów, sond oraz kontroli bez matrycy używanych do przygotowania płytek.Następnie, przy użyciu automatycznego pipetora wielokanałowego, przygotowywane są 384-dołkowe płytki analityczne, które następnie są suszone w celu przechowywania. Na koniec płytki analityczne są poddawane analizie. Ostatecznie wysokoprzepustowy ilościowy test real-time RT PCR jest wykorzystywany do określania sygnatur ekspresji interferonu w modelach hodowli tkankowych, podczas badania patogenów lub w próbkach klinicznych w kontekście chorób zakaźnych lub autoinflamacyjnych.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak ilościowy RT-PCR z użyciem standardowych sond liniowych lub SYBR Green, jest możliwość zastosowania sond fluorescencyjnych typu molecular beacon oraz LNA (lock nucleic acid) do rozróżniania różnic w obrębie pojedynczej pary zasad pomiędzy bardzo podobnymi sekwencjami. Po rozmrożeniu, wymieszaniu w wirówce typu vortex i krótkim odwirowaniu standardu oraz ssDNA z plemni łososia. Przygotuj mieszaninę ssDNA z wodą dla 17 zestawów rozcieńczeń standardu, mieszając 51 µL ssDNA z 20,3 mL wody. Odmierz 190 µL mieszaniny ssDNA z wodą do pierwszej probówki w ośmioprobowkowej pasku PCR oraz po 180 µL do kolejnych pięciu probówek.Wykonaj rozcieńczenie 1:20, przenosząc 10 µL z zapasu standardu 50 pM do probówki zawierającej 190 µL mieszaniny S-S-D-N-A water; wymieszaj na wirówce typu vortex i krótko odwiruj pasek PCR. Wykonaj rozcieńczenie 1:10, przenosząc 20 µL z ostatnio rozcieńczonej probówki do kolejnej probówki w serii; wymieszaj na wirówce typu vortex i krótko odwiruj pasek PCR. Powtarzaj rozcieńczanie 1:10, aż ostatnia probówka w serii otrzyma standard.Po etykietowaniu do 17 probówek o pojemności 2 ml, należy użyć 12,5 µl elektronicznej pipety wielokanałowej, aby dodać 2 µl S-S-D-N-A do każdej probówki, wykorzystując primery i sondy przygotowane zgodnie z protokołem tekstowym. Do każdej probówki z zapasem roboczym zestawu primerów i sond należy dodać odpowiedni primer forward, primer reverse oraz sondę, aby przygotować mieszaniny zapasu roboczego dla kontroli bez matrycy (NTC).Przenieś 14,3 µL każdego zestawu starterów i sond do odpowiedniej probówki z mieszaniną zapasu roboczego NTC zgodnie z poniższą tabelą. Po pobraniu ilości zestawów starterów i sond wymaganych do mieszanin zapasu roboczego NTC, dodaj 1,5 ml wody, aby doprowadzić końcową objętość w każdej probówce z zapasem roboczym zestawu starterów i sond do 1,7 ml. Przygotuj 96-dołkową płytkę źródłową z zestawami starterów i sond oraz mieszaninami NTC.Umieść nową płytkę 96-dołkową w schłodzonym bloku chłodzącym do płytek 96-dołkowych i przypisz do dołków odpowiednie zestawy starterów i sond lub mieszaninę NTC, używając elektronicznej pipety wielokanałowej o objętości 250 µL. Do każdego zestawu starterów i sond dodaj 66 µL wody. Do czterech docelowych dołków 17 dodaj po 82,5 µL wody.Do każdego otworu z mieszaniną anti C odmierzyć 27,5 µL wody. Następnie do odpowiednich otworów przeznaczonych na sondy starterowe dodać 54 µL właściwych sond starterowych z roztworu roboczego. Do otworów przeznaczonych na sondy starterowe target 17 odmierzyć 67,5 µL roztworu roboczego sond starterowych target 17.Dodaj 22,5 µL odpowiedniej mieszaniny roboczej NTC do wyznaczonych dołków. Następnie użyj uszczelki do płytek, aby zamknąć płytkę 96-dołkową i wiruj przez jedną minutę przy 700 Gs, używając adaptera do płytek 96-dołkowych, aby upewnić się, że zawartość znajduje się na dnie dołków. Umieść płytkę w mieszalniku wortex i mieszaj przy 1000 RP przez jedną minutę.Następnie odwiruj płytkę z prędkością 700 Gs przez pięć minut. Aby przygotować płytki analityczne 384-dołkowe, włącz zautomatyzowaną pipetę wielokanałową i dwukrotnie kliknij ikonę oprogramowania, aby otworzyć protokół przygotowania płytek do analizy interferonu w celu konfiguracji platformy. Umieść całkowicie pełne pudełko z końcówkami do pipety w pozycji pierwszej platformy, płytkę źródłową 96-dołkową w pozycji czwartej, a nową płytkę 384-dołkową w pozycji szóstej.Rozpocznij pomiar, naciskając przycisk play. Po zakończeniu pomiaru delikatnie uderz płytkę assay z 384 dołkami o płaską powierzchnię, aby upewnić się, że ciecze znajdują się na dnie dołków, a następnie nałóż samoprzylepną uszczelkę do płytek po wirowaniu płytki przy 700 Gs przez jedną minutę. Usuń samoprzylepną uszczelkę do płytek.Umieść płytkę analityczną z 384 dołkami w suszarce do płytek i ustaw manifold do płytek 384-dołkowych bezpośrednio nad dołkami. Po wyschnięciu zawartości płytek analitycznych z 384 dołkami nałóż nową przylepną uszczelkę do płytek, szybką etykietę foliową i przechowuj w ciemności w temperaturze czterech stopni Celsjusza aż do momentu załadowania i przeprowadzenia analizy na płytce.Przygotuj dwie mieszaniny do studzienek dla genów referencyjnych (HKG), rozcieńczając 2 µL S-S-D-N-A w 84,9 µL wody. Następnie do każdej probówki z oznaczeniem HKG dodaj 2 µL rozcieńczonego SSD NA, 11,8 µL wody, 23 µL master mixu oraz 9,2 µL odpowiedniego zestawu starterów i sond 20 XHKG; wymieszaj na wortexie i krótko odwiruj. Po przygotowaniu próbek i kontroli pozytywnej cDNA dodaj 78,8 µL master mixu i 54,8 µL wody do każdej probówki z 24 µL próbki oraz kontroli pozytywnej. Aby przygotować mieszaniny do studzienek dla standardów i NTC, które zostaną dodane do wysuszonej płyty testowej 384-dołkowej, dodaj 165 µL wody do 275 µL master mixu w probówce 1,5 mL dla mieszaniny NTC oraz 52,5 µL wody do 52,5 µL master mixu w probówce 1,5 mL.Wyjąć wcześniej przygotowaną, wysuszoną płytkę analityczną 384-dołkową z temperatury 4°C i wirować przy 700 g przez jedną minutę. Za pomocą elektronicznej pipety wielokanałowej o objętości 30 µl nanieść 7,5 µl NTC. Dobrze wymieszać każdy dołek z NTC.Do studzienek zywności należy odmierzyć 6 µL standardów, dobrze wymieszać i dodać 1,5 µL standardu do każdej studzienki. Następnie, używając elektronicznej pipety wielokanałowej o objętości 12,5 µL, należy odmierzyć 7,5 µL próbek do wyznaczonych studzienek. Do odpowiednich studzienek należy dodać 2,5 µL mieszanin primerów i sond HKG. Po uszczelnieniu płytki optyczną folią klejącą i wirowaniu przy 700 ×g przez jedną minutę, należy wymieszać zamkniętą płytkę 384-dołkową w mieszalniku wierzchołkowym przy 2 600 RPM przez dwie minuty, a następnie wirować przy 700 ×g przez pięć minut.Na koniec umieść szczelnie zamkniętą płytkę analityczną w urządzeniu do qRT-PCR. Otwórz szablon układu analizy i zastosuj następujące warunki reakcji. Rozpocznij pomiar, a następnie wyeksportuj i przeanalizuj dane zgodnie z protokołem tekstowym przedstawionym na tej rycinie; przeanalizowano sygnatury ekspresji interferonów typu I i III w mononuklearnych komórkach krwi obwodowej (PBMCs) od sześciu dawców stymulowanych ligandami receptorów Toll-podobnych.Dane przedstawiono w formie wykresów radarowych w skali logarytmicznej z wykorzystaniem dwóch metod analizy, obejmujących bezwzględną wartość CQ znormalizowaną do genu konstytutywnego oraz liczbę kopii matrycy na mikrogram całkowitego RNA. Dane wykazują, że sygnatury ekspresji ludzkiego interferonu wywołane przez agoniści TLR są ligandowo specyficznymi sygnaturami ekspresji interferonu typu I i III u Resus Maccacus. W tym eksperymencie wykazano również specyficzność względem ligandów TLR; PBMC od trzech dawców stymulowano trzema ligandami przez trzy godziny.Ekspresja subtypów interferonu w niepobudzonych komórkach w stanie wyjściowym była niska, co pokazano tutaj. W odpowiedzi na LPS i poly I:C wykazano ekspresję ograniczonej liczby subtypów interferonu alfa. W przeciwieństwie do tego, ekspresja interferonu w odpowiedzi na imikimod była wysoka, a ekspresja subtypów obejmowała szeroki zakres interferonu beta oraz interferonu.Poziom ekspresji Lambda 1 został zwiększony przez wszystkie trzy agoniści TLR. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć dobrą wiedzę na temat przygotowania, przeprowadzenia i analizy testów na płytkach 3D z czterema dołkami do wysokoprzepustowej analizy bardzo podobnej grupy genów, takich jak podtypy interferonów typu 1 i 3.

high-throughput-quantitative-real-time-rt-pcr-assay-for-determining

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Test RT-PCR ilościowej czasu rzeczywistego o wysokiej wydajności do określania profili ekspresji podtypów interferonu typu I i III

Zaprezentujemy konfigurację i analizę tablic 96-dołkowych pre-microRNA do QPCR, przeprowadzonych zarówno przy użyciu robota, jak i ręcznie za pomocą wielokanałowej pipety Thermo Scientific Matrix.

Profilowanie pre-microRNA i microRNA z wykorzystaniem matryc ilościowej PCR w czasie rzeczywistym (qPCR)

W niniejszej pracy opisujemy zoptymalizowany protokół multipleksowej ilościowej reakcji polimerazy w odwrotnej transkrypcji (qRT-PCR) w połączeniu z platformą mikroprzepływową, stanowiący efektywne pod względem kosztów i czasu narzędzie do wysokoprzepustowego przesiewowania poziomów ekspresji mikroRNA (miRNA), szczególnie w przypadku pracy z ograniczoną ilością materiału próbnego.

Wysokoprzepustowe profilowanie mikroRNA: zoptymalizowana wielokanałowa qRT-PCR w skali nanolitrowej na IFC Fluidigm Dynamic ArrayTM

Source: Ren, S., et al. A Protocol for Analyzing Hepatitis C Virus Replication. J. Vis. Exp. (2014).This video demonstrates the procedure for quantifying Hepatitis C viral RNA using quantitative reverse transcription PCR to measure viral load in infected cell cultures.

Measuring Hepatitis C Viral Load Using Quantitative Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction

Ten film demonstruje ilościową metodę wykrywania infekcji wirusowej za pomocą PCR z odwrotną transkrypcją w czasie rzeczywistym. Krok odwrotnej transkrypcji przekształca RNA w cDNA, które jest następnie amplifikowane w cyklach PCR. Obecność wirusowego RNA w próbce potwierdza się analizując krzywe amplifikacji i dysocjacji DNA uzyskane z PCR.

Ilościowy PCR z odwrotną transkrypcją w czasie rzeczywistym do diagnozowania infekcji wirusowych

Ten film demonstruje test wydzielania embrionalnej fosfatazy alkalicznej przy użyciu komórek reporterowych interferonu HEK-Blue α/β do ilościowego określenia interferonów typu I (IFN) uwolnionych po stymulacji plazmocytoidalnych komórek dendrytycznych przez limfocyty T CD4+ zakażone HIV-1.

Oznaczanie ilościowe bioaktywnych interferonów typu I przy użyciu testu reporterowego wydzielanej embrionalnej fosfatazy alkalicznej

Krążące mikroRNA pojawiły się ostatnio jako obiecujące i nowe biomarkery dla różnych nowotworów i innych chorób. Celem tego artykułu jest omówienie trzech różnych platform i metod PCR w czasie rzeczywistym opartych na sondach, które są dostępne do ilościowego określania i określania obfitości krążących mikroRNA.

Oparte na sondzie podejścia PCR w czasie rzeczywistym do ilościowego pomiaru mikroRNA

Dostarczony jest protokół do opracowania testu amplifikacji polimerazy rekombinazy w czasie rzeczywistym w celu ilościowego określenia początkowego stężenia próbek DNA za pomocą termocyklera lub mikroskopu i podgrzewacza scenicznego. Opisano również rozwój wewnętrznej kontroli pozytywnej. Dostępne są skrypty do przetwarzania surowych danych fluorescencyjnych w czasie rzeczywistym.

Opracowanie ilościowego testu amplifikacji polimerazy rekombinazy z wewnętrzną kontrolą pozytywną

Designerskie chromosomy projektu Synthetic Yeast Genome, Sc2.0, można odróżnić od swoich natywnych odpowiedników za pomocą testu genotypowania opartego na PCR zwanego PCRTagging, który ma punkt końcowy obecności/braku. W tym miejscu opisujemy wysokoprzepustową metodę wykrywania PCR w czasie rzeczywistym do genotypowania PCRTag.

Analiza qPCRTag - Wysokoprzepustowy test PCR w czasie rzeczywistym do genotypowania Sc2.0

Ten manuskrypt opisuje procedurę eksperymentalną i analizę oprogramowania dla dwukierunkowego testu miejsca integracji, który może jednocześnie analizować DNA połączenia wektor-gospodarz w górę i w dół. Dwukierunkowe produkty PCR mogą być używane na dowolnej platformie sekwencjonowania niższego szczebla. Uzyskane dane są przydatne do wysokoprzepustowego, ilościowego porównania zintegrowanych celów DNA.

Dwukierunkowa metodologia PCR w miejscu integracji retrowirusowej i przepływ pracy analizy danych ilościowych

Tutaj prezentujemy protokół opisujący rozwój i walidację cyfrowego testu ELISA z pojedynczą matrycą molekuł, który umożliwia ultraczułe wykrywanie wszystkich podtypów IFN-α w próbkach ludzkich.

Opracowanie i walidacja ultraczułego, cyfrowego testu immunoenzymatycznego z pojedynczą matrycą cząsteczek dla ludzkiego interferonu-α

Poznaj wysokoprzepustowy test qRT-PCR do analizy ekspresji podtypów interferonu typu I i III. Ta metoda umożliwia rozróżnianie różnic na poziomie pojedynczych par zasad w podobnych sekwencjach.

Wysokoprzepustowy ilościowy test RT-PCR w czasie rzeczywistym do określania profili ekspresji podtypów interferonu typu I i III

Przeglądaj więcej filmów