Uchwycenie naprawy tkanek u larw danio pręgowanego za pomocą stereomikroskopii poklatkowej w jasnym polu

Ten film przedstawia metodę uchwycenia dynamiki naprawy tkanek pod mikroskopem stereoskopowym za pomocą obrazowania poklatkowego. Osiąga się to poprzez najpierw wyhodowanie zarodków danio pręgowanego do stadium larwalnego, gdy płetwa ogonowa wystarczająco rozwinęła się do rozmiaru, w którym można łatwo przeprowadzić amputację. Zwykle osiąga się to po wykluciu.

Drugim krokiem jest amputacja płetwy ogonowej za pomocą igły strzykawkowej. Trzecim krokiem jest zamontowanie larw w komorze obrazowania i uchwycenie filmu poklatkowego pod mikroskopem stereoskopowym. Ostatnim krokiem jest ilościowe określenie regeneracji płetw ogonowych przy użyciu oprogramowania do analizy obrazowania, takiego jak Bit Plains S lub oprogramowania typu open source, obraz J.Hi.My badań laboratoryjnych nad gojeniem ran i regeneracją tkanek przy użyciu danio pręgowanego jako modelu.

Dzisiaj zademonstrujemy metodę, która rejestruje dynamikę tych procesów w czasie rzeczywistym za pomocą mikroskopii stereoskopowej w jasnym polu. Dzisiaj zademonstrujemy metodę, która pozwala uchwycić wczesne procesy regeneracji tkanek za pomocą płetwy ogonowej larw danio pręgowanego. Przedstawiona metoda obrazowania daje możliwość obserwacji i analizy zachowań całej skali tkankowej w prostym ustawieniu mikroskopowym, który można łatwo dostosować do każdego mikroskopu stereoskopowego wyposażonego w funkcje poklatkowe.

Więc zacznijmy. Hodowla danio pręgowanego do stadiów larwalnych. Gojenie się ran w płetwie ogonowej można najlepiej zaobserwować po wykluciu się, ponieważ płetwa ogonowa jest już wystarczająco rozwinięta do tego czasu, a amputacje można łatwo wykonać bez uszkodzenia rdzenia kręgowego lub innych tkanek.

W bliskiej odległości zbierz jaja i wysiaduj je przez noc w inkubatorze o temperaturze 28 stopni Celsjusza. Następnego ranka usuń martwe zarodki i spłucz pożywką zarodkową zawierającą 0,03% instant roztwór soli oceanicznej. W razie potrzeby dodaj do naczynia pożywkę zarodkową z 0,003% fenotarczycy, aby zapobiec pigmentacji larw.

W tej demonstracji pozwalamy zarodkom rozwijać się do dwóch dni po zapłodnieniu w inkubatorze, kiedy larwy wykluwają się z konów przygotowanych w komorze obrazowania. Na tym etapie przedstawiamy dwie metody budowy komory obrazowania. Metoda pierwsza składa się z komory obrazowania wykonanej z rurki PVC lub teflonowej klasy wody pitnej, którą można kupić w każdym sklepie z narzędziami.

Używaj rurki o średnicy zewnętrznej 25 milimetrów i średnicy wewnętrznej 20 milimetrów, ponieważ mają one odpowiedni rozmiar do mocowania szkiełka nakrywkowego. Przetnij rurkę, aby jak najbardziej wyrównać pierścienie o grubości 10 milimetrów. Użyj papieru ściernego, aby wygładzić krawędzie i spłucz w wodzie i etanolu.

Pozostaw komorę do wyschnięcia na powietrzu. Metoda druga polega na wykorzystaniu wstępnie wyprodukowanego dna z matowego szkła technicznego, szklanej górnej komory obrazowania lub wykonaniu komory obrazowania z małej szalki Petriego. Aby stworzyć własną komorę obrazowania, użyj 35 lub 50 milimetrowej szalki Petriego i wywierć 10-milimetrowy otwór w pokrywie.

Następnie nałóż smar silikonowy na zewnętrzną stronę szkiełka nakrywkowego i przymocuj kwadratową lub okrągłą szkiełko nakrywkowe o wymiarach 25 na 25 milimetrów na zewnątrz za pomocą czystej końcówki pipety, aby upewnić się, że materiał montażowy pozostaje mocno przymocowany. Podczas procedury obrazowania przymocuj cienką siatkę z tworzywa sztucznego do wewnętrznej strony szkiełka nakrywkowego. Można to osiągnąć, przecinając siatkę na rozmiar średnicy wewnętrznego pierścienia, a następnie wycinając mały prostokąt około trzy razy większy od larw w środku siatki.

Montaż i obrazowanie larw przed urazem. Ten etap jest odpowiedni do późniejszego ilościowego określenia regeneracji płetw. Najpierw przygotuj 0,5% niskotopliwy roztwór agro w pożywce zarodkowej do unieruchomienia próbki przenoszącej znieczuloną larwę do roztworu aro, który był utrzymywany w temperaturze 42 stopni Celsjusza.

W bloku grzewczym przenieś larwy z kroplą agros na małą szalkę Petriego i umieść larwy na boku. Używając zaślepionej końcówki mikroładowarki, pozwól aros zestalać się i dodaj roztwór trica. Przejdź do mikroskopu stereoskopowego, który będzie używany później.

Do obrazowania poklatkowego używamy mikroskopu stereoskopowego zes discovery V 12 i oprogramowania wizyjnego Axio do demonstracji. Najpierw dostosuj ustawienia mikroskopu, wybierając odpowiedni obiektyw i powiększenie do obrazowania. Następnie wybierz tryb wykrywania kamery w mikroskopie w oprogramowaniu alvis.

Wybierz tryb na żywo, aby wyświetlić larwę na ekranie. Otwórz okno właściwości, aby automatycznie wykryć jasność, ręcznie wyreguluj kontrast na podstawie transoświetlenia mikroskopu. Odsuń larwy poza pole widzenia i wybierz funkcję korekcji zacienienia.

Aby zminimalizować hałas w tle, ustaw larwy z powrotem w polu view i zrób zdjęcie. Zapisz obraz, aby przygotować się do zranienia. Usuń larwy z aros, najpierw zeskrobując aeros z głowy.

Dzięki temu larwy mogą wyślizgnąć się z aeros poprzez delikatne odciągnięcie głowy od pozostałego testu amputacji aerodynamicznej. Przygotuj 1,5% talerz aeros, używając błyskawicznego roztworu soli oceanicznej. Pod mikroskopem stereoskopowym umieść larwy bokiem na zestalonym aros i amputuj dystalną część płetwy ogonowej za pomocą igły strzykawkowej o rozmiarze 23.

Montaż larw do obrazowania poklatkowego. Przedstawimy dwie metody obrazowania poklatkowego. W pierwszej metodzie pokażemy, jak obrazować larwy w pierścieniu komory po zamontowaniu larw.

Ostrożnie zeskrob zestalony agros otaczający dystalną płetwę ogonową za pomocą zaślepionej końcówki pipety do mikroładowarki. Pozwala to na prawidłowe gojenie się ran lub regenerację tkanek Bez krępowania tkanki staraj się nie uszkadzać płetwy wielokrotnie. Podczas tej procedury należy usunąć z komory niechciane zanieczyszczenia, które zakłócają procedurę obrazowania, zastępując stary roztwór.

Świeżym roztworem Trica nałóż smar silikonowy na górną część komory i napełnij pierścień komory świeżym roztworem trica. Przyłóż szkiełko do góry, aby uszczelnić komorę metoda druga. W tej metodzie pokażemy, jak obrazować larwy na szklanej szalce Petriego.

Zamontuj larwy na pokrywie, przykryj szkiełko i napełnij pokrywkę. Z roztworem trica. Zeskrob agros z płetwy ogonowej.

Następnie nałóż smar silikonowy na górną krawędź dolnej komory i napełnij komorę roztworem trica. Ostrożnie zdekantuj roztwór trica z pokrywki i odwróć pokrywkę, aby zanurzyć larwy w roztworze trica dolnej komory, co można zrobić pod niewielkim kątem. Aby uniknąć kieszeni powietrznych, komora zostanie uszczelniona obrazowaniem poklatkowym smarem silikonowym, aby zapewnić utrzymanie odpowiedniej temperatury 28 stopni Celsjusza.

Zamontuj podgrzewaną komorę inkubacyjną wykonaną z tekturowej folii bąbelkowej do izolacji i przewodową kopułę używaną do inkubacji jaj kurzych jako źródło ciepła. Umieść komorę inkubacyjną wokół mikroskopu i ustaw temperaturę na 28 stopni Celsjusza. Przez około 10 do 20 minut lub do momentu, gdy temperatura się ustabilizuje, otwórz przód podgrzewanej komory inkubacyjnej i umieść komorę obrazowania na mikroskopie.

Stań z szkiełkiem nakrywkowym skierowanym do góry w kierunku celu. Ustawić płetwę larwalną w taki sposób, aby dwie trzecie pola widzenia pozostało niezajęte, aby zapewnić uchwycenie wzrostu i regeneracji płetwy w trakcie procedury obrazowania. Bez konieczności zmiany położenia larw w 60-wymiarowym oknie akwizycji oprogramowania, wybierz opcję stosu Z i poklatkowego w zakładce Zack i trybie plasterków.

Wybierz grubość plasterka, a następnie wybierz tryb początkowo-końcowy. Zdefiniuj górną i dolną pozycję stosu w tabeli poklatkowej. Wybierz interwał i czas trwania filmu, a następnie naciśnij przycisk start, aby rozpocząć nagrywanie.

W ciągu pierwszej godziny sprawdź granice larw i Zack. Jeśli to konieczne, z czasem zmień położenie larw, ponieważ mogło się ono przesunąć ze względu na wzrost lub różnice w składzie agros. Zapisz plik na końcu nagrania poklatkowego i kontynuuj proces przetwarzania końcowego i analizy danych na etapie kwantyfikacji.

W tej sekcji omówiono kilka sposobów analizowania metody generowanych przez dane. Najpierw omówimy, jak określić wzrost płetw za pomocą oprogramowania imas. Otwórz film poklatkowy w oprogramowaniu Amaris i zapisz pliki w formacie pliku MRS.

Aby zwiększyć wydajność Oprogramowania, wybierz widok ortogonalny, który ma być wyświetlany jako projekcja. Aby zmierzyć długość żeber, wybierz opcję dodaj nowe punkty pomiarowe na lewym górnym pasku narzędzi. W obszarze Konfiguruj listę widocznych wartości statystyk wybierz wartości statystyk, które mają być wyświetlane w trybie liniowym.

W zakładce ustawień wybierz pary we właściwościach etykiet, wybierz nazwę i odległość, aby wyświetlić odległość między punktami A i B obok linii pomiaru, przejdź do trybu edycji i przytrzymaj przycisk Shift, aby wybrać pierwszy punkt na dystalnej płetwie. Następnie użyj tej samej konfiguracji, aby wybrać drugi punkt na dystalnym końcu akordu noakordu. Odległość zostanie wyświetlona na obrazie i można ją wyeksportować w zakładce statystyki.

Wybierając przycisk dysku, eksportuj wszystko w prawym dolnym rogu. Alternatywnie do opcji punktów pomiarowych, przeglądarka przekrojów może być używana do mierzenia odległości w trybie widoku przekrojów. Przewiń do żądanej pozycji i kliknij pierwszą i drugą pozycję lewym przyciskiem myszy, zostanie wyświetlona odległość.

Opcja ta nie pozwala jednak na eksport danych. Teraz pokrótce omówimy, jak określić obszar płetwy za pomocą oprogramowania open source. Obraz J.Otwórz film TimeLapse na obrazie J za pomocą wtyczki, która rozpoznaje format pliku Zeiss Axio vision.

Alternatywnie można załadować nieskompresowaną sekwencję TIFF. Zapewni to, że informacje o pliku zostaną zapisane w obszarze Analizuj wybierz ustaw skalę w celu zdefiniowania odległości i pikseli oraz znanej odległości, jeśli nie są zachowane w pliku. Ustaw również długość jednostki na mikrometry.

Na pasku narzędzi. Wybierz narzędzie do zaznaczania z wolnej ręki i obrysuj ranę, przytrzymując lewy przycisk myszy. Podczas rysowania wzdłuż krawędzi rany.

Kliknij opcję pomiaru w obszarze Analizuj, aby wyświetlić obszar reprezentatywnych wyników rany. Amputacja płetwy prowadzi do częściowej regeneracji w ciągu 36 godzin po amputacji. Pomiary powierzchni płetwy pokazują, że amputacja płetwy powoduje zmniejszenie tkanki płetwy do około 14 godzin po amputacji, prawdopodobnie z powodu śmierci komórki, po której następuje cienka długość regeneracji.

Porównanie amputowanej i zregenerowanej płetwy pokazuje 2,48-krotny wzrost długości płetwy w ciągu 36 godzin. Amputacja początkowo wywołuje efekt sznurka torebki charakteryzujący się skurczami za pośrednictwem kaliów miozyny aktyny, które są obecne w komórkach fałdu płetwowego, wyciągają się z rany amputacji, a następnie są usuwane. Długość ciała początkowo wzrasta, ale płetwa nie regeneruje się.

We wczesnych fazach. Po około 14 godzinach od amputacji płetwa zaczyna wyrastać z pozycji proksymalnej do dystalnej. Podsumowując, nasze wyniki pokazują, że amputacja wywołuje skurcz rany, co może być niezbędne do promowania ekstruzji komórek.

Po zakończeniu procesu płetwa zaczyna się regenerować. Wydaje się, że następuje wzrost płetwy rozwojowej. Niezależnie od tego procesu przedstawiliśmy metodę, która pozwala na obserwację dynamicznych procesów naprawy tkanek z wykorzystaniem żywych larw danio pręgowanego.

Ta procedura wymaga pewnych aspektów, które przetestowaliśmy w celu optymalizacji wyniku. Niewątpliwą zaletą prezentowanej metody obrazowania jest to, że można ją łatwo dostosować do każdego mikroskopu stereoskopowego wyposażonego w kamerę CCD i oprogramowanie TimeLapse. Stanowi również tanią alternatywę dla droższego systemu obrazowania konfokalnego.

Chociaż metoda ta nie wykorzystuje fluorescencji ani detekcji komórek, można ją rozszerzyć o takie zastosowania, wykorzystując zautomatyzowany system kontroli pękania i oprogramowanie do dekonwolucji po obrazowaniu w celu dalszej obserwacji procesów gojenia i regeneracji ran z rozdzielczością subkomórkową. Ta metoda może zapewnić uczniom lepsze zrozumienie podstawowych procesów biologicznych, leżących u podstaw naprawy i regeneracji tkanek. Przejrzystość optyczna i łatwość, z jaką można wykorzystać embrionalne i larwalne rybki pręgowanego, a także zdolność adaptacji systemu do dowolnego mikroskopu stereoskopowego sprawiają, że nadaje się on do nauczania podstawowej biologii kręgów w klasie.