Uchwycenie naprawy tkanek u larw danio pręgowanego za pomocą stereomikroskopii poklatkowej w jasnym polu

W niniejszym filmie zaprezentowano metodę rejestrowania dynamiki regeneracji tkanki za pomocą mikroskopu stereoskopowego z wykorzystaniem obrazowania poklatkowego. W tym celu zarodki danio-pręgowanego hoduje się do stadium larwalnego, kiedy płetwa ogonowa jest już wystarczająco rozwinięta, aby można było w niej łatwo przeprowadzić amputację. Zazwyczaj osiąga się to po wykluciu.

Drugim krokiem jest amputacja płetwy ogonowej za pomocą igły strzykawki. Trzecim krokiem jest umieszczenie larw w komorze obrazowej i zarejestrowanie filmu poklatkowego przy użyciu mikroskopu stereoskopowego. Ostatnim krokiem jest ilościowe określenie regeneracji płetwy ogonowej z wykorzystaniem oprogramowania do analizy obrazu, takiego jak Bit Plains S lub otwartoźródłowe oprogramowanie ImageJ. Cześć. Moje laboratorium bada gojenie ran i regenerację tkanek, wykorzystując danio przebrany jako model.

Dzisiaj zaprezentujemy metodę rejestrującą dynamikę tych procesów w czasie rzeczywistym przy użyciu stereomikroskopii w jasnym polu. Przedstawimy sposób obrazowania wczesnych etapów regeneracji tkanki na przykładzie płetwy ogonowej larwy danio pręgowanego. Zaprezentowana metoda obrazowania umożliwia obserwację i analizę zachowań w skali całej tkanki w prostym układzie mikroskopowym, który można łatwo dostosować do każdego stereomikroskopu wyposażonego w funkcję time-lapse.

Zacznijmy zatem. Hodowla danio przeżłaczkowego do stadiów larwalnych. Gojenie ran w płetwie ogonowej można najlepiej obserwować po etapach wyklucia, ponieważ do tego czasu płetwa ogonowa jest już wystarczająco rozwinięta, a amputacje można łatwo przeprowadzić bez uszkodzenia rdzenia kręgowego lub innych tkanek.

Zebierz jaja w bezpośrednim sąsiedztwie i inkubuj je przez noc w inkubatorze w temperaturze 28 °C. Następnego ranka usuń martwe embriony i opłucz je medium dla embrionów zawierającym 0,03% roztwór soli akwarystycznej instant ocean. W razie potrzeby dodaj do naczynia medium dla embrionów z 0,003% fenotyroksyny, aby zapobiec pigmentacji larw.

W tym pokazie pozwoliliśmy embrionom rozwijać się w inkubatorze do dwóch dni po zapłodnieniu, aż larwy wyklują się z ich osłonek, po czym przystąpiliśmy do przygotowania komory obrazowej. Na tym etapie przedstawiamy dwie metody budowy komory obrazowej. Metoda pierwsza polega na wykonaniu komory z rurek z PVC klasy spożywczej lub teflonowych, które można nabyć w każdym sklepie budowlanym.

Należy zastosować rurkę o średnicy zewnętrznej 25 millimeter i wewnętrznej 20 millimeter, ponieważ posiada ona odpowiedni rozmiar do mocowania szkiełek nakrywkowych. Przeciąć rurkę, aby przygotować pierścienie o grubości 10 millimeter, dbając o to, by były one jak najrówniejsze. Wykorzystać papier ścierny do wygładzenia krawędzi, a następnie wypłukać je w wodzie i etanolu.

Pozostaw komorę do wyschnięcia. Metoda druga polega na wykorzystaniu gotowej komory obrazującej z matowym dnem szklanym i szklaną górą lub na wykonaniu własnej komory obrazującej z małej szalki Petriego. Aby wykonać własną komorę obrazującą, należy użyć szalki Petriego o średnicy 35 lub 50 mm i wywiercić w pokrywce otwór o średnicy 10 mm.

Następnie należy nanieść smar silikonowy na zewnętrzną stronę szkiełka nakrywkowego i przymocować kwadratowe lub okrągłe szkiełko nakrywkowe o wymiarach 25 x 25 mm do zewnętrznej strony, używając czystego końcówki pipety, aby upewnić się, że podłoże montażowe pozostaje mocno przytwierdzone. Podczas procedury obrazowania należy przymocować drobną plastikową siatkę do wewnętrznej strony szkiełka nakrywkowego. Można to osiągnąć poprzez docięcie siatki do rozmiaru średnicy wewnętrznego pierścienia, a następnie wycięcie w środku siatki małego prostokąta o powierzchni około trzech razy większej niż rozmiar larwy.

Mocowanie i obrazowanie larw przed wystąpieniem urazu. Ten etap jest odpowiedni do późniejszej kwantyfikacji regeneracji płetwy. Najpierw przygotuj 0,5% roztwór niskotopliwego agarozu w medium dla embrionów do unieruchomienia okazu, przenosząc znieczuloną larwę do roztworu agarozy utrzymywanego w temperaturze 42 °C.

W bloku grzejnym przenieść larwy z kroplą agros do małej szalki Petriego i ułożyć larwy na boku. Za pomocą zakrytej końcówki mikroladera pozwolić agros zestalić się, a następnie dodać roztwór trica. Przejść do stereomikroskopu, który zostanie wykorzystany w dalszej części.

Do obrazowania poklatkowego wykorzystujemy stereomikroskop Zeiss Discovery V 12 oraz oprogramowanie AxioVision w celu przeprowadzenia demonstracji. Najpierw należy dostosować ustawienia mikroskopu, wybierając odpowiedni obiektyw i powiększenie do obrazowania. Następnie w oprogramowaniu należy wybrać tryb detekcji kamery w mikroskopie.

Wybierz tryb podglądu na żywo, aby wyświetlić larwę na ekranie. Otwórz okno właściwości, aby automatycznie wykryć jasność lub ręcznie dostosować kontrast w podstawie oświetlenia przechodzącego mikroskopu. Przesuń larwy poza pole widzenia i wybierz funkcję korekcji cieniowania.

Aby zminimalizować szum tła, umieść larwy ponownie w polu widzenia i wykonaj zdjęcie. Zapisz obraz, aby przygotować się do wykonania zranienia. Usuń larwy z aerosów, najpierw zeskrobując aerosy z głowy.

Pozwala to larwom na wyślizgnięcie się z agaru poprzez delikatne odciągnięcie głowy od pozostałej części podczas testu amputacji. Przygotuj płytkę z 1,5% agaru, używając roztworu soli Instant Ocean. Pod mikroskopem stereoskopowym ułóż larwy bokiem na zestalonej agarze i amputuj dystalną część płetwy ogonowej za pomocą igły z organizacji 23G.

Montowanie larw do obrazowania poklatkowego. Przedstawimy dwie metody obrazowania poklatkowego. W pierwszej metodzie pokażemy, jak obrazować larwy w pierścieniu komory po ich zamontowaniu.

Ostrożnie usuń zastygły agar wokół dystalnej płetwy ogonowej za pomocą zakrytej końcówki pipety mikro-loader. Pozwala to na prawidłowe gojenie rany lub regenerację tkanki. Staraj się nie uszkodzić płetwy wielokrotnie, nie unieruchamiając tkanki. Podczas tej procedury usuń z komory niepożądane zanieczyszczenia utrudniające obrazowanie, wymieniając stary roztwór.

Używając świeżego roztworu Trica, nałożyć smar silikonowy na górną część komory i wypełnić pierścień komory świeżym roztworem Trica. Na górze położyć szkiełko przedmiotowe, aby uszczelnić komorę metodą drugą. W tej metodzie pokażemy, jak obrazować larwy w szklanej płytce Petri z pokrywką.

Zamocuj larwy na pokrywce i szkiełku nakrywkowym, a następnie wypełnij pokrywkę roztworem trica. Zeskrob agrosy z płetwy ogonowej.

Następnie nanieś smar silikonowy na górną krawędź dolnej komory i napełnij komorę roztworem trica. Ostrożnie zlej roztwór trica z pokrywki, a następnie odwróć pokrywkę, aby zanurzyć larwę w roztworze trica w dolnej komorze, co można wykonać pod niewielkim kątem. Aby uniknąć powstawania pęcherzyków powietrza, komora zostanie uszczelniona smarem silikonowym podczas obrazowania poklatkowego, aby zapewnić utrzymanie odpowiedniej temperatury 28 °C.

Zmontować ogrzewaną komorę inkubacyjną wykonaną z tektury i folii bąbelkowej służącej jako izolacja oraz z drutowej kopuły stosowanej do inkubacji jaj kurzych jako źródła ciepła. Umieścić komorę inkubacyjną wokół mikroskopu i ustawić temperaturę na 28 °C. Przez około 10 do 20 minut lub do momentu stabilizacji temperatury, należy otworzyć front ogrzewanej komory inkubacyjnej i umieścić komorę obrazowania na mikroskopie.

Ustaw preparat tak, aby szkiełko nakrywka było skierowane w górę, w stronę obiektywu. Upozycjonuj płetwę larwalną w taki sposób, aby dwie trzecie pola widzenia pozostały wolne, co zapewni możliwość uchwycenia wzrostu i regeneracji płetwy w trakcie procedury obrazowania. Bez konieczności ponownego pozycjonowania larw w 60-wymiarowym oknie akwizycji oprogramowania, wybierz opcję Z stack i time-lapse w zakładce Zack oraz tryb slice.

Wybierz grubość warstwy, a następnie wybierz tryb start-stop. Określ górną i dolną pozycję stosu w tabeli time-lapse. Wybierz interwał oraz czas trwania filmu, a następnie naciśnij przycisk start, aby rozpocząć nagrywanie.

W ciągu pierwszej godziny sprawdź granice osi Z i X larw. W razie potrzeby koryguj pozycję larw w czasie, ponieważ mogły one ulec przesunięciu w wyniku wzrostu lub różnic w składzie żelu agarowego. Zapisz plik po zakończeniu rejestracji poklatkowej i przejdź do etapu postprocesingu oraz analizy danych ilościowych.

W tej sekcji omówimy kilka sposobów analizy danych wygenerowanych metodą imas. Najpierw przedstawimy sposób określania wzrostu płetwy za pomocą oprogramowania imas. Otwórz film time-lapse w oprogramowaniu Amaris i zapisz pliki w formacie MRS.

Aby zwiększyć wydajność oprogramowania, wybierz widok ortogonalny, aby wyświetlić film jako projekcję. Aby zmierzyć długość płetwy, wybierz opcję dodawania nowych punktów pomiarowych w górnym lewym pasku narzędzi. W sekcji konfiguracji listy widocznych wartości statystycznych wybierz wartości statystyczne, które mają być wyświetlane w trybie liniowym.

W karcie ustawień (settings) w właściwościach etykiet (labels properties) wybierz opcję „pairs”, a następnie zaznacz „name” oraz „distance”, aby wyświetlić odległość między punktami A i B obok linii pomiarowej. Przełącz do trybu edycji i przytrzymaj klawisz Shift, aby zaznaczyć pierwszy punkt na dystalnej części płetwy. Następnie, korzystając z tej samej konfiguracji, zaznacz drugi punkt na dystalnym końcu struny. Odległość zostanie wyświetlona na obrazie i może zostać wyeksportowana w karcie statystyk (statistics).

Po wybraniu przycisku eksportu wszystkich danych (ikona dyskietki) w prawym dolnym rogu, dane zostaną wyeksportowane. Alternatywnie do opcji punktów pomiarowych, do mierzenia odległości w trybie widoku przekroju można wykorzystać przeglądarkę przekrojów. Przewiń do żądanej pozycji i kliknij lewym przyciskiem myszy w pierwszym i drugim punkcie; odległość zostanie wyświetlona.

Ta opcja nie umożliwia jednak eksportu danych. Teraz krótko omówimy, jak wyznaczyć powierzchnię płetwy za pomocą oprogramowania open source Image J. Otwórz film TimeLapse w programie Image J, korzystając z wtyczki obsługującej format plików Zeiss Axio vision.

Alternatywnie można załadować nieskompresowaną sekwencję plików TIFF. Zapewni to zapisanie informacji o pliku w opcji analyze select set scale, aby zdefiniować odległość i piksele oraz znaną odległość, jeżeli nie zostały one zachowane w pliku. Należy również ustawić jednostkę długości na mikrometry.

Na pasku narzędzi wybierz narzędzie do wolnego zaznaczania i obrysuj ranę, przytrzymując lewy przycisk myszy podczas prowadzenia linii wzdłuż krawędzi rany.

Kliknij opcję pomiaru w sekcji analizy, aby wyświetlić reprezentatywne wyniki dotyczące powierzchni rany. Amputacja płetwy prowadzi do częściowej regeneracji w ciągu 36 godzin po zabiegu. Pomiary powierzchni płetwy wskazują, że amputacja wywołuje spadek ilości tkanki płetwy aż do około 14 godziny po amputacji, co prawdopodobnie wynika z obumarcia komórek, po czym następuje niewielka regeneracja długości.

Porównanie amputowanej i zregenerowanej płetwy wykazuje 2,48-krotny wzrost długości płetwy w ciągu 36 godzin. Amputacja początkowo wywołuje efekt ściągacza, charakteryzujący się skurczami za pośrednictwem kabli aktynowo-miozynowych, które występują w komórkach fałdu płetwy wysuwających się z rany po amputacji, a następnie są usuwane. Długość ciała początkowo zwiększa się, ale płetwa nie regeneruje się.

W fazach wczesnych, około 14 godzin po amputacji, płetwa zaczyna odrastać w kierunku od proksymalnym do dystalnego. Podsumowując, nasze wyniki wykazują, że amputacja wywołuje kurczenie się rany, co może być niezbędne dla promowania ekstruzji komórek.

Po zakończeniu procesu rozpoczyna się regeneracja płetwy. Następuje wzrost płetwy rozwojowej. Niezależnie od tego procesu przedstawiliśmy metodę, która umożliwia obserwację dynamicznych procesów naprawy tkanek z wykorzystaniem żywych larw zebrafish.

Niniejsza procedura wymaga uwzględnienia określonych aspektów, które zostały przez nas przetestowane w celu optymalizacji wyniku. Wyraźną zaletą przedstawionej metody obrazowania jest to, że można ją łatwo dostosować do każdego stereomikroskopu wyposażonego w kamerę CCD i oprogramowanie TimeLapse. Stanowi ona również niedrogą alternatywę dla znacznie droższych systemów obrazowania konfokalnego.

Choć metoda ta nie wykorzystuje fluorescencji ani detekcji komórek, można ją rozszerzyć o takie zastosowania, wykorzystując zautomatyzowany system kontroli przesunięć oraz oprogramowanie do dekonwolucji obrazów po akwizycji, aby dokładniej obserwować procesy gojenia ran i regeneracji z rozdzielczością subkomórkową. Metoda ta pozwala studentom lepiej zrozumieć podstawowe procesy biologiczne leżące u podstaw naprawy i regeneracji tkanek. Przejrzystość optyczna, łatwość wykorzystania embrionów i larw zebrafish oraz możliwość dostosowania systemu do każdego stereomikroskopu sprawiają, że nadaje się on do nauczania podstaw biologii kręgowców w warunkach lekcyjnych.