Name: Ocena podzbiorów leukocytów naciekających nowotwór w podskórnym modelu guza (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 49 s
Description: Poznaj metodę analizy podzbiorów leukocytów naciekających nowotwór w podskórnym modelu guza myszy. Protokół obejmuje inokulację komórek melanoma B16, izolację zawiesiny komórkowej oraz cytometrię przepływową do oceny dynamiki komórek immunologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty R01-CA169354 i R01-047822 od National Institutes of Health oraz nagrodę za zasługi od Departamentu ds. Weteranów (ECB). RKP był wspierany przez NIH T32 CA009287-30A1, ASCO Young Investigator Award, California Breast Cancer Research Project Fellowship oraz American Cancer Society Mentored Research Scholar Grant; BAZ był wspierany przez NIH grant AI079320. JM był wspierany przez stypendia z grantu szkoleniowego NIH T-32 T32-AI07290-25, T32-AI07290-24 oraz stypendium podoktorskiego American Cancer Society PF-12-052-01-CSM.

UWAGA: Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z zatwierdzonymi wytycznymi Stanford, Palo Alto VA HCS i National Institutes of Health Institutional AnimalCare and Use Committee.
1. Przygotowanie do pobierania i przetwarzania próbek (wymagany czas: ~10-15 min)
<ol>
	<li>Zaszczepić mysie komórki czerniaka B16F0 (0,5-1 x 106) podskórnie na lub w pobliżu linii środkowej brzucha u samic myszy C57BL / 6, jak opisano wcześniej6. Alternatywnie, inokulować komórki nowotworowe w dodatkowych miejscach anatomicznych (np. bok, poduszeczka tłuszczowa sutka itp. 
	UWAGA: Dowolna liczba guzów (implantowanych lub samoistnych) może być używana i oceniana za pomocą tego protokołu. Na przykład inne powszechnie stosowane nowotwory syngeniczne w C57BL / 6 obejmują linię okrężnicy MC38, raka płuc Lewisa (LLC) i linię TRAMP-C2 prostaty. Chociaż ludzkie ksenoprzeszczepy zaszczepione myszom z niedoborem odporności mogą być również oceniane w ten sposób, należy zauważyć, że profile leukocytów naciekających nowotwór będą koniecznie zmieniane zgodnie ze stanem niedoboru odporności myszy gospodarza.
	<ol>
		<li>Należy użyć kompletnych pożywek (np. RPMI zawierających 10% FBS i dodatków) lub innego odpowiedniego buforu zawierającego białko (np. HBSS lub PBS +1% FBS lub 1% BCS). Schłodzić pożywkę lub bufor do temperatury 4 °C przed eutanazją.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ustaw probówki i filtry do wyciętych guzów; umieść je na lodzie.
	<ol>
		<li>Użyj jednej stożkowej probówki o pojemności 50 ml na guz, który ma zostać wycięty. Włóż filtr zawiesinowy komórek 40-70 μm do każdego z nich. Alternatywnie można użyć stożkowych probówek o pojemności 15 ml z metalową siatką filtracyjną. Użyj tłoka strzykawki o pojemności 5 ml lub grubego wstrzykiwacza, aby utworzyć filtr w kształcie miseczki na górze probówki o pojemności 15 ml.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj narzędzia do resekcji i leczenia guza; użyj kleszczy chirurgicznych i drobnych nożyczek do wycięcia i leczenia guzów. Użyj 70% etanolu do czyszczenia narzędzi między resekcjami/próbkami guza. W przypadku większej liczby próbek (np. >10) zalecamy jednoczesne przetwarzanie próbek przez wielu badaczy, aby uniknąć znacznych różnic w czasie przetwarzania między próbkami guza.</li>
</ol>
2. Resekcja guza (wymagany czas: ~5 min/guz)
<ol>
	<li>Eutanazja myszy z guzem B16 odbywa się indywidualnie przy użyciu dwutlenku węgla lub innej zatwierdzonej metody.</li>
	<li>Zabezpiecz mysz na etapie chirurgicznym. Spryskaj obszar guza 70% etanolem i zetrzyj nadmiar; Pomaga to zapobiegać rozprzestrzenianiu się obecnych włosów. W przypadku myszy nienagich należy ogolić obszar skóry wokół guza przed resekcją w razie potrzeby.</li>
	<li>Za pomocą kleszczy i nożyczek wyciąć guz podskórny en bloc, w tym skórę leżącą i otaczającą. Ilość pobranej skóry "marginesowej" może być różna, ale zazwyczaj należy wyciąć 2-3 mm skóry wokół guza.
	<ol>
		<li>W tym momencie zważ wycięte guzy (+/- otaczające skórę). Umieść wycięty wycinek skóry/guza w filtrze zabezpieczonym w plastikowej stożkowej rurce.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Przygotowanie zawiesiny pojedynczej komórki guza (wymagany czas: ~5-7 min/guz)
<ol>
	<li>Użyj kleszczy i nożyczek, aby zmielić guz i nadmiernie przylegającą/otaczającą skórę. Zmiel próbkę nożyczkami, aż wszystkie duże skrawki tkanki zostaną przetworzone na odcinki o średnicy 1-2 mm. 
	UWAGA: Zazwyczaj przetwarzane są całe guzy; Alternatywnie, w przypadku większych guzów, reprezentatywne odcinki guzów można zmielić i przetworzyć.</li>
	<li>Za pomocą tłoka z jednorazowej strzykawki o pojemności 5 lub 10 ml mechanicznie zdezagregować zmieloną tkankę nowotworową na zabezpieczonym filtrze.</li>
	<li>Za pomocą pipetora przemyj przetworzoną tkankę nowotworową 5-10 ml zimnej pożywki lub buforu. Spowoduje to przepłukanie pojedynczych komórek przez filtr.</li>
	<li>Powtórz powyższe dwa kroki kilka razy, upewniając się, że całkowita liczba i objętość popłuczyn jest w przybliżeniu taka sama dla guzów o podobnej wielkości.
	<ol>
		<li>Po umyciu przetworzonej tkanki nowotworowej należy zaobserwować, że w filtrze należy pozostawić małe fragmenty skóry i/lub innej tkanki łącznej.</li>
		<li>Alternatywnie, w przypadku nowotworów, w których sama mechaniczna dezagregacja może nie być wystarczająca, przed procedurą mielenia można przeprowadzić trawienie za pomocą kolagenazy i/lub innych enzymów. Pozwoli to na dokładniejsze zawieszenie pojedynczych komórek. Należy jednak zauważyć, że takie protokoły trawienia mogą wpływać na powierzchniową ekspresję antygenu20, dlatego należy zachować ostrożność przy interpretacji tych wyników.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umyć i granulować komórki, dodając pożywkę/bufor i odwirowując w temperaturze 4 °C 500 x g przez 5 minut.</li>
</ol>
4. Barwienie FACS zawiesiny pojedynczej komórki (wymagany czas: ~30-60 min)
<ol>
	<li>Zawieś komórki w lodowatym buforze FACS (PBS + 1% FBS).</li>
	<li>Policz żywe komórki za pomocą błękitu trypanowego i hemacytometru lub automatycznego licznika komórek.</li>
	<li>Określ całkowitą wydajność żywotnych komórek na objętość. Dane te można wykorzystać do ekstrapolacji bezwzględnej liczby leukocytów naciekających nowotwór w połączeniu z danymi FACS.</li>
	<li>Określ liczbę komórek, które mają być barwione i analizowane przez FACS. Będzie na to miało wpływ kilka czynników (np. rodzaj histologii guza, wiek i wielkość guza, średni odsetek naciekających leukocytów itp.). 
	UWAGA: W czerniaku B16 znaleźliśmy niski odsetek leukocytów naciekających nowotwór (TIL; zwykle <5%) w porównaniu z komórkami nowotworowymi. W związku z tym co najmniej 1 x 106 całkowitych komórek nowotworowych (guz + naciekające leukocyty) zwykle pobierano za pomocą FACS do analizy.
	<ol>
		<li>Korzystając z danych zliczania barwionych trypanem, oblicz objętość komórek do barwienia dla FACS. Na przykład, jeśli TIL zazwyczaj stanowią 5% wszystkich komórek nowotworowych (wiele komórek nowotworowych będzie martwych po barwieniu trypanem), należy to uwzględnić w całkowitej liczbie zawiesiny pojedynczych komórek nowotworowych do barwienia.</li>
		<li>W przypadku mniej powszechnych podzbiorów leukocytów, np. CCR9 + pDC), należy użyć większej liczby całkowitych komórek nowotworowych (np. 2-3 x 106) do barwienia FACS, biorąc pod uwagę stosunkowo niską częstotliwość tych komórek w zawiesinie pojedynczej komórki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wybarwić zawiesinę pojedynczej komórki guza na FACS.
	<ol>
		<li>W przypadku dyskryminacji żywej / martwej można użyć trwałej plamy lub nietrwałej plamy (np. jodku propidyny). Jeśli komórki są barwione bez rozróżnienia na żywe/martwe, należy zachować ostrożność ze względu na możliwość niespecyficznego wiązania przeciwciał.</li>
		<li>Wybarwić zawiesinę komórek dla określonych podzbiorów leukocytów przy użyciu standardowego protokołu barwienia FACS. Blokuj komórki w celu zmniejszenia niespecyficznego wiązania przeciwciał z PBS / FBS zawierającym 1% surowicę szczura i blok Fc (anty-CD16 / 32) przez 10 minut przed barwieniem przeciwciałami specyficznymi dla antygenu. Uwzględnij odpowiednie przeciwciała kontrolne izotypu, aby upewnić się, że barwienie jest specyficzne.</li>
		<li>W tym momencie, po zakończeniu barwienia FACS, utrwal próbki 4% formaldehydem lub innym podobnym środkiem utrwalającym. Próbki należy przechowywać w temperaturze 4 °C w ciemności (aby uniknąć wygaszania fluoroforów) do czasu pobrania i analizy. 
		UWAGA: Przechowywanie utrwalonych próbek przez długi czas może spowodować zmianę sygnału i intensywności fluoroforów21.</li>
		<li>Pobrać próbki za pomocą cytometru przepływowego. Optymalne ustawienia cytometru przepływowego będą się różnić w zależności od typu przyrządu i konfiguracji lasera/detektora. 
		UWAGA: Ponadto mogą występować różnice między eksperymentami, nawet jeśli używasz tej samej maszyny. W związku z tym należy przeprowadzić odpowiednią konfigurację maszyny (np. za pomocą koralików kalibracyjnych), aby zapewnić odpowiednie ustawienie kompensacji przed pobraniem i analizą FACS każdego eksperymentu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza podzbiorów leukoctye
	<ol>
		<li>Korzystanie z oprogramowania do analizy danych FACS w celu analizy danych. W przypadku żywej/martwej plamy zacznij od bramkowania martwych komórek. Użyj przeciwciała przeciwko markerowi specyficznemu dla leukocytów (np. anty-CD45) w celu identyfikacji leukocytów w żywych komórkach.
		<ol>
			<li>Następnie użyj różnych schematów bramkowania, aby zidentyfikować określone podzbiory, w zależności od protokołu barwienia. Na przykład, aby zidentyfikować limfocyty T CD4 +, wybierz regionlo SSC z populacji CD45 + i wybierz komórki CD19-CD3 +; z tego limfocyty T CD4 + można zidentyfikować22.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Analizuj dane i prezentuj je na wiele różnych sposobów, aby zapewnić spójność i identyfikować wzorce lub trendy (np. używaj liczb całkowitych, procentów lub współczynników do ilościowego określania podzbiorów). 
		UWAGA: Na przykład przyjrzeliśmy się całkowitej liczbie żywych komórek CD45 + jako procentowi wszystkich zebranych komórek nowotworowych (ryc. 1). Dodatkowo następnie obliczyliśmy procent każdego podzbioru leukocytów (np. Limfocyty T CD4 +) w guzie i porównaliśmy je jako proporcje między grupą kontrolną a grupą testową (ryc. 3).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Mantovani, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemokines+in+the+recruitment+and+shaping+of+the+leukocyte+infiltrate+of+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cancer+Biol%22%5BJournal%5D)">Chemokines in the recruitment and shaping of the leukocyte infiltrate of tumors.</a> Semin Cancer Biol. 14 (3), 155-160 (2004).</li>
<li>Zitvogel, L., Tesniere, A., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+despite+immunosurveillance%3A+immunoselection+and+immunosubversion%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cancer despite immunosurveillance: immunoselection and immunosubversion.</a> Nat Rev Immunol. 6 (10), 715-727 (2006).</li>
<li>Gajewski, T. F., Schreiber, H., Fu, Y. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+and+adaptive+immune+cells+in+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Innate and adaptive immune cells in the tumor microenvironment.</a> Nat Immunol. 14 (10), 1014-1022 (2013).</li>
<li>Fridman, W. H., Pages, F., Sautes-Fridman, C., Galon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immune+contexture+in+human+tumours%3A+impact+on+clinical+outcome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">The immune contexture in human tumours: impact on clinical outcome.</a> Nat Rev Cancer. 12 (4), 298-306 (2012).</li>
<li>Curiel, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+recruitment+of+regulatory+T+cells+in+ovarian+carcinoma+fosters+immune+privilege+and+predicts+reduced+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Specific recruitment of regulatory T cells in ovarian carcinoma fosters immune privilege and predicts reduced survival.</a> Nat Med. 10 (9), 942-949 (2004).</li>
<li>Pachynski, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemoattractant+chemerin+suppresses+melanoma+by+recruiting+natural+killer+cell+antitumor+defenses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">The chemoattractant chemerin suppresses melanoma by recruiting natural killer cell antitumor defenses.</a> J Exp Med. 209 (8), 1427-1435 (2012).</li>
<li>Hoffman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+nude+mice+ubiquitously+expressing+fluorescent+proteins+for+color-coded+imaging+of+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Transgenic nude mice ubiquitously expressing fluorescent proteins for color-coded imaging of the tumor microenvironment.</a> Methods Mol Biol. 1194, 353-365 (2014).</li>
<li>Mansfield, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+in+cancer+immunology%3Aphenotyping+immune+cell+subsets+in+situ+in+FFPE+tissue+sections%5BTitle%5D)+AND+%22MLO+Med+Lab+Obs%22%5BJournal%5D)">Imaging in cancer immunology:phenotyping immune cell subsets in situ in FFPE tissue sections.</a> MLO Med Lab Obs. 46 (6), 12-13 (2014).</li>
<li>Serres, S., O'Brien, E. R., Sibson, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+angiogenesis%2C+inflammation%2C+and+metastasis+in+the+tumor+microenvironment+with+magnetic+resonance+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Imaging angiogenesis, inflammation, and metastasis in the tumor microenvironment with magnetic resonance imaging.</a> Adv Exp Med Biol. 772, 263-283 (2014).</li>
<li>Schietinger, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longitudinal+confocal+microscopy+imaging+of+solid+tumor+destruction+following+adoptive+T+cell+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncoimmunology%22%5BJournal%5D)">Longitudinal confocal microscopy imaging of solid tumor destruction following adoptive T cell transfer.</a> Oncoimmunology. 2 (11), e26677(2013).</li>
<li>Singh, A. S., Radu, C. G., Ribas, A. P. E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((imaging+of+the+immune+system%3A+immune+monitoring+at+the+whole+body+level%5BTitle%5D)+AND+%22Q+J+Nucl+Med+Mol+Imaging%22%5BJournal%5D)">imaging of the immune system: immune monitoring at the whole body level.</a> Q J Nucl Med Mol Imaging. 54 (3), 281-290 (2010).</li>
<li>Kilarski, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+immunofluorescence+for+visualizing+the+microcirculatory+and+immune+microenvironments+in+the+mouse+ear+dermis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Intravital immunofluorescence for visualizing the microcirculatory and immune microenvironments in the mouse ear dermis.</a> PLoS One. 8 (2), e57135(2013).</li>
<li>Habibollahi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+nanoparticle+imaging+allows+noninvasive+evaluation+of+immune+cell+modulation+in+esophageal+dysplasia%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Imaging%22%5BJournal%5D)">Fluorescent nanoparticle imaging allows noninvasive evaluation of immune cell modulation in esophageal dysplasia.</a> Mol Imaging. 13 (3), 1-11 (2014).</li>
<li>Balducci, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+probe+for+the+non-invasive+detection+of+tumor-associated+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Oncoimmunology%22%5BJournal%5D)">A novel probe for the non-invasive detection of tumor-associated inflammation.</a> Oncoimmunology. 2 (2), e23034(2013).</li>
<li>Liu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmacytoid+dendritic+cells+induce+NK+cell-dependent%2C+tumor+antigen-specific+T+cell+cross-priming+and+tumor+regression+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Plasmacytoid dendritic cells induce NK cell-dependent, tumor antigen-specific T cell cross-priming and tumor regression in mice.</a> J Clin Invest. 118 (3), 1165-1175 (2008).</li>
<li>Hadeiba, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CCR9+expression+defines+tolerogenic+plasmacytoid+dendritic+cells+able+to+suppress+acute+graft-versus-host+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">CCR9 expression defines tolerogenic plasmacytoid dendritic cells able to suppress acute graft-versus-host disease.</a> Nat Immunol. 9 (11), 1253-1260 (2008).</li>
<li>McLean, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+BALB%2Fc+murine+lung+alveolar+carcinoma+used+to+establish+a+surgical+spontaneous+metastasis+model%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Metastasis%22%5BJournal%5D)">A BALB/c murine lung alveolar carcinoma used to establish a surgical spontaneous metastasis model.</a> Clin Exp Metastasis. 21 (4), 363-369 (2004).</li>
<li>Watkins, S. K., Zhu, Z., Watkins, K. E., Hurwitz, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+immune+cells+from+primary+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of immune cells from primary tumors.</a> J Vis Exp. (64), e3952(2012).</li>
<li>Shafer-Weaver, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+Edge%3A+Tumor-specific+CD8%2B+T+cells+infiltrating+prostatic+tumors+are+induced+to+become+suppressor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cutting Edge: Tumor-specific CD8+ T cells infiltrating prostatic tumors are induced to become suppressor cells.</a> J Immunol. 183 (8), 4848-4852 (2009).</li>
<li>Goodyear, A. W., Kumar, A., Dow, S., Ryan, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+murine+small+intestine+leukocyte+isolation+for+global+immune+phenotype+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Optimization of murine small intestine leukocyte isolation for global immune phenotype analysis.</a> J Immunol Methods. 405, 97-108 (2014).</li>
<li>Stewart, J. C., Villasmil, M. L., Frampton, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+fluorescence+intensity+of+selected+leukocyte+surface+markers+following+fixation%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Changes in fluorescence intensity of selected leukocyte surface markers following fixation.</a> Cytometry A. 71 (6), 379-385 (2007).</li>
<li>Hackstein, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+respiratory+dendritic+cell+subsets+and+lymphocyte+populations+in+inbred+mouse+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Respir+Res%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of respiratory dendritic cell subsets and lymphocyte populations in inbred mouse strains.</a> Respir Res. 13, 94(2012).</li>
<li>Ostrand-Rosenberg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloid-derived+suppressor+cells%3A+more+mechanisms+for+inhibiting+antitumor+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunol+Immunother%22%5BJournal%5D)">Myeloid-derived suppressor cells: more mechanisms for inhibiting antitumor immunity.</a> Cancer Immunol Immunother. 59 (10), 1593-1600 (2010).</li>
<li>Curran, M. A., Montalvo, W., Yagita, H., Allison, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PD-1+and+CTLA-4+combination+blockade+expands+infiltrating+T+cells+and+reduces+regulatory+T+and+myeloid+cells+within+B16+melanoma+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">PD-1 and CTLA-4 combination blockade expands infiltrating T cells and reduces regulatory T and myeloid cells within B16 melanoma tumors.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (9), 4275-4280 (2010).</li>
<li>Schreiber, R. D., Old, L. J., Smyth, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+immunoediting%3A+integrating+immunity%27s+roles+in+cancer+suppression+and+promotion%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cancer immunoediting: integrating immunity's roles in cancer suppression and promotion.</a> Science. 331 (6024), 1565-1570 (2011).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Przeprowadzenie szczegółowej analizy mikrośrodowiska guza ma kluczowe znaczenie dla określenia mechanizmów i skutków immunomodulacji. Wraz z rosnącą obecnością immunoterapeutyków w sferze klinicznej ludzi, zrozumienie wpływu tych środków na leukocyty naciekające guz staje się niezbędne do zdefiniowania ich mechanizmu działania. U ludzi często występują trudności kliniczne i/lub logistyczne w pozyskiwaniu i analizowaniu tkanki nowotworowej do analizy podzbioru leukocytów, a zatem często przeprowadza się analizę obwodowej ...

Równowaga między wzrostem i promocją guza a regresją jest częściowo zależna od równowagi pro- i anty-nowotworowych leukocytów naciekających obecne w mikrośrodowisku1,2. W celu zbadania mikrośrodowiska guza (TME) i specyficznej identyfikacji naciekających subpopulacji leukocytów, opracowaliśmy metodę oceny guzów podskórnych w mysim modelu guza. Znaczenie badania mikrośrodowiska guza jest dobrze znane i poparte w literaturze. Liczne badania wykazały, że równowaga pro- i przeciwnowotworowych naciekających komórek odpornościowych może wpływać na wyniki wzrostu guza, nie tylko w badaniach na myszach, ale także na ludziach (przegląd w3,4). Na przykład Curiel i wsp. wykazali, że pogorszenie wyników klinicznych u pacjentek z rakiem jajnika było skorelowane z obecnością rosnącego odsetka naciekających nowotwór regulatorowych limfocytów T CD4 + (Treg)5. Nasza własna praca wykazała również wpływ nowego chemoatraktantu leukocytów na stosunek podzbiorów leukocytów w mysim czerniaku model6, co również korelowało ze zmniejszonym wzrostem guza. W związku z tym szczegółowe analizy podzbiorów leukocytów w obrębie guza są obecnie szerzej rozpoznawane i coraz ważniejsze.
Istnieje wiele sposobów oceny mikrośrodowiska guza pod kątem infiltracji leukocytów; na przykład grupy zaprojektowały transgeniczne myszy do ekspresji różnych białek fluorescencyjnych w celu zobrazowania TME7, klasycznej immunohistochemii i immunofluorescencji zachowanych sekcji8, w tym różnych metod obrazowania, takich jak MRI, PET, mikroskopia konfokalna9-11 - niektóre z możliwością monitorowania śródżyłowego10,12. Mogą być one stosowane z różnymi środkami do obrazowania molekularnego, takimi jak nanocząstki13 lub nowe środki kontrastowe14, które znakują komórki odpornościowe. Nasza metoda jest podejściem opartym na cytometrii przepływowej i ma kilka zalet. Po pierwsze, można pobrać próbki z całego mikrośrodowiska guza; W momencie analizy cały guz podskórny i otaczające go obrzeża są chirurgicznie wycinane w celu przetworzenia. Eliminuje to wszelkie potencjalne odchylenia w próbkowaniu w obrębie pojedynczego guza i daje bardziej "globalną" analizę guza jako całości. Po drugie, zastosowanie wielokolorowej cytometrii przepływowej do analizy podzbiorów leukocytów pozwala nam dokładniej ocenić fenotyp naciekających leukocytów. W zależności od liczby użytych kolorów można zidentyfikować bardzo konkretne podzbiory. Jest to ważne, ponieważ istnieje kilka podzbiorów leukocytów w obrębie określonego typu komórek - lub nawet w ogólnej klasyfikacji podtypów - które mają różne funkcje, które są potencjalnie istotne w określaniu losu guza. Na przykład plazmocytoidalne komórki dendrytyczne (pDC) są zaangażowane w odporność przeciwnowotworową15. Wykazano jednak, że podzbiór pDC CCR9 + jest tolerogenny16, a przesunięcie równowagi takiego podzbioru może mieć wpływ na wzrost guza.
Nasza metoda jest odpowiednia dla guzów podskórnych lub innych, które mogą być wycięte en bloc. W naszych rękach guzy były jednolicie wycinane w czasie eutanazji. Można sobie jednak wyobrazić, jak to miało miejsce w niektórych badaniach, że guz podskórny mógłby zostać całkowicie wycięty z zamknięciem otaczającej skóry podczas operacji przeżycia17, co pozwala na dodatkową ocenę zwierzęcia. Następnie przeprowadza się analizę wyciętego guza. Tak więc wyniki reprezentują pojedynczy punkt czasowy w rozwoju guza. Chociaż pozwala to na szczegółowe spojrzenie w mikrośrodowisko, jest to również statyczny obraz tego, co bez wątpienia jest procesem dynamicznym. Jednak wyizolowane leukocyty (np. poprzez separację magnetyczną lub gradient gęstości) mogą być następnie analizowane oddzielnie od nabłonka guza i zrębu lub wykorzystywane w innych, funkcjonalnych testach w celu dalszego określenia ich fenotypu, jak opisano wcześniej18. Metoda ta byłaby zatem przydatna dla wszystkich badaczy zainteresowanych zrozumieniem składu leukocytów w mikrośrodowisku guza w danym punkcie czasowym, czy to w warunkach naturalnego przebiegu choroby, czy po określonych zaburzeniach terapeutycznych. Chociaż nie zostało to przez nas wykonane, warianty tej procedury mogą być również potencjalnie wykorzystane do analizy określonych części guza w izolacji. Na przykład, biorąc pod uwagę rozmiar guza, strefa obwodowa (strefy) może zostać wypreparowana z dala od centralnego, prawdopodobnie martwiczego rdzenia guza, aby dać badaczowi bardziej przestrzennie posegregowany obraz mikrośrodowiska guza.
W rozwijającej się dziedzinie immunologii nowotworów, bez wątpienia będzie wykładniczo rosła liczba badań oceniających nowe czynniki immunomodulujące w mysich modelach nowotworów. Kilka doniesień podkreśliło różnice w specyficznej funkcji leukocytów w obrębie guza w porównaniu ze środowiskiem obwodowym. Na przykład Shafer-Weaver i in. wykazali w modelu mysim, że specyficzne dla antygenu komórki efektorowe T CD8 +, choć aktywne na obrzeżach, zostały przekształcone w komórki supresorowe T CD8 + po przedostaniu się do mikrośrodowiska guza19. Było to częściowo spowodowane TGFβ, ale prawdopodobnie w grę wchodzą również inne czynniki. Tak więc ocena podzbiorów leukocytów – liczb i stosunków, a także statusu funkcjonalnego – w samym guzie zapewni dokładniejsze odwzorowanie wpływu określonej immunomodulacji na los guza.
Nasza technika pozwala na szczegółową analizę guza i daje badaczowi możliwość dokładniejszego zidentyfikowania zmian w populacjach leukocytów niż poprzednie podejścia.

<table><tbody><tr><td>RPMI</td><td>Cellgro</td><td>10-040</td><td>http://cellgro.com; keep on ice</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Cellgro</td><td>35-011-CV</td><td>http://cellgro.com</td></tr><tr><td>50 ml probówki stożkowe</td><td>Falcon</td><td>14-432-22</td><td>fischersci.com</td></tr><tr><td>40 &#956; m filtr</td><td>Falcon</td><td>08-771-1</td><td>fischersci.com</td></tr><tr><td>strzykawka 5 ml</td><td>BD</td><td>14-823-35</td><td>fischersci.com</td></tr><tr><td>nożyczki/kleszcze chirurgiczne</td><td>Roboz</td><td>RS-5910</td><td>roboz.com</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Cellgro</td><td>MT-21-030-CM</td><td>http://cellgro.com; keep on ice</td></tr><tr><td>trypan niebieski</td><td>Hemacytometr fischersci.com Cellgro</td><td>MT-25-900-CI</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Hausser Scientifice&nbsp;</td><td>02-671-54&nbsp;</td><td>fischersci.com</td></tr><tr><td>Żywa/martwa plama</td><td>Life Technologies</td><td>L34957</td><td>lieftechnologies.com</td></tr><tr><td>oprogramowanie FlowJo</td><td>TreeStar, Inc</td><td></td><td>flowjo.com</td></tr></tbody></table>

ocena podzbiorów leukocytów naciekających nowotwór w podskórnym modelu guza

Evaluation of Tumor-infiltrating Leukocyte Subsets in a Subcutaneous Tumor Model

Wyspecjalizowane komórki odpornościowe, które infiltrują mikrośrodowisko guza, regulują wzrost i przetrwanie nowotworów. Komórki nowotworowe muszą unikać lub obalać przeciwnowotworowe odpowiedzi immunologiczne, aby przetrwać i rozwijać się. Guzy wykorzystują wiele różnych mechanizmów "ucieczki" immunologicznej, w tym rekrutację tolerogennego DC, immunosupresyjnych regulatorowych limfocytów T (Treg) i komórek supresorowych pochodzenia szpikowego (MDSC), które hamują cytotoksyczne odpowiedzi przeciwnowotworowe. I odwrotnie, przeciwnowotworowe efektorowe komórki odpornościowe mogą spowolnić wzrost i ekspansję nowotworów złośliwych: immunostymulujące komórki dendrytyczne, komórki NK posiadające wrodzoną odporność przeciwnowotworową i cytotoksyczne limfocyty T mogą uczestniczyć w supresji guza. Równowaga między leukocytami pro- i przeciwnowotworowymi ostatecznie determinuje zachowanie i los transformowanych komórek; Potwierdziło to wiele badań klinicznych na ludziach. W związku z tym coraz ważniejsza staje się szczegółowa analiza podzbiorów leukocytów w mikrośrodowisku guza. W tym miejscu opisujemy metodę analizy naciekających podzbiorów leukocytów obecnych w mikrośrodowisku guza w mysim modelu guza. Mysie komórki nowotworowe czerniaka B16 inokulowano podskórnie myszom C57BL/6. W określonym czasie guzy i otaczająca je skóra zostały wycięte en bloc i przetworzone na zawiesiny jednokomórkowe, które następnie wybarwiono do wielokolorowej cytometrii przepływowej. Korzystając z różnych markerów podzbioru leukocytów, byliśmy w stanie porównać względne procenty naciekających podzbiorów leukocytów między guzami kontrolnymi i wykazującymi ekspresję chemeryny. Badacze mogą użyć takiego narzędzia do badania obecności immunologicznej w mikrośrodowisku guza, a w połączeniu z tradycyjnymi pomiarami wielkości suwmiarki wzrostu guza, potencjalnie pozwoli im wyjaśnić wpływ zmian w składzie immunologicznym na wzrost guza. Taką technikę można zastosować do dowolnego modelu guza, w którym guz i jego mikrośrodowisko mogą być wycięte i przetworzone.

Nasze wyniki wykazały, że wymuszona nadekspresja chemeryny w mysich guzach B16 zwiększyła odsetek leukocytów naciekających guz (TILs). Ponadto zidentyfikowano zmiany w stosunku podgrup leukocytów obecnych w mikrośrodowisku guza powiązane z ekspresją chemeryny. Przedruk za zgodą Pachynski et al.6.
Rysunek 1 pokazuje, że w guzach wykazujących ekspresję chemeryny nastąpił istotny wzrost całkowitej liczby komórek CD45+ (TILs) w porównaniu z grupą kontrolną, co ok...

Ten protokół opisuje metodę szczegółowej oceny podzbiorów leukocytów w mikrośrodowisku guza w modelu guza myszy. Komórki czerniaka B16 z ekspresją chemeryny wszczepiono podskórnie myszom syngenicznym. Komórki z mikrośrodowiska guza zostały następnie wybarwione i przeanalizowane za pomocą cytometrii przepływowej, co pozwoliło na szczegółowe analizy podzbiorów leukocytów.

Ocena podzbiorów leukocytów naciekających nowotwór w podskórnym modelu guza

Specialized immune cells that infiltrate the tumor microenvironment regulate the growth and survival of neoplasia.&#160; Malignant cells must elude or ...

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest przeprowadzenie szczegółowej analizy leukocytów naciekających w mysim modelu guza podskórnego. Osiąga się to poprzez uprzednie inokulację mysich komórek czerniaka B 16 F zero pochodzących od samic myszy C 57 BL six w celu wywołania wzrostu guza in vivo. Następnie myszy z linią B 16 z nowotworem są uśpione, a guz podskórny jest wycinany w bloku, wraz z nakładającą się i otaczającą go skórą.Następnie izoluje się zawiesinę pojedynczych komórek, składającą się zarówno z komórek nowotworowych, jak i leukocytów naciekających guz, którą można następnie poddać analizie za pomocą cytometrii przepływowej. Na koniec określa się wydajność żywych komórek w przeliczeniu na objętość i oblicza liczbę komórek do zabarwienia i analizy za pomocą FACS. Ostatecznie cytometria przepływowa służy do wykazania częstości występowania i rodzaju subpopulacji leukocytów w mikrośrodowisku guza.Zastosowania tej techniki obejmują terapię lub diagnostykę nowotworów, ponieważ umożliwia ona ocenę wpływu terapii na leukocyty w mikrośrodowisku guza. To właśnie równowaga między komórkami efektorowymi a supresoryjnymi pomaga określić, czy guz rośnie, czy ulega regresji. Aby zindukować wzrost guza, należy podskórnie zaszczepić komórki czerniaka mysiego B 16 F zero w buforze fizjologicznym, takim jak sól fizjologiczna (PBS), w linii środkowej brzucha samic myszy C 57 BL six zgodnie z protokołem tekstowym. Po 7 do 14 dniach, bezpośrednio przed wycięciem guzów, należy przygotować jedną probówkę stożkową o pojemności 50 ml na każdy guz i umieścić ją w lodzie.Do każdej probówki włóż filtr do zawiesin komórkowych o rozmiarze oczek od 40 do 70 mikronów. Przygotuj pęsetę chirurgiczną oraz nożyczki do resekcji, a także 70% etanol do czyszczenia narzędzi pomiędzy próbkami guzów. Po uśpieniu myszy z guzami B 16, zgodnie z protokołem tekstowym, unieruchom mysz na stole chirurgicznym, spryskaj obszar guza 70% etanolem i przetrzyj miejsce dostępu, aby zapobiec rozprzestrzenianiu się sierści. Przed resekcją guza za pomocą pęsety i nożyczek upewnij się, że etanol miejscowy został całkowicie wytarty i odparował. Wyciśnij guz podskórny w całości, obejmując skórę nad nim oraz około dwa do trzech milimetrów skóry otaczającej.Zważ wycięte guzy wraz z otaczającą skórą oraz bez niej, a następnie umieść każdą sekcję w filtrze w probówce stożkowej. Aby przygotować zawiesinę pojedynczych komórek guza, użyj pęsety i nożyczek do rozdrobnienia guza oraz pokrywającej go i otaczającej go skóry, aż wszystkie duże fragmenty tkanki zostaną podzielone na sekcje o rozmiarze od jednego do dwóch milimetrów. Następnie, używając tłoka z jednorazowej strzykawki o pojemności 5 lub 10 ml, mechanicznie rozdrobnij posiekaną tkankę guza, dociskając ją do zamocowanego filtra.Następnie za pomocą pipety dodaj od 5 do 10 ml zimnego medium lub buforu. Przemyj przetworzoną tkankę nowotworową. Pozwoli to na przepłukanie pojedynczych komórek przez filtr.Powtórz etapy dysagregacji i przemywania kilka razy, dbając o to, aby całkowita liczba i objętości przemyć były zbliżone dla guzów o podobnej wielkości. Po przemyciu tkanki sprawdź, czy w filtrze nie pozostały małe fragmenty skóry i/lub innej tkanki łącznej. Aby przemyć i sfragmentować komórki w pellet, dodaj medium i wiruj przy 500 Gs w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez pięć minut. W celu przeprowadzenia analizy FACS użyj lodowatego buforu FACS do resuspensji komórek.Następnie, przy użyciu błękitu trypanu i komory countingowej (hemocytometru), określono liczbę żywych komórek, aby wyznaczyć całkowitą liczbę żywych komórek w objętości, co służy do ekstrapolacji bezwzględnej liczby leukocytów naciekających guz lub do zastosowania w połączeniu z analizą FACS. Na podstawie danych z liczenia po barwieniu błękitem trypanu obliczono objętość komórek do zabarwienia metodą FACS. Na przykład, jeśli TIL stanowią zazwyczaj 5% całkowitej liczby komórek nowotworowych, należy uwzględnić ten czynnik przy określaniu całkowitej liczby komórek nowotworowych w zawiesinie przeznaczonej do zabarwienia.W celu barwienia komórek do rozróżnienia żywych od martwych należy zastosować barwnik utrwalający lub nieutrwalający, taki jak jodek propidyny. Następnie należy użyć FBS w PBS z 1% surowicy szczurzej oraz FC block, aby zablokować komórki przez 10 minut, a następnie zastosować standardowy protokół barwienia FACS w celu zbarwienia zawiesiny komórkowej pod kątem specyficznych subpopulacji leukocytów.Po barwieniu należy użyć 4% paraformaldehydu do utrwalenia próbek, a następnie przechowywać je w temperaturze czterech stopni Celsjusza w ciemności do momentu ich zbierania i analizy. Do zbierania próbek z utrwalonych preparatów należy użyć cytometru przepływowego. Analizę danych w programie komputerowym należy rozpocząć od wykluczenia martwych komórek (gating), a następnie, przy użyciu przeciwciała przeciwko markerowi specyficznemu dla leukocytów, takiemu jak anty-CD 45, zidentyfikować leukocyty wśród żywych komórek.Następnie, zgodnie z protokołem tekstowym, należy zastosować różne schematy bramkowania w celu zidentyfikowania konkretnych subpopulacji. Przeanalizuj dane i przedstaw je na kilka sposobów, aby zapewnić spójność oraz zidentyfikować wzorce lub trendy, tak jak pokazano tutaj. Wymuszona nadekspresja kein w mysich guzach B 16 wyciętych w 17. dniu doprowadziła do znaczącego wzrostu całkowitej liczby komórek CD 45-dodatnich w porównaniu z grupą kontrolną na tej rycinie, z wykorzystaniem immunofluorescencji na mrożonych przekrojach guzów B 16.Potwierdzono wzrost liczby naciekających komórek CD 45 dodatnich w guzach. Dalsza analiza danych z cytometrii przepływowej wykazała średnio wzglalszy wzrost liczebności komórek NK, limfocytów T oraz konwencjonalnych komórek dendrytycznych CD 11 C dodatnich. W guzach, w których stwierdzono nadekspresję kein w porównaniu z guzami kontrolnymi, odnotowano również względny spadek odsetka leukocytów immunosupresyjnych, w tym mieloidalnych komórek supresyjnych oraz plazmacytoidalnych komórek dendrytycznych.Badania wykazały, że stosunek podgrup leukocytów w obrębie guza może być istotnym czynnikiem wpływającym na wzrost nowotworu i wyniki kliniczne; potwierdzają to dane wskazujące na zwiększoną liczbę komórek T CD3+ oraz komórek NK na guza w nowotworach wykazujących ekspresję kein w porównaniu z grupą kontrolną. Rysunek ten pokazuje, że w bezpośrednim porównaniu populacji komórek efektorowych i supresyjnych w mikrośrodowisku guza, w nowotworach wykazujących ekspresję kein widoczne były istotne wzrosty stosunku populacji komórek efektorowych do supresyjnych w porównaniu z grupą kontrolną. Postępuj zgodnie z poniższą procedurą.W celu odpowiedzi na dodatkowe pytania dotyczące funkcjonalności leukocytów naciekających guz można zastosować inne metody, takie jak sortowanie lub izolacja komórek.

evaluation-tumor-infiltrating-leukocyte-subsets-subcutaneous-tumor

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Ocena podzespołów leukocytów infiltrujących guz w podskórnym modelu guza

W niniejszym raporcie opisujemy protokół izolacji wysoko oczyszczonych populacji leukocytów infiltrujących guzy. Protokół ten został opracowany na podstawie metody firmy Miltenyi Biotech w celu zwiększenia wydajności i czystości izolacji komórek z złożonej tkanki nowotworowej.

Izolacja komórek odpornościowych z guzów pierwotnych

Ten protokół opisuje szybką nieenzymatyczną dysocjację świeżych fragmentów tkanek ludzkich do jakościowej i ilościowej oceny komórek CD45+ (limfocytów/leukocytów) obecnych w różnych normalnych i złośliwych tkankach ludzkich. Dodatkowo, supernatant uzyskany z pierwotnego homogenatu tkankowego może być zbierany i przechowywany do dalszej analizy lub eksperymentów.

Prosty i szybki protokół nieenzymatycznej dysocjacji świeżych tkanek ludzkich w celu analizy naciekających limfocytów

Tutaj opisujemy metodę rozdzielania i wzbogacania składników mikrośrodowiska immunologicznego i nieimmunologicznego guza w ustalonych guzach podskórnych. Technika ta pozwala na oddzielną analizę nacieków immunologicznych guza i nieimmunologicznych frakcji guza, co może pozwolić na kompleksową charakterystykę mikrośrodowiska immunologicznego guza.

Wzbogacenie i charakterystyka mikrośrodowisk immunologicznych i nieimmunologicznych guza w ustalonych podskórnych guzach myszy

Tutaj demonstrujemy metody ilościowego oznaczania in vivo wyjścia leukocytów z naiwnej, zapalnej i złośliwej skóry myszy. Przeprowadzamy bezpośrednie porównanie dwóch modeli: transdermalnej aplikacji FITC i fotokonwersji in situ. Ponadto wykazujemy przydatność fotokonwersji do śledzenia wychodzenia leukocytów z guzów skóry.

Kwantyfikacja wychodzenia leukocytów przez naczynia limfatyczne z mysiej skóry i guzów

Tutaj prezentujemy powtarzalną metodę tworzenia ortotopowego mysiego modelu raka płaskonabłonkowego głowy i szyi. Guzy wykazują klinicznie istotne cechy histopatologiczne choroby, w tym martwicę, słabe różnicowanie, przerzuty węzłowe i naciek immunologiczny. U myszy z guzem rozwijają klinicznie istotne objawy, w tym dysfagię, przemieszczenie szczęki i utratę wagi.

Dośluzówkowa inokulacja komórek raka płaskonabłonkowego u myszy w celu profilowania immunologicznego guza i oceny odpowiedzi na leczenie

Tutaj prezentujemy protokół przeszczepu guza do charakterystyki limfocytów naciekanych nowotworem w modelu guza myszy w intruzie naturalnym i pochodzącym z obwodu limfocytach. Specyficzne śledzenie napływu komórek odpornościowych pochodzących od biorcy za pomocą cytometrii przepływowej ujawnia dynamikę zmian fenotypowych i funkcjonalnych tych komórek podczas przeciwnowotworowych odpowiedzi immunologicznych.

Przeszczep guza w celu oceny dynamiki limfocytów T CD8 + naciekających nowotwór u myszy

Opisano standardowy protokół do badania aktywności przeciwnowotworowej i związanej z nią toksyczności IL-1α w syngenicznym mysim modelu HNSCC.

Ocena aktywności przeciwnowotworowej in vivo nanocząstek bezwodnika IL-1α

Protokół przedstawia model immunoterapii nowotworów za pomocą komórkowego szczepienia guza z ekspresją Flt3L czerniaka B16-F10. Protokół ten demonstruje procedury, w tym przygotowanie hodowanych komórek nowotworowych, implantację guza, napromienianie komórek, pomiar wzrostu guza, izolację wewnątrznowotworowych komórek odpornościowych i analizę cytometrii przepływowej.

Eksperymentalny model immunoterapii czerniaka z wykorzystaniem szczepienia przeciwnowotworowego cytokiną krwiotwórczą

Niniejsze badanie koncentruje się na indukcji in vivo podskórnej indukcji luminescencyjnych komórek raka jelita grubego w modelu mysim oraz na późniejszym pomiarze luminescencji za pomocą systemu obrazowania. Procedura ma na celu stworzenie powtarzalnego modelu wzrostu guza do monitorowania w czasie rzeczywistym i oceny terapeutycznej.

Podskórne zastrzyki ludzkich komórek raka jelita grubego u athymicznych nagich myszy w celu oceny skuteczności przeciwnowotworowej

Wraz ze wzrostem zainteresowania immunoterapią wnętrznowrzodową, wybór modeli nowotworów, które są dostępne i praktyczne, jest niezbędny. Guzy podskórne są łatwe do ustanowienia, ale trudne do wizualizowania i manipulowania. W tym protokole opisujemy metody generowania guzów śródskórnych, które zapewniają lepszą widoczność i dostępność.

Wszczepienie nowotworu śródskórnego jako solidny model badań nad immunoterapią guzów mysich wewnątrzguzikowych

Poznaj metodę analizy podzbiorów leukocytów naciekających nowotwór w podskórnym modelu guza myszy. Protokół obejmuje inokulację komórek melanoma B16, izolację zawiesiny komórkowej oraz cytometrię przepływową do oceny dynamiki komórek immunologicznych.

Ocena podzbiorów leukocytów naciekających nowotwór w podskórnym modelu guza

Przeglądaj więcej filmów