Name: Pomiar HPLC biomarkera utleniania DNA, 8-okso-7,8-dihydro-2-deoksyguanozyny, w hodowanych komórkach i tkankach zwierzęcych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 12 s
Description: Poznaj metodę HPLC-ED do wykrywania 8-okso-dGuo, biomarkera utleniania DNA, w hodowanych komórkach i tkankach zwierzęcych. Technika ta umożliwia precyzyjną ocenę uszkodzeń oksydacyjnych DNA.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

To badanie zostało sfinansowane przez Health Canada Genomics Research and Development Initiative (GRDI) oraz Canadian Regulatory Strategy for Biotechnology (CRSB). Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów.

<ol><li>Helbock, H. J., Beckman, K. B., Shigenaga, M. K., Walter, P. B., Woodall, A. A., Yeo, H. C., Ames, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+oxidation+matters%3A+The+HPLC-electrochemical+assay+of+8-oxo-deoxyguianosine+and+8-oxo-guanine%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">DNA oxidation matters: The HPLC-electrochemical assay of 8-oxo-deoxyguianosine and 8-oxo-guanine.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 95 (1), 288-293 (1998).</li>
<li>Valavanidis, A., Vlachogianni, T., Fiotakis, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((8-hydroxy-2%27+-deoxyguanosine+%288-OHdG%29%3A+A+critical+biomarker+of+oxidative+stress+and+carcinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Environ.+Sci+Health+C+Environ.+Carcinog.+Ecotoxicol.+Rev%22%5BJournal%5D)">8-hydroxy-2' -deoxyguanosine (8-OHdG): A critical biomarker of oxidative stress and carcinogenesis.</a> J. Environ. Sci Health C Environ. Carcinog. Ecotoxicol. Rev. 27 (2), 120-139 (2009).</li>
<li>Cadet, J., Bellon, S., Douki, T., Frelon, S., Gasparutto, D., Muller, E., Pouget, J. P., Ravanat, J. L., Romieu, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiation-induced+DNA+damage%3A+formation%2C+measurement%2C+and+biochemical+features%5BTitle%5D)+AND+%22J+Environ+Pathol+Toxicol+Oncol%22%5BJournal%5D)">Radiation-induced DNA damage: formation, measurement, and biochemical features.</a> J Environ Pathol Toxicol Oncol. 23 (1), 23-23 (2004).</li>
<li>Weiss, J. M., Goode, E. L., Ladiges, W. C., Ulrich, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymorphic+variation+in+hOGG1+and+risk+of+cancer%3A+a+review+of+the+functional+and+epidemiologic+literature%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Carcinog%22%5BJournal%5D)">Polymorphic variation in hOGG1 and risk of cancer: a review of the functional and epidemiologic literature.</a> Mol. Carcinog. 42 (3), 127-141 (2005).</li>
<li>Culp, S. J., Cho, B. P., Kadlubar, F. F., Evans, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+Conformational+Analyses+of+8-hydroxy-2%27-deoxyguanosine%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Res.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Structural and Conformational Analyses of 8-hydroxy-2'-deoxyguanosine.</a> Chem. Res. Toxicol. 2 (6), 416-422 (1989).</li>
<li>Cooke, M. S., Loft, S., Olinski, R., Evans, M. D., Bialkowski, K., Wagner, J. R., Dedon, P. C., Møller, P., Greenberg, M. M., Cadet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recommendations+for+standardized+description+of+and+nomenclature+concerning+oxidatively+damaged+nucleobases+in+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Res.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Recommendations for standardized description of and nomenclature concerning oxidatively damaged nucleobases in DNA.</a> Chem. Res. Toxicol. 23 (4), 705-707 (2010).</li>
<li>Jang, Y. H., Goddard, W. A. 3rd, Noyes, K. T., Sowers, L. C., Hwang, S., Chung, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First+principles+calculations+of+the+tautomers+and+pKa+values+of+8-oxoguanine%3A+implications+for+mutagenicity+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Res.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">First principles calculations of the tautomers and pKa values of 8-oxoguanine: implications for mutagenicity and repair.</a> Chem. Res. Toxicol. 15 (8), 1023-1035 (2002).</li>
<li>Park, J. -H., Gopishetty, S., Szewczuk, L. M., Troxel, A. B., Harvey, R. G., Penning, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+8-oxo-7%2C8-dihydro-2%27-deoxyguanosine+%288-oxo-dGuo%29+by+PAH+o-quinones%3A+involvement+of+reactive+oxygen+species+and+copper%28ii%29%2Fcopper%28i%29+redox+cycling%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Res.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Formation of 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine (8-oxo-dGuo) by PAH o-quinones: involvement of reactive oxygen species and copper(ii)/copper(i) redox cycling.</a> Chem. Res. Toxicol. 18 (6), 1026-1037 (2005).</li>
<li>Mangal, D., Vudathala, D., Park, J. H., Lee, S. H., Penning, T. M., Blair, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+7%2C8-dihydro-8-oxo-2%27-deoxyguanosine+in+cellular+DNA+during+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Res.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Analysis of 7,8-dihydro-8-oxo-2'-deoxyguanosine in cellular DNA during oxidative stress.</a> Chem. Res. Toxicol. 22 (5), 788-797 (2009).</li>
<li>Ravanat, J. L., Douki, T., Duez, P., Gremaud, E., Herbert, K., Hofer, T., Lasserre, L., Saint-Pierre, C., Favier, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+background+level+of+8-oxo-7%2C8-dihydro-2%27-deoxyguanosine%3A+an+isotope+based+method+to+evaluate+artefactual+oxidation+of+DNA+during+its+extraction+and+subsequent+work-up%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Cellular background level of 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine: an isotope based method to evaluate artefactual oxidation of DNA during its extraction and subsequent work-up.</a> Carcinogenesis. 23 (11), 1911-1918 (2002).</li>
<li>Gossen, J. A., De Leeuw, W. J. F., Tan, C. H. T., Zwarthoff, E. C., Berends, F., Lohman, P. H. M., Knook, D. L., Vijg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+rescue+of+integrated+shuttle+vectors+from+transgenic+mice%3A+A+model+for+studying+mutations+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Efficient rescue of integrated shuttle vectors from transgenic mice: A model for studying mutations in vivo.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86 (20), 7971-7975 (1989).</li>
<li>Test No. 488: Transgenic Rodent Somatic and Germ Cell Gene Mutation Assays. , Organisation for Economic Co-operation and Development (OECD). Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.oecd-ilibrary.org">http://www.oecd-ilibrary.org</a> (2015).</li>
<li>Van Campen, L. E., Murphy, W. J., Franks, J. R., Mathias, P. I., Toraason, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+DNA+damage+is+associated+with+intense+noise+exposure+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">Oxidative DNA damage is associated with intense noise exposure in the rat.</a> Hear Res. 164 (1-2), 164-161 (2002).</li>
<li>European Standards Committee on Oxidative DNA Damage (ESCODD). <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+DNA+oxidation+in+human+cells+by+chromatographic+and+enzymic+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic.+Biol.+Med%22%5BJournal%5D)">Measurement of DNA oxidation in human cells by chromatographic and enzymic methods.</a> Free Radic. Biol. Med. 34 (8), 1089-1099 (2003).</li>
<li>Rebelo, I. A., Piedade, J. A., Oliveira-Brett, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+HPLC+method+with+electrochemical+detection+of+femtomoles+of+8-oxo-7%2C8-dihydroguanine+and+8-oxo-7%2C8-dihydro-2%27-deoxyguanosine+in+the+presence+of+uric+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Talanta%22%5BJournal%5D)">Development of an HPLC method with electrochemical detection of femtomoles of 8-oxo-7,8-dihydroguanine and 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine in the presence of uric acid.</a> Talanta. 63 (2), 323-331 (2004).</li>
<li>Ravanat, J. -L., Turesky, R. J., Gremaud, E., Trudel, L. J., Stadler, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+8-oxoguanine+in+DNA+by+gas+chromatography-mass+spectrometry+and+HPLC-electrochemical+detection%3A+overestimation+of+the+background+level+of+the+oxidized+base+by+the+gas+chromatography-mass+spectrometry+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Res.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Determination of 8-oxoguanine in DNA by gas chromatography-mass spectrometry and HPLC-electrochemical detection: overestimation of the background level of the oxidized base by the gas chromatography-mass spectrometry assay.</a> Chem. Res. Toxicol. 8 (8), 1039-1045 (1995).</li>
<li>Kawanishi, S., Murata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+DNA+damage+induced+by+bromate+differs+from+general+types+of+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology%22%5BJournal%5D)">Mechanism of DNA damage induced by bromate differs from general types of oxidative stress.</a> Toxicology. 221 (2-3), 172-178 (2006).</li>
<li>Tahara, S., Kaneko, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Susceptibility+of+mouse+splenic+cells+to+oxidative+DNA+damage+by+x-ray+irradiation%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Pharm.+Bull%22%5BJournal%5D)">Susceptibility of mouse splenic cells to oxidative DNA damage by x-ray irradiation.</a> Biol. Pharm. Bull. 27 (1), 105-108 (2004).</li>
<li>Garratt, L. W., Mistry, V., Singh, R., Sandhu, J. K., Sheil, B., Cooke, M. S., Sly, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interpretation+of+urinary+8-oxo-7%2C8-dihydro-2%27-deoxyguanosine+is+adversely+affected+by+methodological+inaccuracies+when+using+a+commercial+ELISA%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic.+Biol.+Med%22%5BJournal%5D)">Interpretation of urinary 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine is adversely affected by methodological inaccuracies when using a commercial ELISA.</a> Free Radic. Biol. Med. 48 (11), 1460-1464 (2012).</li>
<li>Cooke, M. S., Collins, A., Olinski, R., Rozalski, R., Loft, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harmonising+measurements+of+8-oxo-7%2C8-dihydro-2%E2%80%B2-deoxyguanosine+in+cellular+DNA+and+urine%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic.+Res%22%5BJournal%5D)">Harmonising measurements of 8-oxo-7,8-dihydro-2′-deoxyguanosine in cellular DNA and urine.</a> Free Radic. Res. 46 (4), 541-553 (2012).</li>
<li>Cadet, J., Douki, T., Ravanat, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+oxidatively+generated+base+damage+in+cellular+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res%22%5BJournal%5D)">Measurement of oxidatively generated base damage in cellular DNA.</a> Mutat Res. 711 (1-2), 3-12 (2011).</li>
<li>Chomczynski, P., Mackey, K., Drews, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNAzol%3A+a+reagent+for+the+rapid+isolation+of+genomic+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">DNAzol: a reagent for the rapid isolation of genomic DNA.</a> Biotechniques. 22 (3), 550-553 (1997).</li>
<li>Collins, A. R., Cadet, J., Möller, L., Poulsen, H. E., Viña, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Are+we+sure+we+know+how+to+measure+8-oxo-7%2C8-dihydroguanine+in+DNA+from+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Biochem+Biophys%22%5BJournal%5D)">Are we sure we know how to measure 8-oxo-7,8-dihydroguanine in DNA from human cells.</a> Arch Biochem Biophys. 423 (1), 57-65 (2004).</li>
<li>Badouard, C., Ménézo, Y., Panteix, G., Ravanat, J. L., Douki, T., Cadet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+new+types+of+DNA+lesions+in+human+sperm%5BTitle%5D)+AND+%22Zygote%22%5BJournal%5D)">Determination of new types of DNA lesions in human sperm.</a> Zygote. 16 (1), 9-13 (2008).</li>
<li>Cadet, J., Douki, T., Gasparutto, D., Ravanat, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+damage+to+DNA%3A+formation%2C+measurement+and+biochemical+features%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res%22%5BJournal%5D)">Oxidative damage to DNA: formation, measurement and biochemical features.</a> Mutat Res. 531 (1-2), 1-2 (2003).</li>
<li>Validation of analytical procedures: text and methodology Q2(R1). International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use (ICH), 2015 Mar 1, San Diego, CA, , Available at: <a target="_blank" href="http://www.ich.org/fileadmin/Public_Web_Site/ICH_Products/Guidelines/Quality/Q2_R1/Step4/Q2_R1__Guideline.pdf">http://www.ich.org/fileadmin/Public_Web_Site/ICH_Products/Guidelines/Quality/Q2_R1/Step4/Q2_R1__Guideline.pdf</a> (2015).</li>
</ol>

Nie stwierdzono konfliktu interesów ani konkurencyjnych interesów finansowych.

Chociaż 8-oxo-dGuo został zgłoszony jako użyteczny biomarker utleniania DNA, jego wiarygodna kwantyfikacja może stanowić wyzwanie. Chociaż istnieje kilka opublikowanych metod, istnieje potrzeba kompleksowego, opisowego przeglądu protokołu, aby umożliwić naukowcom wdrożenie metody w swoich laboratoriach. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy przegląd protokołu opartego na HPLC, który pozwoli nowym użytkownikom ustalić skuteczną metodę wykrywania i oznaczania ilościowego 8-oxo-dGuo.
Trzy główn...

Reaktywne formy tlenu (ROS), których poziom w stanie stacjonarnym może wzrastać podczas wielu stanów patologicznych i ksenotoksycznego metabolizmu, przyczyniają się do zwiększonej częstotliwości uszkodzeń oksydacyjnych DNA. Wśród kilku możliwych produktów utleniania zasad nukleotydowych, oksydacyjne uszkodzenie DNA można łatwo zmierzyć za pomocą stabilnego markera 8-okso-7,8-dihydro-2'-deoksyguanozyny (8-okso-dGuo), który jest jedną z utlenionych form 2'-deoksyguanozyny (dGuo)1. 8-oxo-dGuo jest najliczniejszą zmianą DNA2 i dlatego została zbadana bardziej szczegółowo jako biomarker utleniania DNA, pomimo istnienia wielu produktów utleniania DNA 3. U ludzi uszkodzenie to można naprawić poprzez naprawę przez wycięcie zasady przez glikozylazę 8-oksoguaninową 1 (hOGG1)4. Jeśli nie zostanie naprawiony, 8-oxo-dGuo może przyczyniać się do powstawania mutacji substytucji par zasad (tj. transwersji G do T)4. Co ważne, 8-oxo-dGuo jest uznanym markerem uszkodzenia DNA w odniesieniu do inicjacji i promocji kancerogenezy2. Dlatego dokładna kwantyfikacja 8-oxo-dGuo jest użytecznym i pożądanym biomarkerem oksydacyjnego uszkodzenia DNA5.
W literaturze panuje powszechne zamieszanie co do prawidłowych nazw dla uszkodzonych oksydacyjnie form 2-deoksyguanozyny, a ponadto poprawnej nazwy związku (związków) rutynowo mierzonego jako biomarker oksydacyjnego uszkodzenia DNA6. 6,8-diketo i 6-enol,8-keto tautomeryczne formy 8-oxo-dGuo (pokazane na rysunku 1) są dwoma najważniejszymi tautomerami omawianymi w literaturze5,7. Forma 6,8-diketo jest najbardziej znaną formą o fizjologicznym pH 7,4 i jest najbardziej widocznym produktem utleniania DNA7. Dlatego 8-oxo-dGuo, a nie 8-hydroksy-dGuo, jest najbardziej odpowiednią nazwą dla tego produktu utleniania6. Ważne jest również, aby zauważyć, że 2-deoksyguanozyna (dGuo), a nie guanina nukleotydowa (Gua) lub guanozyna rybonukleozydowa (Guo), odpowiednio, jest wykrywana przez większość metod6.
Dokładne wykrywanie i oznaczanie ilościowe 8-oxo-dGuo jest wyzwaniem ze względu na: i) zmienność trawienia próbki DNA, ii) przypadkowe utlenianie dGuo do 8-oxo-dGuo, które może wystąpić podczas przygotowywania próbki, oraz iii) potrzebę skutecznej walidacji analitycznej metody HPLC-ED8. W tym protokole dążyliśmy do osiągnięcia i) poprzez zapewnienie warunków sprzyjających całkowitemu trawieniu DNA oraz ii) poprzez włączenie chelatora metalu i roztworów traktowanych chelatorem oraz specjalnego odczynnika izolującego DNA, podczas gdy iii) tylko częściowo rozwiązano problem poprzez włączenie kontroli pozytywnych, a tym samym zapewnienie, że metoda jest w stanie wykryć 8-oxo-dGuo w próbkach biologicznych. Dalsza walidacja wykracza poza zakres tego dokumentu. Jesteśmy jednak przekonani, że protokół ten pomoże potencjalnym użytkownikom określić zakres, w jakim muszą formalnie zweryfikować protokół, w zależności od ich celów. Wykaz kroków wymaganych do formalnej walidacji metody znajduje się w dalszej części. W trakcie opracowywania i wdrażania metody wykrywania 8-oxo-dGuo dokonano przeglądu i konsolidacji opublikowanych metod. W związku z tym metoda ta eliminuje potrzebę zbierania informacji z kilku opublikowanych źródeł, w których często brakuje ważnych szczegółów eksperymentalnych, a jednocześnie zapewnia szybkie i proste środki testowania, jeśli metoda wykrywania i oznaczania ilościowego 8-oxo-dGuo została przyjęta z powodzeniem. Ta zaadaptowana metoda została wykorzystana do pomyślnej analizy próbek DNA z hodowanych komórek i tkanek mysich. Ten artykuł wideo pomoże innym grupom w ustaleniu skutecznej metody wiarygodnego wykrywania i oznaczania ilościowego 8-oxo-dGuo za pomocą HPLC-ED.

<table><tbody><tr><td>8-oxo-dGuo standard</td><td>Cayman Chemical Company</td><td>89320</td><td>Niewłaściwie określany jako "8-hydroksy-2'-deoksyguanozyna"; patrz Rys. 1 i tekst, aby uzyskać szczegółowe informacje.</td></tr><tr><td>Fosfataza alkaliczna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5931</td><td>Z E. coli</td></tr><tr><td>Chelex 100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7901</td><td>Chelaty metali ciężkich</td></tr><tr><td>Mesylan desferoksaminy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9533</td><td></td></tr><tr><td>wzorzec dGuo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D7145</td><td></td></tr><tr><td>Dwuzasadowy fosforan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9390</td><td></td></tr><tr><td>DNA z nasienia łososia</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1626</td><td>Sól sodowa</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4527</td><td>TypeII, z trzustki bydła</td></tr><tr><td>DNAzol</td><td>Invitrogen</td><td>10503-27</td><td></td></tr><tr><td>Sól disodowa dwuwodnego kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4884</td><td>Związek nie rozpuści się całkowicie, dopóki pH roztworu nie zostanie dostosowane do 8,0 (np. z pożywką NaOH)</td></tr><tr><td>F12-K</td><td>ATCC</td><td>30-2004</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td><td>płodu ATCC</td><td>30-2020</td><td></td></tr><tr><td>Kolumna ochronna</td><td>Specjalności chromatograficzne</td><td>YBA 99S03 0204GC</td><td>Chroni kolumnę przed zanieczyszczeniem; może również prowadzić do wzrostu ciśnienia</td></tr><tr><td>Chlorek magnezu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Monozasadowy fosforan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami</td><td>Invitrogen</td><td>15190-250</td><td></td></tr><tr><td>Enzym fosfodiesterazy I&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3243</td><td>Typ II z homogenizatora teflonowego jadu Crotalus adamaneus</td></tr><tr><td></td><td>Thomas Scientific</td><td>7724T-1 lub 7724T-5 odpowiednio na 1 lub 5 ml</td><td>Objętość (zdolność przechowywania) zależy od ilości próbki do przetworzenia.</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Invitrogen</td><td>15050-065</td><td></td></tr><tr><td>Kolumna YMC-BASIC ze spoiwą sferyczną krzemionką</td><td>Specjalności chromatograficzne</td><td>YBA 99S03 1546WT</td><td></td></tr></tbody></table>

pomiar hplc biomarkera utleniania dna, 8-okso-7,8-dihydro-2'-deoksyguanozyny, w hodowanych komórkach i tkankach zwierzęcych

HPLC Measurement of the DNA Oxidation Biomarker, 8-oxo-7,8-dihydro-2&#8217;-deoxyguanosine, in Cultured Cells and Animal Tissues

Stres oksydacyjny jest związany z wieloma procesami fizjologicznymi i patologicznymi, a także metabolizmem ksenobiotyków, co prowadzi do utleniania biomakromolekuł, w tym DNA. Dlatego skuteczne wykrywanie utleniania DNA jest ważne dla różnych dyscyplin badawczych, w tym medycyny i toksykologii. Powszechnym biomarkerem DNA uszkodzonego oksydacyjnie jest 8-okso-7,8-dihydro-2'-deoksyguanozyna (8-okso-dGuo; często błędnie określana jako 8-hydroksy-2'-deoksyguanozyna (8-OH-dGuo lub 8-oxo-dG)). Opisano kilka protokołów pomiaru 8-oxo-dGuo metodą wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej z detekcją elektrochemiczną (HPLC-ED). Stosowano je jednak głównie do oczyszczonego DNA poddanego działaniu prooksydantów. Ponadto, ze względu na różnice metodologiczne między laboratoriami, głównie wynikające z różnic w sprzęcie analitycznym, przyjęcie opublikowanych metod wykrywania 8-oxo-dGuo za pomocą HPLC-ED wymaga starannej optymalizacji przez każde laboratorium. Brakuje kompleksowego protokołu, opisującego taki proces optymalizacji. Tutaj opisano szczegółowy protokół wykrywania 8-oxo-dGuo za pomocą HPLC-ED, w DNA z hodowanych komórek lub tkanek zwierzęcych. Ilustruje on, w jaki sposób można łatwo i szybko zoptymalizować przygotowanie próbki DNA, aby zminimalizować niepożądane utlenianie DNA, które może wystąpić podczas przygotowywania próbki. Protokół ten pokazuje, jak wykryć 8-oxo-dGuo w hodowanych ludzkich komórkach gruczolakoraka pęcherzyków płucnych (tj. komórkach A549) traktowanych środkiem utleniającym KBrO3 oraz w śledzionie myszy narażonych na wielopierścieniowy węglowodór aromatyczny dibenzo(def,p)chryzen (DBC, wcześniej znany jako dibenzo(a,l)piren, DalP). Ogólnie rzecz biorąc, praca ta ilustruje, w jaki sposób metodologia HPLC-ED może być łatwo zoptymalizowana pod kątem wykrywania 8-oxo-dGuo w próbkach biologicznych.

Zaobserwowano, że dGuo ma czas retencji wynoszący 4,7 min, podczas gdy 8-oxo-dGuo ma czas retencji około 6,4 min (Rycina 2A i B). Jak widać na Rycini 2C, wysokości pików dla tych dwóch analitów różnią się około 1000-krotnie. Woltamogramy dla 8-oxo-dGuo i dGuo uzyskano poprzez pomiar wzorców przy potencjale roboczym w zakresie od +0,2 do +1,1 V. Optymalny potencjał roboczy dla 8-oxo-dGuo określono jako +0,5 V, a dla dGuo jako +0,9 V (Rycina 3). Potencjały...

Celem tego protokołu jest wykrycie markera utleniania DNA, 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoksyguanozyny (8-oxo-dGuo) przez HPLC-ED, w DNA z hodowanych komórek lub tkanek zwierzęcych.

Pomiar HPLC biomarkera utleniania DNA, 8-okso-7,8-dihydro-2'-deoksyguanozyny, w hodowanych komórkach i tkankach zwierzęcych

Oxidative stress is associated with many physiological and pathological processes, as well as xenobiotic metabolism, leading to the oxidation of ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wykrycie i ilościowe oznaczenie produktu utleniania DNA, 8-oxo-dG, w próbkach biologicznych za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej z detekcją elektrochemiczną (HPLC-ED). Osiąga się to poprzez izolację próbki DNA z materiału biologicznego, a następnie całkowitą trawienie DNA w sposób minimalizujący niepożądane utlenianie DNA, które może wystąpić podczas przygotowania próbki, dzięki zastosowaniu chelatora metali i specjalnego odczynnika do izolacji DNA. Następnie optymalizuje się warunki prowadzenia analizy HPLC-ED i sporządza krzywe wzorcowe dla 8-oxo-dG oraz 2-primed dioxazine.Ostatnim krokiem jest analiza trawionego DNA w serii z czystym 8-ODDG oraz 2'-dezoksyguanozyną za pomocą układu HPLC, w celu wyznaczenia stosunku 8-ODDG do 2'-dezoksyguanozyny w badanych próbkach trawionego DNA. Ostatecznie detekcja i kwantyfikacja 8-ODDG za pomocą HPLEC-ED służy do określenia stopnia utlenienia DNA w próbkach biologicznych. Główną zaletą tej techniki w stosunku do istniejących metod jest to, że konsoliduje ona wszystkie istotne informacje z kilku opublikowanych źródeł, zapewniając jednocześnie szybki i prosty sposób sprawdzenia skuteczności

hplc-measurement-dna-oxidation-biomarker-8-oxo-78-dihydro-2

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

Pomiar HPLC biomarkera utleniania DNA, 8-okso-7,8-dihydro-2’-deoksyguanozyny, w hodowlach komórkowych i tkankach zwierzęcych

Chemia biomimetyczna oparta na rodnikach została zastosowana do tworzenia bibliotek niezbędnych do rozwoju biomarkerów.

Wolne rodniki w biologii chemicznej: od zachowania chemicznego do rozwoju biomarkerów

Opisujemy tutaj metody czułego i dokładnego oznaczania zmian 8-okso-7,8-dihydro-2'-deoksyguanozyny (8-oxodGuo), 1,N 6-etheno-2'-deoksyadenozyny (1,N 6-dAdo) i 1,N 2-etheno-2'-deoksyguanozyny (1,N 2-dGuo) w DNA. Metody te zastosowano do oceny wpływu drobnego pyłu zawieszonego (PM2,5) w tkankach (płuca, wątroba i nerki) narażonych myszy A/J.

Kwantyfikacja trzech zmian DNA za pomocą spektrometrii mas i ocena ich poziomów w tkankach myszy narażonych na działanie drobnego pyłu zawieszonego w otoczeniu

Ten protokół opisuje skuteczną metodę ilościowego wykrywania uszkodzeń oksydacyjnych DNA w komórkach MCF-7 za pomocą technologii ELISA.

Kwantyfikacja poziomu 8-oxo-dG za pomocą testu ELISA do oceny oksydacyjnych uszkodzeń DNA w komórkach MCF-7

Kursy czasowe aktywności glikozylazy DNA 8-oksoguaniny są dwufazowe, wykazując gwałtowne tworzenie produktu i liniową fazę stanu ustalonego. Wykorzystując techniki przepływu gaszącego, można zmierzyć szybkość rozerwania i stanu ustalonego, które odpowiadają odpowiednio wycięciu 8-oksoguaniny i uwolnieniu glikozylazy z DNA produktu.

Pomiar kinetyczny w stanie ustalonym, przed stanem ustalonym i pojedynczym obrotem dla aktywności glikozylazy DNA

Origami DNA to potężna metoda wytwarzania precyzyjnych obiektów w nanoskali poprzez programowanie samoorganizacji cząsteczek DNA. Tutaj opisujemy protokół składania robota reagującego biologicznie z origami DNA, jego oczyszczania i barwienia ujemnego do obrazowania pod mikroskopem elektronowym transmisyjnym (TEM).

Składanie i charakterystyka bioresponsywnego robota z DNA Origami

Opisany tutaj protokół reprezentuje łatwą i powtarzalną metodę, która wykorzystuje wysokosprawną chromatografię cieczową z odwróconymi fazami (RP-HPLC) do pomiaru metabolizmu puryn na komórkach przewlekłej białaczki limfocytowej (CLL) hodowanych w różnych warunkach.

Test oparty na HPLC do monitorowania zewnątrzkomórkowego metabolizmu nukleotydów/nukleozydów w ludzkich komórkach przewlekłej białaczki limfocytowej

Przedstawiono protokół unikania utleniania substratów metalicznych podczas przenoszenia próbki z inhibitowanego roztworu kwaśnego do rentgenowskiego spektrometru fotoelektronów.

Określanie składu chemicznego inhibitora korozji/granicy faz metalu za pomocą XPS: minimalizacja utleniania po zanurzeniu

Opisujemy proces produkcji i testowania termometrów fotonicznych.

Produkcja i testowanie termometrów fotonicznych

Obecna metoda służy do identyfikacji specyficznych dla izoform inhibitorów deacetylaz histonowych (HDAC) w komórkach HeLa za pomocą analizy UHPLC-MS wielu substratów. Jest to metoda wolna od przeciwciał opracowana w celu odzwierciedlenia aktywności HDAC1 i HDAC6 w środowisku żywych komórek, w przeciwieństwie do testów bezkomórkowych z pojedynczymi izoformami.

Jednoczesny pomiar aktywności HDAC1 i HDAC6 w komórkach HeLa za pomocą UHPLC-MS

Ten protokół opisuje syntezę cząstek magnetycznych i ocenę ich właściwości wiązania DNA za pomocą dynamicznego i elektroforetycznego rozpraszania światła. Metoda ta koncentruje się na monitorowaniu zmian wielkości cząstek, ich polidyspersyjności i potencjału zeta powierzchni cząstek, które odgrywają główną rolę w wiązaniu materiałów takich jak DNA.

Analiza wiązania cząstek DNA-magnetycznych za pomocą dynamicznego i elektroforetycznego rozpraszania światła

Poznaj metodę HPLC-ED do wykrywania 8-okso-dGuo, biomarkera utleniania DNA, w hodowanych komórkach i tkankach zwierzęcych. Technika ta umożliwia precyzyjną ocenę uszkodzeń oksydacyjnych DNA.

Pomiar HPLC biomarkera utleniania DNA, 8-okso-7,8-dihydro-2'-deoksyguanozyny, w hodowanych komórkach i tkankach zwierzęcych

Przeglądaj więcej filmów