Name: Izolacja i przeszczep różnych wiekowych mysich przeszczepów grasicy. (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 47 s
Description: Naucz się izolacji i przeszczepu grasicy mysiej do immunodeficytnych biorców w celu analizy in vivo rozwoju komórek T. Metoda umożliwia badanie selekcji tymicznej i ontogenezy limfocytów T.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez fundusze otrzymane od National Institutes of Health (1R01AI083269).

Badania na myszach zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Ich Użytkowania (IACUC) Uniwersytetu Karoliny Północnej w Chapel Hill, a cała opieka nad zwierzętami była zgodna z wytycznymi IACUC.
1. Przygotowanie noworodka i dorosłego Thymi
<ol>
	<li>Przygotuj wszystkie odczynniki i sprzęt przed eutanazją myszy dawców.</li>
	<li>Sterylizuj narzędzia chirurgiczne w autoklawie lub innymi odpowiednimi metodami. Wszystkie zabiegi chirurgiczne muszą być wykonywane pod kapturem z przepływem laminarnym, aby utrzymać sterylne warunki i uniknąć zanieczyszczenia. Zbierz narzędzia potrzebne do ekstrakcji thymi od myszy dawców.</li>
	<li>Napełnij naczynie o średnicy 60 mm sterylnym 1x PBS (pH 7,4) i umieść na lodzie wewnątrz okapu. Będzie on używany do krótkiego przechowywania thymi wyciętej od myszy dawców przed przeszczepem.</li>
	<li>Zgodnie z wytycznymi etycznymi, nowonarodzone myszy dawcy należy poddać eutanazji przez dekapitację, a dorosłe myszy dawców przez uduszenie CO2, a następnie zwichnięcie szyjki macicy.</li>
	<li>Do usunięcia grasicy: Połóż mysz w pozycji grzbietowej leżącej na sterylnym chłonnym ręczniku papierowym i spryskaj 70% etanolem przed wykonaniem nacięcia.</li>
	<li>Odsłoń jamę brzuszną i klatkę piersiową, wykonując nacięcie w linii środkowej skóry. Zawiń skórę na klatce piersiowej i kończynach przednich, aby odsłonić jamę piersiową.</li>
	<li>Wykonaj dwa boczne nacięcia przez przeponę i klatkę piersiową, aby odsłonić górne śródpiersie i przednią jamę piersiową. Grasica powinna być widoczna jako dwa białe płaty znajdujące się bezpośrednio nad sercem i przylegające do niego.</li>
	<li>Rozerwij tkankę łączną otaczającą grasicę cienkimi kleszkami, uważając, aby nie naruszyć kapsułki. Przytrzymując klatkę piersiową kleszczami, użyj drugiej pary kleszczy, aby wydobyć dwa płaty grasicy, umieszczając zakrzywione kleszcze pod narządem i ciągnąc pionowo. Można to zrobić za pomocą lunety preparacyjnej do ekstrakcji thymi od nowonarodzonych myszy.</li>
	<li>Umieścić grasicę w naczyniu o średnicy 60 mm zawierającym sterylny 1x PBS (pH 7,4) na lodzie i oddzielić płaty grasicy, przecinając przesmyk łączny. Usuń wszelkie zanieczyszczenia z płatów grasicy, upewniając się, że nie uszkodzisz kapsułki, i pokrój grasicę na odpowiednią liczbę odcinków do przeszczepu.</li>
	<li>Nie należy manipulować thymi uzyskaną od nowonarodzonych myszy. 
	UWAGA: Używany dla maksymalnie dwóch myszy biorcy (1 płat na odbiorcę).</li>
	<li>Przeszczep thymi uzyskaną od dorosłych myszy maksymalnie 4-6 myszom biorcy. Za pomocą kleszczy ostrożnie chwyć jeden dorosły płat grasicy, jak pokazano na rycinie 1, pokrój grasicę na trzy równe części za pomocą nożyczek chirurgicznych.</li>
	<li>Powtórz kroki 1.3-1.4 dla każdej myszy dawcy. W celu ograniczenia czasu ekspozycji tych grasic należy przygotować jednorazowo 1 grasicę dawcy.</li>
</ol>
2. Implantacja grasicy pod torebką nerkową
<ol>
	<li>Zmontuj wstępnie wysterylizowany sprzęt wymieniony w Tabeli 1. W trakcie zabiegu należy stosować odpowiednią technikę aseptyczną, aby zapobiec narażeniu biorców przeszczepów na kontakt ze skażonymi narzędziami lub odczynnikami.</li>
	<li>Przed przeszczepem należy zważyć i oznaczyć każdą mysz biorcę.</li>
	<li>Ustaw mikroskop preparacyjny i obwód znieczulenia w okapie z przepływem laminarnym.</li>
	<li>Za pomocą elektrycznej maszynki do golenia ogol lewą stronę myszy biorcy i upewnij się, że wokół obszaru użytego do wykonania nacięcia nie pozostały żadne włosy.</li>
	<li>Włącz waporyzator izofluorowy i znieczul mysz dawką 1-2%. Upewnij się, że należy znieczulić pacjenta przed rozpoczęciem zabiegu chirurgicznego, sprawdzając, czy nie ma odruchu po uszczypnięciu palca</li>.
	<li>Po odpowiednim znieczuleniu myszy nałóż maść weterynaryjną na oczy myszy, aby zapobiec wysuszeniu i przygotuj mysz do przeszczepu w następujący sposób:</li>
	<li>Umieść mysz pod mikroskopem preparacyjnym w prawej bocznej pozycji leżącej, tak aby ogolona strona była skierowana do góry. Zaczynając od środka pola operacyjnego, dozuj okrężnymi ruchami za pomocą jednorazowej pipety transferowej 70% etanolu, a następnie powidonu-jodu (betadyny). Powtórz zabieg etanolem/betadyną 3 razy przed wykonaniem nacięcia.</li>
	<li>Za pomocą nożyczek preparacyjnych wykonaj 1-2 cm nacięcie boku bezpośrednio nad nerką.</li>
	<li>Za pomocą średnich kleszczy chwyć tkankę łączną przylegającą do nerki i delikatnie unieś nerkę tak, aby leżała na szczycie mięśni. Aby nerka była odsłonięta i znajdowała się na miejscu nad mięśniami, należy włożyć jedno ramię średnich kleszczy pod nerkę, zwracając szczególną uwagę, aby nie naruszyć kości biodrowej nerki.</li>
	<li>Aby zapobiec wysuszeniu tkanek, należy przepłukać nerkę sterylnym 1x PBS (pH 7,4) podczas każdego etapu, aż do zakończenia manipulacji nerką i torebką nerkową.</li>
	<li>Za pomocą cienkich kleszczy ściśnij i podnieś kapsułkę w pobliżu krawędzi nerki najbardziej dystalnej do nadnerczy, aby oddzielić ją od nerki.</li>
	<li>Użyj igły o rozmiarze 18, aby wykonać nacięcie wystarczająco duże, aby wprowadzić przygotowany kawałek grasicy dawcy (ryc. 2A). Upewnij się, że nacięcie torebki jest jak najmniejsze, aby zapobiec przemieszczeniu przeszczepu w czasie.</li>
	<li>Trzymając torebkę odciągniętą od nerki, użyj drugiej pary cienkich kleszczy, aby wprowadzić przeszczep pod kapsułkę i popchnąć grasicę jak najdalej do przodu od nacięcia torebki (ryc. 2B).</li>
	<li>Usuń kleszcze spod nerki i delikatnie przywróć nerkę z powrotem na miejsce przez nacięcie.</li>
	<li>Zamknij mięśnie, zszywając ścianę otrzewnej i nakładając betadynę po zamknięciu. Po zakończeniu szycia przyłóż klipsy do ran, aby zamknąć skórę właściwą i nałóż betadynę na okolicę.</li>
	<li>Umieść mysz z powrotem w klatce, która została ogrzana za pomocą lampy grzewczej.</li>
	<li>Monitoruj każdą mysz pooperacyjną, aż odzyska pełną przytomność i mobilność, i nie umieszczaj myszy, które nie wyzdrowiały po znieczuleniu, w klatce z innymi zwierzętami.</li>
	<li>W razie potrzeby należy leczyć myszy lekami przeciwbólowymi pooperacyjnymi. Podawaj myszom pooperacyjne leki przeciwbólowe, takie jak paracetamol, w wodzie do picia w stężeniu 1,6 mg/ml.</li>
	<li>Powtórz kroki 2.3-2.9 dla każdej myszy odbiorcy.</li>
	<li>Upewnij się, że myszy powrócą do normalnej aktywności w ciągu 1 godziny po operacji. Monitoruj pooperacyjną masę ciała, zdolności motoryczne, a także picie i karmienie każdej myszy, aby określić powikłania powstałe w wyniku zabiegu przeszczepu. 
	UWAGA: Pooperacyjna utrata masy ciała w porównaniu z masą ciała sprzed operacji, a także zaburzenia ruchomości lub niejedzenie lub picie mogą wskazywać na powikłania.</li>
	<li>Monitoruj rekonstytucję limfocytów T we krwi obwodowej przez krwawienie myszy przez nacięcie ogona, a następnie oddzielenie limfocytów za pomocą pożywki do separacji komórek limfolitów zgodnie ze specyfikacjami producenta. Dokonaj charakterystyki limfocytów T poprzez barwienie limfocytów fluorescencyjnie sprzężonymi przeciwciałami specyficznymi dla markerów komórek T CD3, CD4 i CD8, a także żywym martwym dyskryminatorem, takim jak fluorescencyjnie aktywowany ester sukcynimidylu8. Analizę, jak pokazano na rysunku 3, można przeprowadzić poprzez bramkowanie na singletach, żywych komórkach i komórkach CD3-dodatnich.</li>
</ol>

<ol><li>Kappler, J. W., Roehm, N., Marrack, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+tolerance+by+clonal+elimination+in+the+thymus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">T cell tolerance by clonal elimination in the thymus.</a> Cell. 49 (2), 273-280 (1987).</li>
<li>Takahama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Journey+through+the+thymus%3A+stromal+guides+for+T-cell+development+and+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Journey through the thymus: stromal guides for T-cell development and selection.</a> Nat. Rev. Immunol. 6, 127-135 (2006).</li>
<li>Klein, L., Kyewski, B., Allen, P. M., Hogquist, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive+and+negative+selection+of+the+T+cell+repertoire%3A+what+thymocytes+see+%28and+don%E2%80%99t+see%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Positive and negative selection of the T cell repertoire: what thymocytes see (and don’t see).</a> Nat. Rev. Immunol. 14 (6), 377-391 (2014).</li>
<li>Schwartz, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acquisition+of+immunologic+self-tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Acquisition of immunologic self-tolerance.</a> Cell. 57 (7), 1073-1081 (1989).</li>
<li>Kishimoto, H., Sprent, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+defect+in+central+tolerance+in+NOD+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">A defect in central tolerance in NOD mice.</a> Nat. Immunol. 2 (11), 1025-1031 (2001).</li>
<li>Anderson, G., Jenkinson, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+central+tolerance+with+reaggregate+thymus+organ+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Investigating central tolerance with reaggregate thymus organ cultures.</a> Methods. Mol. Biol. 380, 185-196 (2007).</li>
<li>He, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thymic+development+of+autoreactive+T+cells+in+NOD+mice+is+regulated+in+an+age-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Thymic development of autoreactive T cells in NOD mice is regulated in an age-dependent manner.</a> J. Immunol. 191 (12), 5858-5866 (2013).</li>
<li>Stewart, C. C., Stewart, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+6.+Immunophenotyping%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cytometry%22%5BJournal%5D)">Chapter 6. Immunophenotyping.</a> Current Protocols in Cytometry. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).</li>
<li>Rice, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thymic+transplantation+for+complete+DiGeorge+syndrome%3A+medical+and+surgical+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pediatr.+Surg%22%5BJournal%5D)">Thymic transplantation for complete DiGeorge syndrome: medical and surgical considerations.</a> J. Pediatr. Surg. 39 (11), 1607-1615 (2004).</li>
<li>Markert, M. L., et al. Transplantation of thymus tissue in complete DiGeorge Syndrome. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMarkert%2C+ML+%22N.+Engl.+J.+Med%22">N. Engl. J. Med</a>. 341, 1180-1189 (1999).</li>
<li>Market, M. L., Devlin, B. H., McCarthy, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thymus+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Thymus transplantation.</a> Clin. Immunol. 135 (2), 236-246 (2010).</li>
<li>Wells, A. D., Li, X., Strom, T. B., Turka, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+peripheral+T-cell+depletion+in+transplantation+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Philos.+Trans.+R.+Soc.+Lond.+B.+Biol.+Sci%22%5BJournal%5D)">The role of peripheral T-cell depletion in transplantation tolerance.</a> Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 356 (1409), 617-623 (2001).</li>
<li>Albuquerque, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+FOXN1-Deficiency+is+associated+with+ab+double-negative+and+FoxP3%2B+T-cell+expansions+that+are+distinctly+modulated+upon+thymic+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Human FOXN1-Deficiency is associated with ab double-negative and FoxP3+ T-cell expansions that are distinctly modulated upon thymic transplantation.</a> PLoS One. 7 (5), e37042(2012).</li>
<li>Chinn, I. K., Milner, J. D., Scheinberg, P., Douek, D. C., Markert, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thymus+transplantation+restores+the+repertoires+of+forkhead+box+protein+3+%28FoxP3%29%2B+and+FoxP3-+T+cells+in+complete+DiGeorge+anomaly%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Immunol%22%5BJournal%5D)">Thymus transplantation restores the repertoires of forkhead box protein 3 (FoxP3)+ and FoxP3- T cells in complete DiGeorge anomaly.</a> Clin Exp Immunol. 173 (1), 140-149 (2013).</li>
<li>Savino, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+thymus+is+a+common+target+organ+in+infectious+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">The thymus is a common target organ in infectious diseases.</a> PLoS Pathog. 2 (6), e62(2006).</li>
</ol>

Autorzy nie mają żadnych konkurencyjnych interesów finansowych do ujawnienia.

Zdarzenia regulujące dobór grasicy są słabo poznane. Ostatnie badania wykazały ontogenne zmiany w efektywności selekcji. Połączenie tego podejścia z różnymi transgenicznymi myszami dawcami i biorcami grasicy jeszcze bardziej ułatwi badania mające na celu zidentyfikowanie zdarzeń i parametrów regulujących selekcję grasicy. W szczególności przeszczep grasicy jest stosowany w leczeniu i leczeniu limfocytów T i zaburzeń grasicy obserwowanych na przykład u niemowląt z atymią pozbawionych funkcjonalnych limfocytów T oraz u pac...

Grasica jest organem, w którym zachodzą krytyczne zdarzenia w rozwoju limfocytów T1. Rezydujące tymocyty, po rearanżacji receptora limfocytów T (TCR) α i genów β, przechodzą szereg interakcji z komórkami limfoskopalnymi i prezentującymi antygen (APC) w obszarach korowych i rdzeniowych grasicy2. Selekcja grasiczo-dodatnia odbywa się za pośrednictwem komórek nabłonka grasicy korowej (TEC) w celu wytworzenia tymocytów, które rozpoznają peptydy antygenowe w kontekście cząsteczek głównego kompleksu zgodności tkankowej gospodarza (MHC) klasy I i II2-3. Późniejsza selekcja ujemna grasicy pociąga za sobą oczyszczanie z autoreaktywnych tymocytów, napędzane przez interakcję z rdzeniastym TEC lub komórkami dendrytycznymi (DC), które prezentują peptydy pochodzące z własnych białek związanych przez cząsteczki MHC klasy I i II3. Efektem końcowym tych procesów jest stworzenie puli dojrzałych limfocytów T CD4+ i CD8+, zdolnych do reagowania na szerokie spektrum obcych antygenów, wykazując przy tym minimalną reaktywność na własne białka4.
Na skuteczność zdarzeń selekcji grasicy wpływa wiele czynników, w tym dojrzewanie grasicy, częstotliwość TEC rdzeniastego i korowego, skład podzbioru DC grasicy oraz źródło prekursorów grasicy3. Warto zauważyć, że nieprawidłowa selekcja grasicy może powodować patologieautoimmunologiczne5 lub patologie z niedoborem odporności, które wynikają odpowiednio z upośledzonej selekcji negatywnej lub pozytywnej. Zdarzenia molekularne regulujące selekcję grasicy są jednak słabo poznane. Podejścia in vitro, takie jak reagregacja hodowli narządów grasicy (RTOC)6, okazały się przydatne do analizy podstawowych zdarzeń związanych z selekcją grasicy, ale nie są w stanie w pełni podsumować dynamiki trwających zdarzeń in vivo. W rezultacie, to podejście oparte na przeszczepie grasicy zostało opracowane, aby lepiej badać zdarzenia selekcji tymocytów in vivo7.
Ten protokół opisuje przeszczepianie thymi od nowonarodzonych i dorosłych myszy dawców do myszy biorców z niedoborem odporności. Technika ta pozwala na badanie mechanizmów regulujących pozytywną i negatywną selekcję grasicy, a także produkcję grasicy różnych podzbiorów limfocytów T podczas ontogenezy. Ostatnio podejście to zostało wykorzystane do wykazania, że skuteczność selekcji grasicy jest ograniczona wcześnie po urodzeniu u myszy, co prowadzi do zwiększonego rozwoju autoreaktywnych limfocytów T i zmniejszonego repertuaru limfocytów T specyficznego dla obcych antygenów7.

<table><tbody><tr><td>Alkohol etylowy&nbsp;</td><td>Decon Laboratories</td><td>2705HC</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>GIBCO</td><td>14190-144</td><td>pH 7,4</td></tr><tr><td>Roztwór betadyny Produkty</td><td>Purdue</td><td>67618-150-17</td><td></td></tr><tr>Igła <td>BD</td> o<td>rozmiarze 18 Szwy</td><td>305195</td><td></td></tr><tr><td>(1,0 metryczne)</td><td>Ethicon</td><td>J493G</td><td>18" (45cm)</td></tr><tr><td>Klipsy do ran AUTOCLIP (9mm)</td><td>Clay Adams&reg; Marka</td><td>427631</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta transferowa</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-20</td><td>Sterylna, jednorazowa</td></tr><tr><td>mysz anty-CD3 Ab</td><td>eBioscience</td><td>11-0031-85</td><td>Klon: 1452C11</td></tr><tr><td>Mysz anty-CD4 Ab</td><td>eBioscience</td><td>48-0042-82</td><td>Klon: RM4-5</td></tr><tr><td>Mysz anty-CD8 Ab</td><td>eBioscience</td><td>25-0081-82</td><td>Klon: 53-6.7</td></tr><tr><td>Lancet</td><td>Medipoint</td><td>Goldenrod 4mm</td><td></td></tr><tr><td>Pacific Orange Succinimidyl Ester, Triethyloammonium Salt</td><td>Invitrogen</td><td>P30253</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowe okrągłe płytki polipropylenowe Corning</td><td></td><td>3365</td><td></td></tr><tr><td>1,2 ml polipropylenowe rurki klastrowe</td><td>Corning</td><td>4401</td><td></td></tr><tr><td>5 ml polipropylenowe probówki okrągłodenne</td><td>BD</td><td>352002</td><td></td></tr><tr><td>40uM Nylon Cell Sitko</td><td>Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>16% roztwór paraformaldehydu,</td><td>usługi mikroskopii elektronowej</td> klasy EM <td>15710</td><td>Niebezpieczna</td></tr><tr><td>maść optyczna Puralube</td><td>Fisher Scientific NC0138063</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Limfolit</td><td>Cedarlane</td><td>CL5030</td><td></td></tr><tr><td>Naczynie do hodowli komórkowych 60 mm</td><td>Corning</td><td>430196</td><td>60 mm x 15 mm, sterylne</td></tr></tbody></table>

izolacja i przeszczep różnych wiekowych mysich przeszczepów grasicy.

Isolation and Transplantation of Different Aged Murine Thymic Grafts.

Mechanizmy regulujące skuteczność selekcji grasiczy pozostają niejasno określone. Przedstawiona metoda pozwala na przeprowadzenie analiz in vivo rozwoju i selekcji limfocytów T specyficznych dla antygenów własnych i obcych. Podejście to polega na wszczepieniu przeszczepów grasicy pochodzących od różnych myszy w różnym wieku biorcom scid z niedoborem odporności. W stosunkowo krótkim czasie biorcy są w pełni odtwarzani za pomocą limfocytów T pochodzących z wszczepionego przeszczepu grasicy. Tylko tymocyty wysiewające grasicę w czasie izolacji podlegają selekcji i przekształcają się w dojrzałe limfocyty T. W związku z tym można ocenić zmiany w charakterze i swoistości przeszczepionych limfocytów T w funkcji zależnych od wieku zdarzeń grasicy. Chociaż do udanego przeszczepu grasicy wymagana jest wiedza techniczna, metoda ta zapewnia unikalną strategię badania in vivo szerokiego zakresu patologii, które są spowodowane lub wynikiem nieprawidłowej funkcji grasicy i/lub homeostazy.

Sukces tej procedury zależy od minimalnego urazu chirurgicznego oraz dokładnego umieszczenia przeszczepu pod torebką nerkową. Przeszczep grasicy należy pociąć, aby uzyskać fragmenty grasicy o odpowiedniej wielkości do późniejszej transplantacji, jak pokazano na Rysunku 1. Postępując zgodnie ze schematem na Rysunku 1, do udanej transplantacji podtorebkowej z powtarzalnymi wynikami przyjmowania komórek T można wykorzystać grasicę myszy noworodkowych lub dorosłych. Jak wspomniano, właściwe ...

Ten raport zawiera szczegółowy opis przeszczepiania mysiej thymi od myszy dawców w różnym wieku pod torebkę nerkową mysich biorców z niedoborem odporności. Celem tego podejścia jest modelowanie rozwoju limfocytów T i zdarzeń selekcji grasicy in vivo.

Izolacja i przeszczep różnych wiekowych mysich przeszczepów grasicy.

The mechanisms that regulate the efficacy of thymic selection remain ill-defined. The method presented here allows in vivo analyses of the development and ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest umożliwienie analizy in vivo selekcji negatywnej limfocytów T w konkretnym punkcie czasowym podczas ontogenezy tych komórek. Osiąga się to poprzez pobranie grasicy z myszy donora w określonym wieku. W drugim kroku odsłania się nerkę myszy biorcy z linii skid, a następnie chirurgicznie implantuje grasicę donora pod torebkę nerki.W ostatnim kroku zamyka się odbiorcę. Ostatecznie pomyślną rekonstytucję obwodowej puli limfocytów T można ocenić za pomocą cytometrii przepływowej. Metoda ta umożliwia czasowe badanie selekcji grasiczej i produkcji limfocytów T, zapewniając w zasadzie obraz produkcji limfocytów T w konkretnym, interesującym czasie podczas prezentacji antygenu limfocytom T. Aby usunąć grasicę z dorosłej myszy lub noworodka, należy zacząć od położenia zwierzęcia w pozycji grzbietowej na sterylnym, chłonnym ręczniku papierowym i spryskania sierści 70% ethanol.Następnie wykonaj cięcie w linii środkowej przez skórę, aby odsłonić jamę brzuszną i klatkę piersiową, a skórę odchyl na klatkę piersiową i przednie kończyny, aby w pełni odsłonić jamę klatki piersiowej. Następnie wykonaj dwa cięcia boczne przez przeponę i klatkę piersiową. Aby odsł

isolation-and-transplantation-of-different-aged-murine-thymic-grafts

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Izolacja i przeszczepianie różnorodnych wiekowych przeszczepów grasicy u myszy.

Opracowaliśmy nowe narzędzia laboratoryjne i protokoły do obrazowania intravitalnego grasicy. Nasza technika powinna pomóc w identyfikacji „nisz” w obrębie grasicy, w których zachodzi rozwój limfocytów T.

Obrazowanie przyżyciowe grasicy myszy z wykorzystaniem mikroskopii dwufotonowej

Przeszczepianie szpiku kostnego u myszy jest powszechnie stosowaną techniką badania mechanizmów immunologicznych sterujących chorobą przeszczep przeciw gospodarzowi u ludzi. Możliwość monitorowania wzorców migracji limfocytów T in vivo pozwala na szczegółową analizę rozwoju i utrwalania odpowiedzi limfocytów T podczas choroby przeszczep przeciw gospodarzowi.

Indukcja choroby przeszczep przeciw gospodarzowi i monitorowanie limfocytów T in vivo z wykorzystaniem modelu mysiego dopasowanego pod kątem MHC

Ten film demonstruje indukcję choroby jelitowej przeszczep przeciwko gospodarzowi, GvHD, u śmiertelnie napromieniowanej myszy biorcy przy użyciu allogenicznych hematopoetycznych komórek macierzystych i indukujących GvHD alloreaktywnych limfocytów T indukujących śledzionę. Protokół ten pomaga w ustaleniu modelu ciężkiej ostrej choroby jelitowej GvHD, aby zrozumieć mechanizm choroby i opracować innowacyjne opcje terapeutyczne.

Indukcja choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi w modelach mysich za pomocą allogenicznego przeszczepu szpiku kostnego i komórek śledziony

Przeszczep skóry ogona jest potężnym modelem do badania zależnego od limfocytów T odrzucania i indukcji tolerancji podczas allogenicznych odpowiedzi immunologicznych u myszy. Zaletami tego protokołu są drobne inwazyjne zabiegi chirurgiczne oraz łatwość monitorowania bez konieczności poświęcania myszy biorcy.

Przeszczep skóry ogona w celu zbadania allogenicznych odpowiedzi limfocytów T CD4 u myszy

Tutaj opisujemy skuteczną metodę izolacji, identyfikacji i oczyszczania mysich komórek nabłonka grasicy (TEC). Protokół może być wykorzystany do badań funkcji grasicy pod kątem prawidłowego rozwoju komórek T, dysfunkcji grasicy i rekonstytucji limfocytów T.

Izolacja, identyfikacja i oczyszczanie mysich komórek nabłonkowych grasicy

Ten artykuł opisuje metodologię in vivo i in vitro do charakteryzowania przodków osiadania grasicy poprzez analizę kinetyki powstawania, fenotypu i liczby ich potomstwa limfocytów T.

Charakterystyka progenitorów osadzania się grasicy w zarodku myszy za pomocą testów in vivo i in vitro

Aby zbadać łączoną allotransplantację narządów litych i unaczynionych kompozytów, opisujemy nowy heterotopowy model przeszczepu en bloc ściany klatki piersiowej, grasicy i serca u myszy przy użyciu techniki mankietu szyjki macicy bez szwów.

Nowatorski model mikrochirurgiczny do heterotopowego, en bloc ściany klatki piersiowej, grasicy i przeszczepu serca u myszy

Przeszczep skóry pełnej grubości myszy jest dobrze znanym modelem do badania odrzucenia w środowisku alloimmunologicznym. W tym miejscu przedstawiamy samouczek dotyczący każdego kroku związanego z wykonaniem przeszczepu skóry pełnej grubości BALB/c--&gt;C57BL/6.

Mysi przeszczep skóry o pełnej grubości

Celem protokołu jest pokazanie podłużnego śledzenia tymocytów w czasie rzeczywistym za pomocą laserowej mikroskopii skaningowej w implantach grasicy w przedniej komorze oka myszy. Przezroczystość rogówki i unaczynienie przeszczepu pozwala na ciągłe rejestrowanie rekrutacji komórek progenitorowych i wyjścia dojrzałych komórek T.

Śledzenie w czasie rzeczywistym in vivo tymocytów w przedniej komorze oka za pomocą laserowej mikroskopii skaningowej

Oferujemy prostą i skuteczną metodę przeszczepiania grasicy leczonej 2'-deoksyguanozyną E18.5 do torebki nerkowej nagiej myszy. Metoda ta powinna pomóc w badaniu zarówno funkcji komórek nabłonka grasicy, jak i dojrzewania limfocytów T.

Podtorebkowe przeszczepienie nerki mysiej grasicy embrionalnej leczonej 2'-deoksyguanozyną u nagich myszy

Tutaj prezentujemy protokoły, które umożliwiają izolację komórek zrębu z mysich kości, szpiku kostnego, grasicy i ludzkiej tkanki grasicy, kompatybilne z monokomórkową multiomiką.

Izolacja komórek zrębu z narządów krwiotwórczych

Naucz się izolacji i przeszczepu grasicy mysiej do immunodeficytnych biorców w celu analizy in vivo rozwoju komórek T. Metoda umożliwia badanie selekcji tymicznej i ontogenezy limfocytów T.

Izolacja i przeszczep różnych wiekowych mysich przeszczepów grasicy.

Przeglądaj więcej filmów