Obrazowanie dwufotonowe wewnątrzkomórkowego obchodzenia się z Ca²⁺ i produkcji tlenku azotu w komórkach śródbłonka i mięśni gładkich izolowanej aorty szczurzej

Ogólnym celem niniejszej procedury jest pomiar stężenia wapnia lub tlenku azotu w świeżo wyizolowanym naczyniu z wykorzystaniem mikroskopii dwufotonowej. Jest to realizowane najpierw poprzez mechaniczną izolację i przygotowanie naczynia. Następnie naczynie inkubuje się w barwniku do znakowania wapnia lub barwniku do znakowania O z kwasem onicowym.

Następnie naczynie zostaje przymocowane do naczynia pokrytego silikonem za pomocą siatki i pinów, aby zapewnić stabilny obraz podczas obrazowania dwufotonowego. Na koniec wykonuje się obrazowanie dwufotonowe i dokonuje kwantyfikacji wyników. Film ten przedstawia wzrost wewnątrzkomórkowej sygnalizacji wapniowej w komórkach śródbłonka izolowanych naczyń krwionośnych w odpowiedzi na zmiany stężenia wapnia pozakomórkowego.

W ostateczności metoda ta pozwoli badaczom na monitorowanie zmian poziomu wapnia lub tlenku azotu w komórkach śródbłonka lub komórkach mięśni gładkich świeżo wyizolowanego naczynia krwionośnego. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami jest zapewnienie lepszej rozdzielczości sygnału oraz precyzyjnych pomiarów procesów wewnątrzkomórkowych w tkankach naczyniowych. W niniejszym opracowaniu technologia ta została zastosowana w połączeniu z klasycznymi, a nie geometrycznymi kostkami, w celu pomiaru przejściowych zmian poziomu wapnia oraz produkcji tlenku azotu w pojedynczych komórkach na wyizolowanej pustej strukturze.

Wierzymy, że technika ta pomoże w poszerzeniu naszej wiedzy na temat mechanizmów regulujących wewnątrzkomórkowe poziomy wapnia i tlenków w różnych typach komórek naczyniowych. Obrazowanie żywych komórek za pomocą mikroskopii dwufotonowej, zwłaszcza w nienaruszonych tkankach, takich jak naczynia krwionośne, zapewnia zalety w postaci sygnału o wysokiej rozdzielczości i niskiej fluorescencji tła poza ogniskiem. Wąska lokalizacja wzbudzenia dwufotonowego oświetla pojedynczą objętość ogniskową w tkance, co znacznie redukuje absorpcję poza ogniskiem i zmniejsza rozpraszanie światła, umożliwiając obrazowanie dynamiki fluoroforów w silnie autofluorescencyjnych tkankach zawierających włókna kolagenu i elastyny.

Po wyizolowaniu aorty szczura zgodnie z protokołem tekstowym pod mikroskopem stereotypowym, należy użyć pęsety z cienkimi końcówkami oraz mikronozycerzy, aby usunąć tłuszcz i tkankę łączną z aorty. Po oczyszczeniu organu należy go przeciąć wzdłużnie i przenieść do fizjologicznego roztworu soli w celu późniejszego wykorzystania. Aby przygotować koktajl ładujący, należy dodać 7 µL gotowego roztworu barwnika fluo-4 AM w stężeniu 1 mM i DMSO do 450 µL PSS nie zawierającego wapnia.

Następnie do koktajlu ładującego należy dodać 40 µL 10% roztworu kwasu oleinowego w nośniku innym niż DMSO, aby pomóc w rozproszeniu estrów acetylometylowych i poprawić ładowanie barwnika wapnia. Wypreparowane aorty należy umieścić w probówkach o pojemności 500 µL zawierających koktajl ładujący. Probówki należy owinąć folią aluminiową i inkubować na wytrząsarku obrotowej w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę.

Po wykonaniu protokołu tekstowego w celu przytwierdzenia tkanki aorty do powierzchni naczynia pokrytego silikonem, umieść naczynie pod elementem nosowym pionowego mikroskopu dwufotonowego, a następnie zamontuj i ustaw obiektyw z imersją wodną 25x nad preparatem. W porcie mikroskopu zainstaluj odpowiedni filtr emisyjny. Za pomocą oprogramowania aktywuj podczerwony laser dwufotonowy i dostrój wzbudzenie lasera do 820 nm w świetle przechodzącym. Używając grubego ustawienia obiektywu, zlokalizuj aortę i ustaw ostrość obiektywu na powierzchni śródbłonka.

Przełącz mikroskop w tryb dwufotonowego skanowania laserowego, upewniając się, że laser wzbudzający pracuje w trybie stabilizacji fazy (mode-locked). Detektory skanujące non-DS są aktywne przy mocy lasera wynoszącej około 5 do 10%. Rozpocznij skanowanie w czasie rzeczywistym.

Na koniec dostosuj obiektyw, aby uzyskać ostrość obrazu komórek śródbłonka lub komórek mięśni gładkich. Pozyskaj sekwencyjne obrazy zgodnie z tekstem protokołu eksperymentalnego. Zapisz obrazy w formacie zawierającym metadane, aby przeprowadzić przetwarzanie obrazów i obliczenia; pobierz i zainstaluj pakiet do przetwarzania obrazów Fiji, który jest udostępniany na mocy licencji general public license.

Za pomocą oprogramowania otwórz plik obrazu. Następnie, gdy pojawi się monit, rozdziel kanały światła przechodzącego i fluorescencyjnego, aby do analizy danych w programie Fiji wykorzystać wyłącznie kanały fluorescencyjne. Kliknij kartę analyze i przewiń w dół do opcji tools.

Następnie kliknij kartę ROI manager, aby otworzyć nowe okno. Dalej, w karcie analyze, kliknij set measurements i wybierz interesujące Cię konkretne parametry pomiaru. W przypadku pomiarów przejściowych stężeń wapnia.

Użyj opcji średniej wartości szarości (mean gray value). Następnie, korzystając z narzędzia okręgu (circular trace tool), zacznij obrysowywać obszary zainteresowania, a w menedżerze ROI klikaj przycisk add dla każdego wybranego ROI. Po obrysowaniu wszystkich interesujących komórek, w menedżerze ROI przejdź do karty more i wybierz opcję multi mesure.

Na koniec należy zapisać pomiary bezpośrednio lub skopiować i wkleić je do arkusza kalkulacyjnego, a następnie przeprowadzić obliczenia zgodnie z protokołem tekstowym. Stosując protokół opisany w tym filmie, komórki śródbłonka aorty są łatwe do zlokalizowania ze względu na ich kształt i silny sygnał fluorescencyjny. W tym samym polu widzenia co komórki śródbłonka widoczne będą również komórki mięśni gładkich, co pozwoli lepiej zrozumieć, w jaki sposób oba typy komórek reagują wspólnie, a zarazem niezależnie, na różne agoniści i bodźce, wykazując użyteczność tej metody.

Pomiary odpowiedzi na acetylocholinę lub CHA, silny zależny od wapnia rozszerzacz naczyń śródbłonka, określono w sposób pokazany tutaj; po dodaniu CHA fluorescencja komórek śródbłonka wzrasta w porównaniu z komórkami w samym PSS, co wskazuje na szybki wzrost wewnątrzkomórkowej zawartości wapnia, która powoli powraca do poziomu bazowego. Protokół ten jest również odpowiedni do wykrywania produkcji tlenku azotu przez śródbłonek. W tym doświadczeniu komórki śródbłonka aorty załadowano barwnikiem DAF FM DA acetate.

Produkcja barwnika ENO wzrosła w sposób zależny od wapnia w odpowiedzi na stymulację CH, a odpowiedź ta została zablokowana za pomocą inhibitora endotelialnej syntazy OCH o nazwie L. Ta metoda może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie fizjologii układu sercowo-naczyniowego. Zastosowanie opisanego tutaj postępowania eksperymentalnego, wraz z wieloma dostępnymi genetycznie zmodyfikowanymi modelami zwierzęcymi, otwiera nowe perspektywy dla zastosowania FAR FSA w dwufotonowej mikroskopii w badaniach podstawowych i translacyjnych.

Zastosowanie tego podejścia może zapewnić pogłębione zrozumienie i wgląd mechanistyczny w konkretne wewnątrzkomórkowe szlaki sygnalizacyjne w komórkach naczyń krwionośnych. Po obejrzeniu tego filmu dowiedzą się Państwo, jak zastosować tę technikę do monitorowania w czasie rzeczywistym poziomu wapnia i tlenku azotu w poszczególnych komórkach świeżo wyizolowanych naczyń krwionośnych.