Name: Test komety jako pośrednia miara ogólnoustrojowego stresu oksydacyjnego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: Poznaj test komety jako metodę pomiaru stresu oksydacyjnego w leukocytach krwi. Technika ta pozwala ilościowo ocenić uszkodzenia DNA za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować Fundacji LHW w Triesen Liechtenstein za finansowe wsparcie naszych badań nad stresem oksydacyjnym.

Badania nad testem komet przeprowadzone na Wydziale Okulistyki Uniwersytetu w Bazylei zostały zatwierdzone przez Lokalną Komisję Etyczną Bazylei
1. Przygotowanie odczynników
<ol>
	<li>Przygotować roztwór soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) (wolny od Ca++, Mg++) firmy Dulbecco, dodając do pożywki PBS (opakowanie 1 l) i 990 mldH2O. Dostosować pH do 7,4. Sklep w RT.</li>
	<li>Przygotować roztwór lizujący: Aby przygotować 1 000 ml dodać 2,5 M NaCl (146,1 g), 100 mM EDTA (37,2 g) i 10 mM zasady Trizma (1,2 g) w dH2O.</li>
	<li>Przygotować bufor do elektroforezy (300 mM NaOH/1 mM EDTA) dodając 30 ml 10 M NaOH i 7,5 ml 0,2 M EDTA, q.s. do 1 500 mldH 2O i dobrze wymieszać. Całkowita objętość zależy od pojemności pojemnika na żel. Przed użyciem należy zmierzyć pH buforu, aby upewnić się, że pH wynosi >13.</li>
	<li>Przygotować bufor neutralizacyjny zawierający 0,4 M Tris (48,5 g dodać do ~800 ml dH2O, dostosować pH do 7,5), stężony (>10 M HCl) w 1 000 ml zdH2O. Przechowywać roztwór w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przygotuj roztwór barwiący. Do bromku etydyny (EtBr; 10x Stock, 20 μg/ml) dodać 10 mg EtBr w 50 ml dH2O i przechowywać w temperaturze RT. Dla 1x Bulionu - zmieszać 1 ml z 9 ml dH2O. UWAGA! Z EtBr należy obchodzić się z zachowaniem odpowiednich środków ostrożności, ponieważ jest to znany czynnik rakotwórczy.</li>
</ol>
2. Izolacja leukocytów
<ol>
	<li>Pobrać próbki krwi ludzkiej (20 ml) z antykoagulantem, takim jak heparyna, za pomocą nakłucia żylnego.</li>
	<li>Oddziel limfocyty za pomocą separatora komórek o gradiencie gęstości, takiego jak Histopaque.
	<ol>
		<li>Krótko mówiąc, rozcieńczyć krew w stosunku 1:1 za pomocą PBS lub RPMI (bez FBS) i nałożyć warstwę na 600 μl płynu do separatora komórek.</li>
		<li>Odwirować 1 800 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Odessać "kożuchową" powłokę do 3-5 ml PBS/RPMI i odwirować przy 300 x g przez 10 minut w celu osadzenia limfocytów.</li>
		<li>Pobrać limfocyty tuż nad granicą między PBS (RPMI) a cieczą separatora komórkowego za pomocą pipetora. Usunąć prążki leukocytów z warstwy cieczy między osoczem a separatorem komórek z każdej probówki i zebrać do jednej probówki o pojemności 50 ml.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Doprowadzić całkowitą objętość do 50 ml za pomocą zimnego Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM). Przemyć zawiesinę komórek trzykrotnie DMEM w stężeniu 300 x g przez 10 minut.</li>
	<li>Policz całkowitą liczbę komórek za pomocą hemocytometru. Zawiesić komórki w PBS i porcjować w probówkach do mikrowirówek po 10-7 komórek/probówkę.</li>
	<li>Odmierzyć pipetą 0,4 ml komórek do jednorazowej probówki z tworzywa sztucznego o pojemności 5 ml. Dodać 1,2 ml 1% agarozy o niskiej temperaturze żelowania w temperaturze 40 °C. Wymieszać i szybko odpipetować 1,2 ml zawiesiny komórkowej na pokrytą agarozą powierzchnię wstępnie powlekanego szkiełka podstawowego. Unikaj wytwarzania pęcherzyków.</li>
	<li>Pozwól agarozie zżelować się przez około 2 minuty. Przestrzegaj czasu i temperatury używanej do żelowania i upewnij się, że agaroza jest w pełni osadzona przed zanurzeniem w roztworze do lizy. Po całkowitym związaniu zanurzyć w roztworze lizującym w temperaturze ~4 ºC.</li>
</ol>
3. Liza i elektroforeza
UWAGA: Opisana procedura dotyczy elektroforezy w warunkach zasadowych pH >13.
<ol>
	<li>Po upływie co najmniej 2 godzin w temperaturze ~4 ºC delikatnie usunąć szkiełka z roztworu lizującego. Umieść szkiełka obok siebie na poziomym pudełku żelowym w pobliżu jednego końca, przesuwając je jak najbliżej siebie.</li>
	<li>Napełnij zbiorniki buforowe świeżo przygotowanym buforem do elektroforezy o pH >13, aż poziom cieczy całkowicie pokryje szkiełka (unikać pęcherzyków na agarozie).</li>
	<li>Pozostaw szkiełka w buforze alkalicznym na 20 minut, aby umożliwić odwinięcie DNA i ekspresję uszkodzenia alkalicznego.</li>
	<li>Włącz zasilanie do 25 V (~0,75 V/cm) i dostosuj prąd do 300 miliamperów, podnosząc lub obniżając poziom bufora. Elektroforezuj szkiełka przez 30 min.</li>
	<li>Wyłącz zasilanie. Delikatnie wyjmij szkiełka z bufora i umieść na tacy ociekowej. Kroplami pokryj szkiełka buforem neutralizacyjnym. Pozostaw szkiełka na co najmniej 5 minut. Odcedź szkiełka i powtórz jeszcze dwa razy.</li>
	<li>Zabarwić szkiełka 80 μl 1x bromkiem etydyny (EtBr) i pozostawić na 5 minut, a następnie zanurzyć w schłodzonej wodzie destylowanej, aby usunąć nadmiar plam. Następnie umieść szkiełko nakrywkowe na szkiełku podstawowym i natychmiast je przechowuj. Przechowuj szkiełka przez miesiąc w RT w suchych warunkach. 
	UWAGA: Można również stosować inne barwniki DNA (np. SYBR-green). Ostrożność! Nosić rękawice ochronne, ponieważ większość barwników jest mutagenna.</li>
</ol>
4. Kwantyfikacja pęknięć DNA
<ol>
	<li>Aby zobrazować uszkodzenie DNA, obserwuj szkiełko DNA barwione EtBr pod obiektywnym mikroskopem fluorescencyjnym 40X.</li>
	<li>Oceń ilościowo uszkodzenia DNA w komórkach, mierząc długość migracji DNA i procent migrowanego DNA (ryc. 1A). Określ ilościowo uszkodzenie DNA (ryc. 1B) za pomocą momentu ogonowego i momentu oliwnego. Definicje Momentu Ogonowego i Momentu Oliwnego – Podano wcześniej8-10, 
	UWAGA: Z naszego doświadczenia wynika, że wystarczy trzymać się jednego z parametrów. Komórki są fotografowane poprzez ustawienie automatycznego narzędzia, które skanuje szkiełko mikroskopu i fotografuje komórki. Kwantyfikacja pęknięć DNA może być wykonana za pomocą pakietów oprogramowania do analizy obrazu. Istnieje kilka różnych pakietów oprogramowania, które są wykonane na zamówienie w celu uchwycenia obrazu komórek i ilościowego określenia uszkodzeń DNA. Zalecamy korzystanie z tego samego pakietu oprogramowania przez cały czas trwania eksperymentu. Technik laboratoryjny identyfikuje nienaruszoną komórkę lub kometę, która ma zostać oceniona na komputerze i klika na nią myszką. Kometa lub nienaruszona komórka jest następnie automatycznie oceniana.</li>
</ol>

<ol><li>Ostling, O., Johanson, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microelectrophoretic+study+of+radiation-induced+DNA+damages+in+individual+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Microelectrophoretic study of radiation-induced DNA damages in individual mammalian cells.</a> Biochem Biophys Res Commun. 123 (1), 291-298 (1984).</li>
<li>Phillips, J. L., Singh, N. P., Lai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electromagnetic+fields+and+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Pathophysiology%22%5BJournal%5D)">Electromagnetic fields and DNA damage.</a> Pathophysiology. 16 (2-3), 79-88 (2009).</li>
<li>Dhawan, A., Bajpayee, M., Parmar, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comet+assay%3A+a+reliable+tool+for+the+assessment+of+DNA+damage+in+different+models%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biol+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Comet assay: a reliable tool for the assessment of DNA damage in different models.</a> Cell Biol Toxicol. 25 (1), 5-32 (2009).</li>
<li>Aiub, C. A., Pinto, L. F., Felzenszwalb, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-repair+genes+and+vitamin+E+in+the+prevention+of+N-nitrosodiethylamine+mutagenicity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biol+Toxicol%22%5BJournal%5D)">DNA-repair genes and vitamin E in the prevention of N-nitrosodiethylamine mutagenicity.</a> Cell Biol Toxicol. 25 (4), 393-402 (2009).</li>
<li>Bartsch, H., Nair, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+inflammation+and+oxidative+stress+in+the+genesis+and+perpetuation+of+cancer%3A+role+of+lipid+peroxidation%2C+DNA+damage%2C+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Langenbecks+Arch+Surg%22%5BJournal%5D)">Chronic inflammation and oxidative stress in the genesis and perpetuation of cancer: role of lipid peroxidation, DNA damage, and repair.</a> Langenbecks Arch Surg. 391 (5), 499-510 (2006).</li>
<li>Martin, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+damage+and+repair%3A+relevance+to+mechanisms+of+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuropathol+Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">DNA damage and repair: relevance to mechanisms of neurodegeneration.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 67 (5), 377-387 (2008).</li>
<li>Choy, C. K., Benzie, I. F., Cho, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UV-mediated+DNA+strand+breaks+in+corneal+epithelial+cells+assessed+using+the+comet+assay+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem+Photobiol%22%5BJournal%5D)">UV-mediated DNA strand breaks in corneal epithelial cells assessed using the comet assay procedure.</a> Photochem Photobiol. 81 (3), 493-497 (2005).</li>
<li>Mozaffarieh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comet+assay+analysis+of+single-stranded+DNA+breaks+in+circulating+leukocytes+of+glaucoma+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Vis%22%5BJournal%5D)">Comet assay analysis of single-stranded DNA breaks in circulating leukocytes of glaucoma patients.</a> Mol Vis. 14, 1584-1588 (2008).</li>
<li>Mozaffarieh, M., Konieczka, K., Hauenstein, D., Schoetzau, A., Flammer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Half+a+pack+of+cigarettes+a+day+more+than+doubles+DNA+breaks+in+circulating+leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Tob+Induc+Dis%22%5BJournal%5D)">Half a pack of cigarettes a day more than doubles DNA breaks in circulating leukocytes.</a> Tob Induc Dis. 8 (14), (2010).</li>
<li>Mozaffarieh, M., Schotzau, A., Josifova, T., Flammer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+ranibizumab+versus+photodynamic+therapy+on+DNA+damage+in+patients+with+exudative+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Vis%22%5BJournal%5D)">The effect of ranibizumab versus photodynamic therapy on DNA damage in patients with exudative macular degeneration.</a> Mol Vis. 15, 1194-1199 (2009).</li>
<li>Pertynska-Marczewska, M., Merhi, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+of+Advanced+Glycation+End+Products+With+Cardiovascular+Disease+in+Menopausal+Women%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod+Sci%22%5BJournal%5D)">Relationship of Advanced Glycation End Products With Cardiovascular Disease in Menopausal Women.</a> Reprod Sci. , (2014).</li>
<li>Singh, N. P., McCoy, M. T., Tice, R. R., Schneider, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+technique+for+quantitation+of+low+levels+of+DNA+damage+in+individual+cells%29%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells).</a> Exp Cell Res. 175, 184-191 (1988).</li>
<li>Gaivão, I., Sierra, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+comet+assay%3A+insights%2C+uses%2C+and+future+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Genet%22%5BJournal%5D)">Drosophila comet assay: insights, uses, and future perspectives.</a> Front Genet. 5, 304(2014).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+damage+in+lens+epithelial+cells+and+peripheral+lymphocytes+from+age-related+cataract+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmic+Res%22%5BJournal%5D)">DNA damage in lens epithelial cells and peripheral lymphocytes from age-related cataract patients.</a> Ophthalmic Res. 51 (3), 124-128 (2014).</li>
<li>Huet, S. A., Vasseur, L., Camus, S., Chesné, C., Fessard, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performance+of+comet+and+micronucleus+assays+in+metabolic+competent+HepaRG+cells+to+predict+in+vivo+genotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Sci%22%5BJournal%5D)">Performance of comet and micronucleus assays in metabolic competent HepaRG cells to predict in vivo genotoxicity.</a> Toxicol Sci. 138 (2), 300-309 (2014).</li>
<li>Danson, S., Ranson, M., Denneny, O., Cummings, J., Ward, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+the+comet-X+assay+as+a+pharmacodynamic+assay+for+measuring+DNA+cross-linking+produced+by+the+novel+anticancer+agent+RH1+during+a+phase+I+clinical+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+chemotherapy+and+pharmacology%22%5BJournal%5D)">Validation of the comet-X assay as a pharmacodynamic assay for measuring DNA cross-linking produced by the novel anticancer agent RH1 during a phase I clinical trial.</a> Cancer chemotherapy and pharmacology. 60, 851-861 (2007).</li>
<li>Moller, P., Moller, L., Godschalk, R. W., Jones, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+and+reduction+of+comet+assay+variation+in+relation+to+DNA+damage%3A+studies+from+the+European+Comet+Assay+Validation+Group%5BTitle%5D)+AND+%22Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">Assessment and reduction of comet assay variation in relation to DNA damage: studies from the European Comet Assay Validation Group.</a> Mutagenesis. 25, 109-111 (2010).</li>
<li>Chan, S. W., Chevalier, S., Aprikian, A., Chen, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+quantification+of+mitochondrial+DNA+damage+and+copy+number+in+circulating+blood%3A+a+sensitive+approach+to+systemic+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Res+Int%22%5BJournal%5D)">Simultaneous quantification of mitochondrial DNA damage and copy number in circulating blood: a sensitive approach to systemic oxidative stress.</a> BioMed Res Int. , 157-547 (2013).</li>
<li>Sanchez-Quesada, J. L., Perez, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modified+lipoproteins+as+biomarkers+of+cardiovascular+risk+in+diabetes+mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinol+Nutr%22%5BJournal%5D)">Modified lipoproteins as biomarkers of cardiovascular risk in diabetes mellitus.</a> Endocrinol Nutr. 60, 518-528 (2013).</li>
<li>Gandhi, G., Kaur, G., Nisar, U. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-sectional+case+control+study+on+genetic+damage+in+individuals+residing+in+the+vicinity+of+a+mobile+phone+base+station%5BTitle%5D)+AND+%22Electromagn+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Cross-sectional case control study on genetic damage in individuals residing in the vicinity of a mobile phone base station.</a> Electromagn Biol Med. 9, 1-11 (2014).</li>
<li>Cabarkapa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+effect+of+dry+olive+leaf+extract+in+adrenaline+induced+DNA+damage+evaluated+using+in+vitro+comet+assay+with+human+peripheral+leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+In+Vitro%22%5BJournal%5D)">Protective effect of dry olive leaf extract in adrenaline induced DNA damage evaluated using in vitro comet assay with human peripheral leukocytes.</a> Toxicol In Vitro. 28 (3), 451-456 (2014).</li>
</ol>

Szwedzcy naukowcy Ostling i Johanson byli pierwszymi w swojej dziedzinie, którzy wykorzystali test komet do ilościowego określenia uszkodzeń DNA w komórkach1. Neutralne warunki, które zastosowali dwaj naukowcy, pozwoliły jednak na wykrycie pęknięć dwuniciowego DNA. Singh i in. później dostosowali test do stosowania w warunkach alkalicznych, co pozwoliło na uzyskanie czułej wersji, która mogła ocenić dwu- i jednoniciowe pęknięcia DNA oraz wykryć miejsca alkaliczno-labilne12. Od czasu początkowego opracowania test był modyfikowany na różnych etapach, aby nadawał się do oceny rodzajów uszkodzeń DNA w różnych typach komórek13-15.
Podobnie jak w przypadku wszystkich technik, zwracanie szczególnej uwagi na szczegóły techniczne jest ważne dla uzyskania dokładnych wyników16. Bazując na naszym doświadczeniu, najlepsze wyniki uzyskuje się, gdy każdy etap metodologiczny – od przygotowania roztworu po kwantyfikację komet – jest wykonywany przez doświadczonych techników laboratoryjnych. Stosowanie świeżych i prawidłowo przygotowanych pożywek, odpowiednie techniki pipetowania, dokładny czas i (jak wspomniano wcześniej w sekcji dotyczącej wyników) użycie świeżo przygotowanych leukocytów są niezbędne do uzyskania dokładnych wyników lizy i elektroforezy żelowej17.
Wszystkie poszczególne etapy tego testu są równie ważne dla uzyskania wiarygodnych wyników. 16 Ogólnie rzecz biorąc, najlepsze wyniki uzyskuje się, jeśli każdy pojedynczy etap metodologiczny, od przygotowania roztworu do oceny ilościowej komety, jest wykonywany przez doświadczonych techników laboratoryjnych. Ważne wydaje się użycie świeżych i prawidłowo przygotowanych pożywek, odpowiednich technik pipetowania, dokładnego czasu oraz, jak już wspomniano w sekcji dotyczącej wyników, użycie świeżo przygotowanych leukocytów do lizy i elektroforezy żelowej w celu uzyskania odpowiednich wyników testu17.
Podobnie jak inne metodologie, technika oznaczania komet ma swoje zalety i wady. Ze względu na to, że jest to metoda czuła, test jest podatny na działanie czynników (np. światła UV), które mogą nasilać pęknięcia DNA, a tym samym wpływać na wyniki. Należy unikać wszelkich czynników, które mogą nasilać stres oksydacyjny, z wyjątkiem tych, które są badane. Stresory mogą zwiększać poziom stresu oksydacyjnego nie tylko w leukocytach, ale także we wszystkich innych pożywkach krwi i limfocytach. Jak wspomniano wcześniej, istnieje wiele różnych i bardziej bezpośrednich sposobów pomiaru stresu oksydacyjnego18,19. Test kometarny jest jedną z wielu metod, która ma pewne zalety. Należą do nich: stosunkowo niski koszt, niewielka liczba wymaganych komórek (<10 000 komórek), a tym samym małe próbki krwi wymagane na pacjenta, stosunkowo krótki czas potrzebny do ilościowego określenia uszkodzeń DNA w komórkach (około 3 dni), jego czułość i szerokie zastosowanie do oceny uszkodzeń DNA w różnych typach komórek. W przeszłości decydowaliśmy się na pracę z leukocytami, ponieważ mieliśmy doświadczenie z tym typem komórek i miało to zastosowanie w konkretnym planowanym badaniu. Kolejną zaletą testu kometarnego jest to, że może być używany do wykrywania różnych typów i poziomów uszkodzeń DNA, a tym samym może być stosowany w różnych innych obszarach badań poza stresem oksydacyjnym, takich jak badania naprawy DNA, próby suplementacji lub badania genotoksyczności.
Stres oksydacyjny jest obecnie uznawany za odgrywający kluczową rolę w patogenezie wielu chorób. Metoda oznaczania komet, choć jest jednym z wielu sposobów pomiaru stresu oksydacyjnego18,19, jest stosunkowo prosta, wszechstronna i niedroga. Po opanowaniu metoda ta może być stosowana we wszystkich dziedzinach medycyny, w których stres oksydacyjny odgrywa rolę 8-10,20,21.

Test kometarny został po raz pierwszy opracowany przez szwedzkich naukowców Ostlinga i Johansona1. DNA jest cząsteczką naładowaną ujemnie. Podczas elektroforezy mniejsze, uszkodzone fragmenty DNA przemieszczają się szybciej w kierunku dodatnio naładowanej anody2. Im mniejsze fragmenty DNA, tym szybsza ich migracja w kierunku anody tworząc typową "kometę" z "głową" złożoną z nienaruszonego, nieuszkodzonego DNA i "ogonem" złożonym z uszkodzonych fragmentów DNA3. Uszkodzone DNA może być naprawiane przez różne mechanizmyw organizmie4, które utrzymują wytwarzanie pęknięć DNA wmiarę zrównoważone5. Jeśli jednak szala przemawia na korzyść pęknięć DNA, pęknięcia mogą się kumulować i ostatecznie przyczynią się do rozwoju choroby.
Nasze DNA doznaje około 0,000165% uszkodzeń w danym momencie6. Pęknięcia jednoniciowego DNA odnoszą się do defektu jednej z dwóch nici podwójnej helisy DNA, podczas gdy pęknięcia dwuniciowego DNA powstają, gdy obie nici podwójnej helisy DNA są uszkodzone. Istnieje wiele czynników, które mogą zwiększyć ilość pęknięć DNA w danym momencie, takich jak wiek komórki, dym papierosowy, różne leki lub stres oksydacyjny7-9. Jeśli wszystkie czynniki prowadzące do zwiększonych pęknięć DNA są utrzymywane na stałym poziomie, to kwantyfikacja pęknięć DNA za pomocą testu komety jest dobrym pośrednim parametrem stresu oksydacyjnego.
Metoda oznaczania komet jest dziś coraz częściej stosowana w medycynie, w tym w okulistyce. Jednym z powodów takiego stanu rzeczy jest to, że stres oksydacyjny jest coraz częściej uznawany za mechanizm patogenetyczny dla różnychchorób8-11, a test komet jest jedną z metod, za pomocą której można pośrednio określić ilościowo stres oksydacyjny.

<table><tbody><tr><td>Dimetylosulfotlenek (DMSO)</td> <td>Qualigens</td> <td>(CPW59)</td><td></td></tr> <tr><td>Disodowy EDTA</td><td>HiMedia</td> <td>(RM1370)</td><td></td></tr> <tr><td>Bromek etydyny</td><td>Sigma</td> <td>(E-8751)</td><td></td></tr> <tr><td>Histopaque</td><td>Sigma</td> <td>(1077-1)</td><td></td></tr> <tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem (PBS) (Ca ++, Mg ++ wolny)</td> <td>HiMedium</td> <td>(TS1006)</td><td></td></tr> <tr><td>Chlorek sodu (NaCl)</td><td>Ranbaxy Rankem</td><td>(S0160)</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu (NaOH)</td><td>BDH-Merck</td><td>(89021)</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>HiMedia</td><td>(RM 845)</td><td></td></tr><tr><td>Spektrochom</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr> zasad trizma<td colspan="4">Materiały wymagane do elektroforezy żelowej</td></tr><tr><td>Normalna topnienie agarozy (NMA)</td><td>HiMedia</td><td>(RM273)</td><td></td></tr><tr><td>Niska temperatura topnienia Agaroza (LMPA)</td><td>Sigma</td><td>(A9414)</td><td></td></tr><tr><td>Metanol - Qualigens</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe (nr 1, 24 x 60 mm)</td><td>Probówki do</td> mikrowirówek Blue Star <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Tarsons</td><td>(500010)</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipety i końcówki</td><td>Szkiełka mikroskopowe Tarson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>, Szkiełka konwencjonalne / do elektroforezy mikrożelowej (MGE)</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

test komety jako pośrednia miara ogólnoustrojowego stresu oksydacyjnego

Comet Assay as an Indirect Measure of Systemic Oxidative Stress

Wyższe organizmy eukariotyczne nie mogą żyć bez tlenu; jednak, paradoksalnie, tlen może być dla nich szkodliwy. Cząsteczka tlenu jest chemicznie stosunkowo obojętna, ponieważ ma dwa niesparowane elektrony znajdujące się na różnych orbitalach antywiążących pi*. Te dwa elektrony mają równoległe spiny, co oznacza, że obracają się w tym samym kierunku wokół własnych osi. Dlatego cząsteczka tlenu nie jest zbyt reaktywna. Aktywacja tlenu może zachodzić w wyniku dwóch różnych mechanizmów; albo poprzez redukcję przez jeden elektron na raz (redukcja jednowartościowa), albo poprzez absorpcję energii wystarczającej do odwrócenia spinu jednego z niesparowanych elektronów. Powoduje to produkcję reaktywnych form utleniających (ROS). Istnieje wiele sposobów, w jakie organizm ludzki eliminuje ROS w swoim stanie fizjologicznym. Jeśli produkcja ROS przekracza zdolność naprawczą, dochodzi do stresu oksydacyjnego i uszkadza różne cząsteczki. Istnieje wiele różnych metod, za pomocą których można zmierzyć stres oksydacyjny. Niniejszy manuskrypt koncentruje się na jednej z metod zwanej elektroforezą w żelu komórkowym, znanej również jako "test kometowy", który umożliwia pomiar pęknięć DNA. Jeśli wszystkie czynniki, o których wiadomo, że powodują uszkodzenia DNA, inne niż stres oksydacyjny, są utrzymywane na stałym poziomie, ilość uszkodzeń DNA mierzona za pomocą testu komety jest dobrym parametrem stresu oksydacyjnego. Zasada jest prosta i opiera się na fakcie, że cząsteczki DNA są naładowane ujemnie. Nienaruszona cząsteczka DNA ma tak duży rozmiar, że nie migruje podczas elektroforezy. Pęknięcia DNA, jeśli jednak występują, skutkują mniejszymi fragmentami, które przemieszczają się w polu elektrycznym w kierunku anody. Mniejsze fragmenty migrują szybciej. Ponieważ fragmenty mają różne rozmiary, końcowym wynikiem elektroforezy nie jest wyraźna linia, ale raczej kontinuum o kształcie komety. System ten pozwala na ilościowe określenie powstałej "komety", a tym samym pęknięć DNA w komórce.

Choć metoda testu kometowego pozwala na uzyskanie powtarzalnych wyników, może ona podlegać wpływowi wielu czynników. Jednym z takich czynników jest to, czy leukocyty zostały kriokonserwowane przed lizą i elektroforezą w żelu, czy też etap ten przeprowadzono na świeżo przygotowanych leukocytach. Rysunek 2 pokazuje, że w Grupie 2, w której leukocyty poddano kriokonserwacji przed lizą i elektroforezą w żelu, liczba pęknięć ss-DNA była znacząco wyższa niż w Grupie 1, gdzie liza i elektroforeza w żelu były wykonywane na świeżo przygotowanych komórkach.
Test ten może być również wykorzystany do pośredniej oceny systemowego stresu oksydacyjnego. Tabela 1 przedstawia statystyki opisowe dla Tail-moment oraz Olive-moment u palaczy i osób zdrowych. Dane wykazują, że palenie pół paczki papierosów dziennie powoduje ponad dwukrotny wzrost liczby pęknięć ssDNA w krążących leukocytach9.
<img alt="Układ mikroskopu optycznego z komputerem do obrazowania, mikroskopii fluorescencyjnej i badań analizy komórek." src="/files/ftp_upload/52763/52763fig1A.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1A">
<img alt="Wynik testu kometkowego, analiza uszkodzeń DNA, elektroforeza, obraz z mikroskopu fluorescencyjnego." src="/files/ftp_upload/52763/52763fig1B.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 1B"> 
Rycina 1. (A) Przedstawia mikroskop używany podczas analizy w teście kometkowym. (B) Δ przedstawia typową „kometę” z jasną głową i ogonem (uszkodzone mniejsze fragmenty DNA). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52763/52763fig1large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza momentu ogona, wykres pudełkowy porównujący pęknięcia DNA w dwóch grupach; frakcja pęknięć ssDNA." src="/files/ftp_upload/52763/52763fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Liczba pęknięć ssDNA była znacząco wyższa w przypadku leukocytów kriokonserwowanych (Grupa 2) niż w przypadku leukocytów świeżo przygotowanych przed lizą i elektroforezą żelową.
<img alt="Tabela porównująca dane palaczy i grupy kontrolnej z różnicami średnich, przedziałami ufności i wartościami p." src="/files/ftp_upload/52763/52763table1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Tabela 1"> 
Tabela 1. Palacze mieli ponad dwukrotnie większą liczbę pęknięć ssDNA w porównaniu do zdrowych osób niepalących, dopasowanych pod względem wieku i płci.

Test Comet mierzy pęknięcia DNA, wywołane przez różne czynniki. Jeśli wszystkie czynniki (z wyjątkiem stresu oksydacyjnego) powodujące uszkodzenie DNA są utrzymywane na stałym poziomie, ilość uszkodzeń DNA jest dobrym pośrednim parametrem stresu oksydacyjnego. Celem tego protokołu jest wykorzystanie testu kometarnego do pośredniego pomiaru stresu oksydacyjnego.

Test komety jako pośrednia miara ogólnoustrojowego stresu oksydacyjnego

Higher eukaryotic organisms cannot live without oxygen; yet, paradoxically, oxygen can be harmful to them. The oxygen molecule is chemically relatively ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wykorzystanie testu kometowego do pośredniego pomiaru stresu oksydacyjnego. Jest to realizowane poprzez wstępną izolację leukocytów z próbek ludzkiej krwi. W drugim kroku komórki miesza się z agarozą o niskiej temperaturze topnienia, a następnie unieruchamia je na szkiełkach przedmiotowych.Następnie komórki poddawane są lizie przez dwie godziny, po czym przeprowadza się elektroforezę po zabarwieniu preparatów bromkiem diumem. DNA wizualizuje się za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Ostatecznie pęknięcia DNA są kwantyfikowane poprzez analizę programową danych z mikroskopii fluorescencyjnej.Obecnie wiadomo, że stres oksydacyjny odgrywa kluczową rolę w patogenezie wielu chorób, w tym oczywiście chorób oczu. Istnieje wiele różnych sposobów pomiaru stresu oksydacyjnego. Jedną z metod jego pośredniego pomiaru jest test kometowy.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami jest to, że stanowi ona prostą, niskokosztową i niezawodną taktykę, dzięki której możemy pośrednio zmierzyć stres oksydacyjny. Leukocyty do tego eksperymentu zostaną wyizolowane z próbek krwi ludzkiej pobranych z użyciem przeciwzakrzepiacza poprzez nakłucie żyły; aby oddzielić limfocyty, najpierw należy rozcieńczyć krew w stosunku jeden do jednego w PBS. Następnie należy nałożyć warstwę 600 µL cieczy do separacji komórek w gradiencie gęstości, takiej jak histo pack, i wirować przy 1 800 G przez 20 minut w temperaturze 4 °C.Odssać warstwę leukocytarną (buffy coat) do 3–5 ml PBS i wirować przy 300 G przez 10 minut. Aby pobrać limfocyty za pomocą pipetora, należy je odessać z obszaru znajdującego się tuż nad granicą między PBS a cieczą separującą komórki. Usunąć pasma leukocytów z granicy między warstwą osocza a cieczą separującą komórki z każdej probówki i zebrać je do jednej probówki o pojemności 50 ml.Dopełnić objętość do 50 mililitrów zimnym PBS. Zawiesinę komórkową przemyć trzykrotnie w PBS, wirując przy 300 G przez 10 minut. Po trzecim przemyciu policzyć całkowitą liczbę komórek za pomocą hematocytometru.Zawiesić komórki w PBS i przenieść do probówek do mikrocentryfugi w stężeniu 10 milionów komórek na probówkę za pomocą pipety. Odpipetować 0,4 ml komórek do jednorazowej plastikowej probówki o pojemności 1,5 ml. Dodać 50 µL zawiesiny komórkowej do 500 µL 1% agarozy o niskiej temperaturze żelowania.Agarozę w temperaturze 40 °C przygotuj wcześniej, wymieszaj i szybko nanieś pipetą 50 µL zawiesiny komórkowej na pokrytą agarozą powierzchnię wstępnie powlekanego szkiełka. Pozostaw agarozę do zgęstnienia przez około dwie minuty w temperaturze 4 °C. Zachowaj stały czas i temperaturę żelowania oraz upewnij się, że agaroza jest całkowicie utwardzona przed przystąpieniem do procedury lizy.Po całkowitym stężeniu agarozy, zanurz szkiełka w roztworze lizującym w temperaturze czterech stopni Celsjusza na co najmniej dwie godziny. Następnie ostrożnie wyjmij szkiełka z roztworu lizującego. Ułóż szkiełka obok siebie w poziomej kasecie do elektroforezy blisko jednego z końców, przesuwając je tak, aby znajdowały się jak najbliżej siebie.Napełnij zbiorniki z buforem świeżo przygotowanym buforem do elektroforezy o pH powyżej 13. Należy pamiętać, że procedura przedstawiona w tym materiale dotyczy elektroforezy. W warunkach alkalicznych przy pH powyżej 13 napełnij zbiorniki z buforem tak, aby poziom cieczy całkowicie zakrywał szkiełka.Należy unikać powstawania pęcherzyków powietrza nad agarem. Pozostawić preparat w buforze alkalicznym na 20 minut, aby umożliwić denaturację DNA oraz ujawnienie uszkodzeń indukowanych przez alkaliów. Po 20 minutach włączyć zasilacz, ustawiając napięcie na 25 V i regulując natężenie prądu do 300 mA poprzez podniesienie lub obniżenie poziomu buforu.Prowadzić elektroforezę na szkiełkach przez 30 minut. Po 30 minutach wyłączyć zasilanie. Ostrożnie wyjąć szkiełka z buforu i umieścić je na tacy odpływowej, a następnie pokryć szkiełka buforem neutralizującym, nanosząc go kroplami.Pozostaw preparaty na co najmniej pięć minut. Odlej nadmiar płynu z prowadek i powtórz etap płukania buforem neutralizującym jeszcze dwa razy. Następnie zabarw preparaty za pomocą 1 mL 1x bromku etydyny przez pięć minut.Należy założyć rękawice ochronne, ponieważ bromek etydyny jest znanym kancerogenem. Po pięciu minutach należy zanurzyć preparaty w schłodzonej wodzie destylowanej, aby usunąć nadmiar barwnika. Następnie na każdy preparat należy nałożyć szkiełko zakrywkowe.Próbki na szkiełkach należy przechowywać niezwłocznie. Pokryte barwnikiem szkiełka można przechowywać przez miesiąc w temperaturze czterech stopni Celsius w suchych warunkach. Aby zwizualizować i ocenić uszkodzenia DNA, należy obserwować szkiełko z DNA zabarwionym bromkiem etydium pod mikroskopem fluorescencyjnym z obiektywem 40 x.Skonfiguruj zautomatyzowane urządzenie skanujące pod mikroskopem, aby wykonać preparaty i sfotografować komórki w teście kometowym. Uszkodzenia DNA w komórkach oceniono ilościowo, mierząc długość migracji DNA oraz procent zmigrowanego DNA. Czarna grot strzałki wskazuje typową kometę z jasną głową i ogonem.Główka składa się z nienaruszonego, nieuszkodzonego DNA, natomiast ogonek składa się z mniejszych, uszkodzonych fragmentów DNA. Chociaż test kometowy daje powtarzalne wyniki, może on być pod wpływem wielu czynników, takich jak to, czy analiza została przeprowadzona na świeżo przygotowanych leukocytach. Na tym wykresie moment ogonka jest zdefiniowany jako iloczyn długości ogonka i intensywności ogonka.Procent DNA w stosunku do całkowitej ilości DNA. Leukocyty grupy drugiej, które zostały kriokonserwowane przed lizą i elektroforezą, wykazują znacznie więcej pęknięć jednoniciowych DNA niż świeżo przygotowane leukocyty grupy pierwszej. Ten test może być również wykorzystany do pośredniej oceny ogólnoustrojowego stresu oksydacyjnego. W tym przypadku moment oliwny stanowi iloczyn procentu całkowitego DNA w ogonie oraz odległości między środkami masy obszarów głowy i ogona.Wyniki uzyskane od palaczy oraz zdrowych osób dobranych pod względem wieku i płci wykazują, że palenie pół paczki papierosów dziennie ponad dwukrotnie zwiększa liczbę jednoniciowych pęknięć DNA w krążących leukocytach. Po opanowaniu ta technika oferuje kilka zalet, w tym względnie niskie koszty, niewielką liczbę komórek, a tym samym małą objętość próbki krwi wymaganej od pacjenta, a także stosunkowo krótki czas potrzebny do ilościowego określenia uszkodzeń DNA w komórkach.

comet-assay-as-an-indirect-measure-of-systemic-oxidative-stress

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Test Komety jako pośrednie mierzenie ogólnoustrojowego stresu oksydacyjnego

Film demonstruje test komety do wykrywania uszkodzeń DNA po ekspozycji na szkodliwe czynniki. W warunkach zasadowych DNA rozwija się i denaturuje, a po elektroforezie nieuszkodzone i uszkodzone DNA migruje inaczej w żelu agarozowym, tworząc strukturę w kształcie komety. Wolno migrujące, nieuszkodzone DNA tworzy okrągłą głowę komety, podczas gdy szybko migrujące uszkodzone fragmenty DNA tworzą wydłużony warkocz komety.

Test komety do wykrywania uszkodzeń DNA w komórkach

Ten film demonstruje test substancji reaktywnych kwasu tiobarbiturowego (TBARS) do oceny stresu oksydacyjnego w próbkach biologicznych.

Test substancji reagujących z kwasem tiobarbiturowym w celu oceny stresu oksydacyjnego w surowicy ludzkiej

Test komet jest skutecznym sposobem wykrywania pęknięć jedno- i dwuniciowych, w tym miejsc alkaliczno-labilnych i powiązań krzyżowych DNA-DNA/DNA-protein na DNA we wszystkich komórkach, w tym w neuronach hipokampa. Metoda wykorzystuje zróżnicowaną migrację DNA w polu elektrycznym ze względu na różnice w ilości uszkodzeń DNA.

Oznaczanie uszkodzeń DNA w neuronach hipokampa za pomocą testu komety

Opisujemy tutaj platformę, która pozwala na wykrywanie uszkodzeń DNA metodą testów komet z niespotykaną dotąd wydajnością. Urządzenie tworzy modele komórek ssaków w mikromacierz i umożliwia równoległe przetwarzanie 96 próbek. Podejście to ułatwia analizę uszkodzeń DNA na poziomie podstawowym, uszkodzeń DNA wywołanych ekspozycją oraz kinetyki naprawy DNA.

CometChip: wysokowydajna, 96-dołkowa platforma do pomiaru uszkodzeń DNA w mikromacierzowanych komórkach ludzkich

Alkaliczny test komet mierzy pęknięcia nici DNA w komórkach eukariotycznych. Dodając etap trawienia endonukleazy III lub ludzkiej 8-oksoguaniny-DNA-N-glikozylazy, test może skutecznie wykryć oksydacyjne uszkodzenie DNA. Opisujemy metody stosowania tych testów do wykrywania uszkodzeń DNA w wątrobie szczura.

In vivo (in vivo) Alkaliczny test kometologiczny i test alkaliczny komety modyfikowany enzymami do pomiaru pęknięć nici DNA i oksydacyjnych uszkodzeń DNA w wątrobie szczura

Test komet jest skuteczną metodą wykrywania uszkodzeń DNA, w tym jedno- i dwuniciowych pęknięć DNA. Opisujemy alkaliczne i neutralne testy komet w celu zmierzenia uszkodzeń DNA w komórkach nowotworowych w celu oceny efektu terapeutycznego chemioterapii.

Ocena uszkodzeń DNA in vitro za pomocą testu komety

Ten protokół opisuje kilka procedur przygotowania wysokiej jakości zamrożonych próbek tkanek podczas sekcji zwłok do użycia w teście kometarnym do oceny uszkodzeń DNA: 1) zmielona tkanka, 2) zeskrobane komórki nabłonkowe z przewodu pokarmowego, oraz 3) sześcienne próbki tkanek, wymagające homogenizacji za pomocą urządzenia do mielenia tkanek.

Wykorzystanie zamrożonej tkanki w teście komety do oceny uszkodzeń DNA

Test kometarny jest popularnym sposobem wykrywania uszkodzeń DNA. W tym badaniu opisano podejście do przeprowadzania slajdów w reprezentatywnych wariantach testu komety. Takie podejście znacznie zwiększyło liczbę próbek przy jednoczesnym skróceniu czasu trwania testu, liczby manipulacji szkiełkami i ryzyka uszkodzenia żeli.

Wysokoprzepustowy test kometowy do oceny uszkodzeń DNA komórkowego

Protokół ten opisuje skuteczną metodę ilościowego określania różnic w uszkodzeniach DNA wywołanych przez inhibitory typu I i typu II w zmutowanych komórkach FLT3 poprzez zastosowanie testu komety.

Test kometarny w celu ilościowego określenia uszkodzeń DNA w komórkach 32D z ekspresją mutanta FLT3 po ekspozycji na inhibitory FLT3 typu I i II

Opracowaliśmy metodę odpowiedzi wizualno-motorycznej (Visual-Motor Response), aby ilościowo określić reakcję motoryczną larw zebrafish w odpowiedzi na przyrosty i spadki natężenia światła. Zbadaliśmy również mutanty wzroku zebrafish, w tym mutanty z brakiem odpowiedzi optokinetycznej (nrc), które uznano za całkowicie niewidome podczas testowania za pomocą innego badania wzroku – odruchu optokinetycznego.

Test behawioralny do pomiaru reaktywności rybek zebrafish na zmiany natężenia światła

Poznaj test komety jako metodę pomiaru stresu oksydacyjnego w leukocytach krwi. Technika ta pozwala ilościowo ocenić uszkodzenia DNA za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Test komety jako pośrednia miara ogólnoustrojowego stresu oksydacyjnego

Przeglądaj więcej filmów