Name: Wysokoprzepustowy pomiar uwalniania zewnątrzkomórkowego DNA i ilościowego tworzenia NET w ludzkich neutrofilach in vitro (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 3 s
Description: Poznaj metody wysokoprzepustowego pomiaru NET w ludzkich neutrofilach in vitro. Techniki ilościowego oznaczania pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili pozwalają badać mechanizmy zapalne i regulację chorób zapalnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Specjalne podziękowania dla personelu laboratorium Centrum Zdrowia Uniwersytetu Georgia za ich ciągłe wsparcie dla naszej pracy nad izolacją ludzkich neutrofili. Prace te były wspierane przez fundusz startowy dr Rady zapewniony przez Biuro Wiceprezesa UGA ds. Badań.

Instytucjonalna Komisja Rewizyjna Uniwersytetu Georgia zatwierdziła badanie z udziałem ludzi w celu pobrania krwi obwodowej od zdrowych ochotników (UGA# 2012-10769-06). 5,7,8 Ochotnicy podpisali wymagany formularz świadomej zgody przed pobraniem krwi. Badania przeprowadzone w tym artykule są zgodne z wytycznymi etycznymi dotyczącymi badań medycznych z udziałem ludzi, zawartymi w Deklaracji Helsińskiej.
1. Izolacja neutrofili z obwodowej krwi ludzkiej (Rysunek 1)
Uwaga: Istnieje kilka sposobów izolowania neutrofili z krwi obwodowej. Poniższy protokół zapewnia jedną z możliwości. Protokół ten daje dużą liczbę nieaktywowanych ludzkich neutrofili zdolnych do uwalniania NET po zewnętrznej stymulacji. Użyj 40 ml krwi pełnej uzyskanej od zdrowych ochotników przez nakłucie żyły. 7,9
<ol>
	<li>Podwielokrotność 20 ml krwi rozlać do dwóch stożkowych probówek o pojemności 50 ml. Dodać 10 ml 6% dekstranu. Delikatnie wymieszaj.</li>
	<li>Po 20 minutach przenieś górną fazę bogatą w leukocyty bez pobierania granulowanych czerwonych krwinek do czystych stożkowych probówek o pojemności 50 ml i napełnij ją sterylnym PBS.</li>
	<li>Odwirować przy 400 x g 10 min. Zawiesić osad w 4 ml sterylnego PBS.</li>
	<li>Przygotuj 5-stopniowy gradient Percoll 85%-80%-75%-70%-65% w dwóch stożkowych probówkach o pojemności 15 ml i nałóż 2 ml zawiesiny leukocytów na każdy gradient.</li>
	<li>Wirować 800 x g przez 30 minut przy wyłączonych hamulcach.</li>
	<li>Zbierz wszystkie komórki (neutrofile) w warstwach na granicy 75%/80% i 70%/75%.</li>
	<li>Umyj komórki dwukrotnie w PBS (350 x g, 10 min, RT) i policz komórki za pomocą hemocytometru.</li>
</ol>
2. Pomiar kinetyki uwalniania zewnątrzkomórkowego DNA za pomocą fluorymetru mikropłytkowego
Uwaga: Metoda ta umożliwia pomiar zmian fluorescencji nieprzepuszczalnego dla błony barwnika wiążącego DNA, wskazującego na uwalnianie DNA na 96-dołkowej mikropłytce (ryc. 2).
<ol>
	<li>Przygotować zawiesinę neutrofili w pożywce do oznaczania (HBSS + 1% (v/v) surowica autologiczna + 5 mM glukozy) w stężeniu 2 x 106 komórek/ml.</li>
	<li>Dodać 5 μmol/l nieprzepuszczalnego dla błony barwnika wiążącego DNA. Delikatnie wymieszaj.</li>
	<li>Podwielokrotność ludzkich neutrofili (50 μl/dołek) na 96-dołkowe czarne, przezroczyste mikropłytki dolne. Upewnij się, że podłoże testowe pokrywa całe dno studzienki. Jeśli nie, delikatnie postukaj w talerz z boku.</li>
	<li>Rozgrzać płytkę zawierającą neutrofile przez 10 minut w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>W międzyczasie należy przygotować roztwory bodźców o podwójnym stężeniu końcowym, które mają być użyte (w ciepłym pożywce do oznaczania o temperaturze 37 °C). Jako dodatnią kontrolę NET użyj ludzkich neutrofili ze 100 nM octanem forbolu (PMA) przez 4 godziny, aby wyzwolić maksymalne uwalnianie NET. Stymulacja 5,8 PMA przez 4 godziny zapewnia maksymalne uwolnienie NET, podczas gdy spontaniczne tworzenie NET pozostaje na niskimpoziomie 5,8.</li>
	<li>Przygotować fluorymetr na mikropłytce do pomiaru (4 godziny, 37 °C, 530 nm dla wzbudzenia i 590 nm dla emisji).</li>
	<li>Stymulować neutrofile, dodając 50 μl roztworu stymulującego do 50 μl zawiesin neutrofili. Użyj 0,5 μg/ml saponiny w jednym dołku, aby zmierzyć maksymalny sygnał uwalniania DNA.</li>
	<li>Umieść płytkę w czytniku i mierz zmiany fluorescencji przez 4 godziny co 2 minuty bez wstrząsania.</li>
	<li>Do analizy danych oblicz znormalizowane wzrosty fluorescencji w czasie.
	<ol>
		<li>Odejmij fluorescencję wyjściową od wartości końcowych dla wszystkich studzienek, w tym saponiny (Rysunek 2A, B). Wzrost fluorescencji saponin powinien być najwyższym sygnałem. Nazywa się to "maksymalnym uwalnianiem DNA" (ryc. 2A).</li>
		<li>Oblicz procenty uwolnienia DNA w nieznanych próbkach, dzieląc wzrost fluorescencji nieznanych próbek przez maksymalne uwolnienie DNA.</li>
		<li>Uśrednione wyniki kontrprób i przedstaw je jako "% maksymalnego uwolnienia DNA" (Figura 2C).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Kwantyfikacja powstawania NET za pomocą testów MPO-DNA i HNE-DNA ELISA
Uwaga: Testy te zmodyfikowane (MPO-DNA) lub ustalone (HNE-DNA) w naszym laboratorium określają ilościowo tworzenie NET poprzez pomiar poziomów kompleksów MPO-DNA i HNE-DNA. 5
<ol>
	<li>Pokryj 96-dołkowe płytki ELISA o wysokiej zdolności wiązania przez noc przeciwciałami wychwytującymi (50 μl/dołek): anty-MPO (rozcieńczenie 1:2,000) lub anty-HNE (1:2,000).</li>
	<li>Umyj płytki ELISA trzykrotnie PBS (200 μl/dołek) i zablokuj je 5% BSA i 0,1% albuminy surowicy ludzkiej przez 2 godziny w RT (200 μl/basenik). Umyj trzy razy PBS.</li>
	<li>Wysiewaj neutrofile na 96-dołkowych mikropłytkach o gęstości 100 000 komórek/studzienkę w pożywce testowej 100 μl i stymuluj tworzenie NET. Inkubować komórki: 4 godziny w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Przeprowadzić ograniczone trawienie DNazy, dodając 2 U/ml DNazy do supernatantów neutrofili, dobrze je wymieszać. Trzymaj je w RT.</li>
	<li>Zatrzymać DNazę po 15 minutach, dodając 11 μl 25 mM EGTA (stężenie końcowe 2,5 mM). Dobrze wymieszaj. Zebrać supernatanty w czystych probówkach do mikrofuge. Wiruj próbki, aby pozbyć się resztek komórek w temperaturze 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Przenieś ich supernatanty do czystych probówek do mikrofiltrów. Trzymaj je na lodzie, aż będą gotowe.</li>
	<li>Użyj podwielokrotności wcześniej przygotowanego "standardu NET". 
	Uwaga: Standard NET jest mieszanką trawionych przez DNazę supernatantów neutrofili stymulowanych PMA, uzyskanych od co najmniej 5 różnych, niezależnych dawców ludzkich.
	<ol>
		<li>Aby używać tego samego wzorca przez długi czas, należy zebrać i podwielokrotnić dużą ilość supernatantów neutrofilowych od każdego indywidualnego dawcy. Zebranie na przykład 2 ml trawionych przez DNazę supernatantów neutrofili stymulowanych PMA da 200 podwielokrotności (po 10 μl każdy) wystarczających na 200 płytek ELISA. Dane charakteryzujące standard NET znajdują się na rysunku 5.</li>
		<li>Stymuluj ludzkie neutrofile za pomocą 100 nM PMA przez 4 godziny i zastosuj trawienie DNazy do ich supernatantów zgodnie z krokami 3.4-3.5.</li>
		<li>Zebrać, połączyć, podzielić (10 μl) i zamrozić (-20 °C) supernatanty neutrofilowe.</li>
		<li>Aby przygotować "standard NET", należy rozmrozić jedną porcję/donor uzyskany od co najmniej pięciu oddzielnych dawców, wymieszać je i przechowywać na lodzie.</li>
		<li>Wyrzuć rozmrożone próbki i użyj świeżych do następnego eksperymentu.</li>
		<li>Przygotować seryjne rozcieńczenie standardu NET w stosunku 1:2 w PBS+EGTA.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozcieńczyć próbki strawione przez DNazę1 (standardowe i nieznane supernatanty) 20-krotnie w PBS+EGTA i podzielić je na podwielokrotności na płytkach ELISA pokrytych przeciwciałami wychwytującymi.</li>
	<li>Inkubować płytki ELISA przez noc w temperaturze 4 °C i przemyć je trzykrotnie PBS.</li>
	<li>Zastosuj roztwór przeciwciała detekcyjnego (100 μl/dołek): przeciwciało anty-DNA sprzężone z peroksydazą chrzanu (1:500, mysz). Inkubować przez 1 godzinę w ciemności.</li>
	<li>Po czterech płukaniach PBS dodać substrat peroksydazy TMB: 100 μl/dołek, 30 min. Niebieskie zabarwienie jest wskazaniem na aktywność peroksydazy (obecne NET).</li>
	<li>Zatrzymać reakcję, dodając 100 μl/basenik 1 M HCl. Niebieskie roztwory zmienią kolor na żółty (Rysunek 5A).</li>
	<li>Odczytać absorbancję przy 450 nm za pomocą fotometru mikropłytki.</li>
	<li>W celu analizy danych należy obliczyć ilość kompleksów MPO-DNA LUB HNE-DNA w porównaniu ze standardem NET.
	<ol>
		<li>Odjąć wartość gęstości optycznej tła pożywki do oznaczania od wszystkich próbek.</li>
		<li>Wykreślić wartości absorbancji (oś X) rozcieńczonych próbek wzorcowych w stosunku do ich względnej zawartości NET (oś Y) (rysunek 5A).</li>
		<li>Korzystając z nienasyconego zakresu tej krzywej standardowej, ustal linię trendu (użyj najlepszego dopasowania wykładniczego z używanego oprogramowania) (Rysunek 5A). Równanie tej linii trendu określa konwersję wartości OD na ilościowe ilości NET.</li>
		<li>Wprowadzić zmierzone wartości OD niewiadomych do równania linii trendu z 3.13.3, które da ilość NET w nieznanej próbce jako procent normy NET (rysunek 5A).</li>
		<li>Obliczyć średnie powtórzeń (potrójne) i przedstawić dane końcowe jako "ilość kompleksów MPO-DNA lub HNE-DNA (% wzorca)" (Rysunek 5C).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303, 1532-1535 (2004).</li>
<li>Fuchs, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+cell+death+program+leads+to+neutrophil+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps.</a> J Cell Biol. 176, 231-241 (2007).</li>
<li>Kessenbrock, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Netting+neutrophils+in+autoimmune+small-vessel+vasculitis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Netting neutrophils in autoimmune small-vessel vasculitis.</a> Nat Med. 15, 623-625 (2009).</li>
<li>Leffler, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Degradation+of+neutrophil+extracellular+traps+co-varies+with+disease+activity+in+patients+with+systemic+lupus+erythematosus%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Degradation of neutrophil extracellular traps co-varies with disease activity in patients with systemic lupus erythematosus.</a> Arthritis Res Ther. 15, R34(2013).</li>
<li>Yoo, D. G., Floyd, M., Winn, M., Moskowitz, S. M., Rada, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NET+formation+induced+by+Pseudomonas+aeruginosa+cystic+fibrosis+isolates+measured+as+release+of+myeloperoxidase-DNA+and+neutrophil+elastase-DNA+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Lett%22%5BJournal%5D)">NET formation induced by Pseudomonas aeruginosa cystic fibrosis isolates measured as release of myeloperoxidase-DNA and neutrophil elastase-DNA complexes.</a> Immunol Lett. 160, 186-194 (2014).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+hypercitrullination+mediates+chromatin+decondensation+and+neutrophil+extracellular+trap+formation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Histone hypercitrullination mediates chromatin decondensation and neutrophil extracellular trap formation.</a> J Cell Biol. 184, 205-213 (2009).</li>
<li>Pang, L., Hayes, C. P., Buac, K., Yoo, D. G., Rada, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudogout-associated+inflammatory+calcium+pyrophosphate+dihydrate+microcrystals+induce+formation+of+neutrophil+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Pseudogout-associated inflammatory calcium pyrophosphate dihydrate microcrystals induce formation of neutrophil extracellular traps.</a> J Immunol. 190, 6488-6500 (2013).</li>
<li>Yoo, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Release+of+cystic+fibrosis+airway+inflammatory+markers+from+Pseudomonas+aeruginosa-stimulated+human+neutrophils+involves+NADPH+oxidase-dependent+extracellular+DNA+trap+formation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Release of cystic fibrosis airway inflammatory markers from Pseudomonas aeruginosa-stimulated human neutrophils involves NADPH oxidase-dependent extracellular DNA trap formation.</a> J. Immunol. 192, 4728-4738 (2014).</li>
<li>Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed,, Goosmann, U., Zychlinsky, C., A, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps%2C+how+to+generate+and+visualize+them%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps, how to generate and visualize them.</a> J. Vis. Exp. , (2010).</li>
<li>Rada, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyocyanin-enhanced+neutrophil+extracellular+trap+formation+requires+the+NADPH+oxidase%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Pyocyanin-enhanced neutrophil extracellular trap formation requires the NADPH oxidase.</a> PLoS One. 8, e54205(2013).</li>
<li>Neumann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+antimicrobial+peptide+LL-37+facilitates+the+formation+of+neutrophil+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">The antimicrobial peptide LL-37 facilitates the formation of neutrophil extracellular traps.</a> Biochem J. 464, 3-11 (2014).</li>
<li>Leon, S. A., Shapiro, B., Sklaroff, D. M., Yaros, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Free+DNA+in+the+serum+of+cancer+patients+and+the+effect+of+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Free DNA in the serum of cancer patients and the effect of therapy.</a> Cancer Res. 37, 646-650 (1977).</li>
<li>Raptis, L., Menard, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+and+characterization+of+plasma+DNA+in+normals+and+patients+with+systemic+lupus+erythematosus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Quantitation and characterization of plasma DNA in normals and patients with systemic lupus erythematosus.</a> J Clin Invest. 66, 1391-1399 (1980).</li>
<li>Chang, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevated+cell-free+serum+DNA+detected+in+patients+with+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chim+Acta%22%5BJournal%5D)">Elevated cell-free serum DNA detected in patients with myocardial infarction.</a> Clin Chim Acta. 327, 95-101 (2003).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

NET reprezentują fascynujący nowy mechanizm, za pomocą którego neutrofile zabijają patogeny. 1 Chociaż literatura na temat NET stale się poszerza w ciągu ostatnich dziesięciu lat od ich odkrycia, kilka ważnych pytań związanych z ich rolą w biologii, mechanizmach i regulacji pozostaje niejasnych. Należy opracować odpowiednią metodologię pomiaru NET, tego bardzo unikalnego mechanizmu przeciwdrobnoustrojowego. W tym artykule opisano metody, których można użyć do ilościowego określania sieci NET w sposób o wysokie...

NET Powstawanie jest nowym mechanizmem, za pomocą którego neutrofile zwalczają patogeny. 1 Rdzeniem sieci NET jest jądrowe DNA. 1 Ta sieć DNA jest związana z białkami granulek neutrofili i histonami. 1 Główną formą powstawania NET jest śmierć neutrofili charakteryzująca się dekondensacją chromatyny, zanikiem błon ziarnistych i jądrowych, translokacją elastazy neutrofili do jądra, cytrulinacją histonów i wreszcie wyciekiem NET opartych na DNA. cyfra arabska NET więzią i zabijają szeroką gamę drobnoustrojów i są istotną częścią wrodzonego repertuaru broni immunologicznej. Niekontrolowane tworzenie NET jest jednak powiązane z licznymi chorobami autozapalnymi. 3,4 Pomimo coraz większego znaczenia tych zjawisk, niewiele wiadomo na temat mechanizmu i regulacji uwalniania NET. 
Neutrofile umierające przez uwolnienie NET różnią się od neutrofili apoptotycznych czy nekrotycznych. 3,5 Neutrofile uwalniające NET wykazują kilka cech charakterystycznych dla powstawania NET. Składniki granulek są związane z DNA w sieciach NET. 1 Mieloperoksydaza (MPO) i ludzka elastaza neutrofilowa (HNE) znajdują się w pierwotnych ziarnistościach w komórkach w stanie spoczynku, ale są translokowane do jądra, aby związać się z DNA w NET. 1 Kompleksy MPO-DNA i HNE-DNA są specyficzne dla NET, nie występują w apoptotycznych lub neutrofilach neutrochłonnych. 1,3,5 Dekondensacja chromatyny to kolejna cecha typowa dla NETosis. cyfra arabska Uwolnienie NET wymaga również cytrulinacji histonów przez aminidazę peptydylu 4 (PAD4). 6 Cytrynowane histony są cechami charakterystycznymi neutrofili, które uległy uwolnieniu NET. 6
Tutaj przedstawiono trzy metody, które w połączeniu dostarczają doskonałych narzędzi do ilościowego oznaczania NET na skali o wysokiej przepustowości. Pierwszy test został zastosowany w terenie z różnymi zmianami i określa ilościowo uwalnianie zewnątrzkomórkowego DNA w formacie mikropłytki. Drugi i trzeci test zapewniają potwierdzenie NET poprzez pomiar specyficznych dla NET kompleksów MPO-DNA i HNE-DNA.

<table><tbody><tr><td>Elastaza anty-ludzka neutrofilowa&nbsp; Królik Ab&nbsp;</td><td>Calbiochem</td><td>481001</td><td>1:2,000x powlekana</td></tr><tr><td>anty-mieloperoksydaza Ab (królik)</td> <td>Millipore</td><td>07-496</td><td>1:2,000x powlekana</td></tr><tr><td>DNaza-1</td><td>Roche</td><td>10-104-159-001</td><td>1 &#181; g/ml używany do trawienia</td></tr><tr><td>20 mM EGTA/ PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889-25G</td><td></td></tr><tr><td>2,5 mM EGTA/PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889-25G</td><td></td></tr><tr><td>Wykrywanie śmierci komórki ELISA Anti-DNA POD</td><td>Roche</td><td>11544675001</td><td>1:500x&nbsp;</td></tr><tr><td>Spektrofotometr Eon Microplate</td><td>Biotek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gen5 All-in-One oprogramowanie do mikropłytek</td><td>Narzędzie analityczne Biotek</td><td></td><td>(ELISA)</td></tr><tr><td>Sytox orange</td><td>Life Technology</td><td>S11368</td><td>0,2% końcowe stężenie / objętość</td></tr><tr><td>1 M Hepes</td><td>Cellgro</td><td>25-060-Cl</td><td>Użyj 10 mM stężenie końcowe.</td></tr><tr><td>1 M</td><td>glukoza Sigma</td><td></td><td>Użyj 5 mM stężenie końcowe.</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Corning</td><td>21-023-CM</td><td></td></tr><tr><td>Varioskan Flash Ver.2.4.3</td><td>Thermoscientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PMA</td><td>Sigma</td><td>P 8139</td><td>100 nM final used</td></tr><tr><td>Płytka ELISA</td><td>Greiner bio-one</td><td>655061</td><td></td></tr><tr><td>Probówki stożkowe 15 ml</td><td>Thermoscientific</td><td>339650</td><td></td></tr><tr><td>Probówki stożkowe 50 ml</td><td>Thermoscientific</td><td>339652</td><td></td></tr><tr><td>Perkol (pH 8,5-9,5)&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P 1644</td><td>Chlorek sodu, Sigma, S7653-250G</td></tr><tr><td>Dextran</td><td>Spectrum</td><td>D1004</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 media</td><td>Corning Cellgro</td><td>17-105-CV</td><td></td></tr><tr><td>96 płytka do oznaczania dołków płytka z przezroczystym dnem</td><td>Costar</td><td>3603</td><td></td></tr></tbody></table>

wysokoprzepustowy pomiar uwalniania zewnątrzkomórkowego dna i ilościowego tworzenia net w ludzkich neutrofilach in vitro

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

Granulocyty neutrofilowe są najliczniejszymi leukocytami w ludzkiej krwi. Neutrofile są pierwszymi, które docierają do miejsca infekcji. Neutrofile rozwinęły kilka mechanizmów przeciwdrobnoustrojowych, w tym fagocytozę, degranulację i tworzenie pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili (NET). NET składają się z rusztowania DNA ozdobionego histonami i kilkoma markerami granulek, w tym mieloperoksydazą (MPO) i ludzką elastazą neutrofilową (HNE). Uwalnianie NET jest aktywnym procesem obejmującym charakterystyczne zmiany morfologiczne neutrofili prowadzące do wydalenia ich DNA do przestrzeni zewnątrzkomórkowej. NET są niezbędne do walki z drobnoustrojami, ale niekontrolowane uwalnianie NET wiąże się z kilkoma zaburzeniami. Aby dowiedzieć się więcej o znaczeniu klinicznym i mechanizmie powstawania NET, potrzebne są niezawodne narzędzia zdolne do ilościowego oznaczania NET. 
Tutaj przedstawione są trzy metody, które mogą ocenić uwalnianie NET z ludzkich neutrofili in vitro. Pierwszym z nich jest wysokoprzepustowy test do pomiaru uwalniania zewnątrzkomórkowego DNA z ludzkich neutrofili przy użyciu nieprzepuszczalnego dla błony barwnika wiążącego DNA. Ponadto opisano dwie inne metody zdolne do ilościowego określania powstawania NET poprzez pomiar poziomów specyficznych dla NET kompleksów MPO-DNA i HNE-DNA. Te metody oparte na mikropłytkach w połączeniu zapewniają doskonałe narzędzia do skutecznego badania mechanizmu i regulacji powstawania NET u ludzkich neutrofili.

Ryciny w niniejszym manuskrypcie opisują metodę izolacji neutrofili, procedury eksperymentalne oraz przedstawiają reprezentatywne wyniki wraz z wyjaśnieniem analizy danych. Rycina 1 przedstawia kolejne etapy przygotowania ludzkich neutrofili. Niniejszy protokół stanowi jedynie jeden z możliwych sposobów izolacji neutrofili. Pozwala on na uzyskanie dużych ilości neutrofili w stanie spoczynku, zdolnych do uwalniania NET po stymulacji. Rycina 2 pokazuje zasa...

Testy o wysokiej przepustowości są prezentowane, które w połączeniu dostarczają doskonałych narzędzi do ilościowego oznaczania uwalniania NET z ludzkich neutrofili.

Wysokoprzepustowy pomiar uwalniania zewnątrzkomórkowego DNA i ilościowego tworzenia NET w ludzkich neutrofilach in vitro

Neutrophil granulocytes are the most abundant leukocytes in the human blood. Neutrophils are the first to arrive at the site of infection. Neutrophils ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest ilościowe oznaczenie pozakomórkowych pułapek neutrofilowych, czyli NETs, uwalnianych z ludzkich neutrofili w skali wysokoprzepustowej. Przedstawione tutaj metody mogą pomóc w uzyskaniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu stanów zapalnych oraz modyfikacji chorób zapalnych poprzez badanie mechanizmu i regulacji tworzenia pozakomórkowych pułapek neutrofilowych in vitro w ludzkich neutrofilach. Zastosowanie tej techniki obejmuje identyfikację centralnych szlaków sygnalizacyjnych pośredniczonych przez NET oraz cząsteczek hamujących lub stymulujących powstawanie NET.Aby wyizolować neutrofile z krwi, odmień 20 mililitrów ludzkiej krwi do stożkowych probówek o pojemności 250 mililitrów. Dodaj 10 mililitrów 6% dekstranu, następnie delikatnie wymieszaj i pozostaw roztwory w temperaturze pokojowej na 20 minut. Ostrożnie przenieś górną fazę bogatą w leukocyty do czystych probówek stożkowych o pojemności 50 mililitrów, a następnie dopełnij probówkę do pełna sterylnym PBS.Następnie odwiruj próbkę przy 400 ×g przez dziesięć minut i użyj 15 mL sterylnego PBS do resuspensji pelletu. Powtórz ten etap płukania jeszcze raz. Następnie przygotuj pięciostopniowe gradienty Percoll o stężeniach 85%, 80%, 75%, 70% i 65% w stożkowych probówkach o pojemności 215 mL i nanieś dwa mL zawiesiny leukocytów na wierzch każdego gradientu.Następnie wiruj gradienty z prędkością 800 ×g przez 30 minut z wyłączonym hamulcem. Po wirowaniu zbierz komórki znajdujące się w warstwach na granicach 75-80% oraz 70-75%. Przemyj komórki dwukrotnie w PBS, a następnie policz je za pomocą hemocytometru.Aby zmierzyć kinetykę uwalniania zewnątrzkomórkowego DNA, należy przygotować zawiesinę neutrofili w medium do testu o stężeniu 2×10⁶ komórek/ml. Dodać 5 µmol/l SYTOX orange, który jest nieprzenikającym przez błony barwnikiem wiążącym DNA, i delikatnie wymieszać. Rozdzielić neutrofile ludzkie do sterylnych czarnych mikropłytek 96-dołkowych z przezroczystym dnem, upewniając się, że medium do testu całkowicie pokrywa dno dołka.Jeśli nie, delikatnie stuknij płytkę z boku. Inkubuj płytkę w temperaturze 37 °C przez 10 minut. W międzyczasie, używając podłoża do testu o temperaturze 37 °C, przygotuj roztwory zawierające stymulatory w dwukrotnym stężeniu końcowym, które zostaną użyte.Jako pozytywną kontrolę NET, przygotuj 100 nanomolar phorbol myristate acetate (PMA) do traktowania ludzkich neutrofili przez cztery godziny w celu wywołania maksymalnego uwalniania NET. Następnie przygotuj fluorometr do mikropłytek do pomiaru. Stymuluj neutrofile, dodając 50 microliters roztworu stymulującego do 50 microliters zawiesiny neutrofili.Do jednego dołka dodaj saponinę do stężenia końcowego 0,5 mg/mL, aby zmierzyć maksymalny sygnał uwalniania DNA. Umieść płytkę w czytniku i mierz zmiany fluorescencji w odstępach dwuminutowych przez cztery godziny bez wstrząsania. Aby przeanalizować dane, oblicz znormalizowane wzrosty fluorescencji w czasie, odejmując fluorescencję podstawową od wartości końcowych dla wszystkich dołków, w tym dla dołka z saponiną.Wzrost fluorescencji saponin powinien stanowić najwyższy sygnał i jest określany jako maksymalne uwalnianie DNA. Wyniki z powtórzeń należy uśrednić i przedstawić jako procent maksymalnego uwalniania DNA. Aby ilościowo określić tworzenie NET za pomocą testów ELISA MPO-DNA i HNE-DNA, należy dodać przeciwciała wychwytujące anty-MPO lub anty-HNE do płytek ELISA o wysokiej zdolności wiązania z 96 dołkami i inkubować je przez noc w celu powlekania.Następnego ranka użyj 200 µL PBS na dołek, aby trzykrotnie przemyć płytki ELISA. Następnie użyj 200 µL 5% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) oraz 0,1% albuminy surowicy ludzkiej (HSA), aby zablokować dołki w temperaturze pokojowej przez dwie godziny. W międzyczasie wysiej neutrofile w 100 µL medium do testu na płytkę 96-dołkową w gęstości 100 000 komórek na dołek i indukuj tworzenie NET po dodaniu stymulatorów poprzez inkubację w temperaturze 37 °C przez cztery godziny.Następnie przeprowadź ograniczoną trawienie DNazą, dodając dwie jednostki na mililitr DNAse do supernatantów neutrofili, po czym wymieszaj dokładnie i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Następnie zatrzymaj reakcję, dodając 15 µL 25 mM EGTA i wymieszaj dokładnie. Zbierz supernatanty do czystych probówek do wirówirki i odwiruj próbki w celu usunięcia szczątków komórkowych przy 300 ×g w temperaturze pokojowej przez pięć minut.Gromadzenie NETów bez ograniczonego trawienia prowadzi do niespójnych danych. Etap ograniczonego trawienia DNA jest kluczowy dla uzyskania powtarzalnych wyników. W związku z tym zoptymalizowano stężenie enzymu DNase I oraz czas trwania trawienia.Przenieś nadsącz do czystych probówek do mikrowirówki i przechowuj na lodzie. Następnie, wykorzystując alikwot wcześniej przygotowanego standardu NET, przygotuj rozcieńczenie jeden do dwóch w PBS i EGTA. Teraz użyj PBS z EGTA, aby rozcieńczyć próbki trawione DNazą I dwudziestokrotnie i nanieś je w formie alikwotów na płytki ELISA pokryte przeciwciałami wychwytującymi.Inkubować płytki przez noc w temperaturze 4 °C. Przed trzykrotnym przemyciem płytek roztworem PBS, nanieść 100 µL na dołek roztworu przeciwciała detekcyjnego, np. przeciwciała anty-DNA sprzężonego z peroksydazą chrzanową, i inkubować w ciemności przez jedną godzinę. Po czterokrotnym przemyciu roztworem PBS, dodać 100 µL na dołek substratu peroksydazy TMB i inkubować przez 30 minut.Niebieskie zabarwienie wskazuje na aktywność peroksydazy i obecność NETs. Aby zatrzymać reakcję, należy dodać 100 µL 1 M HCl. Niebieskie roztwory zmienią kolor na żółty.Za pomocą fotometru do mikropłytek odczytano absorbancję przy 450 nanometrach. Aby porównać ilość zmierzonych kompleksów MPO-DNA lub HNE-DNA w odniesieniu do standardu NET, od wszystkich próbek odjęto tło gęstości optycznej, a następnie naniesiono wartości absorbancji rozcieńczonych próbek standardowych względem ich względnej zawartości NET. Wykorzystując nienasycony zakres tej krzywej wzorcowej, wyznaczono linię trendu, stosując najlepsze dopasowanie wykładnicze dostępne w używanym oprogramowaniu.Wstaw zmierzone wartości OD próbek nieznanych do równania linii trendu, aby uzyskać ilość NET w próbce nieznanej jako procent standardu NET. Na koniec oblicz średnie z powtórzeń i przedstaw końcowe dane jako ilość kompleksów MPO-DNA lub HNE-DNA. Przedstawione tutaj dane są reprezentatywne dla fluorescencyjnego testu uwalniania DNA z ludzkich neutrofili niepobudzonych lub aktywowanych PMA lub P-aeruginosa.P-aeruginosa wywołuje tworzenie NET w ludzkich PMN. Wykres ten ilustruje sposób obliczania średnich przyrostów fluorescencji w powtórzonych dołkach, które zostały znormalizowane względem maksymalnej fluorescencji i wyrażone jako uwalnianie DNA. Przedstawione obrazy fluorescencyjne obrazują neutrofile niepoddane działaniu czynników lub stymulowane PMA.Przedstawiono tutaj obrazy immunofluorescencyjne niestymulowanych oraz aktywowanych PMA i PA01 ludzkich neutrofili z testu ELISA na MPO-DNA i HNE-DNA. Zewnątrzkomórkowe DNA wykazuje typową morfologię NET i kolokalizuje się z MPO oraz cytrulinowanym histonem H4, który jest markerem tworzenia NET. Eksperyment ten obrazuje uwalnianie MPO-DNA i HNE-DNA w ludzkich neutrofilach przy użyciu tego samego testu.Standard NET zawiera średnio 19,5 µg/mL pozakomórkowego DNA, 399 ng/mL MPO oraz 103,4 ng/mL HNE. Biorąc pod uwagę masy cząsteczkowe MPO i HNE oraz fakt, że jeden mikrogram DNA zawiera 9,91 × 10¹⁴ nukleotydów, standard NET zawiera 109 cząsteczek HNE i 147 cząsteczek MPO na 1 000 nukleotydów. Wreszcie, eksperymenty z dwukrotnymi rozcieńczeniami seryjnymi standardu NET wykazują, że zakresy dynamiczne testów ELISA dla MPO-DNA i HNE-DNA mieszczą się w przedziale od 19 do 609 ng/mL DNA.Po opanowaniu techniki, kwas oparty na barwniku SYTOX orange można łatwo i szybko przygotować w ciągu jednej godziny, co pozwala na uzyskanie wyników następnego dnia. Testy ilościowe NET są również łatwe do przeprowadzenia i przy prawidłowym wykonaniu dostarczą danych w dniu następnym. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak w sposób wysokoprzepustowy określić ilość naturalazy w ludzkich neutrofilach.

high-throughput-measurement-extracellular-dna-release-quantitative

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Wysoka wydajność pomiaru uwalniania pozakomórkowego DNA i ilościowego tworzenia sieci neutrofilowych (NET) w neutrofilach ludzkich in vitro

Ten film demonstruje technikę in vitro do generowania i izolowania neutrofili w pułapkach zewnątrzkomórkowych (NET). Neutrofile są izolowane z krwi obwodowej i stymulowane octanem mirystynianu forbolu (PMA) w celu wytworzenia NET. Podczas inkubacji neutrofile przechodzą proces śmierci komórki (NETosis) w celu uwolnienia NET zawierających zdekondensowaną chromatynę zmieszaną z ziarnistymi białkami cytoplazmatycznymi.

Technika in vitro do generowania ludzkich pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofilów

Przyleganie neutrofili do aktywowanego śródbłonka w miejscach infekcji jest integralnym składnikiem odpowiedzi zapalnej gospodarza. W niniejszym raporcie opisano test wiązania neutrofili, który pozwala na ilościowe określenie in vitro pierwotnego wiązania ludzkich neutrofili z komórkami śródbłonka aktywowanymi przez mediatory stanu zapalnego w warunkach statycznych.

Ilościowy test in vitro do pomiaru adhezji neutrofili do aktywowanych pierwotnych ludzkich komórek śródbłonka mikronaczyniowego w warunkach statycznych

Pułapki zewnątrzkomórkowe (NET) to sieci DNA, histonów i białek neutrofilowych. Chociaż jest to składnik wrodzonej odpowiedzi immunologicznej, NET są zaangażowane w autoimmunizację i zakrzepicę. Protokół ten opisuje prostą metodę izolacji neutrofili u psów i ilościowego oznaczania NET za pomocą testu fluorescencji mikropłytek.

Prosty test fluorescencyjny do ilościowego oznaczania uwalniania zewnątrzkomórkowej pułapki neutrofili u psów

Opisujemy metody izolowania neutrofili u psów z krwi pełnej i wizualizacji powstawania NET w żywych neutrofilach za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Opisano również protokoły ilościowego oznaczania powstawania NET i ekspresji cytrulinowanego histonu H3 (citH3) za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej.

In vitro Tworzenie zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofili u psów: analiza dynamiczna i ilościowa za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Tutaj prezentujemy protokół do generowania zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofili (NET) i obsługi NETQUANT, w pełni automatycznej opcji oprogramowania do ilościowego oznaczania NET w obrazach immunofluorescencyjnych.

Zautomatyzowana kwantyfikacja oparta na obrazie pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili przy użyciu NETQUANT

Ten protokół opisuje wysoce czuły i wysokoprzepustowy test pułapki zewnątrzkomórkowej neutrofili (NET) do półautomatycznego oznaczania ilościowego tworzenia ex vivo NET za pomocą immunofluorescencji trójwymiarowej mikroskopii konfokalnej. Protokół ten może być wykorzystany do oceny powstawania i degradacji NET po różnych bodźcach i może być wykorzystany do badania potencjalnych terapii ukierunkowanych na NET.

Wysokoprzepustowy test do oceny i ilościowego określania tworzenia pułapek zewnątrzkomórkowych w neutrofilach

Przedstawiamy protokół zmodyfikowanej techniki testu immunoenzymatycznego połączonego z enzymem kanapkowym do ilościowego pomiaru dwóch składników pozostałości po pułapkach zewnątrzkomórkowych neutrofili, kompleksów DNA sprzężonego z mieloperoksydazą i sprzężonego DNA elastazy neutrofilowej, pochodzących z aktywowanych neutrofili.

Kwantyfikacja kompleksów mieloperoksydazy-DNA i elastazy neutrofilowej z zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofili przy użyciu zmodyfikowanego testu ELISA typu kanapkowego

Prezentujemy zautomatyzowaną, wysokoprzepustową metodę ilościowego oznaczania pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili (NET) przy użyciu systemu analizy żywych komórek, w połączeniu z zależnym od przepuszczalności błony metodą podwójnego barwnika.

Technika wysokoprzepustowa w czasie rzeczywistym do ilościowego określania tworzenia się pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili w ludzkich neutrofilach

Ten zdefiniowany protokół opisuje podejście do mikroskopii wysokoprzepustowej w czasie rzeczywistym w celu wizualizacji i ilościowego określenia uwalniania ludzkich neutrofili zewnątrzkomórkowych (NET) in vitro. Powtarzalna metoda pozwala na zbadanie charakterystyki i kinetyki uwalniania NET po stymulacji odrębnymi induktorami NETozy oraz umożliwia ocenę farmakologii antagonistów NETozy.

Wysokoprzepustowa, mikroskopowa kwantyfikacja uwalniania ludzkich neutrofili z zewnątrzkomórkowych pułapek i ocena farmakologii antagonistów w czasie rzeczywistym

Przedstawiamy sposób wykorzystania mikroskopii dwufotonowej do obserwacji dynamiki granulocytów neutrofilnych w zainfekowanych płucach podczas fagocytowania patogenów lub wytwarzania zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofilowych (NETs).

Bezpośrednia obserwacja fagocytozy i tworzenia sieciy z neutrofili (NET) w zakażonych płucach przy użyciu mikroskopii dwufotonowej

Poznaj metody wysokoprzepustowego pomiaru NET w ludzkich neutrofilach in vitro. Techniki ilościowego oznaczania pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili pozwalają badać mechanizmy zapalne i regulację chorób zapalnych.

Wysokoprzepustowy pomiar uwalniania zewnątrzkomórkowego DNA i ilościowego tworzenia NET w ludzkich neutrofilach in vitro

Przeglądaj więcej filmów