Wysokoprzepustowy pomiar uwalniania zewnątrzkomórkowego DNA i ilościowego tworzenia NET w ludzkich neutrofilach in vitro

Ogólnym celem tej procedury jest ilościowe określenie pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili lub NET uwalnianych z ludzkich neutrofili w skali wysokoprzepustowej. Przedstawione tutaj metody mogą pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie zapalenia i zmiany chorób zapalnych poprzez badanie mechanizmu i regulacji tworzenia się zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofili in vitro w ludzkich neutrofilach. Implikacje tej techniki obejmują identyfikację centralnych szlaków sygnałowych pośredniczących w NET oraz cząsteczek hamujących NET lub stymulujących NET.

Aby wyizolować neutrofile z krwi, wlej 20 mililitrów ludzkiej krwi do 250-mililitrowych stożkowych probówek. Dodaj 10 mililitrów 6% dekstranu, a następnie delikatnie wymieszaj i pozostaw roztwory w temperaturze pokojowej na 20 minut. Ostrożnie przenieś górną fazę bogatą w leukocyty do czystych stożkowych probówek o pojemności 50 mililitrów i użyj sterylnego PBS, aby napełnić probówkę do góry.

Następnie odwirować próbkę o temperaturze 400 razy G przez dziesięć minut i użyć 15 mililitrów sterylnego PBS do ponownego zawieszenia osadu. Powtórz ten krok prania jeszcze raz. Następnie przygotuj pięciostopniowe gradienty perkolu o natężeniu 85, 80, 75, 70 i 65 procent w stożkowych probówkach o pojemności 215 mililitrów i ułóż dwa mililitry zawiesiny leukocytów na każdym gradiencie.

Następnie odwirować gradienty w temperaturze 800 razy G przez 30 minut z odłamaniem. Po odwirowaniu zbierz komórki w warstwach na granicy 75-80% i 70-75%. Użyj PBS, aby dwukrotnie umyć komórki, a następnie użyj hemocytometru, aby policzyć komórki.

Aby zmierzyć kinetykę uwalniania zewnątrzkomórkowego DNA, przygotuj zawiesinę neutrofili w pożywce testowej o stężeniu dwa razy dziesięć do sześciu komórek na mililitr. Dodaj pięć mikromoli na litr pomarańczy SYTOX, która jest nieprzepuszczalnym dla błony barwnikiem wiążącym DNA i delikatnie wymieszaj. Umieścić ludzkie neutrofile w sterylnych 96-dołkowych czarnych przezroczystych mikropłytkach dolnych, zapewniając, że podłoże testowe pokrywa całe dno studzienki.

Jeśli nie, delikatnie postukaj w płytkę z boku. Podgrzej talerz w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 minut. W międzyczasie użyj pożywki testowej o temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby przygotować roztwory zawierające bodźce o dwukrotnie wyższych stężeniach końcowych, które mają być użyte.

Jako pozytywną kontrolę NET przygotuj 100-nanomolowy octan mirystynianu forbolu lub PMA, aby leczyć ludzkie neutrofile przez cztery godziny, aby wyzwolić maksymalne uwalnianie NET. Następnie przygotuj fluorometr mikropłytkowy do pomiaru. Stymuluj neutrofile, dodając 50 mikrolitrów roztworu stymulacyjnego do 50 mikrolitrów zawiesin neutrofili.

Dodaj końcowe stężenie 0,5 miligrama na mililitr saponiny do jednego dołka, aby zmierzyć maksymalny sygnał uwalniania DNA. Umieść płytkę w czytniku i mierz zmiany fluorescencji w dwuminutowych odstępach przez cztery godziny bez wstrząsania. Aby przeanalizować dane, oblicz znormalizowany wzrost fluorescencji w czasie, odejmując fluorescencję bazową od wartości punktu końcowego dla wszystkich studzienek, w tym saponin.

Wzrost fluorescencji saponin powinien być najwyższym sygnałem i jest określany jako maksymalne uwolnienie DNA. Uśrednij wyniki replik i przedstaw je jako procent maksymalnego uwolnienia DNA. Aby określić ilościowo tworzenie NET za pomocą testów ELISA MPO-DNA i HNE-DNA, dodaj przeciwciała wychwytujące anty-MPO lub anty-HNE do 96-dołkowych płytek ELISA o wysokiej zdolności wiązania i inkubuj je przez noc w celu pokrycia.

Następnego ranka użyj 200 mikrolitrów na studzienkę PBS, aby trzykrotnie umyć płytki ELISA. Następnie użyj 200 mikrolitrów 5% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) i 0,1% albuminy surowicy ludzkiej (HSA), aby zablokować studzienki w temperaturze pokojowej na dwie godziny. W międzyczasie wysiewa się neutrofile w 100 mikrolitrach pożywki testowej na 96-dołkowej płytce o gęstości 100 000 komórek na dołek i indukują tworzenie NET po dodaniu bodźców poprzez inkubację w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez cztery godziny.

Następnie przeprowadź ograniczone trawienie DNazy, dodając dwie jednostki na mililitr DNAzy do supernatantów neutrofili, a następnie dobrze wymieszaj i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Następnie zatrzymaj reakcję, dodając 15 mikrolitrów 25 milimolowych EGTA i dobrze wymieszaj. Zebrać supernatanty i czyste probówki do mikrofugowania i wirować próbki, aby pozbyć się resztek komórek w temperaturze 300 razy G i temperaturze pokojowej przez pięć minut.

Zbieranie sieci NET bez ograniczonego trawienia powoduje niespójne dane. Ograniczony etap trawienia DNA ma kluczowe znaczenie dla uzyskania powtarzalnych wyników. W związku z tym zoptymalizowano stężenie enzymu DNazę I i długość trawienia.

Przenieść supernatant do czystych probówek do mikrofuge i przechowywać na lodzie. Następnie, używając podwielokrotności wcześniej przygotowanego wzorca NET, przygotować rozcieńczenie jeden lub dwa w PBS i EGTA. Teraz użyj PBS z EGTA, aby rozcieńczyć próbki trawione przez DNazę I dwudziestokrotnie i podzielić je na płytkach ELISA pokrytych przeciwciałami wychwytującymi.

Inkubuj płytki przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przed użyciem PBS do trzykrotnego przemycia płytek, należy nałożyć 100 mikrolitrów na studzienkę roztworu przeciwciała wykrywającego, takiego jak przeciwciało anty DNA sprzężone z peroksydazą chrzanową i inkubować w ciemności przez godzinę. Po czterech przemyciach PBS dodać 100 mikrolitrów do studzienki substratu peroksydazy TMB i inkubować przez 30 minut.

Niebieskie zabarwienie wskazuje na aktywność peroksydazy i obecność NET. Aby zatrzymać reakcję, dodaj 100 mikrolitrów jednego molowego HCL. Niebieskie roztwory zmienią kolor na żółty.

Za pomocą fotometru na mikropłytce odczytaj absorbancję przy 450 nanometrach. Aby porównać ilość zmierzonych kompleksów MPO-DNA lub HNE-DNA w porównaniu z wzorcem NET, należy odjąć optymalną gęstość tła od wszystkich próbek i wykreślić wartości absorbancji rozcieńczonych próbek wzorcowych w stosunku do ich względnej zawartości NET. Korzystając z nienasyconego zakresu tej krzywej standardowej, ustal linię trendu, korzystając z najlepszego dopasowania wykładniczego z używanego oprogramowania.

Wstaw zmierzone wartości OD niewiadomych do równania linii trendu, które da ilość NET w nieznanej próbce jako procent normy NET. Na koniec należy obliczyć średnie liczby powtórzeń i przedstawić dane końcowe jako ilość kompleksów MPO-DNA lub HNE-DNA. Pokazano tutaj reprezentatywne dane z testu uwalniania DNA opartego na fluorescencji ludzkich neutrofili pozostawionych bez stymulacji lub aktywowanych PMA lub P-aeruginosa.

P-aeruginosa wyzwala tworzenie NET w ludzkich PMN. Wykres ten ilustruje, że średnie wzrosty fluorescencji studzienek replikowanych są obliczane, normalizowane na podstawie maksymalnej fluorescencji i wyrażane jako uwalnianie DNA. Te obrazy fluorescencyjne reprezentują neutrofile pozostawione nieleczone lub stymulowane PMA.

Pokazano tutaj obrazy immunofluorescencyjne niestymulowanych, aktywowanych PMA i PA01 ludzkich neutrofili z testu ELISA MPO-DNA i HNE-DNA. Zewnątrzkomórkowe DNA wykazuje typową morfologię NET i kolokalizuje się z MPO i cytrulinowanym histonem H4, markerem powstawania NET. Ten eksperyment pokazuje uwalnianie MPO-DNA i HNE-DNA w ludzkich neutrofilach przy użyciu tego samego testu.

Standard NET zawiera średnio 19,5 mikrograma na mililitr zewnątrzkomórkowego DNA, 399 nanogramów na mililitr MPO i 103,4 nanogramów na mililitr HNE. Opierając się na masach cząsteczkowych MPO i HNE oraz na tym, że jeden mikrogram DNA zawiera 9,91 razy 10 do 14 nukleotydów, standard NET zawiera 109 cząsteczek HNE i 147 cząsteczek MPO na 1 000 nukleotydów. Wreszcie, dwukrotne eksperymenty z seryjnym rozcieńczaniem standardu NET ujawniają, że zakresy dynamiczne zarówno testów MPO-DNA, jak i HNE-DNA ELISA wynoszą od 19 do 609 nanogramów na mililitr DNA.

Po opanowaniu, kwas na bazie pomarańczy SYTOX można łatwo i szybko zmontować w ciągu jednej godziny, co prowadzi do rezultatów następnego dnia. Test ilościowy NET jest również łatwy do wykonania i da wynik następnego dnia, jeśli zostanie wykonany prawidłowo. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak określić ilościowo naturalazę w ludzkich neutrofilach w sposób wysokoprzepustowy.