Badanie charakterystyki komórek macierzystych raka trzustki w celu opracowania nowych strategii leczenia

Ogólnym celem poniższej procedury jest namnażanie rakowych komórek macierzystych in vitro przy użyciu techniki hodowli niezależnej od Anchorage, a następnie przetestowanie efektów metabolicznych nowych terapii ukierunkowanych na nowotworowe komórki macierzyste. Osiąga się to poprzez najpierw dysocjację próbki tkanki ludzkiego gruczolakoraka trzustki na zawiesinę pojedynczej komórki. W drugim etapie tkanka nowotworowa jest dalej trawiona enzymami, a następnie wysiewana na płytce żelatynowej Aby usunąć populację komórek fibroblastów, izolowane komórki rakowe są następnie wysiewane na bardzo niskiej płytce wielodołkowej i traktowane lekiem będącym przedmiotem zainteresowania w celu oceny aktywności metabolicznej i tworzenia się kulek nowotworowych.

Ostatecznie, lek będący przedmiotem zainteresowania może być stosowany u myszy z obniżoną odpornością u ksenoprzeszczepów pobranych od pacjenta w celu walidacji działania leku in vivo. Metody te są potężnym narzędziem do badania biologii nowotworowych komórek macierzystych i służą jako pierwszy krok do opracowania nowych terapii ukierunkowanych na rakowe komórki macierzyste. Procedurę zademonstruję ja, młodszy badacz w Centrum Komórek Macierzystych w Raku i Starzeniu się w Instytucie Raka Piersi oraz Tini Cruz, doktorantka z mojego laboratorium Izolowanie komórek macierzystych raka z gruczolakoraka przewodowego trzustki w sterylnej komorze bezpieczeństwa biologicznego.

Użyj sterylnego skalpela i kleszczy, aby zmielić ludzki guz w naczyniu hodowlanym o wymiarach 60 na 15 milimetrów zawierającym jeden mililitr sterylnego PBS, dodając kolejne trzy do czterech mililitrów PBS w razie potrzeby, aż tkanka zostanie całkowicie zdysocjowana. Przenieść zawiesinę tkankową do sterylnej stożkowej probówki i dodać PBS do końcowej objętości pięciu mililitrów. Następnie mechanicznie homogenizować próbkę za pomocą wirówki dysocjacyjnej i trawić homogenizowaną tkankę kolagenazą w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Po godzinie wirowania komórki odrywają się, zawieszając osad w 10 mililitrach kompletnego podłoża. Przefiltruj zawiesinę komórek przez sitko o średnicy 40 mikrometrów i ponownie odwiruj komórki. Tym razem resus zawieszający osad w pięciu mililitrach CK Po pięciu minutach w temperaturze pokojowej usuń bufor do lizy czerwonych krwinek przez odwirowanie i ponownie zawieś osad w pożywce z rakowych komórek macierzystych.

Następnie inkubuj komórki na naczyniu pokrytym żelatyną w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby usunąć większość szybko przyczepiających się komórek fibroblastów. Po godzinie odzyskaj supernatant i określ ilościowo liczbę żywotnych komórek raka trzustki, aby ułatwić tworzenie się sfery guza dla raka. Wzbogacanie komórek macierzystych Rozcieńczyć komórki w odpowiedniej objętości pożywki z nowotworowych komórek macierzystych do końcowego stężenia dwa razy 10 do trzech komórek na mililitr i schłodzić je na lodzie przez kilka minut.

Następnie, po dodaniu 500 mikrolitrów PBS do pierwszego i ostatniego rzędu 24 płytek komórkowych o bardzo niskim mocowaniu, ponownie zawiesić komórki za pomocą pipety i zasiać jeden mililitr komórek na studzienkę do pustych dołków płytki. Cztery studzienki komórkowe należy potraktować lekiem będącym przedmiotem zainteresowania i co najmniej cztery studzienki kontroli ujemnej nośnikiem. Następnie inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez tydzień.

Co drugi dzień dodawaj świeżą obróbkę do naszego pojazdu do każdej ze studni. W piątym lub siódmym dniu oceń liczbę uformowanych kul guza za pomocą automatycznego licznika komórek, który umożliwia identyfikację większych struktur do seryjnego pakowania kulek nowotworowych. Siódmego dnia użyj sitka do komórek o średnicy 40 mikrometrów, aby zebrać kulki.

Następnie odwiruj kulki i inkubuj je w jednym mililitrze trypsyny przez 20 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby zdysocjować osad na zawiesinę jednokomórkową. Następnie rozpręż komórki przez kolejne siedem dni, jak właśnie pokazano, aby przygotować kulki do pomiaru ich reaktywnych form tlenu lub produkcji ROS po dysocjacji, jak właśnie pokazano, odwiruj kulki i ponownie zawieś osad w HBSS zawierającym odpowiednią sondę. Po 20-minutowej inkubacji w ciemności w temperaturze 37 stopni Celsjusza, umieść komórki na lodzie do czasu analizy za pomocą cytometrii przepływowej w celu przygotowania kulek do pomiaru ich zużycia tlenu.

Najpierw pokryj 96-dołkową płytkę do hodowli komórkowej klejem komórkowym i tkankowym przez co najmniej 20 minut w temperaturze pokojowej. Następnie oddziel kulki i trypsynę, jak pokazano. Następnie umyj płytkę dwa do trzech razy wodą, aby usunąć nadmiar płytki klejącej, pojedyncze komórki trzy razy od 10 do piątej komórki na studzienkę.

W 150 mikrolitrach pożywki do oznaczania zużycia tlenu zawierającej glukozę i pirogronian sodu przylegają komórki do dna studzienek przez odwirowanie, aż do osiągnięcia 100 razy G. Pozwól, aby wirówka zatrzymała się wraz z odrywaniem. Następnie odwróć orientację płytki i powtórz wirowanie.

Teraz inkubuj komórki przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza bez dwutlenku węgla. W międzyczasie załaduj importowane kasety testowe. A, B i C. Wstrzyknąć 25 mikrolitrów odpowiednio trzy, sześciu i dziewięciu milimolowych stężenia interesującego leku i zaimportować D w ilości 25 mikrolitrów jednomikromolowego stężenia inhibitora mitochondriów rone.

Gdy komórki będą gotowe, skalibruj wkład i załaduj płytkę do hodowli komórek. Na koniec uruchom test ze standardowym protokołem mieszania i pomiaru W tych reprezentatywnych eksperymentach leczenie komórek macierzystych raka trzustki metforminą znacznie zmniejszyło rozmiar i liczbę kulek nowotworowych. Co więcej, redukcje te wykazywały kultury sfery drugo- i trzeciorzędowej.

Nawet jeśli metforminą leczono tylko pierwotną hodowlę sferyczną, metformina podobno działa jako inhibitor mitochondriów. Rzeczywiście, w tym eksperymencie zaobserwowano, że lek indukuje szybki i zależny od dawki spadek zużycia tlenu w komórkach nowotworowych, który koreluje z jego zdolnością do indukowania produkcji ROS. Co ważne, myszy leczone metforminą wykazują krótkotrwałe, ale znaczące zmniejszenie progresji gruczolakoraka trzustki w porównaniu ze zwierzętami kontrolnymi.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak oddzielić świeże ludzkie guzy. Wyizoluj pierwotne komórki rakowe, ustaw jako kulturę tworzącą kulę i oceń aktywność metaboliczną komórek macierzystych raka trzustki.