Name: Stereotaktyczny wlew oligomerycznego beta-amyloidu do hipokampa myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 16 s
Description: Poznaj metodę stereotaktycznego wlewu oligomerycznego beta-amyloidu 1-42 do zakrętu zębatego hipokampa myszy. Technika ta umożliwia badanie toksycznych skutków amyloidu na neurony w modelu in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez grant NS081333 National Institute of Neurological Disorders and Stroke (dla CMT), grant Stowarzyszenia Alzheimera NIRG-10-171721 i grant Narodowego Instytutu Zdrowia Psychicznego MH096702 (dla UH), oraz grant pilotażowy AG008702 National Institute on Aging na Uniwersytecie Columbia (dla YYJ i JB).

Uwaga: We wszystkich eksperymentach na zwierzętach, przestrzegano Instytucjonalnych i Krajowych wytycznych dotyczących opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych.
1. Przygotowanie narzędzi chirurgicznych i rozwiązań do operacji
<ol>
	<li>Autoklaw wszystkich narzędzi chirurgicznych ze stali nierdzewnej.</li>
	<li>Przygotuj 70% etanolu, rozcieńczając 200-procentowy etanol absolutny sterylną dejonizowaną wodą dejonizowaną klasy molekularnej.</li>
	<li>Umieścić igłę 29 G w strzykawce Hamiltona. Wyczyść wnętrze strzykawki i igły Hamiltona, pobierając i wyrzucając nanoczystą wodę kilkakrotnie przez 1 minutę. Powtórz tę procedurę z 70% etanolem.
	<ol>
		<li>Wyjąć tłok i igłę ze strzykawki Hamiltona. Wysuszyć części na powietrzu w okapie z przepływem laminarnym O/N.</li>
		<li>Naświetlić igłę i strzykawkę światłem ultrafioletowym przez 30 minut przed użyciem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować roztwór soli fizjologicznej, rozpuszczając NaCl w wodzie molekularnej do końcowej masy do stężenia objętościowego 0,9%. Wysterylizuj roztwór, filtrując go przez filtr porowy 0,2 μm.</li>
</ol>
2. Przygotuj oligomeryczny Aβ1-42
<ol>
	<li>Monomeryzacja i ponowne zawieszenie rekombinowanego ludzkiego Aβ1-42 w DMSO do 5 mM dokładnie tak, jak opisano w publikacji Fa' i innych13 .</li>
	<li>Rozcieńczyć 5 mM Aβ1-42 sterylnym (1x) PBS do 100 μM w dniu poprzedzającym zabieg.</li>
	<li>Dobrze wymieszać roztwór przez rozcieranie.</li>
	<li>Inkubować roztwór Aβ1-42 przez 12 godzin w temperaturze 4°C. 
	Uwaga: Roztwory kontrolne, takie jak rozcieńczanie DMSO w PBS lub zaszyfrowany/odwrócony peptyd Aβ1-42, należy przygotować w taki sam sposób jak Aβ1-42.</li>
</ol>
3. Określ współrzędne iniekcji
<ol>
	<li>Użyj atlasu mózgu dorosłej myszy, aby określić dokładne współrzędne przednio-tylne (AP), przyśrodkowo-boczne (ML) i grzbietowo-brzuszne (DV) dla obszaru mózgu będącego przedmiotem zainteresowania14. 
	Uwaga: Aby zilustrować tę technikę, jako cel wybraliśmy zakręt zębaty hipokampa o następujących współrzędnych z bregmy: AP, -2,00 mm; ML, ±1,3 mm; DV, -2,2 mm. Znak ujemny poprzedzający wartość AP wskazuje, że znajduje się on 2,00 mm za bregmą. Znak ± poprzedzający wartość ML wskazuje kierunek w lewo i w prawo od środka. Wreszcie, znak ujemny poprzedzający DV wskazuje, że porusza się on brzusznie od powierzchni mózgu.</li>
</ol>
4. Stereotaktyczne ustawienie klatki
<ol>
	<li>Noś chirurgiczną maskę na twarz, czysty fartuch laboratoryjny i sterylne rękawice chirurgiczne.</li>
	<li>Przetrzyj instrument stereotaktyczny i adapter myszy 70% etanolem.</li>
	<li>Połóż sterylną serwetę chirurgiczną na blacie.</li>
	<li>Umieść instrument stereotaktyczny z adapterem myszy na sterylnym serwecie chirurgicznym.</li>
	<li>Przetrzyj poduszkę grzewczą myszy 70% etanolem. Umieść poduszkę grzewczą nad stereotaktycznym łóżkiem ramy. Użyj taśmy do etykietowania laboratoryjnego ogólnego przeznaczenia, aby przykleić poduszkę grzewczą do łóżka adaptera myszy.
	<ol>
		<li>Przymocuj poduszkę grzewczą do pompy recyrkulacyjnej ciepłej wody zgodnie ze wskazówkami producenta.</li>
		<li>Włącz pompę recyrkulatora ciepłej wody i ustaw temperaturę na 37 °C, a następnie poczekaj, aż osiągnie temperaturę.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Strzykawkę Hamiltona o pojemności 50 μl z igłą 29 G przymocować do ramy stereotaktycznej, przykręcając ją do zmotoryzowanego pionowego wału wtryskowego zgodnie ze wskazówkami producenta.</li>
	<li>Włącz sterylizator do koralików i poczekaj, aż osiągnie temperaturę zadaną przez producenta. 
	Uwaga: Służy do sterylizacji narzędzi ze stali nierdzewnej między zwierzętami. Do sterylizacji narzędzia potrzebują 20 sekund kontaktu z kulkami.</li>
	<li>Włącz płytę grzejną i ustaw ją na 42 °C i umieść na niej czystą, pustą klatkę.</li>
	<li>Podczas gdy strzykawka Hamiltona jest zamocowana na ramie stereotaktycznej, użyj zmotoryzowanego wtryskiwacza stereotaktycznego, aby pobrać roztwór Aβ1-42. 
	Uwaga: Pobrać więcej niż 4 μl roztworu do strzykawki, a następnie użyć wstrzykiwacza stereotaktycznego, aby ustawić objętość wstrzykiwanego roztworu. Eksploatuj wtryskiwacz zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
</ol>
5. Przygotowanie zwierząt
<ol>
	<li>Określ wagę myszy za pomocą wagi.</li>
	<li>Znieczulić mysz koktajlem ketaminy/ksylazyny w dawce 100 mg/kg ketaminy i 10 mg/kg ksylazyny przez wstrzyknięcie dootrzewnowe (IP). Monitoruj głębokość znieczulenia przez utratę odruchu szczypania palców u stóp.</li>
	<li>Po uspokojeniu myszy weź maszynkę do strzyżenia włosów i ogol jej głowę, aby odsłonić skórę nad czaszką.</li>
	<li>Umieść mysz na poduszce grzewczej na łóżku stereotaktycznym.</li>
	<li>Użyj szpatułki, aby otworzyć usta i umieść siekacze wewnątrz osłony zębów. Przymocuj końcówkę do nosa na pysku myszy. Zaciśnij go delikatnie i niezbyt mocno.</li>
	<li>Umieść obustronne poprzeczki uszne w przewodzie słuchowym, aby zabezpieczyć głowę. Przesuń każdą poprzeczkę, aż uderzy w czaszkę, a następnie przekręć, aby ją zablokować.
	<ol>
		<li>Aby upewnić się, że głowa jest zabezpieczona, delikatnie dociśnij głowę palcem wskazującym. Jeśli głowica jest odpowiednio zabezpieczona, nie podda się ani nie poruszy po naciśnięciu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Nałóż kroplę kremu lub kropli do oczu na oczy, aby utrzymać je nawilżone. Upewnij się, że oczy są wilgotne przez cały zabieg chirurgiczny.</li>
	<li>Aby zdezynfekować miejsce operacji, użyj sterylnych wacików bawełnianych, aby nałożyć roztwór betadyny na skórę nad czaszką, a następnie 70% etanolu. Wykonaj naprzemienne czyszczenie betadyną i 70% etanolem jeszcze 2 razy.</li>
</ol>
6. Chirurgia i infuzja
<ol>
	<li>Użyj skalpela, aby wykonać 2-3 mm nacięcie w linii środkowej skóry głowy, a następnie użyj prostych cienkich nożyczek, aby przedłużyć linię nacięcia do 1,0-1,5 cm, aby odsłonić szew strzałkowy, bregmę i lambdę czaszki, punkty orientacyjne, na których oparte są współrzędne stereotaktyczne. Użyj mikro zacisków, aby utrzymać skórę z dala od siebie. 
	Uwaga: Pozycje bregma i lambda są wyjaśnione w atlasie mózgu myszy "The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates" (Mózg myszy we współrzędnych stereotaktycznych)14.</li>
	<li>Weź bawełniany wacik, namocz go w sterylnym roztworze soli fizjologicznej i użyj go do oczyszczenia czaszki. Następnie użyj czystego, suchego bawełnianego wacika, aby wysuszyć czaszkę.</li>
	<li>Użyj sterylnego cienkiego pisaka, aby zaznaczyć kropkę na bregmie. Użyj stereotaktycznego mikromanipulatora, aby ustawić strzykawkę Hamiltona tak, aby końcówka igły dotykała kropki na bregmie.
	<ol>
		<li>Zapisz współrzędną DV.</li>
		<li>Aby sprawdzić, czy oś AP czaszki jest wypoziomowana, przesuń strzykawkę Hamiltona do tyłu, tak aby końcówka igły dotykała punktu lambda.</li>
		<li>Zapisz pozycję DV. Upewnij się, że współrzędne DV dla bregmy i lambdy mieszczą się w zakresie 0.5 mm. 
		Uwaga: Celem jest zminimalizowanie różnicy DV między bregmą a lambdą.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Użyj mikromanipulatora, aby przywrócić końcówkę igły strzykawki Hamilton z powrotem do kropki bregma.</li>
	<li>Zapisz początkową pozycję AP.</li>
	<li>Oblicz końcową pozycję AP, odejmując 2,00 mm od początkowej współrzędnej AP.</li>
	<li>Użyj mikromanipulatora, aby przesunąć igłę strzykawki Hamiltona na ostateczną współrzędną AP.</li>
	<li>Zapisz bieżącą współrzędną uczenia maszynowego.</li>
	<li>Oblicz lewą i prawą końcową współrzędną ML, dodając lub odejmując 1.3 mm od początkowej współrzędnej ML.</li>
	<li>Użyj mikromanipulatora, aby przesunąć igłę strzykawki Hamiltona do końcowej współrzędnej ML.
	<ol>
		<li>Przyłóż końcówkę igły do powierzchni czaszki na obu końcowych współrzędnych ML i zapisz współrzędne DV i upewnij się, że wartości mieszczą się w granicach 0.5 mm. 
		Uwaga: Celem jest zminimalizowanie różnicy DV między dwiema końcowymi współrzędnymi ML.</li>
		<li>Będąc na współrzędnej końcowej, pociągnij igłę w górę 0,5-1 cm nad czaszką. Weź sterylny cienki długopis, aby zaznaczyć kropkę na powierzchni czaszki. Powtórz ten krok dla przeciwległej strony czaszki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odsuń strzykawkę Hamiltona na bok.</li>
	<li>Przymocuj głowicę wiertarską 0.8 mm do wiertła. Weź wiertło obiema rękami, ustaw łokcie na powierzchni stołu, aby zapewnić stabilność, i umieść głowicę wiertarską nieco powyżej kropki sharpie na lewej lub prawej współrzędnej ML. Aktywuj wiertło, opuść końcówkę wiertła na powierzchnię czaszki, aby wprowadzić otwór w czaszce. Powtórz ten krok dla strony przeciwnej. 
	Uwaga: Z nowo wprowadzonych otworów może wystąpić pewne krwawienie. Jeśli wystąpi krwawienie, użyj czystego, suchego bawełnianego wacika, aby przetrzeć krew.</li>
	<li>Przesunąć strzykawkę Hamiltona z powrotem na miejsce nad jednym z nowo wprowadzonych otworów ML. Opuść igłę Hamiltona tuż za czaszką. W tym momencie należy uważać, aby nie przebić mózgu. Aby upewnić się, że igła przeszła przez czaszkę, weź palec wskazujący i delikatnie dociśnij igłę do czaszki, aby upewnić się, że igła nie wyjdzie z otworu.</li>
	<li>Zapisz początkową współrzędną DV.</li>
	<li>Oblicz końcową współrzędną DV, odejmując 2,2 mm od początkowej współrzędnej DV.</li>
	<li>Opuść wskazówkę w dół do końcowej współrzędnej DV.</li>
	<li>Aktywuj stereotaktyczną pompę wtryskową, aby wpompować 4 μl Aβ1-42 do zakrętu zębatego z szybkością 0,5 μl/min.</li>
	<li>Po zakończeniu infuzji pozostaw igłę na miejscu przez dodatkowy 1 minutę, aby zminimalizować cofanie się roztworu z miejsca wstrzyknięcia.</li>
	<li>Przesuń igłę na drugą stronę mózgu i powtórz kroki 6.13-6.18.</li>
</ol>
7. Usuwanie zwierząt i opieka pooperacyjna
<ol>
	<li>Odkręć nauszniki i osłonę twarzy/nosa. Wyjmij mysz z urządzenia.</li>
	<li>Użyj standardowych kleszczyków uczniowskich, aby zbliżyć skórę głowy, a następnie uszczelnić ranę szwem.</li>
	<li>Wstrzyknij 1 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej myszy za pośrednictwem IP w celu nawodnienia.</li>
	<li>Buprenorfinę (0,1 mg/kg) należy wstrzykiwać podskórnie w celu złagodzenia bólu.</li>
	<li>Trzymaj mysz w czystej, pustej klatce umieszczonej na płycie grzejnej o temperaturze 42 °C, aż się obudzi, a następnie włóż ją z powrotem do klatki z dużą ilością jedzenia i wody.</li>
	<li>Buprenorfinę należy podawać we wstrzyknięciu podskórnym co 12 godzin przez 3 dni w celu złagodzenia bólu.</li>
</ol>
8. Usuwanie szwów
<ol>
	<li>Znieczulić mysz koktajlem ketaminy/ksylazyny w dawce 100 mg/kg ketaminy i 10 mg/kg klyazyny przez IP. Uwaga: Odbywa się to 7-10 dni po zabiegu.</li>
	<li>Użyj standardowych kleszczyków i prostych cienkich nożyczek, aby usunąć szew.</li>
	<li>Wstrzyknij 1 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej myszy za pośrednictwem IP w celu nawodnienia.</li>
	<li>Trzymaj mysz w czystej, pustej klatce umieszczonej na płycie grzejnej o temperaturze 42 °C, aż się obudzi, a następnie włóż ją z powrotem do klatki z dużą ilością jedzenia i wody.</li>
</ol>
9. Składanie ofiar ze zwierząt i przetwarzanie tkanek
<ol>
	<li>Znieczulij mysz i przetapiaj ją 4% paraformaldehydem15, usuń mózg i poddaj go do kriosekcji16, 
	Uwaga: Czas składania ofiar ze zwierząt zależy od eksperymentatora. Jednak do naszych badań wybraliśmy 7 i 14 dni po zabiegu.</li>
</ol>

<ol><li>Baleriola, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonally+Synthesized+ATF4+Transmits+a+Neurodegenerative+Signal+across+Brain+Regions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Axonally Synthesized ATF4 Transmits a Neurodegenerative Signal across Brain Regions.</a> Cell. 158 (5), 1159-1172 (2014).</li>
<li>Haass, C., Selkoe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soluble+protein+oligomers+in+neurodegeneration%3A+lessons+from+the+Alzheimer%27s+amyloid+beta-peptide.+Nature+reviews%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Soluble protein oligomers in neurodegeneration: lessons from the Alzheimer's amyloid beta-peptide. Nature reviews.</a> Molecular cell biology. 8 (2), 101-112 (2007).</li>
<li>Knowles, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+p75+neurotrophin+receptor+promotes+amyloid-beta%281-42%29-induced+neuritic+dystrophy+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The p75 neurotrophin receptor promotes amyloid-beta(1-42)-induced neuritic dystrophy in vitro and in vivo.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 29 (34), 10627-10637 (2009).</li>
<li>Troy, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((beta-Amyloid-induced+neuronal+apoptosis+requires+c-Jun+N-terminal+kinase+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neurochemistry%22%5BJournal%5D)">beta-Amyloid-induced neuronal apoptosis requires c-Jun N-terminal kinase activation.</a> Journal of neurochemistry. 77 (1), 157-164 (2001).</li>
<li>Crews, L., Rockenstein, E., Masliah, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((APP+transgenic+modeling+of+Alzheimer%27s+disease%3A+mechanisms+of+neurodegeneration+and+aberrant+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+structure+%26+function%22%5BJournal%5D)">APP transgenic modeling of Alzheimer's disease: mechanisms of neurodegeneration and aberrant neurogenesis.</a> Brain structure & function. 214 (2-3), 111-126 (2010).</li>
<li>Gotz, J., Ittner, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+Alzheimer%27s+disease+and+frontotemporal+dementia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Animal models of Alzheimer's disease and frontotemporal dementia.</a> Nature reviews. Neuroscience. 9 (7), 532-544 (2008).</li>
<li>Calhoun, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuron+loss+in+APP+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neuron loss in APP transgenic mice.</a> Nature. 395 (6704), 755-756 (1998).</li>
<li>Oakley, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraneuronal+beta-amyloid+aggregates%2C+neurodegeneration%2C+and+neuron+loss+in+transgenic+mice+with+five+familial+Alzheimer%27s+disease+mutations%3A+potential+factors+in+amyloid+plaque+formation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Intraneuronal beta-amyloid aggregates, neurodegeneration, and neuron loss in transgenic mice with five familial Alzheimer's disease mutations: potential factors in amyloid plaque formation.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 26 (40), 10129-10140 (2006).</li>
<li>Jean, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase-2+is+essential+for+c-Jun+transcriptional+activation+and+Bim+induction+in+neuron+death%5BTitle%5D)+AND+%22The+Biochemical+journal%22%5BJournal%5D)">Caspase-2 is essential for c-Jun transcriptional activation and Bim induction in neuron death.</a> The Biochemical journal. 455 (1), 15-25 (2013).</li>
<li>Sotthibundhu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta-amyloid%281-42%29+induces+neuronal+death+through+the+p75+neurotrophin+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Beta-amyloid(1-42) induces neuronal death through the p75 neurotrophin receptor.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 28 (15), 3941-3946 (2008).</li>
<li>Kar, S., Quirion, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid+beta+peptides+and+central+cholinergic+neurons%3A+functional+interrelationship+and+relevance+to+Alzheimer%27s+disease+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+brain+research%22%5BJournal%5D)">Amyloid beta peptides and central cholinergic neurons: functional interrelationship and relevance to Alzheimer's disease pathology.</a> Progress in brain research. 145, 261-274 (2004).</li>
<li>Leranth, C., Frotscher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+of+the+septal+region+in+the+rat+brain%3A+cholinergic-GABAergic+interconnections+and+the+termination+of+hippocampo-septal+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+comparative+neurology%22%5BJournal%5D)">Organization of the septal region in the rat brain: cholinergic-GABAergic interconnections and the termination of hippocampo-septal fibers.</a> The Journal of comparative neurology. 289 (2), 304-314 (1989).</li>
<li>Fa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+oligomeric+beta-amyloid+1-42+and+induction+of+synaptic+plasticity+impairment+on+hippocampal+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Preparation of oligomeric beta-amyloid 1-42 and induction of synaptic plasticity impairment on hippocampal slices.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (41), (2010).</li>
<li>Paxinos, G., Franklin, K. B. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22The+Mouse+Brain+in+Stereotaxic+Coordinates%22">The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates</a>. , Second edn, Academic Press. (2001).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (65), (2012).</li>
<li>Currle, D. S., Monuki, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flash+freezing+and+cryosectioning+E12.5+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Flash freezing and cryosectioning E12.5 mouse brain.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (4), (2007).</li>
<li>Jin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soluble+amyloid+beta-protein+dimers+isolated+from+Alzheimer+cortex+directly+induce+Tau+hyperphosphorylation+and+neuritic+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Soluble amyloid beta-protein dimers isolated from Alzheimer cortex directly induce Tau hyperphosphorylation and neuritic degeneration.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (14), 5819-5824 (2011).</li>
<li>Lambert, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusible%2C+nonfibrillar+ligands+derived+from+Abeta1-42+are+potent+central+nervous+system+neurotoxins%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Diffusible, nonfibrillar ligands derived from Abeta1-42 are potent central nervous system neurotoxins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (11), 6448-6453 (1998).</li>
<li>Masters, C. L., Selkoe, D. J. Biochemistry of amyloid beta-protein and amyloid deposits in Alzheimer disease. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMasters%2C+CL+%22Cold+Spring+Harbor+perspectives+in+medicine%22">Cold Spring Harbor perspectives in medicine</a>. 2 (6), a006262(2012).</li>
<li>Chakrabarti, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogen+receptor+agonists+for+attenuation+of+neuroinflammation+and+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+research+bulletin%22%5BJournal%5D)">Estrogen receptor agonists for attenuation of neuroinflammation and neurodegeneration.</a> Brain research bulletin. 109C, 22-31 (2014).</li>
<li>Cirrito, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+assessment+of+brain+interstitial+fluid+with+microdialysis+reveals+plaque-associated+changes+in+amyloid-beta+metabolism+and+half-life%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">In vivo assessment of brain interstitial fluid with microdialysis reveals plaque-associated changes in amyloid-beta metabolism and half-life.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 23 (26), 8844-8853 (2003).</li>
<li>Puzzo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Picomolar+amyloid-beta+positively+modulates+synaptic+plasticity+and+memory+in+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Picomolar amyloid-beta positively modulates synaptic plasticity and memory in hippocampus.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 28 (53), 14537-14545 (2008).</li>
<li>Puzzo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endogenous+amyloid-beta+is+necessary+for+hippocampal+synaptic+plasticity+and+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of%22%5BJournal%5D)">Endogenous amyloid-beta is necessary for hippocampal synaptic plasticity and memory.</a> Annals of. 69 (5), 819-830 (2011).</li>
<li>Akpan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intranasal+delivery+of+caspase-9+inhibitor+reduces+caspase-6-dependent+axon%2Fneuron+loss+and+improves+neurological+function+after+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Intranasal delivery of caspase-9 inhibitor reduces caspase-6-dependent axon/neuron loss and improves neurological function after stroke.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 31 (24), 8894-8904 (2011).</li>
<li>Fulmer, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocyte-derived+BDNF+supports+myelin+protein+synthesis+after+cuprizone-induced+demyelination%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Astrocyte-derived BDNF supports myelin protein synthesis after cuprizone-induced demyelination.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 34 (24), 8186-8196 (2014).</li>
<li>Thakker-Varia, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neuropeptide+VGF+is+reduced+in+human+bipolar+postmortem+brain+and+contributes+to+some+of+the+behavioral+and+molecular+effects+of+lithium%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The neuropeptide VGF is reduced in human bipolar postmortem brain and contributes to some of the behavioral and molecular effects of lithium.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 30 (28), 9368-9380 (2010).</li>
<li>Greferath, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enlarged+cholinergic+forebrain+neurons+and+improved+spatial+learning+in+p75+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22The+European+journal+of+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Enlarged cholinergic forebrain neurons and improved spatial learning in p75 knockout mice.</a> The European journal of neuroscience. 12 (3), 885-893 (2000).</li>
<li>Brashear, H. R., Zaborszky, L., Heimer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+GABAergic+and+cholinergic+neurons+in+the+rat+diagonal+band%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Distribution of GABAergic and cholinergic neurons in the rat diagonal band.</a> Neuroscience. 17 (2), 439-451 (1986).</li>
<li>Clarke, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholinergic+innervation+of+the+rat+dentate+gyrus%3A+an+immunocytochemical+and+electron+microscopical+study%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+research%22%5BJournal%5D)">Cholinergic innervation of the rat dentate gyrus: an immunocytochemical and electron microscopical study.</a> Brain research. 360 (1-2), 349-354 (1985).</li>
<li>Garcia-Osta, A., Alberini, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid+beta+mediates+memory+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Learning+%26+memory%22%5BJournal%5D)">Amyloid beta mediates memory formation.</a> Learning & memory. 16 (4), 267-272 (2009).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Aby osiągnąć udane wstrzyknięcie Aβ1-42 , eksperymentator lub chirurg musi: 1) stosować technikę aseptyczną; 2) prawidłowo zidentyfikować obszar mózgu zainteresowania za pomocą dokładnych współrzędnych; 3) umieć prawidłowo zabezpieczyć mysz w ramce stereotaktycznej z mózgiem wypoziomowanym w osi AP i ML; 4) posiadają umiejętność precyzyjnej obsługi mikromanipulatora; 5) Zadbaj o właściwą opiekę pooperacyjną. Jeśli te kluczowe kroki zostaną wykonane, mysz powinna przetrwać operację bez zauważalnej infekcji....

Złogi blaszek amyloidowych, które składają się z beta-amyloidu (Aβ1-42), są kluczową cechą patologii choroby Alzheimera (AD). Liczne badania wykazały, że wysokie lub toksyczne poziomy rekombinowanego oligomerycznego Aβ1-42 wywołują śmierć neuronów, dystrofię synaptyczną, utratę i dysfunkcję; a także deficyty uczenia się i pamięci1-4. Dotknięte obszary mózgu obejmują hipokamp, korę mózgową i struktury podkorowe, takie jak podstawa przodomózgowia i ciało migdałowate5,6. Do tej pory istnieje wiele transgenicznych modeli myszy, które próbują symulować patologię Aβ1-42 w AD. W zależności od szczepu, zwierzęta te okazują się przydatne w badaniu wybranych cech patologicznych AD. Niestety, z wyjątkiem 2 linii transgenicznych, APP23 i 5XFAD, myszy te nigdy w pełni nie replikują utraty neuronów, kluczowego aspektu AD. Nawet przy utracie neuronów zaobserwowanej w APP23 i 5XFAD, obserwowana śmierć neuronów była subtelna, zależna od wieku i izolowana do kilku wybranych regionów7,8.
Bezpośrednia infuzja oligomerycznego Aβ1-42 do mózgu myszy typu dzikiego stanowi doskonały model in vivo, który odtwarza aspekt śmierci neuronalnej amyloidopatii1,9,10. W przeciwieństwie do powszechnie stosowanych modeli myszy transgenicznych, oligomeryczny model infuzji Aβ1-42 jest idealny do gwałtownego podniesienia poziomu Aβ1-42 w sposób przestrzenny i czasowy. Zaletą wykorzystania myszy typu dzikiego w tym modelu jest wyeliminowanie potencjalnej kompensacji lub skutków ubocznych mutacji wprowadzonych w transgenicznych liniach myszy. Wcześniejsze badania wykazały, że wprowadzenie toksycznych poziomów Aβ1-42 do hipokampa powoduje śmierć neuronów w pobliżu miejsca wstrzyknięcia w ciągu 1 tygodnia1. Ponadto, zgodnie z obserwacją, że Aβ1-42 jest toksyczny dla neuronów cholinergicznych11, populacja podstawowych neuronów cholinergicznych w przodomózgowiu (BFCN), która rzutuje do hipokampa, zmniejsza się o 20-50% w ciągu 7-14 dni po infuzji beta-amyloidu1,10 u myszy, skutecznie umożliwiając badanie izolowanych obwodów neuronalnych w mózgu. Ponieważ BFCN rzutuje ipsilateralnie do zakrętu zębatego hipokampa12, w większości roztwory kontrolne / nośnikowe i oligomeryczne Aβ1-42 mogą być wstrzykiwane po obu stronach mózgu, co pozwala na porównania między lewą i prawą półkulą1.
W tym raporcie przedstawimy szczegółową metodologię chirurgiczną i iniekcyjną dla dorosłych myszy C57BL/6J typu dzikiego. Ten szczep myszy jest wybierany ze względu na jego szerokie zastosowanie w badaniach. Technicznie rzecz biorąc, każdy obszar mózgu może być celem infuzji, jednak tutaj użyjemy zakrętu zębatego hipokampa jako celu, aby zilustrować technikę.

<table><tbody><tr><td>Ketamina HCl (100 mg/ml)</td><td>Henry Schein Medical</td><td>1049007</td><td>100 mg ketaminy na 1 kg zwierzęcia</td></tr><tr><td>Ksylazyna (20 mg/ml)</td><td>Henry Schein Medical</td><td>niedostępne</td><td>10 mg ksylazyny na 1 kg zwierzęcia</td></tr><tr><td>Buprenex (0,3 mg/ml)</td><td>Henry Schein Medical</td><td>1217793</td><td>0,1 mg buprenex na 1 kg zwierzęcia</td></tr><tr><td>A&beta; 1-42</td><td>David Teplow/UCLA</td><td>niedostępny</td><td>100 &mu; M; Ten amyloid został wykorzystany w pracy</td></tr><tr><td>A&beta; 1-42</td><td>Bachem</td><td>H-1368</td><td>Może być stosowany zamiast amyloidu z laboratorium Teplow</td></tr><tr><td>A&beta; 1-42</td><td>American Peptide</td><td>62-0-80B</td><td>Może być stosowany zamiast amyloidu z laboratorium Teplow</td></tr><tr><td>Scrambled A&beta; 1-42</td><td>American Peptide</td><td>62-0-46B</td><td>Może być stosowany jako peptyd kontrolny do porównywania A i beta; Przeciwciało 1-42</td></tr><tr><td>NU4 (oligomeryczne przeciwciało amyloidowe)</td><td>Prezent od Williama Kleina/Northwestern U.</td><td>niedostępne</td> Przeciwciało oligomeryczne antyamyloidowe w <td>rozcieńczeniu 1:2 000</td></tr><tr><td>&nbsp; (Królik poliklonalny)</td><td>EMD Millipore</td><td>AB9234</td><td>Może być stosowany zamiast Nu4; musi&nbsp; być przetestowany przez użytkownika końcowego</td></tr><tr><td>Przeciwciało 6E10 (mysz monoklonalna) (przeciwciało amyloidowe)</td><td>Biolegend</td><td>sig-39320</td><td>rozcieńczenie 1:1,000</td></tr><tr><td>Przeciwciało ChAT (koza poliklonalna)</td><td>Milipora</td><td>AB144P</td><td>Rozcieńczenie 1:100</td></tr><tr><td>Ślepy zaułek Fluorometryczny system TUNEL</td><td>Promega</td><td>G3250</td><td>Postępuj zgodnie ze wskazówkami producenta dla użyj</td></tr><tr><td>odczynnika Prolong Gold Antifade z DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>P36935</td><td>Używaj podczas szkiełek nakrywkowych</td></tr><tr><td>Fluorogold</td><td>Fluorochrome, LLC</td><td>niedostępne</td> 2<td>% roztwór</td></tr><tr><td>Absolutny etanol (200 proof)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2818-4</td><td>Do wytwarzania 70% etanolu do odkażania i dezynfekcji</td></tr><tr><td>Novex 10-20% Tricine gel</td><td>Life Technologies</td><td>EC6625BOX</td><td>Do oddzielania A&beta; 1-42</td></tr><tr><td>Novex Tricine SDS Running Buffer (10X)</td><td>Life Technologies</td><td>LC1675</td><td>Do uruchamiania 10-20% żeli Tricine</td></tr><tr><td>Novex Tris-Glycine Transfer Buffer (25X)</td><td>Life Technologies</td><td>LC3675</td><td>Do przenoszenia 10-20% żeli Tricine</td></tr><tr><td>SuperSignal Western Blot Enhancer</td><td>Thermo Scientific</td><td>46640</td><td>Do wzmacniania A&beta; sygnał 1-42; postępuj zgodnie z protokołem producenta</td></tr><tr><td>Protran BA79 Nitrocelulozowa membrana bibułowa, 0,1 &mu; m</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>10402088</td><td>Do przenoszenia 10-20% żeli Tricine</td></tr><tr><td>Xcell SureLock Mini-Cell</td><td>Life Technologies</td><td>EI0001</td><td>Aparatura do elektroforezy do uruchamiania 10-20% żeli tricine</td></tr><tr><td>GenTeal Lubricant Żel pod oczy</td><td>Novartis</td><td>niedostępny</td><td>Do utrzymywania wilgotności oczu myszy podczas operacji; można znaleźć w lokalnych aptekach &#160; </td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>Odśwież Optive Lubricant Krople do oczu</td><td>Allergan</td><td>niedostępne</td><td>Do utrzymywania wilgotności oczu myszy podczas operacji; można je znaleźć w lokalnych aptekach; Może być stosowany zamiast GenTeal</td></tr><tr><td>Betadine</td><td>Stoelting</td><td>50998</td><td>Do odkażania i dezynfekcji</td></tr><tr><td>szpatułki okrągłej/stożkowej&nbsp;</td><td>VWR</td><td>82027-490</td><td>Do otwierania pyska zwierzęcia</td></tr><tr><td>Bulldog Serrefines Zaciski (szczęki wym. 9X1,6 mm; Długość 28 mm)</td><td>Fine Science Tools</td><td>18050-28</td><td>Opcjonalnie; Do rozsuwania skóry głowy podczas iniekcji</td></tr><tr><td>Proste cienkie nożyczki (krawędź tnąca 25 mm; Długość 11,5 cm)</td><td>Fine Science Tools</td><td>14060-11</td><td>Do cięcia skóry głowy</td></tr><tr><td>#3 Rękojeść skalpela</td><td>Fine Science Tools</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>#11 Ostrze chirurgiczne</td><td>Fine Science Tools</td><td>10011-00</td><td>Do wykonywania nacięć skóry głowy</td></tr><tr><td>Student Standard Pattern Forcep (końcówka wym. 2,5x1,5 mm; Długość 11,5 cm)</td><td>Fine Science Tools</td><td>91100-12</td><td>Do trzymania skóry głowy zamkniętej podczas szycia</td></tr><tr><td>Zestaw trymerów Combo Kent</td><td>Scientific</td><td>CL9990-1201</td><td>Do golenia włosów</td></tr><tr><td>Recyrkulator ciepłej wody T/Pump&nbsp;</td><td>Kent Naukowy&nbsp;</td><td>TP-700</td><td>Do ogrzewania zwierzęcia podczas operacji</td></tr><tr><td>Podkładka wojenna wielokrotnego użytku (5 "x 10")</td><td>Kent Scientific&nbsp;</td><td>TPZ-0510FEA</td><td>Do podłączenia go do recyrkulatora ciepłej wody T / Pump w celu ogrzania zwierzęcia podczas operacji</td></tr><tr><td>Akumulatorowa wiertarka Micro Drill</td><td>58610</td><td>Użyj stalowych zadziorów 0,8 mm do wiercenia otworów w czaszce</td><td></td></tr><tr><td>Standardowy instrument stereotaktyczny Lab z myszą i Adapter dla noworodków dla szczurów</td><td>Stoelting</td><td>51615</td><td></td></tr><tr><td>Tylko dla myszy Stereotaktyczny instrument</td><td>Stoelting</td><td>51730</td><td>Może używać tego zamiast Stoelting Cat. #51615</td></tr><tr><td>Kwintesencja wtryskiwacza stereotaktycznego</td><td>Stoelting</td><td>53311</td><td></td></tr><tr><td>Sterylizator z suchymi szklanymi kulkami</td><td>Stoelting</td><td>50287</td><td>Do sterylizacji narzędzi ze stali nierdzewnej</td></tr><tr><td>Sterylna serweta chirurgiczna (18" x 26")</td><td>Stoelting</td><td>50981</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka Hamilton 50 ml, Model 705 RN SYR, NDL</td><td>Hamilton Company</td><td>7637-01</td><td>Do wstrzykiwania mózgu; używaj różnych strzykawek do różnych roztworów</td></tr><tr><td>Igła 29 G, mała piasta RN</td><td>NDL Hamilton Company</td><td>7803-06</td><td>Do mocowania do strzykawki Hamilton do wstrzykiwań mózgu</td></tr><tr><td>1 ml BD Strzykawki tuberkulinowe</td><td>VWR</td><td>BD309659</td><td>Do podawania znieczulenia i soli fizjologicznej</td></tr><tr><td>Igła 30 G (0,5")</td><td>VWR</td><td>BD305106</td><td>Do podawania znieczulenia i soli fizjologicznej</td></tr><tr><td>Przenośna elektroniczna waga z serii CS (Ohaus)</td><td>VWR</td><td>65500-202</td><td>Do ważenia zwierząt w celu ustalenia dawki znieczulającej</td></tr><tr><td>Płyta grzejna (płyta górna o wymiarach 7,25 x 7,25 cala)</td><td>VWR</td><td>47751-148</td><td>Do ogrzewania zwierząt po operacji</td></tr><tr><td>Cięcie szwu jedwabnego Sofsilk C-1 3/8, 12 mm</td><td>Covidien</td><td>S1173</td><td>Do zamykania rany</td></tr><tr><td>Klej tkankowy Vetbond (3M)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-361931</td><td>Opcjonalnie: do pomocy w zamykaniu ran; Stosować ze szwem.</td></tr><tr><td>Sterylne aplikatory z drewnianą końcówką z bawełnianą końcówką</td><td>Fisher scientific</td><td>22-029-488</td><td>Do czyszczenia i suszenia ran pooperacyjnych</td></tr><tr><td>Fisherbrand Superfrost Plus Szkiełka mikroskopowe</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>12-550-15</td><td>Do pobierania wycinków mózgu</td></tr><tr><td>Szkło osłonowe VWR Micro 24 X 50 mm</td><td>VWR</td><td>48393241</td><td>Do montażu szkiełek mikroskopowych</td></tr><tr><td>Thermo Scientific Nalgene Filtr strzykawkowy 0,2 &mu; m</td><td>Fisher Scientific</td><td>194-2520</td><td>Do sterylizacji roztworu soli</td></tr><tr><td>fizjologicznej Sterylne markery do skóry z podwójną końcówką firmy Viscot Medical</td><td>Medline</td><td>VIS1422SRL91</td><td>Do oznaczania współrzędnych na czaszce</td></tr></tbody></table>

stereotaktyczny wlew oligomerycznego beta-amyloidu do hipokampa myszy

Stereotaxic Infusion of Oligomeric Amyloid-beta into the Mouse Hippocampus

Choroba Alzheimera jest chorobą neurodegeneracyjną dotykającą starzejące się społeczeństwo. Kluczową cechą neuropatologiczną choroby jest nadmierna produkcja beta-amyloidu i odkładanie się blaszek beta-amyloidowych w obszarach mózgu osób dotkniętych chorobą. Przez lata naukowcy stworzyli wiele mysich modeli choroby Alzheimera, które próbują odtworzyć patologię beta-amyloidu. Niestety, modele myszy tylko wybiórczo naśladują cechy choroby. Śmierć neuronów, znaczący efekt w mózgach pacjentów z chorobą Alzheimera, jest zauważalnie nieobecna u tych myszy. W związku z tym my i inni zastosowaliśmy metodę bezpośredniego wstrzykiwania rozpuszczalnych oligomerycznych form beta-amyloidu - form beta-amyloidu, które, jak udowodniono, są najbardziej toksyczne dla neuronów - stereotaktycznie do mózgu. W tym raporcie wykorzystujemy samce myszy C57BL / 6J, aby udokumentować tę chirurgiczną technikę zwiększania poziomu beta amyloidu w wybranym regionie mózgu. Celem infuzji jest zakręt zębaty hipokampa, ponieważ ta struktura mózgu, wraz z podstawną przodomózgowiem, która jest połączona obwodem cholinergicznym, stanowi jeden z obszarów zwyrodnienia w chorobie. Wyniki podniesienia beta-amyloidu w zakręcie zębatym za pomocą infuzji stereotaktycznej ujawniają wzrost utraty neuronów w zakręcie zębatym w ciągu 1 tygodnia, podczas gdy jednocześnie występuje wzrost śmierci komórek i utrata neuronów cholinergicznych w pionowej kończynie ukośnego pasma Broca podstawy przodomózgowia. Efekty te obserwuje się do 2 tygodni. Nasze dane sugerują, że obecny model infuzji beta-amyloidu stanowi alternatywny model mysi do rozwiązywania problemów związanych ze śmiercią neuronów specyficznych dla regionu w perspektywie krótkoterminowej. Zaletą tego modelu jest to, że beta-amyloid może być podwyższony w sposób przestrzenny i czasowy.

Opisana metoda otrzymywania ludzkiego rekombinowanego oligomerycznego Aβ1-42 pozwala na uzyskanie rozpuszczalnych form oligomerycznych składających się z monomerów, dimerów, trimerów i tetramerów (Rysunek 1A). Wykazano w wielu badaniach, że te formy Aβ1-42 o niskiej masie cząsteczkowej, a nie włókna i blaszki, są najbardziej toksyczne dla neuronów1,4,9,17-19. Aby ustalić, czy oligomeryczny Aβ1-42 indukuje śmierć neuronów w mózgu myszy, Aβ1-42 (4 µl r...

Tutaj prezentujemy protokół bezpośredniej stereotaktycznej infuzji beta-amyloidu do mózgu. Metodologia ta zapewnia alternatywny model mysi in vivo w celu rozwiązania krótkoterminowych skutków beta-amyloidu na neurony mózgowe.

Stereotaktyczny wlew oligomerycznego beta-amyloidu do hipokampa myszy

Alzheimer&#8217;s disease is a neurodegenerative disease affecting the aging population. A key neuropathological feature of the disease is the ...

Ogólnym celem tej procedury jest stereotaktyczne wstrzyknięcie Liga meric a beta 1 42 do zakrętu zębatego hipokampa. Osiąga się to poprzez przygotowanie najpierw liga meric, roztworu beta 1 42. Drugim krokiem jest określenie współrzędnych iniekcji.Następnie chirurgicznie odsłoń czaszkę zwierzęcia i wprowadź w niej dwa otwory do wprowadzenia igły. Ostatnim krokiem jest przesunięcie igły strzykawki do jej ostatecznej pozycji i podanie w infuzji beta 1 42. Ostatecznie metoda iniekcji Stereotaxic Abeta 1 42 jest stosowana do zbadania toksycznego działania Abeta 1 42 u żywego zwierzęcia.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi transgenicznymi modelami myszy Abeta 42 jest to, że oligomeryczny ALA 42 może być podwyższony w specjalny i czasowy sposób i niezawodnie odtwarzać patologię śmierci komórki, której brakuje w transgenicznych modelach myszy. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie choroby Alzheimera, takie jak sposób rozprzestrzeniania się procesów patologicznych w chorobie Alzheimera. Aby rozpocząć tę procedurę, ogol głowę znieczulonej myszy, aby odsłonić skórę.Następnie umieść mysz na poduszce grzewczej w stereotaktycznej ramce. Następnie zabezpiecz jego siekacze w osłonie zębów i kawałek nosa na pysku myszy. Następnie umieść pręty douszne w mauss słuchowym, aby zabezpieczyć głowę do sprawdzenia.Jeśli głowa jest zabezpieczona, delikatnie ją dociśnij i upewnij się, że się nie porusza. Następnie nałóż maść na oba oczy, aby utrzymać wilgotność. Następnie zdezynfekuj miejsce operowane, nakładając Betadine na skórę nad czaszką, a następnie 70% etanol za pomocą sterylnych wacików.Wykonaj naprzemienne czyszczenie betadiną i etanolem jeszcze dwa razy. Teraz wykonaj skalpelem dwu- lub trzymilimetrowe nacięcie w linii środkowej skóry głowy. Użyj prostych, cienkich nożyczek, aby przedłużyć linię nacięcia do około 1,0 centymetra, aby odsłonić szew strzałkowy, bgma i lambda czaszki.Następnie użyj kleszczy, aby rozsunąć skórę. Oczyść czaszkę sterylnym wacikiem nasączonym sterylnym roztworem soli fizjologicznej. Następnie użyj czystego, suchego bawełnianego wacika, aby wysuszyć czaszkę.Następnie zaznacz kropkę. Na Bre ma ustaw strzykawkę Hamiltona za pomocą mikromanipulatora tak, aby końcówka igły dotykała kropki na bgma. Następnie zapisz współrzędną DV zaznacz kropkę w punkcie Lambda, upewnij się, że oś AP czaszki jest wypoziomowana, przesuwając strzykawkę do tyłu do punktu Lambda.Końcówka igły powinna dotykać punktu Lambda, tak jak dotykała punktu bgma. Następnie zapisz pozycję DV. Współrzędne DV dla Bre, MA i Lambda powinny mieścić się w granicach 0,5 milimetra.Teraz umieść końcówkę igły z powrotem w kropce BMA. Zapisz początkową pozycję AP. Następnie oblicz końcową pozycję AP, odejmując dwa milimetry od początkowej ap.Skoordynować i przesunąć igłę strzykawki na ostateczną współrzędną AP. Następnie zarejestruj bieżącą współrzędną uczenia maszynowego. Oblicz lewą i prawą końcową współrzędną ml, dodając lub odejmując 1,3 milimetra od początkowej mili.Skoordynuj i przesuń igłę strzykawki do końcowych współrzędnych ML. Przyłóż końcówkę igły do powierzchni czaszki na obu końcowych współrzędnych ML i upewnij się, że współrzędne DV mieszczą się w granicach 0,5 milimetra. Będąc na końcowej współrzędnej ml, pociągnij igłę do góry, 0,5 do jednego centymetra nad czaszką.Zaznacz kropkę na czaszce ciemnym, bardzo drobnym markerem. Powtórz ten krok dla przeciwległej strony czaszki. Następnie odsunąć strzykawkę.Wywierć otwór po lewej lub prawej stronie ml. Skoordynuj na czaszce za pomocą wiertła o średnicy 0,8 milimetra. Powtórz ten krok dla strony przeciwnej.Następnie przenieść strzykawkę do jednego z nowo wprowadzonych otworów. Opuść igłę tuż za czaszkę i uważaj, aby nie przebić mózgu, aby upewnić się, że igła przeszła przez czaszkę. Delikatnie dociśnij igłę do czaszki, aby upewnić się, że igła nie wyjdzie z otworu.Następnie zapisz początkową współrzędną DV. Oblicz końcową wartość dv. Współrzędne, odejmując 2,2 milimetra od początkowej DV.Współrzędnej i opuść wskazówkę do końcowej bazy danych.Następnie ustaw stereotaktyczną pompę wtryskiwacza tak, aby wstrzykiwała cztery mikrolitry beta 1 42 do zakrętu zębatego z szybkością 0,5 mikrolitra na minutę. Po infuzji należy pozostawić igłę na miejscu przez dodatkową minutę, aby zminimalizować cofanie się roztworu z miejsca wstrzyknięcia. Następnie przesuń igłę na drugą stronę mózgu i powtórz procedurę.Teraz odkręć nauszniki. Użyj standardowych kleszczyków uczniowskich, aby zamknąć skórę głowy i uszczelnić ranę szwem. Zdejmij osłonę nosa i wyjmij mysz.Wstrzyknij jeden mililitr sterylnej soli fizjologicznej myszy początkowo w celu nawodnienia i wstrzyknij buprenorfinę w ilości 0,1 miligrama na kilogram podskórnie w celu złagodzenia bólu. Następnie przenieś mysz do czystej, pustej klatki umieszczonej na płycie grzejnej o temperaturze 42 stopni Celsjusza, aż się obudzi. Następnie umieść mysz z powrotem w klatce z dużą ilością jedzenia i wody.Rysunek ten przedstawia infuzję beta 1 42 i nośnika w odpowiednim lewym i prawym zakręcie zębatym dziewięciomiesięcznej myszy. Przerywane linie przedstawiają wstrzyknięcie, a strzałki pokazują zapadnięty zakręt zębaty. W ciągu tygodnia od wstrzyknięcia Abeta 1 42 zakręt zębaty wykazywał podwyższony poziom Abeta 1 42 w warstwie molekularnej i polimorficznej warstwie komórkowej w pobliżu miejsca wstrzyknięcia po siedmiu i 14 dniach.Abeta 1 42 powodowała wzrost barwienia tunelowego dodatniego i zmniejszenie grubości zakrętu zębatego, co potwierdza neurodegeneracyjne działanie Abeta 1 42. W tym przypadku wsteczny znacznik fluorozłoto został wstrzyknięty jednocześnie z Abeta 1 42 do zakrętu zębatego. Siedem dni po wstrzyknięciu wykryto fluorgold w podstawie przodomózgowia, co sugeruje wsteczny transport znacznika przez neurony cholinergiczne.Do oceny ilościowej wybrano neurony fluorgoldowo-dodatnie w podstawie przodomózgowia. Siedem dni po wstrzyknięciu, Abeta 1 42 powodowała zwiększenie tunelu i zmniejszenie czatu. Dodatnie neurony w podstawowej czwórce mózgu Po opanowaniu tej techniki można wykonać w około 30 minut, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.Po tej procedurze można zastosować inne metody, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak badania mechanizmu molekularnego w celu zajęcia się mechanistycznym wpływem wlewu amyloidu na mózg. Dziękuję za obejrzenie naszego filmu i mam nadzieję, że metoda okaże się przydatna w Waszych eksperymentach.

stereotaxic-infusion-oligomeric-amyloid-beta-into-mouse

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Stereotaktyczna infuzja oligomerów amyloidu-beta do hipokampu mysiego

Jedną z cech choroby Alzheimera jest podwyższony poziom peptydu Aβ1-42. W niniejszym materiale przedstawiamy protokół przygotowania syntetycznych oligomerów Aβ1-42, które upośledzają długotrwałe wzmocnienie synaptyczne w hipokampie, będące komórkowym korelatem pamięci. Procedura ta jest przydatna do badania mechanizmów patologii indukowanej przez Aβ oraz do przesiewowego badania leków.

Przygotowanie oligomerów β-amyloidu1-42 i indukcja upośledzenia plastyczności synaptycznej w skrawkach hipokampa

Ten film demonstruje technikę ciągłego wlewu przeciwciał specyficznych dla peptydu beta-amyloidu (Aβ) do hipokampa szczura. W badaniu zastosowano implantację obustronnego systemu kaniuli w celu kontrolowanego wlewu przeciwciał specyficznych dla peptydu Aβ w połączeniu z infuzją rozpuszczalnych oligomerów Aβ (Aβo) do hipokampa szczura w celu zbadania interakcji między oligomerami a przeciwciałami.

Kontrolowany wlew przeciwciał swoistych dla peptydu Aβ i oligomerów Aβ do hipokampa szczura

Ten film demonstruje precyzyjną stereotaktyczną infuzję beta amyloidu do zakrętu zębatego w celu stworzenia mysiego modelu choroby Alzheimera. Dokładne określenie współrzędnych i kontrolowane dostarczanie białek beta amyloidu powoduje degradację neuronów, zakłócając przetwarzanie pamięci i przyczyniając się do rozwoju choroby Alzheimera.

Bezpośrednia stereotaktyczna infuzja białek beta amyloidu w mózgu dla modelu choroby Alzheimera

Źródło: Arango-Lievano, M. et. al., Podłużne obrazowanie in vivo naczyń mózgowych: znaczenie dla chorób OUN. J. Vis. Exp. (2016)Ten film demonstruje obrazowanie dwufotonowe in vivo w celu wizualizacji znakowanych fluorescencyjnie blaszek amyloidowych i naczyń mózgowych. Niebieska fluorescencja oznacza blaszki miażdżycowe, podczas gdy zielona fluorescencja podkreśla naczynia krwionośne mózgu. Mapa 3D obszaru zainteresowania i obrazowanie mozaikowe o wysokiej rozdzielczości ujawniają szczegółowe...

Obrazowanie in vivo naczyń mózgowych i blaszek amyloidowych w mysim modelu choroby Alzheimera

Źródło: Slezia, A. i wsp. Elektroforetyczne dostarczanie kwasu γ-aminomasłowego (GABA) do ogniska padaczkowego zapobiega napadom padaczkowym u myszy. J. Vis. Exp. (2019 rok)Ten film pokazuje elektroforetyczne dostarczanie kwasu gamma-aminomasłowego (GABA) w celu zahamowania aktywności napadowej u znieczulonej myszy. Przedstawiono w nim etapy związane z implantacją sondy, rejestracją aktywności neuronalnej, indukcją napadów i kontrolowanym dostarczaniem GABA za pomocą mikroprzepływowej pompy...

Elektroforetyczne dostarczanie GABA do ogniska padaczkowego znieczulonej myszy

MikroRNA odgrywają znaczącą rolę w strukturze i funkcjonowaniu mózgu. Tutaj opisujemy metodę wymuszania nadmiernej ekspresji miRNA w hipokampie za pomocą stereotaktycznego wstrzykiwania zmodyfikowanego lentiwirusa wykazującego ekspresję miRNA. Podejście to może służyć jako stosunkowo szybki sposób oceny skutków in vivo nadmiernej ekspresji miRNA w określonych regionach mózgu.

Stereotaktyczne wstrzyknięcie lentiwirusów eksprymujących mikroRNA do regionu CA1 hipokampa myszy i ocena wyniku behawioralnego

Model zwierzęcy z wstrzyknięciem β amyloidu (Aβ) umożliwia podawanie określonej ilości i gatunku fragmentów Aβ oraz redukuje indywidualne różnice w każdej badanej grupie. Protokół ten opisuje wstrzyknięcie Aβ do komory mózgowej (ICV) bez instrumentów stereotaktycznych, umożliwiając wytwarzanie nieprawidłowości behawioralnych podobnych do choroby Alzheimera u normalnych myszy.

Wstrzyknięcie domózgowo-komorowe peptydów β amyloidu u normalnych myszy w celu ostrego wywołania deficytów poznawczych podobnych do choroby Alzheimera

Ten artykuł ilustruje, jak można określić ilościowo ekspresję receptorów neuroprzekaźników i przeanalizować wzór w synapsach z zidentyfikowanymi elementami pre i postsynaptycznymi, wykorzystując kombinację transdukcji wirusa za pomocą narzędzi optogenetycznych i techniki immunoznakowania repliki zamrażania i złamania.

Połączone znakowanie immunologiczne repliki optogenetycznej i zamrażalniczo-łamliwej w celu zbadania specyficznego dla danych wejściowych rozmieszczenia receptorów glutaminianu w ciele migdałowatym myszy

Aby zbadać efekty Aβo in vivo, opracowaliśmy model oparty na powtarzających się wlewach rozpuszczalnego Aβo z hipokampa w połączeniu z ciągłym wlewem przeciwciała Aβo (6E10) w hipokampie za pomocą pomp osmotycznych, aby przeciwdziałać neurotoksycznemu działaniu Aβo.

Neurodegeneracja w zwierzęcym modelu przewlekłego wlewu oligomerów beta-amyloidu jest przeciwdziałana przez leczenie przeciwciałami podawanymi pompami osmotycznymi

In utero operacje przeżycia u myszy umożliwiają molekularną manipulację ekspresją genów podczas rozwoju. W niniejszej pracy opisujemy wykorzystanie obrazowania ultradźwiękowego o wysokiej częstotliwości do prowadzenia iniekcji wektorów retrowirusowych do mózgu myszy w 9,5 dniu embrionalnym (E).

Mikroiniekcja do przedniego mózgu myszy in utero w dniu E9.5 pod kontrolą ultradźwięków

Poznaj metodę stereotaktycznego wlewu oligomerycznego beta-amyloidu 1-42 do zakrętu zębatego hipokampa myszy. Technika ta umożliwia badanie toksycznych skutków amyloidu na neurony w modelu in vivo.

Stereotaktyczny wlew oligomerycznego beta-amyloidu do hipokampa myszy

Przeglądaj więcej filmów