Name: Stereotaktyczny wlew oligomerycznego beta-amyloidu do hipokampa myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 16 s
Description: Poznaj metodę stereotaktycznego wlewu oligomerycznego beta-amyloidu 1-42 do zakrętu zębatego hipokampa myszy. Technika ta umożliwia badanie toksycznych skutków amyloidu na neurony w modelu in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez grant NS081333 National Institute of Neurological Disorders and Stroke (dla CMT), grant Stowarzyszenia Alzheimera NIRG-10-171721 i grant Narodowego Instytutu Zdrowia Psychicznego MH096702 (dla UH), oraz grant pilotażowy AG008702 National Institute on Aging na Uniwersytecie Columbia (dla YYJ i JB).

Uwaga: We wszystkich eksperymentach na zwierzętach, przestrzegano Instytucjonalnych i Krajowych wytycznych dotyczących opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych.
1. Przygotowanie narzędzi chirurgicznych i rozwiązań do operacji
<ol>
	<li>Autoklaw wszystkich narzędzi chirurgicznych ze stali nierdzewnej.</li>
	<li>Przygotuj 70% etanolu, rozcieńczając 200-procentowy etanol absolutny sterylną dejonizowaną wodą dejonizowaną klasy molekularnej.</li>
	<li>Umieścić igłę 29 G w strzykawce Hamiltona. Wyczyść wnętrze strzykawki i igły Hamiltona, pobierając i wyrzucając nanoczystą wodę kilkakrotnie przez 1 minutę. Powtórz tę procedurę z 70% etanolem.
	<ol>
		<li>Wyjąć tłok i igłę ze strzykawki Hamiltona. Wysuszyć części na powietrzu w okapie z przepływem laminarnym O/N.</li>
		<li>Naświetlić igłę i strzykawkę światłem ultrafioletowym przez 30 minut przed użyciem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować roztwór soli fizjologicznej, rozpuszczając NaCl w wodzie molekularnej do końcowej masy do stężenia objętościowego 0,9%. Wysterylizuj roztwór, filtrując go przez filtr porowy 0,2 μm.</li>
</ol>
2. Przygotuj oligomeryczny Aβ1-42
<ol>
	<li>Monomeryzacja i ponowne zawieszenie rekombinowanego ludzkiego Aβ1-42 w DMSO do 5 mM dokładnie tak, jak opisano w publikacji Fa' i innych13 .</li>
	<li>Rozcieńczyć 5 mM Aβ1-42 sterylnym (1x) PBS do 100 μM w dniu poprzedzającym zabieg.</li>
	<li>Dobrze wymieszać roztwór przez rozcieranie.</li>
	<li>Inkubować roztwór Aβ1-42 przez 12 godzin w temperaturze 4°C. 
	Uwaga: Roztwory kontrolne, takie jak rozcieńczanie DMSO w PBS lub zaszyfrowany/odwrócony peptyd Aβ1-42, należy przygotować w taki sam sposób jak Aβ1-42.</li>
</ol>
3. Określ współrzędne iniekcji
<ol>
	<li>Użyj atlasu mózgu dorosłej myszy, aby określić dokładne współrzędne przednio-tylne (AP), przyśrodkowo-boczne (ML) i grzbietowo-brzuszne (DV) dla obszaru mózgu będącego przedmiotem zainteresowania14. 
	Uwaga: Aby zilustrować tę technikę, jako cel wybraliśmy zakręt zębaty hipokampa o następujących współrzędnych z bregmy: AP, -2,00 mm; ML, ±1,3 mm; DV, -2,2 mm. Znak ujemny poprzedzający wartość AP wskazuje, że znajduje się on 2,00 mm za bregmą. Znak ± poprzedzający wartość ML wskazuje kierunek w lewo i w prawo od środka. Wreszcie, znak ujemny poprzedzający DV wskazuje, że porusza się on brzusznie od powierzchni mózgu.</li>
</ol>
4. Stereotaktyczne ustawienie klatki
<ol>
	<li>Noś chirurgiczną maskę na twarz, czysty fartuch laboratoryjny i sterylne rękawice chirurgiczne.</li>
	<li>Przetrzyj instrument stereotaktyczny i adapter myszy 70% etanolem.</li>
	<li>Połóż sterylną serwetę chirurgiczną na blacie.</li>
	<li>Umieść instrument stereotaktyczny z adapterem myszy na sterylnym serwecie chirurgicznym.</li>
	<li>Przetrzyj poduszkę grzewczą myszy 70% etanolem. Umieść poduszkę grzewczą nad stereotaktycznym łóżkiem ramy. Użyj taśmy do etykietowania laboratoryjnego ogólnego przeznaczenia, aby przykleić poduszkę grzewczą do łóżka adaptera myszy.
	<ol>
		<li>Przymocuj poduszkę grzewczą do pompy recyrkulacyjnej ciepłej wody zgodnie ze wskazówkami producenta.</li>
		<li>Włącz pompę recyrkulatora ciepłej wody i ustaw temperaturę na 37 °C, a następnie poczekaj, aż osiągnie temperaturę.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Strzykawkę Hamiltona o pojemności 50 μl z igłą 29 G przymocować do ramy stereotaktycznej, przykręcając ją do zmotoryzowanego pionowego wału wtryskowego zgodnie ze wskazówkami producenta.</li>
	<li>Włącz sterylizator do koralików i poczekaj, aż osiągnie temperaturę zadaną przez producenta. 
	Uwaga: Służy do sterylizacji narzędzi ze stali nierdzewnej między zwierzętami. Do sterylizacji narzędzia potrzebują 20 sekund kontaktu z kulkami.</li>
	<li>Włącz płytę grzejną i ustaw ją na 42 °C i umieść na niej czystą, pustą klatkę.</li>
	<li>Podczas gdy strzykawka Hamiltona jest zamocowana na ramie stereotaktycznej, użyj zmotoryzowanego wtryskiwacza stereotaktycznego, aby pobrać roztwór Aβ1-42. 
	Uwaga: Pobrać więcej niż 4 μl roztworu do strzykawki, a następnie użyć wstrzykiwacza stereotaktycznego, aby ustawić objętość wstrzykiwanego roztworu. Eksploatuj wtryskiwacz zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
</ol>
5. Przygotowanie zwierząt
<ol>
	<li>Określ wagę myszy za pomocą wagi.</li>
	<li>Znieczulić mysz koktajlem ketaminy/ksylazyny w dawce 100 mg/kg ketaminy i 10 mg/kg ksylazyny przez wstrzyknięcie dootrzewnowe (IP). Monitoruj głębokość znieczulenia przez utratę odruchu szczypania palców u stóp.</li>
	<li>Po uspokojeniu myszy weź maszynkę do strzyżenia włosów i ogol jej głowę, aby odsłonić skórę nad czaszką.</li>
	<li>Umieść mysz na poduszce grzewczej na łóżku stereotaktycznym.</li>
	<li>Użyj szpatułki, aby otworzyć usta i umieść siekacze wewnątrz osłony zębów. Przymocuj końcówkę do nosa na pysku myszy. Zaciśnij go delikatnie i niezbyt mocno.</li>
	<li>Umieść obustronne poprzeczki uszne w przewodzie słuchowym, aby zabezpieczyć głowę. Przesuń każdą poprzeczkę, aż uderzy w czaszkę, a następnie przekręć, aby ją zablokować.
	<ol>
		<li>Aby upewnić się, że głowa jest zabezpieczona, delikatnie dociśnij głowę palcem wskazującym. Jeśli głowica jest odpowiednio zabezpieczona, nie podda się ani nie poruszy po naciśnięciu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Nałóż kroplę kremu lub kropli do oczu na oczy, aby utrzymać je nawilżone. Upewnij się, że oczy są wilgotne przez cały zabieg chirurgiczny.</li>
	<li>Aby zdezynfekować miejsce operacji, użyj sterylnych wacików bawełnianych, aby nałożyć roztwór betadyny na skórę nad czaszką, a następnie 70% etanolu. Wykonaj naprzemienne czyszczenie betadyną i 70% etanolem jeszcze 2 razy.</li>
</ol>
6. Chirurgia i infuzja
<ol>
	<li>Użyj skalpela, aby wykonać 2-3 mm nacięcie w linii środkowej skóry głowy, a następnie użyj prostych cienkich nożyczek, aby przedłużyć linię nacięcia do 1,0-1,5 cm, aby odsłonić szew strzałkowy, bregmę i lambdę czaszki, punkty orientacyjne, na których oparte są współrzędne stereotaktyczne. Użyj mikro zacisków, aby utrzymać skórę z dala od siebie. 
	Uwaga: Pozycje bregma i lambda są wyjaśnione w atlasie mózgu myszy "The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates" (Mózg myszy we współrzędnych stereotaktycznych)14.</li>
	<li>Weź bawełniany wacik, namocz go w sterylnym roztworze soli fizjologicznej i użyj go do oczyszczenia czaszki. Następnie użyj czystego, suchego bawełnianego wacika, aby wysuszyć czaszkę.</li>
	<li>Użyj sterylnego cienkiego pisaka, aby zaznaczyć kropkę na bregmie. Użyj stereotaktycznego mikromanipulatora, aby ustawić strzykawkę Hamiltona tak, aby końcówka igły dotykała kropki na bregmie.
	<ol>
		<li>Zapisz współrzędną DV.</li>
		<li>Aby sprawdzić, czy oś AP czaszki jest wypoziomowana, przesuń strzykawkę Hamiltona do tyłu, tak aby końcówka igły dotykała punktu lambda.</li>
		<li>Zapisz pozycję DV. Upewnij się, że współrzędne DV dla bregmy i lambdy mieszczą się w zakresie 0.5 mm. 
		Uwaga: Celem jest zminimalizowanie różnicy DV między bregmą a lambdą.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Użyj mikromanipulatora, aby przywrócić końcówkę igły strzykawki Hamilton z powrotem do kropki bregma.</li>
	<li>Zapisz początkową pozycję AP.</li>
	<li>Oblicz końcową pozycję AP, odejmując 2,00 mm od początkowej współrzędnej AP.</li>
	<li>Użyj mikromanipulatora, aby przesunąć igłę strzykawki Hamiltona na ostateczną współrzędną AP.</li>
	<li>Zapisz bieżącą współrzędną uczenia maszynowego.</li>
	<li>Oblicz lewą i prawą końcową współrzędną ML, dodając lub odejmując 1.3 mm od początkowej współrzędnej ML.</li>
	<li>Użyj mikromanipulatora, aby przesunąć igłę strzykawki Hamiltona do końcowej współrzędnej ML.
	<ol>
		<li>Przyłóż końcówkę igły do powierzchni czaszki na obu końcowych współrzędnych ML i zapisz współrzędne DV i upewnij się, że wartości mieszczą się w granicach 0.5 mm. 
		Uwaga: Celem jest zminimalizowanie różnicy DV między dwiema końcowymi współrzędnymi ML.</li>
		<li>Będąc na współrzędnej końcowej, pociągnij igłę w górę 0,5-1 cm nad czaszką. Weź sterylny cienki długopis, aby zaznaczyć kropkę na powierzchni czaszki. Powtórz ten krok dla przeciwległej strony czaszki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odsuń strzykawkę Hamiltona na bok.</li>
	<li>Przymocuj głowicę wiertarską 0.8 mm do wiertła. Weź wiertło obiema rękami, ustaw łokcie na powierzchni stołu, aby zapewnić stabilność, i umieść głowicę wiertarską nieco powyżej kropki sharpie na lewej lub prawej współrzędnej ML. Aktywuj wiertło, opuść końcówkę wiertła na powierzchnię czaszki, aby wprowadzić otwór w czaszce. Powtórz ten krok dla strony przeciwnej. 
	Uwaga: Z nowo wprowadzonych otworów może wystąpić pewne krwawienie. Jeśli wystąpi krwawienie, użyj czystego, suchego bawełnianego wacika, aby przetrzeć krew.</li>
	<li>Przesunąć strzykawkę Hamiltona z powrotem na miejsce nad jednym z nowo wprowadzonych otworów ML. Opuść igłę Hamiltona tuż za czaszką. W tym momencie należy uważać, aby nie przebić mózgu. Aby upewnić się, że igła przeszła przez czaszkę, weź palec wskazujący i delikatnie dociśnij igłę do czaszki, aby upewnić się, że igła nie wyjdzie z otworu.</li>
	<li>Zapisz początkową współrzędną DV.</li>
	<li>Oblicz końcową współrzędną DV, odejmując 2,2 mm od początkowej współrzędnej DV.</li>
	<li>Opuść wskazówkę w dół do końcowej współrzędnej DV.</li>
	<li>Aktywuj stereotaktyczną pompę wtryskową, aby wpompować 4 μl Aβ1-42 do zakrętu zębatego z szybkością 0,5 μl/min.</li>
	<li>Po zakończeniu infuzji pozostaw igłę na miejscu przez dodatkowy 1 minutę, aby zminimalizować cofanie się roztworu z miejsca wstrzyknięcia.</li>
	<li>Przesuń igłę na drugą stronę mózgu i powtórz kroki 6.13-6.18.</li>
</ol>
7. Usuwanie zwierząt i opieka pooperacyjna
<ol>
	<li>Odkręć nauszniki i osłonę twarzy/nosa. Wyjmij mysz z urządzenia.</li>
	<li>Użyj standardowych kleszczyków uczniowskich, aby zbliżyć skórę głowy, a następnie uszczelnić ranę szwem.</li>
	<li>Wstrzyknij 1 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej myszy za pośrednictwem IP w celu nawodnienia.</li>
	<li>Buprenorfinę (0,1 mg/kg) należy wstrzykiwać podskórnie w celu złagodzenia bólu.</li>
	<li>Trzymaj mysz w czystej, pustej klatce umieszczonej na płycie grzejnej o temperaturze 42 °C, aż się obudzi, a następnie włóż ją z powrotem do klatki z dużą ilością jedzenia i wody.</li>
	<li>Buprenorfinę należy podawać we wstrzyknięciu podskórnym co 12 godzin przez 3 dni w celu złagodzenia bólu.</li>
</ol>
8. Usuwanie szwów
<ol>
	<li>Znieczulić mysz koktajlem ketaminy/ksylazyny w dawce 100 mg/kg ketaminy i 10 mg/kg klyazyny przez IP. Uwaga: Odbywa się to 7-10 dni po zabiegu.</li>
	<li>Użyj standardowych kleszczyków i prostych cienkich nożyczek, aby usunąć szew.</li>
	<li>Wstrzyknij 1 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej myszy za pośrednictwem IP w celu nawodnienia.</li>
	<li>Trzymaj mysz w czystej, pustej klatce umieszczonej na płycie grzejnej o temperaturze 42 °C, aż się obudzi, a następnie włóż ją z powrotem do klatki z dużą ilością jedzenia i wody.</li>
</ol>
9. Składanie ofiar ze zwierząt i przetwarzanie tkanek
<ol>
	<li>Znieczulij mysz i przetapiaj ją 4% paraformaldehydem15, usuń mózg i poddaj go do kriosekcji16, 
	Uwaga: Czas składania ofiar ze zwierząt zależy od eksperymentatora. Jednak do naszych badań wybraliśmy 7 i 14 dni po zabiegu.</li>
</ol>

<ol><li>Baleriola, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonally+Synthesized+ATF4+Transmits+a+Neurodegenerative+Signal+across+Brain+Regions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Axonally Synthesized ATF4 Transmits a Neurodegenerative Signal across Brain Regions.</a> Cell. 158 (5), 1159-1172 (2014).</li>
<li>Haass, C., Selkoe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soluble+protein+oligomers+in+neurodegeneration%3A+lessons+from+the+Alzheimer%27s+amyloid+beta-peptide.+Nature+reviews%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Soluble protein oligomers in neurodegeneration: lessons from the Alzheimer's amyloid beta-peptide. Nature reviews.</a> Molecular cell biology. 8 (2), 101-112 (2007).</li>
<li>Knowles, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+p75+neurotrophin+receptor+promotes+amyloid-beta%281-42%29-induced+neuritic+dystrophy+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The p75 neurotrophin receptor promotes amyloid-beta(1-42)-induced neuritic dystrophy in vitro and in vivo.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 29 (34), 10627-10637 (2009).</li>
<li>Troy, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((beta-Amyloid-induced+neuronal+apoptosis+requires+c-Jun+N-terminal+kinase+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neurochemistry%22%5BJournal%5D)">beta-Amyloid-induced neuronal apoptosis requires c-Jun N-terminal kinase activation.</a> Journal of neurochemistry. 77 (1), 157-164 (2001).</li>
<li>Crews, L., Rockenstein, E., Masliah, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((APP+transgenic+modeling+of+Alzheimer%27s+disease%3A+mechanisms+of+neurodegeneration+and+aberrant+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+structure+%26+function%22%5BJournal%5D)">APP transgenic modeling of Alzheimer's disease: mechanisms of neurodegeneration and aberrant neurogenesis.</a> Brain structure & function. 214 (2-3), 111-126 (2010).</li>
<li>Gotz, J., Ittner, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+Alzheimer%27s+disease+and+frontotemporal+dementia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Animal models of Alzheimer's disease and frontotemporal dementia.</a> Nature reviews. Neuroscience. 9 (7), 532-544 (2008).</li>
<li>Calhoun, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuron+loss+in+APP+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neuron loss in APP transgenic mice.</a> Nature. 395 (6704), 755-756 (1998).</li>
<li>Oakley, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraneuronal+beta-amyloid+aggregates%2C+neurodegeneration%2C+and+neuron+loss+in+transgenic+mice+with+five+familial+Alzheimer%27s+disease+mutations%3A+potential+factors+in+amyloid+plaque+formation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Intraneuronal beta-amyloid aggregates, neurodegeneration, and neuron loss in transgenic mice with five familial Alzheimer's disease mutations: potential factors in amyloid plaque formation.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 26 (40), 10129-10140 (2006).</li>
<li>Jean, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase-2+is+essential+for+c-Jun+transcriptional+activation+and+Bim+induction+in+neuron+death%5BTitle%5D)+AND+%22The+Biochemical+journal%22%5BJournal%5D)">Caspase-2 is essential for c-Jun transcriptional activation and Bim induction in neuron death.</a> The Biochemical journal. 455 (1), 15-25 (2013).</li>
<li>Sotthibundhu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta-amyloid%281-42%29+induces+neuronal+death+through+the+p75+neurotrophin+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Beta-amyloid(1-42) induces neuronal death through the p75 neurotrophin receptor.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 28 (15), 3941-3946 (2008).</li>
<li>Kar, S., Quirion, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid+beta+peptides+and+central+cholinergic+neurons%3A+functional+interrelationship+and+relevance+to+Alzheimer%27s+disease+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+brain+research%22%5BJournal%5D)">Amyloid beta peptides and central cholinergic neurons: functional interrelationship and relevance to Alzheimer's disease pathology.</a> Progress in brain research. 145, 261-274 (2004).</li>
<li>Leranth, C., Frotscher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+of+the+septal+region+in+the+rat+brain%3A+cholinergic-GABAergic+interconnections+and+the+termination+of+hippocampo-septal+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+comparative+neurology%22%5BJournal%5D)">Organization of the septal region in the rat brain: cholinergic-GABAergic interconnections and the termination of hippocampo-septal fibers.</a> The Journal of comparative neurology. 289 (2), 304-314 (1989).</li>
<li>Fa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+oligomeric+beta-amyloid+1-42+and+induction+of+synaptic+plasticity+impairment+on+hippocampal+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Preparation of oligomeric beta-amyloid 1-42 and induction of synaptic plasticity impairment on hippocampal slices.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (41), (2010).</li>
<li>Paxinos, G., Franklin, K. B. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22The+Mouse+Brain+in+Stereotaxic+Coordinates%22">The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates</a>. , Second edn, Academic Press. (2001).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (65), (2012).</li>
<li>Currle, D. S., Monuki, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flash+freezing+and+cryosectioning+E12.5+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Flash freezing and cryosectioning E12.5 mouse brain.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (4), (2007).</li>
<li>Jin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soluble+amyloid+beta-protein+dimers+isolated+from+Alzheimer+cortex+directly+induce+Tau+hyperphosphorylation+and+neuritic+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Soluble amyloid beta-protein dimers isolated from Alzheimer cortex directly induce Tau hyperphosphorylation and neuritic degeneration.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (14), 5819-5824 (2011).</li>
<li>Lambert, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusible%2C+nonfibrillar+ligands+derived+from+Abeta1-42+are+potent+central+nervous+system+neurotoxins%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Diffusible, nonfibrillar ligands derived from Abeta1-42 are potent central nervous system neurotoxins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (11), 6448-6453 (1998).</li>
<li>Masters, C. L., Selkoe, D. J. Biochemistry of amyloid beta-protein and amyloid deposits in Alzheimer disease. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMasters%2C+CL+%22Cold+Spring+Harbor+perspectives+in+medicine%22">Cold Spring Harbor perspectives in medicine</a>. 2 (6), a006262(2012).</li>
<li>Chakrabarti, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogen+receptor+agonists+for+attenuation+of+neuroinflammation+and+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+research+bulletin%22%5BJournal%5D)">Estrogen receptor agonists for attenuation of neuroinflammation and neurodegeneration.</a> Brain research bulletin. 109C, 22-31 (2014).</li>
<li>Cirrito, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+assessment+of+brain+interstitial+fluid+with+microdialysis+reveals+plaque-associated+changes+in+amyloid-beta+metabolism+and+half-life%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">In vivo assessment of brain interstitial fluid with microdialysis reveals plaque-associated changes in amyloid-beta metabolism and half-life.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 23 (26), 8844-8853 (2003).</li>
<li>Puzzo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Picomolar+amyloid-beta+positively+modulates+synaptic+plasticity+and+memory+in+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Picomolar amyloid-beta positively modulates synaptic plasticity and memory in hippocampus.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 28 (53), 14537-14545 (2008).</li>
<li>Puzzo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endogenous+amyloid-beta+is+necessary+for+hippocampal+synaptic+plasticity+and+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of%22%5BJournal%5D)">Endogenous amyloid-beta is necessary for hippocampal synaptic plasticity and memory.</a> Annals of. 69 (5), 819-830 (2011).</li>
<li>Akpan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intranasal+delivery+of+caspase-9+inhibitor+reduces+caspase-6-dependent+axon%2Fneuron+loss+and+improves+neurological+function+after+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Intranasal delivery of caspase-9 inhibitor reduces caspase-6-dependent axon/neuron loss and improves neurological function after stroke.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 31 (24), 8894-8904 (2011).</li>
<li>Fulmer, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocyte-derived+BDNF+supports+myelin+protein+synthesis+after+cuprizone-induced+demyelination%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Astrocyte-derived BDNF supports myelin protein synthesis after cuprizone-induced demyelination.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 34 (24), 8186-8196 (2014).</li>
<li>Thakker-Varia, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neuropeptide+VGF+is+reduced+in+human+bipolar+postmortem+brain+and+contributes+to+some+of+the+behavioral+and+molecular+effects+of+lithium%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The neuropeptide VGF is reduced in human bipolar postmortem brain and contributes to some of the behavioral and molecular effects of lithium.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 30 (28), 9368-9380 (2010).</li>
<li>Greferath, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enlarged+cholinergic+forebrain+neurons+and+improved+spatial+learning+in+p75+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22The+European+journal+of+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Enlarged cholinergic forebrain neurons and improved spatial learning in p75 knockout mice.</a> The European journal of neuroscience. 12 (3), 885-893 (2000).</li>
<li>Brashear, H. R., Zaborszky, L., Heimer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+GABAergic+and+cholinergic+neurons+in+the+rat+diagonal+band%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Distribution of GABAergic and cholinergic neurons in the rat diagonal band.</a> Neuroscience. 17 (2), 439-451 (1986).</li>
<li>Clarke, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholinergic+innervation+of+the+rat+dentate+gyrus%3A+an+immunocytochemical+and+electron+microscopical+study%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+research%22%5BJournal%5D)">Cholinergic innervation of the rat dentate gyrus: an immunocytochemical and electron microscopical study.</a> Brain research. 360 (1-2), 349-354 (1985).</li>
<li>Garcia-Osta, A., Alberini, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid+beta+mediates+memory+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Learning+%26+memory%22%5BJournal%5D)">Amyloid beta mediates memory formation.</a> Learning & memory. 16 (4), 267-272 (2009).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Aby osiągnąć udane wstrzyknięcie Aβ1-42 , eksperymentator lub chirurg musi: 1) stosować technikę aseptyczną; 2) prawidłowo zidentyfikować obszar mózgu zainteresowania za pomocą dokładnych współrzędnych; 3) umieć prawidłowo zabezpieczyć mysz w ramce stereotaktycznej z mózgiem wypoziomowanym w osi AP i ML; 4) posiadają umiejętność precyzyjnej obsługi mikromanipulatora; 5) Zadbaj o właściwą opiekę pooperacyjną. Jeśli te kluczowe kroki zostaną wykonane, mysz powinna przetrwać operację bez zauważalnej infekcji....

Złogi blaszek amyloidowych, które składają się z beta-amyloidu (Aβ1-42), są kluczową cechą patologii choroby Alzheimera (AD). Liczne badania wykazały, że wysokie lub toksyczne poziomy rekombinowanego oligomerycznego Aβ1-42 wywołują śmierć neuronów, dystrofię synaptyczną, utratę i dysfunkcję; a także deficyty uczenia się i pamięci1-4. Dotknięte obszary mózgu obejmują hipokamp, korę mózgową i struktury podkorowe, takie jak podstawa przodomózgowia i ciało migdałowate5,6. Do tej pory istnieje wiele transgenicznych modeli myszy, które próbują symulować patologię Aβ1-42 w AD. W zależności od szczepu, zwierzęta te okazują się przydatne w badaniu wybranych cech patologicznych AD. Niestety, z wyjątkiem 2 linii transgenicznych, APP23 i 5XFAD, myszy te nigdy w pełni nie replikują utraty neuronów, kluczowego aspektu AD. Nawet przy utracie neuronów zaobserwowanej w APP23 i 5XFAD, obserwowana śmierć neuronów była subtelna, zależna od wieku i izolowana do kilku wybranych regionów7,8.
Bezpośrednia infuzja oligomerycznego Aβ1-42 do mózgu myszy typu dzikiego stanowi doskonały model in vivo, który odtwarza aspekt śmierci neuronalnej amyloidopatii1,9,10. W przeciwieństwie do powszechnie stosowanych modeli myszy transgenicznych, oligomeryczny model infuzji Aβ1-42 jest idealny do gwałtownego podniesienia poziomu Aβ1-42 w sposób przestrzenny i czasowy. Zaletą wykorzystania myszy typu dzikiego w tym modelu jest wyeliminowanie potencjalnej kompensacji lub skutków ubocznych mutacji wprowadzonych w transgenicznych liniach myszy. Wcześniejsze badania wykazały, że wprowadzenie toksycznych poziomów Aβ1-42 do hipokampa powoduje śmierć neuronów w pobliżu miejsca wstrzyknięcia w ciągu 1 tygodnia1. Ponadto, zgodnie z obserwacją, że Aβ1-42 jest toksyczny dla neuronów cholinergicznych11, populacja podstawowych neuronów cholinergicznych w przodomózgowiu (BFCN), która rzutuje do hipokampa, zmniejsza się o 20-50% w ciągu 7-14 dni po infuzji beta-amyloidu1,10 u myszy, skutecznie umożliwiając badanie izolowanych obwodów neuronalnych w mózgu. Ponieważ BFCN rzutuje ipsilateralnie do zakrętu zębatego hipokampa12, w większości roztwory kontrolne / nośnikowe i oligomeryczne Aβ1-42 mogą być wstrzykiwane po obu stronach mózgu, co pozwala na porównania między lewą i prawą półkulą1.
W tym raporcie przedstawimy szczegółową metodologię chirurgiczną i iniekcyjną dla dorosłych myszy C57BL/6J typu dzikiego. Ten szczep myszy jest wybierany ze względu na jego szerokie zastosowanie w badaniach. Technicznie rzecz biorąc, każdy obszar mózgu może być celem infuzji, jednak tutaj użyjemy zakrętu zębatego hipokampa jako celu, aby zilustrować technikę.

<table><tbody><tr><td>Ketamina HCl (100 mg/ml)</td><td>Henry Schein Medical</td><td>1049007</td><td>100 mg ketaminy na 1 kg zwierzęcia</td></tr><tr><td>Ksylazyna (20 mg/ml)</td><td>Henry Schein Medical</td><td>niedostępne</td><td>10 mg ksylazyny na 1 kg zwierzęcia</td></tr><tr><td>Buprenex (0,3 mg/ml)</td><td>Henry Schein Medical</td><td>1217793</td><td>0,1 mg buprenex na 1 kg zwierzęcia</td></tr><tr><td>A&beta; 1-42</td><td>David Teplow/UCLA</td><td>niedostępny</td><td>100 &mu; M; Ten amyloid został wykorzystany w pracy</td></tr><tr><td>A&beta; 1-42</td><td>Bachem</td><td>H-1368</td><td>Może być stosowany zamiast amyloidu z laboratorium Teplow</td></tr><tr><td>A&beta; 1-42</td><td>American Peptide</td><td>62-0-80B</td><td>Może być stosowany zamiast amyloidu z laboratorium Teplow</td></tr><tr><td>Scrambled A&beta; 1-42</td><td>American Peptide</td><td>62-0-46B</td><td>Może być stosowany jako peptyd kontrolny do porównywania A i beta; Przeciwciało 1-42</td></tr><tr><td>NU4 (oligomeryczne przeciwciało amyloidowe)</td><td>Prezent od Williama Kleina/Northwestern U.</td><td>niedostępne</td> Przeciwciało oligomeryczne antyamyloidowe w <td>rozcieńczeniu 1:2 000</td></tr><tr><td>&nbsp; (Królik poliklonalny)</td><td>EMD Millipore</td><td>AB9234</td><td>Może być stosowany zamiast Nu4; musi&nbsp; być przetestowany przez użytkownika końcowego</td></tr><tr><td>Przeciwciało 6E10 (mysz monoklonalna) (przeciwciało amyloidowe)</td><td>Biolegend</td><td>sig-39320</td><td>rozcieńczenie 1:1,000</td></tr><tr><td>Przeciwciało ChAT (koza poliklonalna)</td><td>Milipora</td><td>AB144P</td><td>Rozcieńczenie 1:100</td></tr><tr><td>Ślepy zaułek Fluorometryczny system TUNEL</td><td>Promega</td><td>G3250</td><td>Postępuj zgodnie ze wskazówkami producenta dla użyj</td></tr><tr><td>odczynnika Prolong Gold Antifade z DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>P36935</td><td>Używaj podczas szkiełek nakrywkowych</td></tr><tr><td>Fluorogold</td><td>Fluorochrome, LLC</td><td>niedostępne</td> 2<td>% roztwór</td></tr><tr><td>Absolutny etanol (200 proof)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2818-4</td><td>Do wytwarzania 70% etanolu do odkażania i dezynfekcji</td></tr><tr><td>Novex 10-20% Tricine gel</td><td>Life Technologies</td><td>EC6625BOX</td><td>Do oddzielania A&beta; 1-42</td></tr><tr><td>Novex Tricine SDS Running Buffer (10X)</td><td>Life Technologies</td><td>LC1675</td><td>Do uruchamiania 10-20% żeli Tricine</td></tr><tr><td>Novex Tris-Glycine Transfer Buffer (25X)</td><td>Life Technologies</td><td>LC3675</td><td>Do przenoszenia 10-20% żeli Tricine</td></tr><tr><td>SuperSignal Western Blot Enhancer</td><td>Thermo Scientific</td><td>46640</td><td>Do wzmacniania A&beta; sygnał 1-42; postępuj zgodnie z protokołem producenta</td></tr><tr><td>Protran BA79 Nitrocelulozowa membrana bibułowa, 0,1 &mu; m</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>10402088</td><td>Do przenoszenia 10-20% żeli Tricine</td></tr><tr><td>Xcell SureLock Mini-Cell</td><td>Life Technologies</td><td>EI0001</td><td>Aparatura do elektroforezy do uruchamiania 10-20% żeli tricine</td></tr><tr><td>GenTeal Lubricant Żel pod oczy</td><td>Novartis</td><td>niedostępny</td><td>Do utrzymywania wilgotności oczu myszy podczas operacji; można znaleźć w lokalnych aptekach &#160; </td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>Odśwież Optive Lubricant Krople do oczu</td><td>Allergan</td><td>niedostępne</td><td>Do utrzymywania wilgotności oczu myszy podczas operacji; można je znaleźć w lokalnych aptekach; Może być stosowany zamiast GenTeal</td></tr><tr><td>Betadine</td><td>Stoelting</td><td>50998</td><td>Do odkażania i dezynfekcji</td></tr><tr><td>szpatułki okrągłej/stożkowej&nbsp;</td><td>VWR</td><td>82027-490</td><td>Do otwierania pyska zwierzęcia</td></tr><tr><td>Bulldog Serrefines Zaciski (szczęki wym. 9X1,6 mm; Długość 28 mm)</td><td>Fine Science Tools</td><td>18050-28</td><td>Opcjonalnie; Do rozsuwania skóry głowy podczas iniekcji</td></tr><tr><td>Proste cienkie nożyczki (krawędź tnąca 25 mm; Długość 11,5 cm)</td><td>Fine Science Tools</td><td>14060-11</td><td>Do cięcia skóry głowy</td></tr><tr><td>#3 Rękojeść skalpela</td><td>Fine Science Tools</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>#11 Ostrze chirurgiczne</td><td>Fine Science Tools</td><td>10011-00</td><td>Do wykonywania nacięć skóry głowy</td></tr><tr><td>Student Standard Pattern Forcep (końcówka wym. 2,5x1,5 mm; Długość 11,5 cm)</td><td>Fine Science Tools</td><td>91100-12</td><td>Do trzymania skóry głowy zamkniętej podczas szycia</td></tr><tr><td>Zestaw trymerów Combo Kent</td><td>Scientific</td><td>CL9990-1201</td><td>Do golenia włosów</td></tr><tr><td>Recyrkulator ciepłej wody T/Pump&nbsp;</td><td>Kent Naukowy&nbsp;</td><td>TP-700</td><td>Do ogrzewania zwierzęcia podczas operacji</td></tr><tr><td>Podkładka wojenna wielokrotnego użytku (5 "x 10")</td><td>Kent Scientific&nbsp;</td><td>TPZ-0510FEA</td><td>Do podłączenia go do recyrkulatora ciepłej wody T / Pump w celu ogrzania zwierzęcia podczas operacji</td></tr><tr><td>Akumulatorowa wiertarka Micro Drill</td><td>58610</td><td>Użyj stalowych zadziorów 0,8 mm do wiercenia otworów w czaszce</td><td></td></tr><tr><td>Standardowy instrument stereotaktyczny Lab z myszą i Adapter dla noworodków dla szczurów</td><td>Stoelting</td><td>51615</td><td></td></tr><tr><td>Tylko dla myszy Stereotaktyczny instrument</td><td>Stoelting</td><td>51730</td><td>Może używać tego zamiast Stoelting Cat. #51615</td></tr><tr><td>Kwintesencja wtryskiwacza stereotaktycznego</td><td>Stoelting</td><td>53311</td><td></td></tr><tr><td>Sterylizator z suchymi szklanymi kulkami</td><td>Stoelting</td><td>50287</td><td>Do sterylizacji narzędzi ze stali nierdzewnej</td></tr><tr><td>Sterylna serweta chirurgiczna (18" x 26")</td><td>Stoelting</td><td>50981</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka Hamilton 50 ml, Model 705 RN SYR, NDL</td><td>Hamilton Company</td><td>7637-01</td><td>Do wstrzykiwania mózgu; używaj różnych strzykawek do różnych roztworów</td></tr><tr><td>Igła 29 G, mała piasta RN</td><td>NDL Hamilton Company</td><td>7803-06</td><td>Do mocowania do strzykawki Hamilton do wstrzykiwań mózgu</td></tr><tr><td>1 ml BD Strzykawki tuberkulinowe</td><td>VWR</td><td>BD309659</td><td>Do podawania znieczulenia i soli fizjologicznej</td></tr><tr><td>Igła 30 G (0,5")</td><td>VWR</td><td>BD305106</td><td>Do podawania znieczulenia i soli fizjologicznej</td></tr><tr><td>Przenośna elektroniczna waga z serii CS (Ohaus)</td><td>VWR</td><td>65500-202</td><td>Do ważenia zwierząt w celu ustalenia dawki znieczulającej</td></tr><tr><td>Płyta grzejna (płyta górna o wymiarach 7,25 x 7,25 cala)</td><td>VWR</td><td>47751-148</td><td>Do ogrzewania zwierząt po operacji</td></tr><tr><td>Cięcie szwu jedwabnego Sofsilk C-1 3/8, 12 mm</td><td>Covidien</td><td>S1173</td><td>Do zamykania rany</td></tr><tr><td>Klej tkankowy Vetbond (3M)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-361931</td><td>Opcjonalnie: do pomocy w zamykaniu ran; Stosować ze szwem.</td></tr><tr><td>Sterylne aplikatory z drewnianą końcówką z bawełnianą końcówką</td><td>Fisher scientific</td><td>22-029-488</td><td>Do czyszczenia i suszenia ran pooperacyjnych</td></tr><tr><td>Fisherbrand Superfrost Plus Szkiełka mikroskopowe</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>12-550-15</td><td>Do pobierania wycinków mózgu</td></tr><tr><td>Szkło osłonowe VWR Micro 24 X 50 mm</td><td>VWR</td><td>48393241</td><td>Do montażu szkiełek mikroskopowych</td></tr><tr><td>Thermo Scientific Nalgene Filtr strzykawkowy 0,2 &mu; m</td><td>Fisher Scientific</td><td>194-2520</td><td>Do sterylizacji roztworu soli</td></tr><tr><td>fizjologicznej Sterylne markery do skóry z podwójną końcówką firmy Viscot Medical</td><td>Medline</td><td>VIS1422SRL91</td><td>Do oznaczania współrzędnych na czaszce</td></tr></tbody></table>

stereotaktyczny wlew oligomerycznego beta-amyloidu do hipokampa myszy

Stereotaxic Infusion of Oligomeric Amyloid-beta into the Mouse Hippocampus

Choroba Alzheimera jest chorobą neurodegeneracyjną dotykającą starzejące się społeczeństwo. Kluczową cechą neuropatologiczną choroby jest nadmierna produkcja beta-amyloidu i odkładanie się blaszek beta-amyloidowych w obszarach mózgu osób dotkniętych chorobą. Przez lata naukowcy stworzyli wiele mysich modeli choroby Alzheimera, które próbują odtworzyć patologię beta-amyloidu. Niestety, modele myszy tylko wybiórczo naśladują cechy choroby. Śmierć neuronów, znaczący efekt w mózgach pacjentów z chorobą Alzheimera, jest zauważalnie nieobecna u tych myszy. W związku z tym my i inni zastosowaliśmy metodę bezpośredniego wstrzykiwania rozpuszczalnych oligomerycznych form beta-amyloidu - form beta-amyloidu, które, jak udowodniono, są najbardziej toksyczne dla neuronów - stereotaktycznie do mózgu. W tym raporcie wykorzystujemy samce myszy C57BL / 6J, aby udokumentować tę chirurgiczną technikę zwiększania poziomu beta amyloidu w wybranym regionie mózgu. Celem infuzji jest zakręt zębaty hipokampa, ponieważ ta struktura mózgu, wraz z podstawną przodomózgowiem, która jest połączona obwodem cholinergicznym, stanowi jeden z obszarów zwyrodnienia w chorobie. Wyniki podniesienia beta-amyloidu w zakręcie zębatym za pomocą infuzji stereotaktycznej ujawniają wzrost utraty neuronów w zakręcie zębatym w ciągu 1 tygodnia, podczas gdy jednocześnie występuje wzrost śmierci komórek i utrata neuronów cholinergicznych w pionowej kończynie ukośnego pasma Broca podstawy przodomózgowia. Efekty te obserwuje się do 2 tygodni. Nasze dane sugerują, że obecny model infuzji beta-amyloidu stanowi alternatywny model mysi do rozwiązywania problemów związanych ze śmiercią neuronów specyficznych dla regionu w perspektywie krótkoterminowej. Zaletą tego modelu jest to, że beta-amyloid może być podwyższony w sposób przestrzenny i czasowy.

Opisana metoda otrzymywania ludzkiego rekombinowanego oligomerycznego Aβ1-42 pozwala na uzyskanie rozpuszczalnych form oligomerycznych składających się z monomerów, dimerów, trimerów i tetramerów (Rysunek 1A). Wykazano w wielu badaniach, że te formy Aβ1-42 o niskiej masie cząsteczkowej, a nie włókna i blaszki, są najbardziej toksyczne dla neuronów1,4,9,17-19. Aby ustalić, czy oligomeryczny Aβ1-42 indukuje śmierć neuronów w mózgu myszy, Aβ1-42 (4 µl r...

Tutaj prezentujemy protokół bezpośredniej stereotaktycznej infuzji beta-amyloidu do mózgu. Metodologia ta zapewnia alternatywny model mysi in vivo w celu rozwiązania krótkoterminowych skutków beta-amyloidu na neurony mózgowe.

Stereotaktyczny wlew oligomerycznego beta-amyloidu do hipokampa myszy

Alzheimer&#8217;s disease is a neurodegenerative disease affecting the aging population. A key neuropathological feature of the disease is the ...

Ogólnym celem tej procedury jest stereotaktyczne wstrzyknięcie Liga meric a beta 1 42 do zakrętu zębatego hipokampa. Osiąga się to poprzez przygotowanie najpierw liga meric, roztworu beta 1 42. Drugim krokiem jest określenie współrzędnych iniekcji.Następnie chirurgicznie odsłoń czaszkę zwierzęcia i wprowadź w niej dwa otwory do wprowadzenia igły. Ostatnim krokiem jest przesunięcie igły strzykawki do jej ostatecznej pozycji i podanie w infuzji beta 1 42. Ostatecznie metoda iniekcji Stereotaxic Abeta 1 42 jest stosowana do zbadania toksycznego działania Abeta 1 42 u żywego zwierzęcia.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi transgenicznymi modelami myszy Abeta 42 jest to, że oligomeryczny ALA 42 może być podwyższony w specjalny i czasowy sposób i niezawodnie odtwarzać patologię śmierci komórki, której brakuje w transgenicznych modelach myszy. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie choroby Alzheimera, takie jak sposób rozprzestrzeniania się procesów patologicznych w chorobie Alzheimera. Aby rozpocząć tę procedurę, ogol głowę znieczulonej myszy, aby odsłonić skórę.Następnie umieść mysz na poduszce grzewczej w stereotaktycznej ramce. Następnie z

stereotaxic-infusion-oligomeric-amyloid-beta-into-mouse

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Stereotaktyczna infuzja oligomerów amyloidu-beta do hipokampu mysiego

Jedną z cech choroby Alzheimera jest podwyższony poziom peptydu Aβ1-42. W niniejszym materiale przedstawiamy protokół przygotowania syntetycznych oligomerów Aβ1-42, które upośledzają długotrwałe wzmocnienie synaptyczne w hipokampie, będące komórkowym korelatem pamięci. Procedura ta jest przydatna do badania mechanizmów patologii indukowanej przez Aβ oraz do przesiewowego badania leków.

Przygotowanie oligomerów β-amyloidu1-42 i indukcja upośledzenia plastyczności synaptycznej w skrawkach hipokampa

Ten film demonstruje technikę ciągłego wlewu przeciwciał specyficznych dla peptydu beta-amyloidu (Aβ) do hipokampa szczura. W badaniu zastosowano implantację obustronnego systemu kaniuli w celu kontrolowanego wlewu przeciwciał specyficznych dla peptydu Aβ w połączeniu z infuzją rozpuszczalnych oligomerów Aβ (Aβo) do hipokampa szczura w celu zbadania interakcji między oligomerami a przeciwciałami.

Kontrolowany wlew przeciwciał swoistych dla peptydu Aβ i oligomerów Aβ do hipokampa szczura

Ten film demonstruje precyzyjną stereotaktyczną infuzję beta amyloidu do zakrętu zębatego w celu stworzenia mysiego modelu choroby Alzheimera. Dokładne określenie współrzędnych i kontrolowane dostarczanie białek beta amyloidu powoduje degradację neuronów, zakłócając przetwarzanie pamięci i przyczyniając się do rozwoju choroby Alzheimera.

Bezpośrednia stereotaktyczna infuzja białek beta amyloidu w mózgu dla modelu choroby Alzheimera

Źródło: Arango-Lievano, M. et. al., Podłużne obrazowanie in vivo naczyń mózgowych: znaczenie dla chorób OUN. J. Vis. Exp. (2016)Ten film demonstruje obrazowanie dwufotonowe in vivo w celu wizualizacji znakowanych fluorescencyjnie blaszek amyloidowych i naczyń mózgowych. Niebieska fluorescencja oznacza blaszki miażdżycowe, podczas gdy zielona fluorescencja podkreśla naczynia krwionośne mózgu. Mapa 3D obszaru zainteresowania i obrazowanie mozaikowe o wysokiej rozdzielczości ujawniają szczegółowe...

Obrazowanie in vivo naczyń mózgowych i blaszek amyloidowych w mysim modelu choroby Alzheimera

Źródło: Slezia, A. i wsp. Elektroforetyczne dostarczanie kwasu γ-aminomasłowego (GABA) do ogniska padaczkowego zapobiega napadom padaczkowym u myszy. J. Vis. Exp. (2019 rok)Ten film pokazuje elektroforetyczne dostarczanie kwasu gamma-aminomasłowego (GABA) w celu zahamowania aktywności napadowej u znieczulonej myszy. Przedstawiono w nim etapy związane z implantacją sondy, rejestracją aktywności neuronalnej, indukcją napadów i kontrolowanym dostarczaniem GABA za pomocą mikroprzepływowej pompy...

Elektroforetyczne dostarczanie GABA do ogniska padaczkowego znieczulonej myszy

MikroRNA odgrywają znaczącą rolę w strukturze i funkcjonowaniu mózgu. Tutaj opisujemy metodę wymuszania nadmiernej ekspresji miRNA w hipokampie za pomocą stereotaktycznego wstrzykiwania zmodyfikowanego lentiwirusa wykazującego ekspresję miRNA. Podejście to może służyć jako stosunkowo szybki sposób oceny skutków in vivo nadmiernej ekspresji miRNA w określonych regionach mózgu.

Stereotaktyczne wstrzyknięcie lentiwirusów eksprymujących mikroRNA do regionu CA1 hipokampa myszy i ocena wyniku behawioralnego

Model zwierzęcy z wstrzyknięciem β amyloidu (Aβ) umożliwia podawanie określonej ilości i gatunku fragmentów Aβ oraz redukuje indywidualne różnice w każdej badanej grupie. Protokół ten opisuje wstrzyknięcie Aβ do komory mózgowej (ICV) bez instrumentów stereotaktycznych, umożliwiając wytwarzanie nieprawidłowości behawioralnych podobnych do choroby Alzheimera u normalnych myszy.

Wstrzyknięcie domózgowo-komorowe peptydów β amyloidu u normalnych myszy w celu ostrego wywołania deficytów poznawczych podobnych do choroby Alzheimera

Ten artykuł ilustruje, jak można określić ilościowo ekspresję receptorów neuroprzekaźników i przeanalizować wzór w synapsach z zidentyfikowanymi elementami pre i postsynaptycznymi, wykorzystując kombinację transdukcji wirusa za pomocą narzędzi optogenetycznych i techniki immunoznakowania repliki zamrażania i złamania.

Połączone znakowanie immunologiczne repliki optogenetycznej i zamrażalniczo-łamliwej w celu zbadania specyficznego dla danych wejściowych rozmieszczenia receptorów glutaminianu w ciele migdałowatym myszy

Aby zbadać efekty Aβo in vivo, opracowaliśmy model oparty na powtarzających się wlewach rozpuszczalnego Aβo z hipokampa w połączeniu z ciągłym wlewem przeciwciała Aβo (6E10) w hipokampie za pomocą pomp osmotycznych, aby przeciwdziałać neurotoksycznemu działaniu Aβo.

Neurodegeneracja w zwierzęcym modelu przewlekłego wlewu oligomerów beta-amyloidu jest przeciwdziałana przez leczenie przeciwciałami podawanymi pompami osmotycznymi

Opisano celowaną ablację konkretnych obszarów mózgu poprzez infuzję egzocytotoksyny z wykorzystaniem współrzędnych stereotaksycznych. Technikę tę można również zaadaptować do infuzji innych substancji chemicznych do mózgu szczura.

Chirurgia stereotaktyczna w celu wywołania uszkodzeń ekscytotoksycznych w określonych obszarach mózgu dorosłego szczura

Poznaj metodę stereotaktycznego wlewu oligomerycznego beta-amyloidu 1-42 do zakrętu zębatego hipokampa myszy. Technika ta umożliwia badanie toksycznych skutków amyloidu na neurony w modelu in vivo.

Stereotaktyczny wlew oligomerycznego beta-amyloidu do hipokampa myszy

Przeglądaj więcej filmów