Enkapsulacja termogenicznych preadipocytów do przeszczepu do magazynów tkanki tłuszczowej

Ogólnym celem tej procedury jest zaprezentowanie enkapsulacji termogennej linii komórkowej katabolicznej oraz jej zastosowań in vitro i potencjalnie in vivo. Aby rozpocząć tę procedurę, należy przygotować zawiesinę komórkową w alginianie sodu i przenieść ją do strzykawki o pojemności 5 ml. Następnym krokiem jest użycie urządzenia do enkapsulacji w celu wytworzenia alginianowych mikrokulek.

Następnie mikrokulki są powlekane roztworem polikationowej poli-L-lizyny, a rdzeń alginianowy jest usuwany w celu utworzenia półprzepuszczalnej membrany wokół zawiesiny komórek. Ostatnim etapem jest współhodowla inkapsulowanych komórek z innymi liniami komórkowymi lub ich wstrzyknięcie do tkanki tłuszczowej myszy. Ostatecznie analiza krwi w kierunku markerów immunologicznych wykazuje wyższą aktywność lipolityczną w adipocytach współhodowanych z mikrokapsułkami zawierającymi adipocyty z niedoborem dehydrogenazy aldehydowej.

Podczas gdy immunohistochemia wykazuje pomyślny przeszczep w formie enkapsulowanych komórek do tkanki tłuszczowej myszy, metoda ta może dostarczyć informacji na temat termogenezy i tkanki tłuszczowej. Może ona zostać zastosowana również w innych istniejących modelach zwierzęcych, aby zapewnić niskokosztowy system modelowy do testowania subpopulacji komórek in vivo. W celu dokonania odkryć biomedycznych wszystkie procedury powinny być wykonywane w komorze z laminarnym przepływem powietrza o drugim poziomie bezpieczeństwa biologicznego.

W celu rozpoczęcia należy usunąć stare pożywkę z kolby z hodowlą komórkową i wypłukać preadipocyty 10 mililitrami PBS. Po usunięciu PBS komórki należy resuspendować w dwóch mililitrach 0,25% trypsyny EDTA. Należy pobrać 10 mikrolitrów zawiesiny komórkowej i policzyć komórki przy użyciu komory countingowej (hemocytometru).

Zgodnie z instrukcjami producenta, należy dodać DMEM do pozostałych komórek, aby uzyskać optymalną ich liczbę, a następnie odwirować przy 480 ×g w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Po ustaleniu potrzebnej liczby komórek zgodnie z wytycznymi w tekście protokołu, zawieszamy osad komórkowy w odpowiedniej objętości 2% roztworu alginianu sodu. Przenosimy roztwór komórek z alginianem sodu do strzykawki o pojemności pięciu mililitrów.

Usuń wszelkie pęcherzyki powietrza z roztworu i odwróć strzykawkę, aby stworzyć kieszeń powietrzną o objętości 1 ml. W celu przygotowania do enkapsulacji, przygotuj mały zlew zawierający 144 ml 100 mM roztworu chlorku wapnia. Pod wylotem igły urządzenia do enkapsulacji przymocuj elektrodę do materiału enkapsulowanego tak, aby końcówka znajdowała się około 2,5 cm nad powierzchnią roztworu chlorku wapnia.

Umieść strzykawkę zawierającą roztwór komórek w alginianie sodu stabilnie w pompie strzykawkowej. Podłącz gumowy przewód do otworu strzykawki. Przesuwaj tłok, aż roztwór komórek w alginianie sodu wypełni połowę przewodu.

Ustaw napięcie na 5,4 kilovoltów oraz średnicę na 12,06 milimetrów w pompie strzykawkowej. Ustaw prędkość na trzy mililitry na godzinę. Uruchom pompę, włącz urządzenie do enkapsulacji i utrzymuj napięcie na poziomie 5,4 kilovoltów.

Zamknij szybę dygestorium i unikaj wszelkich niepotrzebnych wibracji aż do czasu zakończenia procesu formowania alginianowych mikrokulek. Po przepłynięciu całego roztworu przez igłę, utrzymaj kuliste mikrokulki alginianowe w roztworze chlorku wapnia przez dodatkowe 20 minut w celu ich utwardzenia przed powlekaniem polianionową poliłyziną (PLL). Po utwardzeniu kulistych mikrokulek z alginianu sodu, wyjmij z urządzenia do enkapsulacji zlewkę zawierającą mikrokulki.

Przenieść mikrokulki do probówki wirówkowej o pojemności 50 mililitrów. Usunąć roztwór chlorku wapnia z osadu mikrokulek. Przemyć mikrokulki, dodając 30 mililitrów 0.9% roztworu chlorku sodu i delikatnie potrząsając probówką w dłoni.

Pozwól mikrokuleczkom opaść pod wpływem grawitacji. Następnie za pomocą pipety o pojemności 25 mililitrów usuń roztwór chlorku sodu w opisany sposób. Przemyj mikrokuleczki łącznie trzy razy.

Następnie do mikrokulek należy dodać 0,05% roztwór PLL. Należy użyć 10 ml roztworu PLL na każdy 1 ml roztworu alginianu sodu. Próbkę należy mieszać w wstrząsarku wortex o prędkości 1000 obr./min przez 10 minut, co zazwyczaj jest wystarczające do powlekania PLL.

Po potwierdzeniu utworzenia powłoki PLL, usunąć roztwór PLL i trzykrotnie przemyć kapsułki 0,9% roztworem chlorku sodu, zgodnie z wcześniejszą procedurą. Aby w pierwszej kolejności usunąć alternatywny rdzeń z mikrokulek powlekanych PLL, dodać 30 ml 50 mM roztworu cytrynianu sodu do probówki o pojemności 50 ml. Odczekać pięć minut lub do czasu całkowitego rozpuszczenia alginianu sodu. Przemyć kapsułki trzykrotnie 0,9% roztworem chlorku sodu, tak jak opisano poprzednio.

Po trzecim przemyciu, przenosząc 20 mililitrów pożywki hodowlanej do probówki, przenieś wszystkie kapsułki zawierające komórki do kolby hodowlanej i inkubuj zamknięte w kapsułkach komórki w standardowych warunkach hodowli komórkowej. Komórki gospodarza do tej procedury należy hodować w płytkach 24-dołkowych aż do osiągnięcia konfluencji. Należy użyć pożywki do wzrostu fibroblastów przygotowanej zgodnie z opisem w towarzyszącym protokole.

Tekst dotyczący hodowli preadipocytów. Przenieść mikrokapsułki do płytki 24-dołkowej zawierającej konfluentne komórki gospodarza, dodać mikrokapsułki tak, aby uzyskać monowarstwę w każdym dołku, a następnie indukować różnicowanie preadipocytów za pomocą pożywki do różnicowania nr 1 i inkubować przez 48 godzin.

Po 48 godzinach należy zmienić pożywkę na pożywkę różnicującą nr 2. Następnie pożywkę należy zastąpić świeżą pożywką różnicującą nr 2. Co 48 godzin białka z komórek będą analizowane metodą western blot.

Każdy etap produkcji mikrokulek można obserwować pod mikroskopem. Przedstawiono alginianową mikrokulkę przy 20-krotnym powiększeniu. Przed powłoką z PLL, po powleczeniu PLL oraz po rozpuszczeniu rdzenia żelatynowego w badaniu ilościowym porównano ekspresję adipocytowej lipazy triglicerydowej (ATGL) w adipocytach 3T3-L1 w ko-kulturze z bezkomórkowymi mikrokapsułkami zawierającymi adipocyty typu dzikiego lub adipocyty z niedoborem dehydrogenazy aldehydowej 1 (ALDH1).

Wyższa ekspresja A TGL w adipocytach współhodowanych z komórkami niedoborowymi L DH one A one w mikrokapsułkach zawierających adipocyty wskazuje na wyższą aktywność lipolityczną. W badaniu in vivo GFP-znakowane komórki zamknięte w kapsułkach wstrzyknięto do brzusznych złogów tłuszczowych myszy. Po 80 dniach w wstrzykniętej tkance tłuszczowej zaobserwowano odbarwione skupiska zamkniętych w kapsułkach komórek.

Przekrój tkanki z zapasu tłuszczu wewnątrzbrzusznego zatopiony w parafinie i barwiony hematoksyliną i eozyną wykazuje skupiska zaimplantowanych komórek zamkniętych w mikrokapsułkach oraz adipocyty gospodarza. Ten sam przekrój analizowany w świetle fluorescencyjnym ukazuje komórki przeszczepione oznakowane GFP wewnątrz okrągłych, nienaruszonych kapsułek. Ekspresja GFP jest również wskaźnikiem żywotności komórek po ich rozwoju.

Ta technika enkapsulacji utorowała drogę badaczom w dziedzinie chorób metabolicznych do eksploracji potencjalnych metod leczenia otyłości, insulinooporności w cukrzycy typu drugiego, stanów zapalnych oraz nowotworów w organizmach modelowych.