Name: Enkapsulacja termogenicznych preadipocytów do przeszczepu do magazynów tkanki tłuszczowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-02T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Poznaj metodę enkapsulacji termogenicznych preadipocytów w mikrokapsułki alginianowe do zastosowań w badaniach nad otyłością i metabolizmem energetycznym u myszy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Chcielibyśmy podziękować Jennifer Petrosino i Davidowi DiSilvestro za pomoc redakcyjną. Badania te były wspierane przez nagrodę numer 20020728 od American Egg Board i nagrodę numer 10040042 od Novo Nordisk Pharmaceuticals, a także przez Centrum Innowacji Żywnościowych, Biuro Spraw Międzynarodowych, Centrum Zaawansowanych Badań nad Żywnością Funkcjonalną i Przedsiębiorczością na OSU, a także grant National Science Foundation EEC-0914790 (L.J.L). Opisany projekt był wspierany przez Award Number R21OD017244 (O.Z.) i UL1RR025755 (OSUCCC) z National Center for Research Resources, finansowany przez Biuro Dyrektora, National Institutes of Health (OD) i wspierany przez NIH Roadmap for Medical Research i NCI P30CA16058. Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i niekoniecznie reprezentują one oficjalne poglądy National Center for Research Resources lub National Institutes of Health.

Protokół badania został zatwierdzony przez Komisje Etyki Uniwersytetu Stanowego Ohio. Eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez protokół IACUC. Wszystkie zabiegi zostały wykonane w komorze bezpieczeństwa biologicznego poziomu 2 z przepływem laminarnym. Przestrzegaliśmy wszystkich standardowych wymogów i procedur bezpieczeństwa. Technikę mikrokapsułkowania w celu przygotowania mikrokapsułek przeprowadzono zgodnie z opisem 17,18.
1. Przygotowanie materiałów
<ol>
	<li>Przygotować 10 ml 2% roztworu alginianu sodu w autoklawizowanym roztworze soli fizjologicznej (0,9% NaCl w wodzie). Przygotować 0,05% roztwór PLL w soli fizjologicznej. Przygotuj te roztwory dzień wcześniej i mieszaj przez noc. Przed użyciem przefiltrować roztwory filtrem 0,22 μm.</li>
	<li>Przygotować 50 mM cytrynianu sodu i 100 mM CaCl2 w 0,9% roztworach NaCl i sterylizować je w autoklawie.</li>
	<li>Autoklawuj wszystkie roztwory, igły, elektrody i zlewki. Dokładnie wyczyść igły drutami, aby uniknąć zatkania.</li>
	<li>Określ odpowiednią ilość komórek do użycia w kapsułkach (102 mikrokapsułki są potrzebne na każdycm2 studzienki, a na kapsułkę przypada około 500 komórek18). Użyj 1 ml alginianu sodu na dwa miliony komórek.</li>
	<li>Przygotuj "Pożywkę do wzrostu fibroblastów" zawierającą 10% surowicy cielęcej i 100 U/ml penicyliny/streptomycyny w zmodyfikowanym pożywce Dulbecco Eagle's (DMEM) o wysokiej zawartości glukozy (4 500 mg/l glukozy).
	<ol>
		<li>Przygotować "Pożywkę różnicującą I" zawierającą 10% płodowej surowicy bydlęcej, 10 μg/ml insuliny, 1 μM deksametazonu, 0,5 mM 3-izobutylo-1-metyloksantyny i 100 j./ml penicyliny/streptomycyny w DMEM.</li>
		<li>Przygotować "Pożywkę różnicującą II" zawierającą 10% płodowej surowicy bydlęcej, 10 μg/ml insuliny i 100 j./ml penicyliny/streptomycyny w DMEM.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować bufor do lizy zawierający jedną tabletkę inhibitora proteazy na 10 ml buforu do testów radioimmunoprecypitacyjnych (bufor RIPA).</li>
</ol>
2. Przygotowanie mikrogranulek alginianowych (Rysunek 1A)
<ol>
	<li>Usunąć starą pożywkę z kolby do hodowli komórkowych. Przepłukać komórki 10 ml PBS. Doprowadzić komórki do zawiesiny za pomocą 0,25% trypsyny-EDTA (2 ml na jedną zlewającą się kolbę T175).</li>
	<li>Policz komórki w zawiesinie komórek za pomocą hemocytometru. Użyć 10 ml podwielokrotności z zawiesiny komórek i policzyć komórki zgodnie z instrukcjami producenta. Pozostałe komórki odwirować w pożywce wirówkowej o sile 480 x g w temperaturze pokojowej przez 5 minut.</li>
	<li>Zawiesić osad komórkowy w alginianie sodu, jak opisano w kroku 1.4. Przenieść roztwór komórek alginianu sodu do strzykawki o pojemności 5 ml.</li>
	<li>Usunąć pęcherzyki powietrza z roztworu, dodać igłę o rozmiarze 23 i odwrócić strzykawkę, aby utworzyć kieszeń o pojemności 1 ml powietrza.</li>
	<li>Umieścić małą zlewkę (180 ml) zawierającą 144 ml 100 mM roztworu CaCl2 pod dziobkiem igły kapsułkatora. Przymocuj elektrodę do enkapsulatora z końcówką umieszczoną około 2,5 cm nad powierzchnią roztworu 100 mM CaCl2.</li>
	<li>Umieścić szczelnie strzykawkę zawierającą roztwór komórek alginianu sodu w pompie strzykawkowej. Przymocować gumową rurkę do otworu strzykawki. Naciskać tłok, aż roztwór komórek alginianu sodu wejdzie do połowy rurki. Dostosuj napięcie do 5,4 kV. Ustawić średnicę 12,06 mm na pompie strzykawkowej. Dostosuj prędkość do 3 ml/h. Uruchom pompę. Włącz enkapsulator i utrzymuj napięcie na poziomie 5,4 kV.</li>
	<li>Zamknij okienko maski i unikaj niepotrzebnych wibracji aż do końca tworzenia się mikrokulek alginianowych. Po tym, jak cały roztwór przejdzie przez igłę, zestalić mikrokulki alginianowe w kształcie kuli w 100 mM roztworze CaCl2 przez dodatkowe 20 minut przed pokryciem PLL.</li>
</ol>
3. Powlekanie mikrokulek PLL (Rysunek 1B)
<ol>
	<li>Wyjąć zlewkę zawierającą mikrokulki w kształcie kuli z komórek alginianu sodu i przenieść te mikrokulki do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Usunąć roztwór CaCl2 z osadu mikrokulek.</li>
	<li>Umyj mikrokulki w kształcie kuli z komórek alginianowych, dodając 30 ml 0,9% NaCl. Delikatnie potrząśnij tubką ręcznie. Usunąć 0,9% NaCl za pomocą pipety o pojemności 25 ml po tym, jak mikrogranulki wytrącą się grawitacyjnie. Powtórz jeszcze dwa razy, w sumie 3 prania.</li>
	<li>Użyć 10 ml 0,05% roztworu PLL na każdy 1 ml roztworu alginianu sodu. Dodaj 0,05% PLL i wiruj z prędkością 1,000 obrotów na minutę przez 10 min. 
	Uwaga: Zwykle do powlekania PLL wystarcza 10 minut.</li>
	<li>Po utworzeniu powłoki PLL należy usunąć roztwór PLL i umyć kapsułki 3 razy, jak opisano w ppkt 3.2.</li>
</ol>
4. Usunięcie rdzenia alginianowego (Rysunek 1C)
<ol>
	<li>Dodać 30 ml 50 ml roztworu cytrynianu sodu. Odczekaj 5 minut lub do momentu, gdy cały alginian sodu się rozpuści. Umyć kapsułki trzy razy, jak opisano w kroku 3.1.1.</li>
	<li>Usunąć 0,9% NaCl, dodać 20 ml pożywki do probówki o pojemności 50 ml i przenieść wszystkie kapsułki zawierające komórki do kolby do hodowli komórkowych. Z zamkniętymi w kapsułkach komórkami należy obchodzić się w standardowych warunkach hodowli komórkowej18.</li>
</ol>
5. Zastosowania in vitro do badania interakcji ksenoprzeszczepu i komórek gospodarza lub kinetyki napływu/odpływu metabolitów między komórkami (Rysunek 2)
<ol>
	<li>Hoduj komórki gospodarza na 24-dołkowej płytce, aż do zlewania się dla kokultur. Użyj "Pożywki Wzrostu Firobiblastów" do hodowli preadipocytów.</li>
	<li>Przenieś mikrokapsułki do 24-dołkowej płytki zawierającej zbiegające się komórki gospodarza. Dodaj mikrokapsułki, aby uzyskać monowarstwę (102 mikrokapsułki/cm2 dołka).</li>
	<li>Indukuj różnicowanie preadipocytów za pomocą pożywki różnicującej I. Co 48 godzin zmieniaj pożywkę na Differentiation Medium II na sześć dni. Lizuj komórki w buforze RIPA. Użyj 50 μg białka na warunek, aby przeanalizować ekspresję białka za pomocą Western blot.</li>
</ol>
6. Aplikacja in vivo do leczenia otyłości (Rysunek 3)
<ol>
	<li>Zmieszać 4% izofluranu z tlenem w celu indukcji znieczulenia i 2% izofluranu z tlenem w celu podtrzymania znieczulenia. Potwierdź odpowiednią głębokość znieczulenia przez uszczypnięcie palca.
	<ol>
		<li>Nałóż maść przeciwświądową na oczy, aby chronić rogówki przed wysuszeniem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Używaj zamkniętych w kapsułkach komórek, które są trwale znakowane sztucznym białkiem fluorescencyjnym, takim jak białko zielonej fluorescencji (GFP).</li>
	<li>Za pomocą strzykawki o pojemności 3 ml i igły o rozmiarze 20 wstrzyknąć kapsułkowane komórki.
	<ol>
		<li>Wstrzyknąć 0,5 x 106 komórek zawieszonych w 0,2 ml PBS do każdego magazynu tłuszczu iAb, który znajduje się w obszarze wewnątrzotrzewnowym między gonadą a nerką, jak pokazano na rysunku 3. Użyj tej objętości PBS i liczby komórek dla myszy o średniej wadze 40 g. Dostosuj liczbę i objętość komórek u myszy o różnej masie ciała lub w celu określenia efektów zależnych od dawki.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Vogeli, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+chronic+conditions%3A+prevalence%2C+health+consequences%2C+and+implications+for+quality%2C+care+management%2C+and+costs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+general+internal+medicine%22%5BJournal%5D)">Multiple chronic conditions: prevalence, health consequences, and implications for quality, care management, and costs.</a> Journal of general internal medicine. 22, Suppl 3. 391-395 (2007).</li>
<li>Vija, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells%3A+Stem+cell+therapy+perspectives+for+type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+%26+metabolism%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells: Stem cell therapy perspectives for type 1 diabetes.</a> Diabetes & metabolism. 35, 85-93 (2009).</li>
<li>Acarregui, A., Orive, G., Pedraz, J. L., Hernandez, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+applications+of+encapsulated+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Therapeutic applications of encapsulated cells.</a> Methods in molecular biology. 1051, 349-364 (2013).</li>
<li>Chang, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Semipermeable+Microcapsules%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Semipermeable Microcapsules.</a> Science. 146, 524-525 (1964).</li>
<li>Elliott, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+encapsulated+porcine+islets+from+a+type+1+diabetic+patient+9.5+yr+after+xenotransplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Xenotransplantation%22%5BJournal%5D)">Live encapsulated porcine islets from a type 1 diabetic patient 9.5 yr after xenotransplantation.</a> Xenotransplantation. 14, 157-161 (2007).</li>
<li>Lim, F., Sun, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microencapsulated+islets+as+bioartificial+endocrine+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Microencapsulated islets as bioartificial endocrine pancreas.</a> Science. 210, 908-910 (1980).</li>
<li>Vos, P., Spasojevic, M., Faas, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+diabetes+with+encapsulated+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+experimental+medicine+and+biology%22%5BJournal%5D)">Treatment of diabetes with encapsulated islets.</a> Advances in experimental medicine and biology. 670, 38-53 (2010).</li>
<li>Cotton, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+challenges+in+cell-encapsulation+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+biotechnology%22%5BJournal%5D)">Engineering challenges in cell-encapsulation technology.</a> Trends in biotechnology. 14, 158-162 (1996).</li>
<li>Yach, D., Stuckler, D., Brownell, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiologic+and+economic+consequences+of+the+global+epidemics+of+obesity+and+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+medicine%22%5BJournal%5D)">Epidemiologic and economic consequences of the global epidemics of obesity and diabetes.</a> Nature medicine. 12, 62-66 (2006).</li>
<li>Ng, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global%2C+regional%2C+and+national+prevalence+of+overweight+and+obesity+in+children+and+adults+during+1980-2013%3A+a+systematic+analysis+for+the+Global+Burden+of+Disease+Study+2013%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Global, regional, and national prevalence of overweight and obesity in children and adults during 1980-2013: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2013.</a> Lancet. 384, 766-781 (2014).</li>
<li>Kissebah, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relation+of+body+fat+distribution+to+metabolic+complications+of+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+clinical+endocrinology+and+metabolism%22%5BJournal%5D)">Relation of body fat distribution to metabolic complications of obesity.</a> The Journal of clinical endocrinology and metabolism. 54, 254-260 (1982).</li>
<li>Bray, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relation+of+central+adiposity+and+body+mass+index+to+the+development+of+diabetes+in+the+Diabetes+Prevention+Program%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+journal+of+clinical+nutrition%22%5BJournal%5D)">Relation of central adiposity and body mass index to the development of diabetes in the Diabetes Prevention Program.</a> The American journal of clinical nutrition. 87, 1212-1218 (2008).</li>
<li>Klein, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+are+subcutaneous+adipocytes+really+good+for%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+dermatology%22%5BJournal%5D)">What are subcutaneous adipocytes really good for.</a> Experimental dermatology. 16, 45-70 (2007).</li>
<li>Tran, T. T., Yamamoto, Y., Gesta, S., Kahn, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beneficial+effects+of+subcutaneous+fat+transplantation+on+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+metabolism%22%5BJournal%5D)">Beneficial effects of subcutaneous fat transplantation on metabolism.</a> Cell metabolism. 7, 410-420 (2008).</li>
<li>Seale, P., Kajimura, S., Spiegelman, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+control+of+brown+adipocyte+development+and+physiological+function--of+mice+and+men%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+development%22%5BJournal%5D)">Transcriptional control of brown adipocyte development and physiological function--of mice and men.</a> Genes & development. 23, 788-797 (2009).</li>
<li>Kozak, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+variation+in+brown+fat+activity+and+body+weight+regulation+in+mice%3A+lessons+for+human+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+biophysica+acta%22%5BJournal%5D)">Genetic variation in brown fat activity and body weight regulation in mice: lessons for human studies.</a> Biochimica et biophysica acta. 1842, 370-376 (2014).</li>
<li>Zhang, X., He, H., Yen, C., Ho, W., Lee, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+biodegradable%2C+immunoprotective%2C+dual+nanoporous+capsule+for+cell-based+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">A biodegradable, immunoprotective, dual nanoporous capsule for cell-based therapies.</a> Biomaterials. 29, 4253-4259 (2008).</li>
<li>Yang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+prolonged+survival+of+fibroblasts+with+forced+lipid+catabolism+in+visceral+fat+following+encapsulation+in+alginate-poly-L-lysine%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The prolonged survival of fibroblasts with forced lipid catabolism in visceral fat following encapsulation in alginate-poly-L-lysine.</a> Biomaterials. 33, 5638-5649 (2012).</li>
<li>Chang, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+cells+with+emphasis+on+bioencapsulation+in+biotechnology%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+annual+review%22%5BJournal%5D)">Artificial cells with emphasis on bioencapsulation in biotechnology.</a> Biotechnology annual review. 1, 267-295 (1995).</li>
<li>Chang, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybrid+artificial+cells%3A+microencapsulation+of+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22ASAIO+journal%22%5BJournal%5D)">Hybrid artificial cells: microencapsulation of living cells.</a> ASAIO journal. 38, 128-130 (1992).</li>
<li>Koo, J., Chang, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secretion+of+erythropoietin+from+microencapsulated+rat+kidney+cells%3A+preliminary+results%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+journal+of+artificial+organs%22%5BJournal%5D)">Secretion of erythropoietin from microencapsulated rat kidney cells: preliminary results.</a> The International journal of artificial organs. 16, 557-560 (1993).</li>
<li>Weidenauer, U., Bodmer, D., Kissel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microencapsulation+of+hydrophilic+drug+substances+using+biodegradable+polyesters.+Part+I%3A+evaluation+of+different+techniques+for+the+encapsulation+of+pamidronate+di-sodium+salt%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+microencapsulation%22%5BJournal%5D)">Microencapsulation of hydrophilic drug substances using biodegradable polyesters. Part I: evaluation of different techniques for the encapsulation of pamidronate di-sodium salt.</a> Journal of microencapsulation. 20, 509-524 (2003).</li>
<li>Smidsrod, O., Skjak-Braek, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alginate+as+immobilization+matrix+for+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+biotechnology%22%5BJournal%5D)">Alginate as immobilization matrix for cells.</a> Trends in biotechnology. 8, 71-78 (1990).</li>
<li>Lewinska, D., Rosinski, S., Werynski, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+process+conditions+during+impulsed+electrostatic+droplet+formation+on+size+distribution+of+hydrogel+beads%5BTitle%5D)+AND+%22Artificial+cells%2C+blood+substitutes%2C+and+immobilization+biotechnology%22%5BJournal%5D)">Influence of process conditions during impulsed electrostatic droplet formation on size distribution of hydrogel beads.</a> Artificial cells, blood substitutes, and immobilization biotechnology. 32, 41-53 (2004).</li>
<li>Chan, E. S., Lee, B. B., Ravindra, P., Poncelet, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prediction+models+for+shape+and+size+of+ca-alginate+macrobeads+produced+through+extrusion-dripping+method%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+colloid+and+interface+science%22%5BJournal%5D)">Prediction models for shape and size of ca-alginate macrobeads produced through extrusion-dripping method.</a> Journal of colloid and interface science. 338, 62-72 (2009).</li>
<li>Bhujbal, S. V., Paredes-Juarez, G. A., Niclou, S. P., de Vos, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+influencing+the+mechanical+stability+of+alginate+beads+applicable+for+immunoisolation+of+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+behavior+of+biomedical+materials%22%5BJournal%5D)">Factors influencing the mechanical stability of alginate beads applicable for immunoisolation of mammalian cells.</a> Journal of the behavior of biomedical materials. 37, 196-208 (2014).</li>
<li>Gushchina, L. V., Yasmeen, R., Ziouzenkova, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moderate+vitamin+A+supplementation+in+obese+mice+regulates+tissue+factor+and+cytokine+production+in+a+sex-specific+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+biochemistry+and+biophysics%22%5BJournal%5D)">Moderate vitamin A supplementation in obese mice regulates tissue factor and cytokine production in a sex-specific manner.</a> Archives of biochemistry and biophysics. 539, 239-247 (2013).</li>
<li>Ziouzenkova, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinaldehyde+represses+adipogenesis+and+diet-induced+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Retinaldehyde represses adipogenesis and diet-induced obesity.</a> Nature. 13, 695-702 (2007).</li>
<li>Yasmeen, R., Jeyakumar, S. M., Reichert, B., Yang, F., Ziouzenkova, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+contribution+of+vitamin+A+to+autocrine+regulation+of+fat+depots%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+biophysica+acta%22%5BJournal%5D)">The contribution of vitamin A to autocrine regulation of fat depots.</a> Biochimica et biophysica acta. 1821, 190-197 (2012).</li>
<li>Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-133a+regulates+adipocyte+browning+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+genetics%22%5BJournal%5D)">miR-133a regulates adipocyte browning in vivo.</a> PLoS genetics. 9, e1003626(2013).</li>
<li>Rao, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meteorin-like+is+a+hormone+that+regulates+immune-adipose+interactions+to+increase+beige+fat+thermogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Meteorin-like is a hormone that regulates immune-adipose interactions to increase beige fat thermogenesis.</a> Cell. 157, 1279-1291 (2014).</li>
<li>Kir, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour-derived+PTH-related+protein+triggers+adipose+tissue+browning+and+cancer+cachexia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tumour-derived PTH-related protein triggers adipose tissue browning and cancer cachexia.</a> Nature. 513, 100-104 (2014).</li>
</ol>

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Do kapsułkowania komórek stosowano różne metody, w tym suszenie, wytłaczanie i emulsję19. W tej metodzie kulki alginianowe są wytłaczane przez igłę, a następnie powlekane PLL, a rdzeń alginianowy zostanie rozpuszczony, aby zakończyć enkapsulację. Chociaż metoda ta jest stosowana od lat, formowanie koralików o pożądanym rozmiarze i kulistym kształcie nadal stanowi wyzwanie. Wielkość kapsułek w dużym stopniu zależy od lepkości roztworu alginianu sodu, średnicy ekstrudera i odległości między końcówką igły a roztw...

Rosnąca częstość występowania chorób przewlekłych1 pobudziła badania nad przeszczepianiem terapeutycznych populacji komórek2. Syngeniczne lub allogeniczne komórki macierzyste są najczęściej stosowanymi typami komórek do tych zastosowań2. Zabiegi te nie pozwalają jednak na kontrolę różnicowania i migracji komórek macierzystych po implantacji i nie są opłacalne. Przeszczepienie genetycznie zmodyfikowanych komórek o korzystnych funkcjach przewiduje poprawę leczenia wielu chorób. Jednak genetyczne modyfikacje komórek są rozpoznawane przez układ odpornościowy gospodarza, dlatego leczenie to wymaga immunosupresji3. Enkapsulacja komórek produkujących insulinę została opracowana przez dr Chang4. Technika opiera się na enkapsulacji komórek w kropelkach alginianu, które są zanurzone w roztworze chlorku wapnia. Cząsteczki alginianu składają się z kwasu mannuronowego (M) i guluronowego (G) i mogą być połączone przez Ca2+. Po żelowaniu kulki są zawieszane w roztworze poli-L-lizyny (PLL). Na tym etapie PLL wiąże się z G i M w cząsteczkach alginianu, które tworzą błonę kapsułki. Porowatość błony kapsułki można modulować poprzez zmianę stężeń M i PLL, czasu inkubacji i temperatury. Wiązanie PLL zależy również od rodzaju i stężenia alginianu. Matryce alginianowe usieciowane jonami Ca2+ są niestabilne w środowisku fizjologicznym lub w zwykłych roztworach buforowych o wysokim stężeniu jonów fosforanowych i cytrynianowych. Bufor te może ekstrahować Ca2+ z alginianu i upłynniać rdzeń. Upłynnienie rdzenia alginianowego zapewnia przestrzeń wewnątrz kapsułek dla ruchu i wzrostu komórek. Komórki otoczone alginianem polianionowym z polikationową poli-L-lizyną (APL) są nieprzepuszczalne dla immunoglobulin, ale mają napływ składników odżywczych i wypływ toksyn. Te właściwości APL umożliwiają długoterminowe przeżycie otorbionych komórek po przeszczepie do genetycznie różnych gospodarzy. Elliott i wsp. opisali przeżycie funkcjonujących zamkniętych w kapsułkach komórek trzustki świni u ludzkiego pacjenta dziewięć lat po implantacji5.
Techniki enkapsulacji można podzielić na mikrokapsułkowanie (3-800 μm) i makroenkapsulację (większe niż 1000 μm). Mikrokapsułki są trwalsze niż makrokapsułki6. Od czasu odkrycia przez dr Changa i współpracowników w 1964 roku, mikrokapsułkowanie jest szeroko stosowane do enkapsulacji komórek anabolicznych wytwarzających insulinę, inne hormony i cząsteczki bioaktywne7. Terapie te napotkały kilka wyzwań w tkance gospodarza, w tym zwłóknienie i odpowiedź immunologiczną8. Początkowo skutki uboczne związane z jakością biopolimerów zostały rozwiązane. Jednak przeszczep komórek anabolicznych nadal inicjuje skutki uboczne, takie jak zwłóknienie, w wyniku nadprodukcji hormonów poza wyspecjalizowanym gruczołem.
W ostatnich dziesięcioleciach otyłość i cukrzyca typu 2 osiągnęły rozmiary epidemii9. Ponad 30% dorosłych ludzi na całym świecie ma nadwagę i otyłość10. Zwiększone tworzenie tłuszczu w jamie brzusznej (iAb) zwiększa częstość występowania przewlekłego stanu zapalnego i sprzyja cukrzycy typu 2, chorobom sercowo-naczyniowym, niektórym nowotworom i innym chorobom11-13. Kilka linii dowodów sugerowało, że patogeneza związana z tłuszczem iAb może być zapobieżona przez określone adipocyty. Ostatnie badania wykazały, że przeszczepienie podskórnych adipocytów do regionu iAb może poprawić metabolizm oraz zmniejszyć otyłość i insulinooporność u gryzoni in vivo14. Skuteczna redukcja otyłości i insulinooporności wiąże się z termogenicznymi adipocytami zdolnymi do rozpraszania energii w postaci ciepła15,16. Termogeniczną modyfikację adipocytów można osiągnąć poprzez stabilną transfekcję genów uczestniczących w mitochondrialnym rozprzęganiu protonów, takich jak rozprzęganie białka 1 (Ucp1) lub genów regulujących ekspresję Ucp1 i innych genów termogenicznych15,16. Nasze ostatnie badania wykazały, że niedobór dehydrogenazy aldehydowej 1 a1 (Aldh1a1) prowadzi do termogenicznej przebudowy tłuszczu iAb, która zmniejsza otyłość i insulinooporność u tych myszy17,18. Warto zauważyć, że enkapsulacja termogenicznych preadipocytów z niedoborem Aldh1a1 (Aldh1a1-/-) pośredniczy w tym samym efekcie terapeutycznym w tłuszczu iAb u otyłych myszy typu dzikiego, co sugeruje nowe możliwości terapeutyczne w leczeniu tłuszczu iAb18. W warunkach eksperymentalnych komórki otorbione umożliwiają naukowcom badanie wpływu określonych populacji komórek w opłacalny sposób19. W tym artykule omówiono metodę enkapsulacji termogenicznej linii komórek katabolicznych oraz jej laboratoryjne i terapeutyczne zastosowanie w mysim modelu otyłości. Protokół opisuje trzy fazy produkcji mikrokapsułek (ryc. 1): tworzenie mikrokulek alginianowych (ryc. 1A), tworzenie polikationowych błon poli-L-lizyny (PLL) na powierzchni mikrogranulek (ryc. 1B) oraz usuwanie rdzeni alginianowych (ryc. 1C).

<table><tbody><tr><td>Urządzenie do enkapsulacji (VAR V1)</td><td>Nisco</td><td>LIN-0042</td><td>Brak</td></tr><tr><td>KD naukowa pompa strzykawkowa</td><td>KD scientific</td><td>780100Y</td><td>Brak</td></tr><tr><td>Mikroskop Olympus&nbsp;</td><td>Olympus Optical</td><td>IX70-S8F2</td><td>Brak</td></tr><tr><td>Alginian sodu</td><td>Sigma</td><td>MKBP8122V</td><td>Brak</td></tr><tr><td>Bromowodorek poli-L-lizyny (PLL)</td><td>Sigma</td><td>020M5006V</td><td>Brak</td></tr><tr><td>Chlorek wapnia</td><td>Sigma</td><td>SLBJ2662V</td><td>Brak</td></tr><tr><td>Cytrynian sodu trójzasadowy dwuwodny</td><td>Sigma</td><td>030M0200</td><td>Brak</td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Sigma</td><td>SLBD2595V</td><td>Brak</td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN TGX Gels</td><td>Bio-Rad</td><td>456-1093</td><td>Brak</td></tr><tr><td>Przeciwciało pierwszorzędowe ATGL (od królika)</td><td>Sygnalizacja komórkowa</td><td>2138S</td><td>Brak</td></tr><tr><td>Przeciwciało wtórne (anty królik)</td><td>LI-COR</td><td>926-68071</td><td>Brak</td></tr><tr><td>Bufor do testu radioimmunoprecypitacyjnego (RIPA) Boston</td><td>BioProducts</td><td>D25Y6Z</td><td>Brak</td></tr><tr><td>Bufor fosforanowy sól fizjologiczna (PBS)</td><td>Sigma</td><td>RNBD2893</td><td>None</td></tr><tr><td>Trypsyna</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td>Brak</td></tr><tr><td>Cortizone 10 maść przeciwświądowa</td><td>Cortizone 10</td><td>C4029138</td><td>Brak</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>11965-092</td><td>Brak</td></tr><tr><td>Surowica dla noworodków (CS)</td><td>Sigma</td><td>N4762</td><td>Brak</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Sigma</td><td>F4135</td><td>Brak</td></tr><tr><td>3-Izobutylo-1-metyloksantyna (IBMX)</td><td>Sigma</td><td>I0516</td><td>Brak</td></tr><tr><td>Deksametazon</td><td>Sigma</td><td>D4902</td><td>Brak</td></tr><tr><td>Insulina (bydlęca)</td><td>Sigma</td><td>I5879</td><td>Brak</td></tr><tr><td>Inhibitor proteazy tabletki koktajlowe</td><td>Roche</td><td>4693159001</td><td>Brak</td></tr></tbody></table>

enkapsulacja termogenicznych preadipocytów do przeszczepu do magazynów tkanki tłuszczowej

Encapsulation Thermogenic Preadipocytes for Transplantation into Adipose Tissue Depots

Enkapsulacja komórek została opracowana w celu uwięzienia żywotnych komórek w półprzepuszczalnych błonach. Wszczepione kapsułkowane komórki mogą wymieniać metabolity o niskiej masie cząsteczkowej w tkankach leczonego gospodarza, aby osiągnąć długoterminowe przeżycie. Półprzepuszczalna błona umożliwia wszczepione komórki otorbione, aby uniknąć odrzucenia przez układ odpornościowy. Procedura enkapsulacji została zaprojektowana tak, aby umożliwić kontrolowane uwalnianie związków bioaktywnych, takich jak insulina, inne hormony i cytokiny. W tym miejscu opisujemy metodę enkapsulacji komórek katabolicznych, które zużywają lipidy do produkcji ciepła i rozpraszania energii (termogenezy) w tkance tłuszczowej w jamie brzusznej otyłych myszy. Enkapsulacja termogenicznych komórek katabolicznych może mieć potencjalne zastosowanie w profilaktyce i leczeniu otyłości i cukrzycy typu 2. Innym potencjalnym zastosowaniem komórek katabolicznych może być detoksykacja z alkoholi lub innych toksycznych metabolitów i zanieczyszczeń środowiska.

Rycina 1 pokazuje, że każdy etap produkcji mikrokulek może być kontrolowany pod mikroskopem. Rycina 2A przedstawia sposób kokultywacji adypocytów z monowarstwą enkapsulowanych komórek. Rycina 2B to reprezentatywny przykład badania ilościowego z wykorzystaniem kokultur adypocytów i mikrokapsułek opisanych w sekcji 5. Lizaty adypocytów przeanalizowano metodą Western blot. W tym doświadczeniu nie analizowano komórek enkapsulowanych. Pierwotne przeciwciała przeciwko ATGL i β...

Tutaj prezentujemy protokół enkapsulacji komórek katabolicznych, które zużywają lipidy do produkcji ciepła w tkance tłuszczowej w jamie brzusznej i zwiększają rozpraszanie energii u otyłych myszy.

Enkapsulacja termogenicznych preadipocytów do przeszczepu do magazynów tkanki tłuszczowej

Cell encapsulation was developed to entrap viable cells within semi-permeable membranes. The engrafted encapsulated cells can exchange low molecular ...

Ogólnym celem tej procedury jest zaprezentowanie enkapsulacji termogennej linii komórkowej katabolicznej oraz jej zastosowań in vitro i potencjalnie in vivo. Aby rozpocząć tę procedurę, należy przygotować zawiesinę komórkową w alginianie sodu i przenieść ją do strzykawki o pojemności 5 ml. Następnym krokiem jest użycie urządzenia do enkapsulacji w celu wytworzenia alginianowych mikrokulek.Następnie mikrokulki są powlekane roztworem polikationowej poli-L-lizyny, a rdzeń alginianowy jest usuwany w celu utworzenia półprzepuszczalnej membrany wokół zawiesiny komórek. Ostatnim etapem jest współhodowla inkapsulowanych komórek z innymi liniami komórkowymi lub ich wstrzyknięcie do tkanki tłuszczowej myszy. Ostatecznie analiza krwi w kierunku markerów immunologicznych wykazuje wyższą aktywność lipolityczną w adipocytach współhodowanych z mikrokapsułkami zawierającymi adipocyty z niedoborem dehydrogenazy aldehydowej.Podczas gdy immunohistochemia wykazuje pomyślny przeszczep w formie enkapsulowanych komórek do tkanki tłuszczowej myszy, metoda ta może dostarczyć informacji na temat termogenezy i tkanki tłuszczowej. Może ona zostać zastosowana również w innych istniejących modelach zwierzęcych,

encapsulation-thermogenic-preadipocytes-for-transplantation-into

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Inkapselacja termogenicznych preadipocytów do przeszczepienia do złóż tkanki tłuszczowej

Pierwotne białe preadipocyty wyizolowane z białych tkanek tłuszczowych u myszy mogą być różnicowane na komórki beżowe/brite. Przedstawiono niezawodny system modelu komórkowego do badania molekularnej regulacji "brązowienia" białego tłuszczu.

Izolacja i różnicowanie komórek naczyniowych zrębu do komórek beżowych/brite

Odróżnienie białych i beżowych adipocytów od komórek progenitorowych naczyń tkanki tłuszczowej niesie ze sobą potencjał do metabolicznej poprawy otyłości. Opisujemy protokoły izolacji komórek śródbłonka CD34 + CD31 + z ludzkiego tłuszczu oraz późniejszej ekspansji i różnicowania in vitro do białych i beżowych adipocytów. Omówiono kilka dalszych zastosowań.

Izolacja, ekspansja i indukcja adipogenna komórek śródbłonka CD34+CD31+ z ludzkiej tkanki tłuszczowej i podskórnej

Tutaj prezentujemy mikrofragmentację ludzkiej tkanki tłuszczowej bez enzymów przy użyciu urządzenia systemu zamkniętego. Ta nowa metoda pozwala na uzyskanie submilimetrowych skupisk tkanki tłuszczowej nadających się do przeszczepu in vivo, hodowli in vitro oraz dalszej izolacji i charakterystyki komórek.

Mikrofragmentacja ludzkiej tkanki tłuszczowej do fenotypowania komórek i charakterystyki sekretomu

Prezentujemy prostą metodę izolowania wysoce żywotnych komórek progenitorowych tkanki tłuszczowej z najądrzy myszy za pomocą sortowania komórek aktywowanego fluorescencją.

Preparat komórek progenitorowych tkanki tłuszczowej tkanki tłuszczowej najądrza myszy

Ten raport opisuje protokół jednoczesnej izolacji pierwotnych brązowych i białych preadipocytów od nowonarodzonych myszy. Wyizolowane komórki można hodować w hodowli i indukować do różnicowania się w pełni dojrzałe białe i brązowe adipocyty. Metoda umożliwia genetyczną, molekularną i funkcjonalną charakterystykę pierwotnych komórek tłuszczowych w hodowli.

Izolacja i różnicowanie pierwotnych białych i brązowych preadipocytów od nowonarodzonych myszy

Ta metoda przeszczepiania wysp trzustkowych pokrytych tłuszczem jest odpowiednia do wykrywania wszczepionych wysp trzustkowych w jamie wewnątrzotrzewnowej. Co ważne, nie wymaga stosowania środków wiążących biologicznie ani szycia.

Przeszczep wysp trzustkowych pokrytych tłuszczem z wykorzystaniem białej tkanki tłuszczowej najądrza

Preadipocyty są izolowane z frakcji naczyniowej zrębu międzyłopatkowej brązowej tkanki tłuszczowej od nowonarodzonych myszy i różnicowane w komórki, które gromadzą kropelki lipidów, wyrażają markery molekularne i pokazują morfologię mitochondriów dojrzałych brązowych adipocytów. Komórki te są dalej analizowane za pomocą immunofluorescencji i transmisyjnej mikroskopii elektronowej.

Różnicowanie i obrazowanie brązowych adipocytów z frakcji zrębowej naczyniowej tkanki tłuszczowej śródłopatkowej od nowonarodzonych myszy

Ten protokół opisuje półautomatyczną izolację frakcji zrębu naczyniowego (SVF) z mysiej tkanki tłuszczowej w celu uzyskania preadipocytów i osiągnięcia różnicowania adipocytów in vitro. Użycie dysocjatora tkankowego do trawienia kolagenazy zmniejsza zmienność eksperymentalną i zwiększa odtwarzalność.

Półautomatyczna izolacja zrębu frakcji naczyniowej z mysiej białej tkanki tłuszczowej za pomocą dysocjatora tkankowego

Tutaj opisujemy protokół izolacji, hodowli i fenotypowania mikronaczyniowych komórek śródbłonka z ludzkiej podskórnej tkanki tłuszczowej (hSATMVECs). Dodatkowo opisujemy eksperymentalny model wzajemnego przenikania się hSATMVEC-adipocytów.

Badanie wzajemnych oddziaływań komórek śródbłonka tkanki tłuszczowej i adipocytów w ludzkiej podskórnej tkance tłuszczowej

Rozmiar i kruchość dojrzałych adipocytów ograniczyły dostępne techniki i narzędzia do ich badania i izolacji. W tym miejscu opisano protokół izolacji dojrzałych mysich adipocytów, który można łatwo dostosować do różnych magazynów tłuszczowych i diety myszy.

Izolacja i hodowla pierwotnych mysich adipocytów od myszy chudych i otyłych

Poznaj metodę enkapsulacji termogenicznych preadipocytów w mikrokapsułki alginianowe do zastosowań w badaniach nad otyłością i metabolizmem energetycznym u myszy.

Enkapsulacja termogenicznych preadipocytów do przeszczepu do magazynów tkanki tłuszczowej

Przeglądaj więcej filmów