Name: Zautomatyzowane wzbogacanie komórek limfocytów T specyficznych dla wirusa cytomegalii do zastosowań klinicznych przy użyciu systemu wychwytywania cytokin (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-05T15:15:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: Poznaj zautomatyzowaną metodę wzbogacania limfocytów T specyficznych dla CMV przy użyciu systemu wychwytywania cytokin. Technika umożliwia produkcję komórek klasy klinicznej bez potrzeby stosowania obiektów GMP.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Miltenyi Biotec, Niemcy za dostarczenie odczynników i sprzętu CliniMACS Prodigy do badań ewaluacyjnych. Dziękujemy George'owi T. McNamarze (Oddział Pediatryczny, MD Anderson Cancer Center) za korektę manuskryptu. Wsparcie grantowe: Cancer Center Core Grant (CA16672); RO1 (CA124782, CA120956, CA141303; CA141303); R33 (CA116127); P01 (CA148600); Burroughs Wellcome Fund; Instytut Profilaktyki i Badań nad Rakiem w Teksasie; Globalna Fundacja Badawcza CLL; posiadłość Noelana L. Biblera; Fundacja Gillson Longenbaugh; Harry T. Mangurian, Jr., Fundusz Immunoterapii Białaczki; Instytut Personalizowanej Terapii Nowotworów; Towarzystwo Białaczki i Chłoniaka; Fundacja Badań nad Chłoniakiem; Fundusz Sieci Instytucji Siostrzanych MDACC; Fundacja Millera; Pan Herb Simons; Pan i Pani Joe H. Scales; Pana Thomasa Scotta; Narodowa Fundacja Badań nad Rakiem; Fundacja Badań nad Rakiem Dziecięcym; Fundacja Dziecięca Williama Lawrence'a i Blanche Hughes.

1. Przygotowanie materiałów w sterylnych warunkach (patrz Tabela Materiałów i Sprzętu)
<ol>
	<li>Przygotować 3 l buforu PBS/EDTA uzupełnionego albuminą surowicy ludzkiej (HSA) do końcowego stężenia 0,5% (w/v).</li>
	<li>Przygotować 1 l worek 0,9 % roztworu chlorku sodu (NaCl) klasy klinicznej i 2 l pożywki do hodowli komórkowych klasy GMP.</li>
	<li>Przygotować 60 nmol koktajlu antygenów peptydowych specyficznych dla CMV, rozpuszczając jedną fiolkę CMV pp65 w 8 ml sterylnej wody.</li>
	<li>Przenieś koktajl peptydowy CMV pp65 do worka do zamrażania o objętości 50 ml za pomocą interkonektora Luer/Spike i zacisku z kleszczami blokującymi, aby uniknąć późniejszego rozprowadzania koktajlu do zestawu rurek. Zestaw wężyków do wzbogacania otwartokomórkowego (TS 500) w sterylnych warunkach.</li>
	<li>Za pomocą sterylnej spawarki do rurek podłącz worek do zamrażania koktajli peptydowych do przyłącza rurki do zaworu 2 zestawu węży TS 500. Nie otwieraj torebki koktajlowej z peptydami clamp w tym czasie.</li>
	<li>Usunąć 1 x 109 TNC z wyjściowego produktu komórkowego i zawiesić w buforze PBS/EDTA zawierającym 2,5% HSA do całkowitej objętości 50 ml. Wstrzyknąć produkt komórkowy do worka transferowego o pojemności 150 ml.</li>
</ol>
2. Przygotowanie i użycie automatycznego systemu wzbogacania komórek (patrz tabela materiałów i sprzętu)
<ol>
	<li>Włącz system wzbogacania ogniw (Rysunek 1B) i wybierz program "CCS_IFN-γ Wzbogacanie". Obserwuj interfejs użytkownika z ekranami z instrukcjami i obrazkami prowadzącymi operatora przez procedurę.</li>
	<li>Wprowadź parametr "Operator" i "Nr P/N zestawu przewodów". Następnie zainstaluj zestaw węży 500 do automatycznego urządzenia do wzbogacania komórek zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi na ekranie interaktywnego monitora.</li>
	<li>Postępuj zgodnie z instrukcjami krok po kroku wyświetlanymi na ekranie, aby podłączyć medium i do urządzenia. Zapisz numer katalogowy i numer partii odczynników przed podłączeniem do urządzenia.</li>
	<li>Po ostatecznym sprawdzeniu zestawu rurek otwórz zacisk torebki koktajlowej z peptydami. Otwórz pożywkę i rozpocznij automatyczne zalewanie zestawu przewodów.</li>
	<li>Po zakończeniu etapu zalewania uzupełnij HSA (2,5%) do buforu NaCl w worku zbiornika (200 ml) za pomocą sterylnej spawarki do przewodów. Przenieś początkowy produkt komórkowy do "worka aplikacyjnego" za pomocą sterylnej spawarki do rurek.</li>
	<li>Podłącz odczynniki CCS (IFNγ) do odpowiednich przewodów za pomocą adapterów. Wprowadź preferowany czas na pobranie frakcji materiału komórkowego przed procesem wzbogacania. Przejrzyj i zweryfikuj dokładność wszystkich wprowadzonych danych/parametrów. Rozpocznij proces.</li>
	<li>Przed rozpoczęciem zautomatyzowanego procesu wzbogacania komórek należy wyjąć worek kontroli jakości (QCB, oryginalna frakcja (ori) zawiera około 1,3 ml ze 100 ml zawartości komory rozcieńczonej buforem PBS/EDTA). Zapieczętować QCB, zważyć i przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Rozpocznij proces wzbogacania. Pod koniec procesu komórki docelowe zostaną wymyte przybliżoną objętością buforu elucyjnego z worka zbiornika.</li>
	<li>Zamknij worek na komórki niebędące celem (NTCB, frakcja ujemna = neg) i worek na komórki docelowe (TCB, frakcja dodatnia = pozycja) i zważ każdy worek. Wagi zostaną później użyte do obliczenia numerów komórek.</li>
	<li>Bezpośrednio po procedurze wzbogacania należy pobrać dwie porcje na frakcję do analizy metodą cytometrii przepływowej i przechowywać pozostałe próbki w temperaturze 4 °C. Użyć jednej podwielokrotności próbki do oznaczania liczby komórek, a drugiej podwielokrotności próbki do analizy wydajności wzbogacania (tabela 1).</li>
	<li>Wyjmij zestaw przewodów z przyrządu do wzbogacania komórek. Przenieś plik dziennika na dysk USB do wykorzystania w przyszłości. 
	UWAGA: Wszystkie odczynniki powinny być przygotowane w sterylnych warunkach. Zdecydowanie zaleca się stosowanie okapu bezpieczeństwa biologicznego typu II. Użyj produktu komórkowego aferezy w stanie stacjonarnym (niezmobilizowanego) wyizolowanego od zdrowego seropozytywnego dawcy CMV w celu wzbogacenia limfocytów T specyficznych dla antygenu CMV. Należy używać wyłącznie HSA licencjonowanego przez FDA. Bufor do przygotowania komórek powinien być utrzymywany w temperaturze od +19 °C do +25 °C, ponieważ niższe lub wyższe temperatury otoczenia spowodują zmniejszenie czystości i wydajności komórek docelowych.</li>
</ol>
3. Określanie liczby komórek
<ol>
	<li>Weź podwielokrotności QCB , NTCB i TCB dla liczby komórek, jak pokazano w tabeli 1. Dodać CD45-VoBlue do każdej podwielokrotności (miano 1:11) i inkubować w ciemności przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Dodać 1,5 ml świeżo przygotowanego roztworu do lizy krwinek czerwonych (1x) do frakcji pierwotnej i frakcji ujemnej, 450 μl świeżo przygotowanego roztworu do lizy krwinek czerwonych do frakcji dodatniej i inkubować wszystkie frakcje przez 15 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Bezpośrednio przed analizą dodać jodek propidyny do końcowego stężenia 1 μg/ml (rozcieńczenie 1:100 100 μg/ml). Użyj automatycznego licznika komórek, aby określić liczbę komórek i żywotność. Do analizy cytometrii przepływowej należy używać zalecanego oprogramowania do licznika komórek. Określ bezwzględną liczbę leukocytów dla frakcji oryginalnych, ujemnych i dodatnich. 
	UWAGA: Liczba komórek żywotnych leukocytów na ml próbek pobranych do analizy liczby komórek jest określana za pomocą zalecanego oprogramowania do analizatora komórek.</li>
	<li>Ustaw region, jak pokazano na rysunku 2 (region 5, żywotne leukocyty). Użyj następującej strategii bramkowania, aby określić liczbę komórek. Żywotny leukocyt w pierwotnej frakcji pokazano na rysunku 2.</li>
	<li>Wskazane regiony (Rysunek 2, 1-6) są hierarchicznie następujące: 
	1: Brama czasowa → 2: Pojedyncze komórki → 3: Komórki CD45+ → 4: Leukocyty (z wyłączeniem szczątków) → 5: Żywotne leukocyty → 6: Żywotne limfocyty</li>
	<li>Powtórz te same kroki, aby określić liczbę komórek dla frakcji ujemnych i dodatnich. Obliczyć liczbę komórek w całej frakcji, biorąc pod uwagę współczynnik rozcieńczalnika próbki i całkowitą objętość frakcji (tabela 2).</li>
</ol>
4. Badanie wydajności separacji
<ol>
	<li>Przemyć podwielokrotności komórek frakcji QCB, NTCB i TCB wstępnie schłodzonym buforem PBS/EDTA/0,5% surowicą AB. Odwirować komórki przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i odessać supernatant.</li>
	<li>Zawiesić komórki w 100 μl mieszaniny barwienia przeciwciało-fluorochrom zawierającej: CD3-FITC, CD4-APC, CD8-APC-Vio770, CD14-PerCP, CD20-PerCP, CD45-VioBlue i anty-IFNγ-PE (miano 1:11) i inkubować w ciemności przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Dodać 1 ml świeżo przygotowanego roztworu do lizy krwinek czerwonych (1x) i inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Wirować przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i odsysać supernatant. Ponownie zawiesić komórki w odpowiedniej objętości buforu PBS/EDTA/0,5% surowicy AB.</li>
	<li>Dodać jodek propidyny do końcowego stężenia 1 μg/ml bezpośrednio przed analizą (rozcieńczenie 1:100 100 μg/ml). Przeprowadzić analizę metodą cytometrii przepływowej w celu oceny czystości próbki.</li>
	<li>Użyj następującej strategii bramkowania, aby obliczyć limfocyty T CD3 + w żywotnych leukocytach Strategia bramkowania w celu określenia limfocytów T CD3 + jest pokazana we frakcji dodatniej po procesie wzbogacania CCS. Wskazane regiony (Rysunek 3A i 3B, 1-6) są hierarchicznie połączone w następujący sposób: 
	1: Brama czasowa → 2: Pojedyncze komórki → 3: Komórki CD45+ → 4: Komórki (z wyłączeniem zanieczyszczeń) → 5: Żywotne leukocyty → 6: Żywotna populacja komórek CD3+</li>
	<li>Określ częstości limfocytów T CD4+, CD8+, CD4+ IFN-γ+ i CD8+ IFN-γ+ po procesie wzbogacania CCS (Tabela 2).</li>
	<li>Użyj strategii bramkowania, aby określić częstości limfocytów T CD4 +, CD8 +, CD4 + IFN-γ + i CD8 + IFN-γ + pokazanych poniżej dla oryginalnej i wzbogaconej (wychwyconej) frakcji dodatniej po procesie CCS. Wskazane regiony są hierarchicznie połączone i nazwane w następujący sposób: 
	1: Brama czasowa → 2: Pojedyncze komórki → 3: Komórki CD45+ → 4: Komórki (bez zanieczyszczeń) → 5: Żywotne leukocyty → 6: Żywotne komórki CD3+ → 7: Komórki CD4+ → 7a: Komórki CD4+ IFN-γ+ (ramka) → 8: Komórki CD8+ → 8a: Komórki CD8+ IFN-γ+ (ramka) </li>
</ol>
UWAGA: Pierwsze 6 wskazanych regionów łączy hierarchii jest takich samych jak na rysunku 3, (1-6), a ostatnie 2 regiony są pokazane na rysunku 4 (6-8a).

<ol><li>Syed, B. A., Evans, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+the+Analyst%27s+Couch+Stem+Cell+Therapy+Market%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">From the Analyst's Couch Stem Cell Therapy Market.</a> Nat Rev Drug Discov. 12 (3), 185-186 (2013).</li>
<li>Maus, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adoptive+Immunotherapy+for+Cancer+or+Viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Adoptive Immunotherapy for Cancer or Viruses.</a> Annu Rev Immunol. 32, 189-225 (2014).</li>
<li>Kumaresan, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioengineering+T+cells+to+target+carbohydrate+to+treat+opportunistic+fungal+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Bioengineering T cells to target carbohydrate to treat opportunistic fungal infection.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (29), 10660-10665 (2014).</li>
<li>Singh, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redirecting+specificity+of+T-cell+populations+for+CD19+using+the+Sleeping+Beauty+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Redirecting specificity of T-cell populations for CD19 using the Sleeping Beauty system.</a> Cancer Res. 68 (8), 2961-2971 (2008).</li>
<li>Kumaresan, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automating+the+manufacture+of+clinically+appealing+designer+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Treatment+Strategies-BMT%22%5BJournal%5D)">Automating the manufacture of clinically appealing designer T cells.</a> Treatment Strategies-BMT. (1), Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.cambridgeresearchcentre.co.uk/all-publications/blood-and-marrow-transplantation/">http://www.cambridgeresearchcentre.co.uk/all-publications/blood-and-marrow-transplantation/</a> 55-59 (2014).</li>
<li>Einsele, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adoptive+transfer+of+CMVpp65-peptide+loaded+DCs+to+improve+CMV-specific+T+cell+reconstitution+following+allogeneic+stem+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Adoptive transfer of CMVpp65-peptide loaded DCs to improve CMV-specific T cell reconstitution following allogeneic stem cell transplantation.</a> Blood. 100 (11), 214a-214a(2002).</li>
<li>Blyth, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Donor-derived+CMV-specific+T+cells+reduce+the+requirement+for+CMV-directed+pharmacotherapy+after+allogeneic+stem+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Donor-derived CMV-specific T cells reduce the requirement for CMV-directed pharmacotherapy after allogeneic stem cell transplantation.</a> Blood. 121 (18), 3745-3758 (2013).</li>
<li>Gerdemann, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety+and+clinical+efficacy+of+rapidly-generated+trivirus-directed+T+cells+as+treatment+for+adenovirus%2C+EBV%2C+and+CMV+infections+after+allogeneic+hematopoietic+stem+cell+transplant%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Safety and clinical efficacy of rapidly-generated trivirus-directed T cells as treatment for adenovirus, EBV, and CMV infections after allogeneic hematopoietic stem cell transplant.</a> Mol Ther. 21 (11), 2113-2121 (2013).</li>
<li>Meij, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+treatment+of+refractory+CMV+reactivation+after+allogeneic+stem+cell+transplantation+with+in+vitro-generated+CMV+pp65-specific+CD8%2B+T-cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunother%22%5BJournal%5D)">Effective treatment of refractory CMV reactivation after allogeneic stem cell transplantation with in vitro-generated CMV pp65-specific CD8+ T-cell lines.</a> J Immunother. 35 (8), 621-628 (2012).</li>
<li>Lee Buckler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enal+Razvi%2C.+Rise+of+Cell-Based+Immunotherapy+%3A+Personalized+Medicine+Takes+Next+Step+Forward%5BTitle%5D)+AND+%22Genetic+Engineering+%26+Biotechnology+News%22%5BJournal%5D)">Enal Razvi,. Rise of Cell-Based Immunotherapy : Personalized Medicine Takes Next Step Forward.</a> Genetic Engineering & Biotechnology News. 33 (5), 12-13 (2013).</li>
<li>Apel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+Clinical+Scale+Manufacturing+System+for+Cellular+Products+Derived+by+Magnetic+Cell+Separation%2C+Centrifugation+and+Cell+Culture%5BTitle%5D)+AND+%22Chem-Ing-Tech%22%5BJournal%5D)">Integrated Clinical Scale Manufacturing System for Cellular Products Derived by Magnetic Cell Separation, Centrifugation and Cell Culture.</a> Chem-Ing-Tech. 85 (1-2), 103-110 (2013).</li>
<li>Brestrich, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adoptive+T-Cell+Therapy+of+a+Lung+Transplanted+Patient+with+Severe+CMV+Disease+and+Resistance+to+Antiviral+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Transplant%22%5BJournal%5D)">Adoptive T-Cell Therapy of a Lung Transplanted Patient with Severe CMV Disease and Resistance to Antiviral Therapy.</a> Am J Transplant. 9 (7), 1679-1684 (2009).</li>
<li>Feuchtinger, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+grade+generation+of+hexon-specific+T+cells+for+adoptive+T-cell+transfer+as+a+treatment+of+adenovirus+infection+after+allogeneic+stem+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunother%22%5BJournal%5D)">Clinical grade generation of hexon-specific T cells for adoptive T-cell transfer as a treatment of adenovirus infection after allogeneic stem cell transplantation.</a> J Immunother. 31 (2), 199-206 (2008).</li>
<li>Peggs, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directly+selected+cytomegalovirus-reactive+donor+T+cells+confer+rapid+and+safe+systemic+reconstitution+of+virus-specific+immunity+following+stem+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Directly selected cytomegalovirus-reactive donor T cells confer rapid and safe systemic reconstitution of virus-specific immunity following stem cell transplantation.</a> Clin Infect Dis. 52 (1), 49-57 (2011).</li>
<li>Tischer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+generation+of+clinical-grade+antiviral+T+cells%3A+selection+of+suitable+T-cell+donors+and+GMP-compliant+manufacturing+of+antiviral+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Rapid generation of clinical-grade antiviral T cells: selection of suitable T-cell donors and GMP-compliant manufacturing of antiviral T cells.</a> Journal of Translational Medicine. 12 (1), 336(2014).</li>
<li>Svahn, B. M., Remberger, M., Alvin, O., Karlsson, H., Ringden, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+Costs+after+Allogeneic+Haematopoietic+Sct+Are+Associated+with+Major+Complications+and+Re-Transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Blood+Marrow+Transplant%22%5BJournal%5D)">Increased Costs after Allogeneic Haematopoietic Sct Are Associated with Major Complications and Re-Transplantation.</a> Biol Blood Marrow Transplant. 18 (2), S339-S339 (2012).</li>
<li>Leen, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicenter+study+of+banked+third-party+virus-specific+T+cells+to+treat+severe+viral+infections+after+hematopoietic+stem+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Multicenter study of banked third-party virus-specific T cells to treat severe viral infections after hematopoietic stem cell transplantation.</a> Blood. 121 (26), 5113-5123 (2013).</li>
</ol>

Zarówno MD Anderson Cancer Center, jak i dr Cooper mają udziały finansowe w ZIOPHARM Oncology, Inc. i Intrexon Corporation. W dniu 7 maja 2015 r. dr Cooper został mianowany dyrektorem generalnym ZIOPHARM Oncology. Dr Cooper jest obecnie wizytującym naukowcem w MD Anderson. Dr Cooper założył i jest właścicielem firmy InCellerate, Inc. Posiada patenty w Sangamo BioSciences na sztuczne nukleazy. Konsultuje się z Targazyme, Inc. (dawniej American Stem cells, Inc.), GE Healthcare, Ferring Pharmaceuticals, Fate Therapeutics, Janssen Pharmaceuticals i Bristol-Myers Squibb. Zasiada w Naukowej Radzie Doradczej firmy Cellectis. Otrzymuje honoraria od Miltenyi Biotec.

Adoptywna terapia komórkami T stała się realną opcją leczenia nowotworów złośliwych komórek B4. Jego potencjał terapeutyczny zależy od podania pożądanej liczby limfocytów T specyficznych dla docelowego antygenu, które nie mają starzenia replikacyjnego2. Można to osiągnąć poprzez oddzielenie czystej populacji limfocytów T specyficznych dla antygenu od ekspandowanych limfocytów T zgodnie z obecnymi dobrymi praktykami produkcyjnymi. Szeroko stosowane są dwie procedury sortowania, a mianowicie sortowani...

Przeszczep hematopoetycznych komórek macierzystych (HSCT) 1 może być połączony z adoptywną terapią komórkami T w celu poprawy efektu przeszczep przeciwko nowotworowi i zapewnienia odporności na infekcje oportunistyczne2. Wytwarzanie specyficznych dla antygenu limfocytów T pochodzących od dawcy do infuzji historycznie wymagało wykwalifikowanego personelu i wykorzystania specjalistycznych urządzeń, które są zgodne z GMP. Dostarczenie takich limfocytów T spowodowało ustąpienie zakażeń oportunistycznych3 , a także leczenie leżącego u ich podstaw nowotworuzłośliwego 4. Ostatnio badacze wykazali, że adoptywny transfer zaledwie kilku tysięcy limfocytów T specyficznych dla wirusa (~ 1 x 104 – 2,5 x 105 komórek/kg masy ciała biorcy) może skutecznie leczyć oportunistyczne infekcje CMV po allogenicznym HSCT5-9. Ograniczona liczba zakładów GMP, z powiązanymi wymaganiami dotyczącymi wykwalifikowanej produkcji i wysokimi kosztami związanymi z produkcją komórek, ograniczyła jednak dostęp pacjentów do obiecujących terapii komórkami T10. Jedno z podejść do izolowania limfocytów T specyficznych dla antygenu opiera się na CCS przy użyciu dwuspecyficznego odczynnika do rozpoznawania CD45 i IFN-γ. Jak pokazano, metodologia ta może być wykorzystana do generowania klinicznych limfocytów T specyficznych dla CMV przy użyciu automatycznego urządzenia CCS do wzbogacania komórek (Figura 1B).
Limfocyty T specyficzne dla CMV są generowane przez inkubację nakładających się peptydów z antygenu pp65 CMV z całkowitymi komórkami jądrowymi leukaferezy (TNC) od seropozytywnych dawców CMV. Peptydy te, wyświetlane w kontekście ludzkiego antygenu leukocytarnego (HLA), aktywują limfocyty T specyficzne dla CMV pp65 w TNC do wydzielania IFN-γ. Te limfocyty T mogą być następnie "wychwycone" i magnetycznie oddzielone. Działanie urządzenia do wzbogacania komórek pierwszej generacji (rysunek 1A) wymagało personelu wykwalifikowanego w zakresie hodowli komórkowych w warunkach GMP oraz koordynacji personelu w celu podjęcia wielu kroków niezbędnych do wytworzenia "wychwyconego" produktu.
Procedura zazwyczaj wymagała od 10 do 12 godzin ciągłej pracy, a zatem personel prawdopodobnie musi pracować na dwie zmiany w obiekcie GMP. Ograniczenia te zostały obecnie wyeliminowane dzięki zastosowaniu urządzenia drugiej generacji (pokazanego na rysunku 1B). To urządzenie przechodzi wzbogacanie magnetyczne, podobnie jak urządzenie pierwszej generacji, ale automatyzuje inne aspekty CCS w sposób nienaruszony. To znacznie zmniejsza obciążenie zespołu GMP, ponieważ większość kroków można wykonać bez nadzoru personelu. Ponadto, ponieważ urządzenie działa jako system zamknięty, limfocyty T specyficzne dla antygenu mogą być wychwytywane i przetwarzane na stole laboratoryjnym, z wyjątkiem etapów związanych z izolacją leukaferezy i przygotowaniem materiałów przed uruchomieniem urządzenia. Szczegółowe informacje na temat pełnego oprzyrządowania i funkcjonalności tego urządzenia do wzbogacania komórek drugiej generacji zostały opublikowane11.
Tutaj opisujemy kroki do wzbogacenia limfocytów T specyficznych dla CMV pp65 z produktu aferezy w stanie ustalonym za pomocą automatycznego systemu CCS do wzbogacania komórek. Po wyizolowaniu te limfocyty T specyficzne dla CMV mogą być natychmiast podawane pacjentowi.

<table><tbody><tr><td>CliniMACS PBS/EDTA Buffer 3 L Bag</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>700-29</td><td></td></tr><tr><td>CliniMACS Prodigy Zestaw przewodów TS 500</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-097-182</td><td></td></tr> 5 <tr><td>L Worek na odpady</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>110-004-067</td><td></td></tr><tr><td>System wychwytywania cytokin CliniMACS (IFN-gamma)</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>279-01</td><td></td></tr><tr><td>Albumina (ludzka) 25%&nbsp;</td><td>Grifols</td><td>58516-5216-2</td><td></td></tr><tr><td>Interkonektor Luer/Spike</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-018-701</td><td></td></tr><tr><td>0,9 % roztwór NaCl (1 l)</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MACS GMP PepTivator HCMV pp65</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>170-076-109</td><td></td></tr><tr><td>Woda do wstrzykiwań</td><td>Hospira, inc, Lake Forest, IL</td><td>NDC-0409-4887-10</td><td></td></tr><tr><td>Jednostka filtrująca MILLEX GV 0,22 &mu; m&nbsp;</td><td>Millipore</td><td>SLGV033RB</td><td></td></tr><tr><td>TexMACS GMP Medium Worek 2 L</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>170-076-306</td><td></td></tr><tr><td>Worek transferowy, 150 ml (na komórkowy materiał wyjściowy)</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-018-301</td><td></td></tr><tr><td>Worek do zamrażania CryoMACS 50</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>200-074-400</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawki 60 ml, sterylne</td><td>BD, Laagstraat, Temse, Belgia</td><td>309653</td><td></td></tr><tr><td>Produkt do aferezy surowiczej CMV</td><td>Key Biologics, LLC, Memphis</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flow Cytometry Materials</td><td>Producent</td><td>Numer katalogowy</td><td></td></tr><tr><td>AB Serum, GemCell</td><td>Gemini Bio-Products, West Sacramento, USA</td><td>100-512</td><td></td></tr><tr><td>CD3-FITC</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-080-401</td><td></td></tr><tr><td>CD4-APC</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-098-033</td><td></td></tr><tr><td>CD8-APC-Vio770</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-098-065</td><td></td></tr><tr><td>CD14-PerCP</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-098-072</td><td></td></tr><tr><td>CD20-PerCP</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-098-077</td><td></td></tr><tr><td>CD45-VioBlue</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-098-136</td><td></td></tr><tr><td>aIFN-&gamma;-PE, człowiek</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-097-940</td><td></td></tr><tr><td>CD3-PE</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-091-374</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór jodku propydu (100 &mikro; g/ml)</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-093-233</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td>Producent</td><td>Numer katalogowy</td><td></td></tr><tr><td>CliniMACS Prodigy Device&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>200-075-301</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie V1.0.0.RC</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MACSQuant Analyzer 10</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-096-343</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie 2.4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wirówka 5415R&nbsp;</td><td>Eppendorf AG</td><td>22331</td><td></td></tr><tr><td>Celometr K2</td><td>Nexelom Bioscience, Lawrence, MA</td><td>LB-001-0016</td><td></td></tr><tr><td>Sterylna spawarka do rur SCDIIB</td><td>Terumo Medical Corp., Elkton, MA</td><td>7811</td><td></td></tr></tbody></table>

zautomatyzowane wzbogacanie komórek limfocytów t specyficznych dla wirusa cytomegalii do zastosowań klinicznych przy użyciu systemu wychwytywania cytokin

Automated Cell Enrichment of Cytomegalovirus-specific T cells for Clinical Applications using the Cytokine-capture System

Adoptywny transfer limfocytów T specyficznych dla patogenów może być wykorzystany do zapobiegania i leczenia infekcji oportunistycznych, takich jak zakażenie wirusem cytomegalii (CMV) występujące po allogenicznym przeszczepie krwiotwórczych komórek macierzystych. Limfocyty T specyficzne dla wirusa od dawców allogenicznych, w tym dawców zewnętrznych, mogą być rozmnażane ex vivo zgodnie z aktualną dobrą praktyką wytwarzania (cGMP), wykorzystując powtarzające się rundy stymulacji sterowanej antygenem w celu selektywnej propagacji pożądanych limfocytów T. Identyfikacja i izolacja limfocytów T specyficznych dla antygenu może być również podjęta w oparciu o system wychwytywania cytokin w limfocytach T, które zostały aktywowane do wydzielania interferonu gamma (IFN-γ). Jednak powszechne stosowanie systemu wychwytywania cytokin (CCS) u ludzi w celu przywrócenia odporności było ograniczone, ponieważ proces produkcji jest czasochłonny i wymaga wykwalifikowanego operatora. Opracowanie urządzenia do wzbogacania komórek drugiej generacji, takiego jak CliniMACS Prodigy, umożliwia teraz badaczom generowanie limfocytów T specyficznych dla wirusa przy użyciu zautomatyzowanego, mniej pracochłonnego systemu. To urządzenie oddziela komórki znakowane magnetycznie od komórek nieznakowanych za pomocą technologii magnetycznego aktywowanego sortowania komórek w celu wytworzenia produktów klasy klinicznej, jest zaprojektowane jako system zamknięty i może być dostępne i obsługiwane na stole laboratoryjnym. Demonstrujemy działanie tego nowego zautomatyzowanego urządzenia do wzbogacania komórek do wytwarzania limfocytów T specyficznych dla CMV pp65 uzyskanych z produktu aferezy w stanie ustalonym uzyskanego od seropozytywnego dawcy CMV. Te wyizolowane limfocyty T mogą być następnie bezpośrednio podawane pacjentowi pod nadzorem instytucjonalnym i federalnym. Wszystkie etapy bioprzetwarzania, w tym usuwanie czerwonych krwinek, stymulacja limfocytów T, separacja limfocytów T specyficznych dla antygenu, oczyszczanie i mycie, są w pełni zautomatyzowane. Urządzenia takie jak to stwarzają możliwość, że limfocyty T do stosowania u ludzi mogą być wytwarzane poza dedykowanymi zakładami dobrej praktyki produkcyjnej (GMP) i zamiast tego być produkowane w bankach krwi, w których personel może nadzorować zautomatyzowane protokoły wytwarzania wielu produktów.

W niniejszym badaniu zautomatyzowany system wzbogacania komórek CCS został wykorzystany do zautomatyzowanej produkcji limfocytów T specyficznych dla CMV pp65. Limfocyty T specyficzne dla CMV zostały wzbogacone z trzech produktów komórkowych uzyskanych w drodze aferezy. Produkt aferezy w stanie stacjonarnym pobierano przez 2 hr od dawcy seropozytywnego pod kątem CMV, co pozwoliło uzyskać 1010 całkowitej liczby komórek jądrowych (TNC). Następnie 109 TNC aktywowano peptydami pochodzącymi z CMV pp65 (60...

Celem tego protokołu jest produkcja specyficznych dla patogenów klinicznych limfocytów T przy użyciu laboratoryjnego, zautomatyzowanego urządzenia do wzbogacania komórek drugiej generacji, które zawiera zamknięty system wychwytywania cytokin i nie wymaga dedykowanego personelu ani korzystania z urządzenia GMP. Wygenerowane limfocyty T specyficzne dla wirusa cytomegalii pp65 mogą być bezpośrednio podawane pacjentom.

Zautomatyzowane wzbogacanie komórek limfocytów T specyficznych dla wirusa cytomegalii do zastosowań klinicznych przy użyciu systemu wychwytywania cytokin

The adoptive transfer of pathogen-specific T cells can be used to prevent and treat opportunistic infections such as cytomegalovirus (CMV) infection ...

Celem niniejszej procedury jest izolacja specyficznych dla antygenu limfocytów T klasy klinicznej do immunoterapii adoptywnej z wykorzystaniem systemu wychwytywania cytokin. Jest to realizowane poprzez wstępną inkubację komórek mononuklearnych uzyskanych od dawcy CMV-dodatniego z panelem nakładających się peptydów pochodnych od CMV PP 65 w celu aktywacji limfocytów T. Następnie aktywowane, specyficzne dla antygenu, CD 45-dodatnie limfocyty T wykazujące ekspresję IFN gamma są izolowane metodą wychwytywania cytokin.Liczbę i czystość limfocytów T swoistych dla CMV ocenia się następnie za pomocą cytometrii przepływowej. Ostatecznie, przy użyciu tego systemu wychwytywania cytokin, można zebrać wysoki odsetek CD4+ i CD8+ limfocytów T swoistych dla CMV wykazujących ekspresję IFN-gamma. Głównymi zaletami tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami są pełna automatyzacja oraz brak konieczności posiadania zaplecza działającego zgodnie z dobrą praktyką wytwarzania (GMP) w celu izolacji wychwyconych limfocytów T klasy klinicznej.Niniejsza metoda może pomóc w znalezieniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie adoptywnej terapii komórkowej, takie jak sposób redukcji kosztów związanych

automated-cell-enrichment-cytomegalovirus-specific-t-cells-for

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Zautomatyzowane wzbogacanie komórek specyficznych dla wirusa cytomegalii komórek T dla zastosowań klinicznych z wykorzystaniem systemu wychwytywania cytokin

Krążące komórki nowotworowe są izolowane z krwi pacjentów onkologicznych bez powodowania uszkodzeń komórkowych. Izolacja komórek nowotworowych jest realizowana przy użyciu bimolekularnej powierzchni E-selectiny oraz przeciwciał przeciwko markerom nabłonkowym. Powłoka z nanorurek specyficznie wspomaga adhezję komórek rakowych, co skutkuje wysoką czystością wychwytu.

Szybka izolacja żywych krążących komórek nowotworowych z próbek krwi pacjentów

Ten film opisuje wzbogacanie limfocytów T ze śledziony myszy poprzez selekcję negatywną za pomocą separatora magnetycznego. Technika ta polega na ukierunkowaniu na inne komórki w próbce w celu zubożenia za pomocą przeciwciał lub ligandów skierowanych przeciwko określonym antygenom powierzchniowym komórki.

Wzbogacanie limfocytów T: technika izolowania limfocytów T z mieszanej populacji komórek za pomocą separacji magnetycznej

Krążące komórki nowotworowe (CTC) są prognostyczne w kilku nowotworach przerzutowych. Ten manuskrypt opisuje złoty standard systemu CellSearch (CSS) platformy wyliczania CTC i zwraca uwagę na typowe błędy błędnej klasyfikacji. Ponadto opisano dwa dostosowane protokoły do definiowanej przez użytkownika charakterystyki markerów CTC i liczenia CTC w przedklinicznych mysich modelach przerzutów przy użyciu tej technologii.

Adaptacja półautomatycznych testów na krążące komórki nowotworowe (CTC) do zastosowań klinicznych i przedklinicznych

Ten protokół ma na celu odzyskanie i przygotowanie rzadkich komórek docelowych z mieszaniny z komórkami tła niebędącymi celem, do molekularnej charakterystyki genetycznej na poziomie pojedynczej komórki. Jakość DNA jest równa jakości pojedynczych komórek niepoddanych działaniu metody i pozwala na zastosowanie pojedynczych komórek (zarówno w oparciu o badania przesiewowe, jak i analizę celowaną).

Wstępne wzbogacanie komórek docelowych i amplifikacja całego genomu w celu dalszej charakterystyki pojedynczej komórki

Tutaj prezentujemy zintegrowany przepływ pracy w celu identyfikacji cech fenotypowych i molekularnych, które charakteryzują krążące komórki nowotworowe (CTC). Łączymy barwienie immunologiczne na żywo i mikromanipulację mikromanipulacją pojedynczych i grupowanych CTC z technikami opartymi na pojedynczych komórkach do dalszej analizy i oceny zdolności do wysiewu przerzutów.

Mikromanipulacja krążącymi komórkami nowotworowymi w celu dalszej analizy molekularnej i oceny potencjału przerzutowego

Tutaj prezentujemy protokół do przeprowadzenia izolacji i ekspansji komórek zabójczych CD3+CD56+ pochodzących z komórek jednojądrzastych krwi obwodowej pochodzących z cytokin indukowanych cytokinami i ilustrujemy ich efekt cytotoksyczności wobec hematologicznych i litych komórek nowotworowych za pomocą systemu cytometrii przepływowej in vitro.

Izolacja i ekspansja cytotoksycznych limfocytów T zabójców indukowanych cytokinami w leczeniu raka

Kliniczny chip mikroprzepływowy jest ważną techniką analizy biomedycznej, która upraszcza wstępne przetwarzanie próbek krwi pacjenta klinicznego i immunofluorescencyjnie barwi krążące komórki nowotworowe (CTC) in situ na chipie, umożliwiając szybkie wykrycie i identyfikację pojedynczego CTC.

Kliniczna mikroprzepływowa platforma chipowa do izolacji wszechstronnych krążących komórek nowotworowych

Komórki nowotworowe krążące (CTC) są kluczowe dla badania postępu nowotworów i przerzutów. Niniejszy artykuł przedstawia wysokoprzepustowy, zintegrowany protokół wzbogacania CTC oraz sekwencjonowania pojedynczego CTC, poprawiający efektywność przechwytywania i czystość CTC, jednocześnie zmniejszając koszty zanieczyszczenia i sekwencjonowania, co przyczynia się do rozwoju badań i zastosowań klinicznych w precyzyjnej onkologii.

Technologia sortowania komórek nowotworowych o wysokiej przepustowości i sekwencjonowania pojedynczych komórek oparta na mikrofluidice

Protokół ten opisuje skalowalną metodę rozszerzania produktów Adoptive Cell Therapies (ACT), mianowicie komórek Chimeric Antigen Receptor (CAR)-T oraz komórek zabójczych indukowanych cytokinami (CIK), wykorzystujących urządzenia Gas-permeable Rapid Expansion (G-Rex), wykazując efektywny i solidny wzrost w klinicznie istotnych warunkach.

Efektywna i szybka generacja komórek zabójczych indukowanych przez CAR-T i cytokiny w urządzeniach skalowalnych GMP

Przedstawiamy protokół otrzymywania swoistych dla antygenu limfocytów T myszy z wykorzystaniem transdukcji...

Retrowirusowa transdukcja receptorów limfocytów T w limfocytach T myszy

Poznaj zautomatyzowaną metodę wzbogacania limfocytów T specyficznych dla CMV przy użyciu systemu wychwytywania cytokin. Technika umożliwia produkcję komórek klasy klinicznej bez potrzeby stosowania obiektów GMP.

Zautomatyzowane wzbogacanie komórek limfocytów T specyficznych dla wirusa cytomegalii do zastosowań klinicznych przy użyciu systemu wychwytywania cytokin (Wideo) | JoVE Journal

Zautomatyzowane wzbogacanie komórek limfocytów T specyficznych dla wirusa cytomegalii do zastosowań klinicznych przy użyciu systemu wychwytywania cytokin

Przeglądaj więcej filmów