Name: Fenomika fagów: fizjologiczne podejścia do charakterystyki nowych białek wirusowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: Poznaj fenomiczne podejścia do charakteryzacji genów fagowych z wykorzystaniem płytek MAP i analizy metabolomicznej w E. coli. Ta metoda pozwala badać funkcje białkowe wirusów i ich wpływ na metabolizm bakteryjny.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Benjaminowi Knowlesowi, Yan Wei Limowi, Andreasowi Haasowi i członkom konsorcjum Viral Dark Matter za ich pomoc i konstruktywny wkład w ten manuskrypt. Badania te są finansowane przez National Science Foundation (DEB-1046413) i są częścią projektu Dimensions: Shedding Light on Viral Dark Matter.

<ol><li>Wommack, K. E., Colwell, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virioplankton%3A+Viruses+in+Aquatic+Ecosystems%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+and+Molecular+Biology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Virioplankton: Viruses in Aquatic Ecosystems.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 64 (1), 69-114 (2000).</li>
<li>Hendrix, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recoding+in+Bacteriophages%5BTitle%5D)+AND+%22Recoding%3A+Expansion+of+decoding+rules+enriches+gene+expression%22%5BJournal%5D)">Recoding in Bacteriophages.</a> Recoding: Expansion of decoding rules enriches gene expression. 24, 249-258 (2010).</li>
<li>Breitbart, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+analysis+of+uncultured+marine+viral+communities%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Genomic analysis of uncultured marine viral communities.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (22), 14250-14255 (2002).</li>
<li>Breitbart, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+and+population+structure+of+a+near-shore+marine-sediment+viral+community%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings.+Biological+sciences+%2F+The+Royal+Society%22%5BJournal%5D)">Diversity and population structure of a near-shore marine-sediment viral community.</a> Proceedings. Biological sciences / The Royal Society. 271 (1539), 565-574 (2004).</li>
<li>Dinsdale, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+metagenomic+profiling+of+nine+biomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional metagenomic profiling of nine biomes.</a> Nature. 452 (7187), 629-632 (2008).</li>
<li>Vega Thurber, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metagenomic+analysis+indicates+that+stressors+induce+production+of+herpes-like+viruses+in+the+coral+Porites+compressa%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Metagenomic analysis indicates that stressors induce production of herpes-like viruses in the coral Porites compressa.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (47), 18413-18418 (2008).</li>
<li>Pedulla, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origins+of+highly+mosaic+mycobacteriophage+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Origins of highly mosaic mycobacteriophage genomes.</a> Cell. 113 (2), 171-182 (2003).</li>
<li>Calendar, R., Abedon, S. T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCalendar%2C+R+%22The+bacteriophages%22">The bacteriophages</a>. , Oxford Univeresity Press. (2006).</li>
<li>Breitbart, M., Miyake, J. H., Rohwer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+distribution+of+nearly+identical+phage-encoded+DNA+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+microbiology+letters%22%5BJournal%5D)">Global distribution of nearly identical phage-encoded DNA sequences.</a> FEMS microbiology letters. 236 (2), 249-256 (2004).</li>
<li>Klenk, H. -P., Palm, P., Zillig, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-Dependent+RNA+Polymerases+as+Phylogenetic+Marker+Molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Systematic+and+Applied+Microbiology%22%5BJournal%5D)">DNA-Dependent RNA Polymerases as Phylogenetic Marker Molecules.</a> Systematic and Applied Microbiology. 16 (4), 638-647 (1993).</li>
<li>Breitbart, M., Thompson, L., Suttle, C., Sullivan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+Vast+Diversity+of+Marine+Viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Oceanography%22%5BJournal%5D)">Exploring the Vast Diversity of Marine Viruses.</a> Oceanography. 20 (2), 135-139 (2007).</li>
<li>Mann, N. H., Cook, A., Millard, A., Bailey, S., Clokie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marine+ecosystems%3A+bacterial+photosynthesis+genes+in+a+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Marine ecosystems: bacterial photosynthesis genes in a virus.</a> Nature. 424 (6950), 741(2003).</li>
<li>Mann, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genome+of+S-PM2%2C+a+%E2%80%9Cphotosynthetic%E2%80%9D+T4-type+bacteriophage+that+infects+marine+Synechococcus+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+bacteriology%22%5BJournal%5D)">The genome of S-PM2, a “photosynthetic” T4-type bacteriophage that infects marine Synechococcus strains.</a> Journal of bacteriology. 187 (9), 3188-3200 (2005).</li>
<li>Lindell, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfer+of+photosynthesis+genes+to+and+from+Prochlorococcus+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Transfer of photosynthesis genes to and from Prochlorococcus viruses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (30), 11013-11018 (2004).</li>
<li>Millard, A., Clokie, M. R. J., Shub, D. A., Mann, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+organization+of+the+psbAD+region+in+phages+infecting+marine+Synechococcus+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Genetic organization of the psbAD region in phages infecting marine Synechococcus strains.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (30), 11007-11012 (2004).</li>
<li>Sullivan, M. B., Coleman, M. L., Weigele, P., Rohwer, F., Chisholm, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+Prochlorococcus+cyanophage+genomes%3A+signature+features+and+ecological+interpretations%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+biology%22%5BJournal%5D)">Three Prochlorococcus cyanophage genomes: signature features and ecological interpretations.</a> PLoS biology. 3 (5), e144(2005).</li>
<li>Rohwer, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+complete+genomic+sequence+of+the+marine+phage+Roseophage+SIOI+shares+homology+with+nonmarine+phages%5BTitle%5D)+AND+%22Limnology+and+Oceanography%22%5BJournal%5D)">The complete genomic sequence of the marine phage Roseophage SIOI shares homology with nonmarine phages.</a> Limnology and Oceanography. 45 (2), 408-418 (2000).</li>
<li>Miller, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+genome+sequence+of+the+broad-host-range+vibriophage+KVP40%3A+comparative+genomics+of+a+T4-related+bacteriophage%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+bacteriology%22%5BJournal%5D)">Complete genome sequence of the broad-host-range vibriophage KVP40: comparative genomics of a T4-related bacteriophage.</a> Journal of bacteriology. 185 (17), 5220-5233 (2003).</li>
<li>Thompson, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phage+auxiliary+metabolic+genes+and+the+redirection+of+cyanobacterial+host+carbon+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Phage auxiliary metabolic genes and the redirection of cyanobacterial host carbon metabolism.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (39), E757-E764 (2011).</li>
<li>Paterson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antagonistic+coevolution+accelerates+molecular+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Antagonistic coevolution accelerates molecular evolution.</a> Nature. 464 (7286), 275-278 (2010).</li>
<li>Seguritan, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+neural+networks+trained+to+detect+viral+and+phage+structural+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+computational+biology%22%5BJournal%5D)">Artificial neural networks trained to detect viral and phage structural proteins.</a> PLoS computational biology. 8 (8), e1002657(2012).</li>
<li>Neidhardt, F. C., Bloch, P. L., Smith, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+Medium+for+Enterobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Culture Medium for Enterobacteria.</a> Journal of Bacteriology. 119 (3), 736-747 (1974).</li>
<li>Khlebnikov, A., Datsenko, K. A., Skaug, T., Wanner, B. L., Keasling, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homogeneous+expression+of+the+P%28BAD%29+promoter+in+Escherichia+coli+by+constitutive+expression+of+the+low-affinity+high-capacity+AraE+transporter%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+%28Reading%2C+England%29%22%5BJournal%5D)">Homogeneous expression of the P(BAD) promoter in Escherichia coli by constitutive expression of the low-affinity high-capacity AraE transporter.</a> Microbiology (Reading, England). 147 (Pt 2), 3241-3247 (2001).</li>
<li>Cuevas, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elucidating+genomic+gaps+using+phenotypic+profiles%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Research%22%5BJournal%5D)">Elucidating genomic gaps using phenotypic profiles.</a> F1000Research. , (2014).</li>
<li>Zwietering, M. H., Jongenburger, I., Rombouts, F. M., van’t Riet, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+of+the+bacterial+growth+curve%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+environmental+microbiology%22%5BJournal%5D)">Modeling of the bacterial growth curve.</a> Applied and environmental microbiology. 56 (6), 1875-1881 (1990).</li>
<li>Venables, W. N., Smith, D. M. An introduction to R. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://cran.r-project.org/doc/manuals/R-intro.pdf">http://cran.r-project.org/doc/manuals/R-intro.pdf</a> (2014).</li>
<li>Schmieder, R., Lim, Y. W., Rohwer, F., Edwards, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TagCleaner%3A+Identification+and+removal+of+tag+sequences+from+genomic+and+metagenomic+datasets%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+bioinformatics%22%5BJournal%5D)">TagCleaner: Identification and removal of tag sequences from genomic and metagenomic datasets.</a> BMC bioinformatics. 11, 341(2010).</li>
<li>Schmieder, R., Edwards, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quality+control+and+preprocessing+of+metagenomic+datasets%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics+%28Oxford%2C+England%29%22%5BJournal%5D)">Quality control and preprocessing of metagenomic datasets.</a> Bioinformatics (Oxford, England). 27 (6), 863-864 (2011).</li>
<li>Schmieder, R., Edwards, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+identification+and+removal+of+sequence+contamination+from+genomic+and+metagenomic+datasets%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Fast identification and removal of sequence contamination from genomic and metagenomic datasets.</a> PloS One. 6 (3), e17288(2011).</li>
<li>Welch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+parameters+to+control+synthetic+gene+expression+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Design parameters to control synthetic gene expression in Escherichia coli.</a> PloS One. 4 (9), e7002(2009).</li>
<li>Fiehn, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quality+control+for+plant+metabolomics%3A+reporting+MSI-compliant+studies%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+journal%3A+for+cell+and+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Quality control for plant metabolomics: reporting MSI-compliant studies.</a> The Plant journal: for cell and molecular biology. 53 (4), 691-704 (2008).</li>
<li>Zeng, Q., Chisholm, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marine+viruses+exploit+their+host%E2%80%99s+two-component+regulatory+system+in+response+to+resource+limitation%5BTitle%5D)+AND+%22Current+biology%3A+CB%22%5BJournal%5D)">Marine viruses exploit their host’s two-component regulatory system in response to resource limitation.</a> Current biology: CB. 22 (2), 124-128 (2012).</li>
<li>Shindy, W. W., Smith, O. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+plant+hormones+from+cotton+ovules%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+physiology%22%5BJournal%5D)">Identification of plant hormones from cotton ovules.</a> Plant physiology. 55 (3), 550-554 (1975).</li>
<li>Lee, H. I., Leon, J., Raskin, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosynthesis+and+metabolism+of+salicylic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Biosynthesis and metabolism of salicylic acid.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (10), 4076-4079 (1995).</li>
<li>Chappell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Biochemistry+and+Molecular+Biology+of+Isoprenoid+Metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">The Biochemistry and Molecular Biology of Isoprenoid Metabolism.</a> Plant Physiology. 107 (1), 1-6 (1995).</li>
<li>Kitagawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+set+of+ORF+clones+of+Escherichia+coli+ASKA+library+%28a+complete+set+of+E.+coli+K-12+ORF+archive%29%3A+unique+resources+for+biological+research%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+research%3A+an+international+journal+for+rapid+publication+of+reports+on+genes+and+genomes%22%5BJournal%5D)">Complete set of ORF clones of Escherichia coli ASKA library (a complete set of E. coli K-12 ORF archive): unique resources for biological research.</a> DNA research: an international journal for rapid publication of reports on genes and genomes. 12 (5), 291-299 (2005).</li>
<li>Baran, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+footprinting+of+mutant+libraries+to+map+metabolite+utilization+to+genotype%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+chemical+biology%22%5BJournal%5D)">Metabolic footprinting of mutant libraries to map metabolite utilization to genotype.</a> ACS chemical biology. 8 (1), 189-199 (2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym miejscu przedstawiamy podejścia fenomiczne do funkcjonalnej charakterystyki przypuszczalnych genów fagowych. Techniki obejmują opracowany test zdolny do monitorowania metabolizmu anabolicznego gospodarza, płytki do oznaczania wielu fenotypów (MAP), oprócz uznanej metody metabolomiki, zdolnej do pomiaru wpływu na metabolizm kataboliczny. Dostarczyliśmy dodatkowe narzędzia do zarządzania dużymi zbiorami danych wynikającymi z tych technologii, pozwalające na wysokoprzepustowe przetwarzanie i analizę24. Wreszcie, poprzez porównanie opisanego białka kapsydu fagowego, tioredoksyny fagowej, dwóch przypuszczalnych metabolicznych genów fagowych i średniej odpowiedzi eksperymentalnej, proponujemy różne strategie interpretacji zarówno zestawów danych, jak i klas genów, z naciskiem na identyfikację trendów fenotypowych i identyfikację wartości odstających.
Jak wspomniano, oba podejścia mierzą ilościowo tylko połowę metabolizmu gospodarza. Aby zinterpretować względną funkcję któregokolwiek z badanych nowych białek, wymagane są dane z obu metod, które dostarczyły dowodów na ich funkcję. Chociaż nie jest to przedmiotem naszego obecnego manuskryptu, dane wyjściowe z każdej metody fenomicznej są poddawane analizom kombinacyjnym, które koncentrują się na technikach grupowania, takich jak analiza lasów losowych i głównych komponentów. Ponadto hipotezy wynikające z połączonej analizy muszą być następnie zweryfikowane za pomocą tradycyjnych metodologii genetycznych.
Wreszcie, przedstawione metody są pod silnym wpływem fizjologii bakterii i dlatego są zgodne z tymi samymi standardami. Podejmując którąkolwiek z tych metod, należy wziąć pod uwagę fakt, że eksperymentuje się z niezależnymi grupami klonów; zapobiega się zanieczyszczeniu; testowana jest pojedyncza zmienna; i równolegle prowadzone są odpowiednie kontrole. Nieuwzględnienie tych punktów spowoduje niejasne wyniki, podobne do każdego testu fizjologicznego.
Płytki do oznaczania wielu fenotypów (MAP)
Opracowanie MAP zapewnia wysoką przepustowość i elastyczność testu w porównaniu z obecnie dostępnymi technologiami (rysunek 5A i tabele 1,2). Test wykorzystuje materiały, sprzęt i podstawowe techniki dostępne we wszystkich laboratoriach mikrobiologicznych. Włączenie potoku obliczeniowego PMAnalyzer24 do późniejszego przetwarzania i analizy danych zapewnia szybką interpretację danych. Ponadto zarówno eksperymentalne, jak i analityczne aspekty podejścia można łatwo dostosować lub dostroić do niestandardowych celów. Na przykład, jeśli duża część danych nie przejdzie filtrowania opisanego w sekcji 4, można ręcznie przesiać krzywe wzrostu, aby zidentyfikować problemy. Jeśli problem pojawi się z powodu rygorystycznych parametrów filtra, można wprowadzić poprawki do skryptu. Alternatywnie, jeśli problemy są związane z procesem eksperymentalnym (np. przedłużona kondensacja, niewłaściwe przenoszenie komórek bakteryjnych itp.), wówczas dodatkowe powtórzenia można łatwo powtórzyć.
Jak opisano w Cuevas i wsp.24, PMAnalyzer jest pojedynczym programem bash napisanym jako skrypt opakowujący, który wykonuje skrypty parsowania i analizy jako spójny, zautomatyzowany potok. Wszystkie skrypty są swobodnie dostępne z repozytorium Git przy 25 , biorąc wartość mediany dla każdego punktu czasowego w trzech danych, a następnie parametryzując krzywą logistyczną w celu uzyskania czasu opóźnienia, maksymalnej szybkości wzrostu, asymptoty i nowego terminu, poziomu wzrostu. W naszym badaniu wartość mediany została wybrana zamiast średniej, aby zmniejszyć wpływ dużych wartości odstających, jednak skrypt można łatwo dostosować do obliczenia średniej danych replikowanych. Ze względu na zmniejszoną zmienność (SE) obserwowaną w powtórzonych danych (Rysunek 2A) utrzymaliśmy użycie mediany w PMAnalyzerze do dopasowania krzywej logistycznej. Ponadto wartość odcięcia wzrostu w tym badaniu (GL ≥ 0,4) została określona poprzez porównanie, w jaki sposób dane rozdzielają się na poziomie wzrostu i maksymalnej stopie wzrostu (rysunek 1A,B). W zależności od zastosowanych instrumentów i modelu systemu, termin ten może się różnić, co wymaga ponownego zdefiniowania tej wartości odcięcia.
Główną zaletą naszego testu jest możliwość porównania fenotypów za pomocą jednego parametru charakteryzującego ogólny wzrost drobnoustrojów, który określamy jako Poziom Wzrostu (GL). Wskaźnik GL jest średnią harmoniczną i dlatego łagodzi skutki dużych wartości odstających w danych. Metodą prób i błędów uzyskano zastosowanie średniej harmonicznej z przesuniętymi wartościami dopasowanymi logistycznie w celu uzyskania podsumowania wzrostu. Inne metody próbujące zróżnicować wzrost obejmowały: czas potrzebny do osiągnięcia określonych parametrów krzywej (połowaμ maksimum, μmaksimum i nośność), współczynnik determinacji (R2) oraz kombinacje R2 pomnożone przez określone parametry krzywej. Użycie średniej harmonicznej z przesuniętymi wartościami dopasowania logistycznego dla GL zapewniło największy zakres oceny wzrostu, dlatego stało się metodą z wyboru. Należy zwrócić uwagę na to, że dynamiczne wzorce krzywych wzrostu mogą zostać utracone w przypadku korzystania z pojedynczego parametru lub dopasowanego modelu. Na przykład poszczególne parametry krzywej logistycznej i GL nie są w stanie odzwierciedlić wzrostu dwufazowego. W środowisku z pojedynczym węglem ten wpływ na wzrost implikuje pośrednictwo białka wirusa w konwersji substratu lub zmianie w wykorzystaniu substratu. Dodatkowe efekty, które mogą zostać utracone w przypadku braku uwzględnienia wielu parametrów wzrostu, obejmują: wydłużony czas opóźnienia, co sugeruje zwiększone obciążenie maszynerią lub produktami wirusowymi; gwałtownie przyspieszająca faza wykładnicza, co sugeruje sprzężenie białek wirusowych ze szlakami produkcji energii gospodarza; lub wyższe poziomy tworzenia biomasy, co sugeruje wsparcie wirusa w pobieraniu składników odżywczych gospodarza i anabolizmie (dane nie pokazane). W związku z tym wykreślenie powstających krzywych wzrostu (rysunek 2A,B) dostarcza informacji dotyczących trendów w czasie, podczas gdy GL uwzględnia główne zmienne modelu logistycznego, dostarczając pojedynczą liczbę ilościową reprezentującą ogólny sukces klonu.
Biorąc pod uwagę różne reakcje zapewniane przez geny strukturalne i metaboliczne w MAP, obserwuje się, że różne klasy substratów, o których mowa, dostarczają największych dowodów na funkcję białek. Na przykład białka metaboliczne są często związane z pozyskiwaniem ograniczających składników odżywczych, które są niespecyficzne dla centralnego metabolizmu gospodarza16,32. Wstępne eksperymenty MAP ujawniają, że klony zawierające przypuszczalne metaboliczne geny fagowe mają zwiększoną fazę opóźnienia, gdy są hodowane na centralnych źródłach węgla metabolicznego (Figura 2A). I odwrotnie, klony przenoszące przypuszczalne geny strukturalne, które wymagają dużych proporcji energii gospodarza i puli dNTP, powodują fałszywie dodatnią odpowiedź na wzrost substratów węglowych centralnego i metabolizmu aminokwasów. Jest to prawdopodobnie spowodowane akumulacją nierozpuszczalnych białek, co prowadzi do filamentacji i / lub inkluzji ciała gospodarza, co zaobserwowano za pomocą mikroskopii (Figura 2A i dane nie pokazane). Chociaż do potwierdzenia tych wstępnych wyników wymagana jest dalsza analiza, MAP są w stanie uzyskać odpowiedzi fenotypowe, które korelują z hipotetycznymi funkcjami określonych klas genów fagowych.
Oprócz wyjaśnienia nieznanych białek wirusowych, MAP są nowym zasobem do badania różnorodności funkcjonalnej i metabolicznej poszczególnych bakterii lub społeczności bakterii. Komponenty MAP są zaprojektowane z myślą o łatwej modyfikacji w celu wspierania wzrostu szeregu bakterii; w tym drobnoustroje morskie, auksotroficzne i beztlenowe. Aby ułatwić te wysiłki, zdefiniowane podłoża podstawowe i przedwzrostowe wymagają dodatkowych lub dostosowanych gatunków chemicznych, zanim inny rodzaj bakterii będzie mógł być wspierany w MAP. Jedną z uwag związanych z tym stosowaniem MAP jest utrzymanie określonych pożywek, zakazując stosowania składników takich jak trypton, ekstrakt drożdżowy i pepton.
Metabolomika
Dziedzina metabolomiki jest zależna od baz danych metabolitów, które obejmują izolowane metabolity identyfikowane za pomocą spektrometrii mas. Wybrana tutaj główna placówka posiada jedną z największych baz danych metabolomicznych. Co ciekawe, ponad połowa metabolitów powstałych w wyniku naszych eksperymentów była niemożliwa do zidentyfikowania (~65%), podczas gdy inne nigdy wcześniej nie zostały zarejestrowane u naszego gospodarza, Escherichia coli (przykłady obejmują: kwas octowy indolo-333, kwas salicylowy34 i kwas dihydroabietynowy35). Fakt ten można przypisać albo silnemu odchyleniu bazy danych w kierunku metabolitów roślinnych, albo konkretnym białkom będącym przedmiotem badań. Niezależnie od tego, wynikiem jest ograniczona liczba znanych metabolitów dostępnych do reprezentacji i analizy danych. W przyszłości wiele metod metabolomicznych wykorzystujących różne bazy danych pozwoli na większe pokrycie metabolitów.
Obecnie zarówno znane, jak i nieznane metabolity są wykorzystywane do porównywania i kontrastowania naszych nowych białek wirusowych. Stosując to podejście, stawiamy hipotezę, że klony zawierające funkcjonalnie podobne białka będą miały zwiększone podobieństwo w swoim pełnym profilu metabolomicznym. Wstępna analiza metabolomiczna wykazała, że chociaż geny strukturalne i metaboliczne nie oddzielają się wyraźnie od siebie, geny wykazujące podobny wpływ na gospodarza w przypadku nadekspresji korelują (ryc. 6). Na przykład, oznaczony adnotacją gen kapsydu grupuje się ściśle z domniemanymi genami metabolicznymi podkreślonymi w tym badaniu, EDT2440 i EDT2441. Badania z wykorzystaniem publicznie dostępnej topologii transbłonowej i programu predykcyjnego peptydów sygnałowych wykazały dowody na to, że oba domniemane geny metaboliczne zawierają pojedynczą domenę transbłonową. Co ciekawe, 5 z 9 klonów w pierwszej grupie klastrów (najbardziej lewa część dendrogramu) przewidywało domeny transbłonowe przy użyciu tego samego programu topologicznego. Potrzebne są dalsze badania, jednak prawdopodobne jest, że metabolity obecne podczas nadekspresji tych klonów są związane z reakcją na stres komórkowy wynikającą z obciążeń błonowych lub strukturalnych. Dowody te potwierdzają, że chociaż dane metabolomiczne zawierają zwiększoną ilość szumu, metoda jest w stanie podkreślić sygnały, które różnicują ogólne efekty genów, zarówno w obrębie klasy genów, jak i w poprzek niej. Aby ustalić, czy metoda jest w stanie wyodrębnić określone informacje o funkcji genów, metabolity pogrupowano w określone szlaki metaboliczne. Hipoteza jest taka, że jeśli klon wpływa na metabolity specyficzne dla pojedynczego szlaku, to gen z nadekspresją jest aktywny w tym szlaku. Przed ustanowieniem naszego procesu zapewniania jakości metabolomiki wstępne dane ujawniły, że nadmierne i niedostatecznie reprezentowane metabolity były zazwyczaj "nieznane", dostarczając niewiele informacji na temat szlaków, z którymi są związane (dane nie pokazane). Wstępnie przetworzone dane metabolomiczne ujawniają jednak, że większość profili metabolitów jest podobna, a tylko wybrana liczba nieznanych i znanych obfitości metabolitów różni się między klonami, na przykład putrescyna i uracyl (Figura 6). Aby zapewnić większą rozdzielczość funkcji białek, podejmowane są wysiłki w celu eksperymentalnego porównania nowych genów fagowych ze znanymi genami fagowymi, które można wykorzystać do wypełnienia "" w charakterystyce funkcjonalnej opartej na metabolitach. Korzystając z tej techniki, przypisana funkcja znanych genów wirusowych stanowi odniesienie dla funkcji nieznanych genów. Niemniej jednak czynnikiem ograniczającym analizę metabolomiczną jest rozmiar i znaczenie bazy danych. Aby skorygować te ograniczenia, należy opracować metabolomiczne bazy danych związane z tymi badaniami; takie jak baza danych metabolitów i ich obfitości specyficznych dla kolekcji ASKA klonów E. coli , w której dochodzi do nadekspresji pojedynczego ORF36. Dowody na potrzebę istnienia takich baz danych zostały dostarczone w 2013 roku, kiedy naukowcy z Lawerence Berkeley National Laboratory skompilowali pierwszą kompleksową bazę danych metabolitów specyficznych dla całych zmutowanych bibliotek bakterii modelowych37. Badania te dostarczyły nowych informacji na temat genów niezbędnych do wykorzystania określonych metabolitów, ujawniając wyraźny związek między fenotypem a genotypem.
Rozważając metabolomikę jako narzędzie, ważne jest, aby określić reżim przetwarzania stosowany w głównym obiekcie. Artefaktem większości procedur eksperymentalnych jest codzienna zmienność związana z instrumentami użycia. Do tej pory we wszystkich analizach GC-MS stosuje się wewnętrzne standardy, które są zawarte w każdym przebiegu analitycznym; Jednak dodanie wewnętrznych próbek specyficznych dla projektu, które były uruchamiane każdego dnia eksperymentów, usuwa dodatkowe odchylenia. Kwestie te należy rozwiązać wcześnie, aby uniknąć problemów z normalizacją i uprzedzeń. Innym rozwiązaniem jest przetwarzanie wszystkich próbek w zakładzie podstawowym na tej samej maszynie i jako pojedynczą partię, co jest opcją dostępną w każdym zakładzie podstawowym.
Różne narzędzia, zarówno przedstawione, jak i ponownie zbadane w tym manuskrypcie, dostarczają nowatorskich środków do badań przesiewowych i charakteryzowania funkcjonalnie nieznanych genów fagów. Prostota i zdolność adaptacji technik eksperymentalnych przy usprawnionym wykorzystaniu potoków obliczeniowych zapewnia, że metody te mają zastosowanie w szerokim zakresie przedsięwzięć badawczych i dziedzin. Naszym celem jest, aby przedstawione tutaj podejścia fenomiczne pomogły w dalszych badaniach nad nowymi białkami fagowymi, a także nad systemami, które są równie funkcjonalnie niezdefiniowane.

Wirusy, które infekują bakterie (a.k.a. bakteriofagi lub fagi) mają na celu więcej niż 1031 cząsteczek wirusopodobnych (VLP) na całym świecie i przewyższają liczebnie wszystkie inne organizmy w środowisku1,2. Pierwsze badanie metagenomiczne badające społeczności wirusów związane ze środowiskiem morskim koncentrowało się na ilościowym określeniu różnorodności obserwowanej we frakcjiwirusa 3. Ponadto Breitbart i współpracownicy odkryli, że ponad 65% sekwencji społeczności wirusów nie miało homologii z żadnymi sekwencjami dostępnymi w publicznych bazach danych. Późniejsze badania metagenomiczne wykazały podobne dowody: metagenomy z osadów morskich w San Diego w Kalifornii zawierają 75% nieznanych sekwencji wirusowych4; metagenomy z hipersolankowych jezior Morza Salton zawierają 98% nieznanych sekwencji wirusowych5; a metagenomy związane z koralowcami zawierają 95 - 98% nieznanych sekwencji wirusowych6. To nagromadzenie nieopatrzonych adnotacjami informacji spowodowało, że materiał genetyczny fagów jest "ciemną materią biologicznego wszechświata"7.
Charakterystyka genomiczna faga polega na identyfikacji podobieństwa sekwencji poprzez porównanie z istniejącymi bazami danych kwasów nukleinowych i białek. Ponieważ informacja genetyczna kodowana przez fagi jest w przeważającej mierze nieznana, metody oparte na homologii są nieskuteczne. W swoim genomie fagi zazwyczaj kodują trzy główne typy genów: geny transkrypcji i replikacji, geny metaboliczne i geny strukturalne. Geny transkrypcji i replikacji (geny klasyI/II 8) obejmują polimerazy, prymazy, endo/egzonukleazy i kinazy. Geny te są wysoce konserwatywne ze względu na ich znaczenie w zakażeniu fagami, transkrypcji i replikacji materiału genetycznego fagów. Polimerazy fagowe są łatwo identyfikowane przy użyciu tradycyjnych metod homologii sekwencji ze względu na ich globalną ochronę9 i wykazano, że służą jako skuteczne markery filogenetyczne10. Natomiast geny metaboliczne i strukturalne fagów (geny klasyII/III 8) są coraz bardziej rozbieżne i często opisywane jako geny hipotetyczne.
Geny metaboliczne fagów wpływają na zdolność metaboliczną gospodarza i niekoniecznie są niezbędne do replikacji wirusa. Geny te, często określane jako pomocnicze geny metaboliczne11 (AMG), wydają się modulować metabolizm gospodarza i umożliwiają optymalny postęp infekcji i powodzenie dojrzewania wirionu. AMG są związane z wykorzystaniem i pobieraniem ograniczających składników odżywczych lub ze szlakami produkcji energii. Niektóre przykłady obejmują geny fotosystemów znajdujące się w genomach różnych cyjanofagów12-16, geny połączone i regulowane przez metabolizm fosforanów17,18 oraz wykorzystanie szlaku pentozofosforanowego do biosyntezy fagów dNTP18,19. Dla porównania, geny strukturalne należą do średnich i późnych genów wytwarzanych podczas infekcji i różnią się w różnych systemach-gospodarz. Produkcja białek strukturalnych zależy od dostępności wirusowego dNTP i pul energii do ich transkrypcji, translacji i składania8. Białka strukturalne kapsydu i włókien ogonowych są uważane za najbardziej rozbieżne ze wszystkich genów kodujących białka wirusa i są niezbędne do pomyślnej produkcji wirionu. Ich rozbieżność jest zwykle przypisywana aktywnej roli, jaką odgrywają w kształtowaniu koewolucji wirus-gospodarz20. Rozbieżne białka, niezależnie od klasy genów, są łatwo pomijane przy użyciu tradycyjnych technik homologii i dopasowania sekwencji. Wysiłki mające na celu skorygowanie ograniczeń obserwowanych przy ścisłych porównaniach sekwencji zaowocowały narzędziami bioinformatycznymi zdolnymi do wykorzystania cech sekwencji do określenia asocjacji, takimi jak sztuczne sieci neuronowe21. Sztuczne sieci neuronowe (ANN) pozwalają na przewidywanie genów strukturalnych i metabolicznych, jednak wymagają dalszej walidacji eksperymentalnej w celu bezpośredniego scharakteryzowania funkcji genów.
Celem tego manuskryptu jest dostarczenie protokołów fenomicznych zdolnych do monitorowania zarówno katabolicznego, jak i anabolicznego metabolizmu bakterii gospodarza podczas ekspresji nowego genu fagowego, funkcjonalnie przewidywanego przez ANNs. Dziedzina fenomiki, biologia związana z fenotypami komórkowymi, jest dobrze ugruntowana w biologii systemowej, aby pomóc w badaniu białek o nieznanej lub plejotropowej funkcji. Narzędzia fenomiczne służą do łączenia informacji fenotypowych z informacjami genotypowymi. Stawiamy hipotezę dla przypuszczalnych genów fagowych, że ich funkcję (funkcje) można określić poprzez obserwację fizjologicznych skutków gospodarza podczas ekspresji genów fagowych. Aby zbadać tę hipotezę, wybrano dwie metody ilościowe. Płytki do oznaczania wielu fenotypów (MAP) wykorzystano do monitorowania wykorzystania substratu gospodarza i późniejszego tworzenia biomasy, podczas gdy metabolomika mierzyła różnorodność metabolitów gospodarza i względną obfitość podczas wzrostu w określonych warunkach środowiskowych. Przypuszczalne białka strukturalne i metaboliczne uległy nadekspresji w Escherichia coli i porównano reprezentatywne wyniki obu eksperymentów. Zaprezentowano liczne techniki wizualne i potoki przetwarzania o wysokiej przepustowości w celu ułatwienia replikacji eksperymentalnej. Na koniec omówiono odtwarzalność i dokładność przedstawionych metod w kontekście oczekiwanych skutków fizjologicznych dla opatrzonego adnotacją białka kapsydu i białka metabolicznego faga, tioredoksyny, oraz dwóch przypuszczalnych AMG.

<table><tbody><tr><td>0,22 &mikro; m Filtr Sterivex</td><td>Fisher Scientific</td><td>SVGP01050</td><td>Millipore</td></tr><tr><td>0,22 i mikro; m Filtry Millex</td><td>Fisher Scientific</td><td>SLGV033RS</td><td>Millipore</td></tr><tr><td>0,22 i mikro; m Filtr SteriCap</td><td>Fisher Scientific</td><td>SCGPS02RE</td><td>Millipore</td></tr><tr><td>0,22 i mikro; m Filtry membranowe Omnipore</td><td>Millipore</td><td>JHWP02500</td><td>Millipore</td></tr><tr><td>96-dołkowe płytki do mikromiareczkowania</td><td>VWR</td><td>82050-764</td><td>Standard F-Bottom 96-dołkowe Mikropłytki</td></tr> 2 <tr><td>ml 96-dołkowe</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Samoprzylepna folia uszczelniająca</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z369667</td><td></td></tr><tr><td>2 L Nalgene kwadratowe</td><td>Cole Parmer</td><td>T-06040-70</td><td></td></tr><tr><td>125 ml Nalgene kwadratowe butelki</td><td>Cole Parmer</td><td>T-06040-50</td><td></td></tr><tr><td>1/4 cala Nakrętka zabezpieczająca do montażu panelowego, nylon</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-45509-04</td><td></td></tr><tr><td>Gwint wewnętrzny Luer do montażu panelowego do 200 Series Barb, 1/16 in.</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-45500-30</td><td></td></tr><tr><td>Żeński gwint Luer do montażu panelowego do zadziorów serii 200, 1/8 cala.</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-45500-34</td><td></td></tr><tr><td>Męski zintegrowany pierścień blokujący Luer do zadzioru serii 500, 1/16 cala. Rurka ID</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-45505-31</td><td></td></tr><tr><td>Męski Luer z pierścieniem blokującym x żeński łącznik Luer</td><td>Cole Parmer</td><td>T-45508-80</td><td></td></tr><tr><td>Złączki grodziowe z zadziorami, 1/4 cala. OD</td><td>Fisher Scientific</td><td>6149-0002</td><td></td></tr><tr><td>Rurka Sanipure, 1/16 cala Identyfikator x 1/8 cala OD</td><td>SaniPure</td><td>AR400002</td><td></td></tr><tr><td>Rurka Sanipure, 1/4 cala OD x 1/8 cala ID</td><td>SaniPure</td><td>AR400007</td><td></td></tr><tr><td>Mini pompa o zmiennym przepływie (pompa perystaltyczna)</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-876-1</td><td></td></tr><tr><td>Mieszadło magnetyczne</td><td>Velp Scientifica</td><td>F203A0160</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-512-141</td><td>Millipore* Kleszcze filtracyjne</td></tr><tr><td>Wielopłytkowy czytnik płytek spektrofotometru</td><td>Analityk urządzeń molekularnych GT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rozdzielacz filtra</td><td>Fisher Scientific</td><td>XX10 025 02</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Oprogramowanie:</td></tr><tr><td>Python wersja 2.7.5</td><td></td><td></td><td><a href="http://www.python.org/" target="_blank">http://www.python.org/</a></td></tr><tr><td>PyLab module</td><td></td><td></td><td><a href="http://wiki.scipy.org/PyLab" target="_blank">http://wiki.scipy.org/PyLab</a></td></tr><tr><td>R wersja 3.0.1</td><td></td><td></td><td><a href="http://www.r-project.org/" target="_blank">http://www.r-project.org/</a></td></tr><tr><td>reshape2 library</td><td></td><td></td><td><a href="http://had.co.nz/reshape" target="_blank">http://had.co.nz/reshape</a></td></tr><tr><td>ggplot2 library</td><td></td><td></td><td><a href="http://ggplot2.org/" target="_blank">http://ggplot2.org/</a></td></tr><tr><td>Gene Composer</td><td>PSI Tech Portal</td><td></td><td><a href="http://www.genecomposer.net" target="_blank">http://www.genecomposer.net</a></td></tr><tr><td colspan="4">Usługi:</td></tr><tr><td>Centrum Metabolomiki Zachodniego Wybrzeża</td><td>UC Davis</td><td></td><td><a href="http://metabolomics.ucdavis.edu/" target="_blank">http://metabolomics.ucdavis.edu</a></td></tr><tr><td>DNA 2.0</td><td></td><td></td><td><a href="https://www.dna20.com" target="_blank">https://www.dna20.com</a></td></tr></tbody></table>

fenomika fagów: fizjologiczne podejścia do charakterystyki nowych białek wirusowych

Phage Phenomics: Physiological Approaches to Characterize Novel Viral Proteins

Obecne badania interakcji między fagami a gospodarzami są zależne od ekstrapolacji wiedzy z (meta)genomów. Co ciekawe, 60 - 95% wszystkich sekwencji fagowych nie ma homologii do obecnych białek opisanych. W rezultacie, duża część genów fagowych jest opisana jako hipotetyczne. Ta rzeczywistość ma duży wpływ na adnotację zarówno strukturalnych, jak i pomocniczych genów metabolicznych. W tym miejscu przedstawiamy metody fenomiczne mające na celu uchwycenie reakcji fizjologicznej wybranego gospodarza podczas ekspresji jednego z tych nieznanych genów fagowych. Płytki do oznaczania wielu fenotypów (MAP) służą do monitorowania różnorodności wykorzystania substratu gospodarza i późniejszego tworzenia biomasy, podczas gdy metabolomika zapewnia analizę produktów ubocznych poprzez monitorowanie obfitości i różnorodności metabolitów. Oba narzędzia są używane jednocześnie w celu zapewnienia profilu fenotypowego związanego z ekspresją pojedynczej przypuszczalnej ramki odczytu otwartego faga (ORF). Porównano reprezentatywne wyniki dla obu metod, podkreślając różnice w profilu fenotypowym gospodarza posiadającego przypuszczalne geny strukturalne lub metaboliczne fagów. Ponadto przedstawiono techniki wizualizacji i wysokowydajne potoki obliczeniowe, które ułatwiły analizę eksperymentalną.

Tutaj prezentujemy fenomiczne podejścia do funkcjonalnej charakterystyki domniemanych genów fagowych. Techniki obejmują opracowany test zdolny do monitorowania metabolizmu anabolicznego gospodarza, płytki do oznaczania wielu fenotypów (MAP), oprócz uznanej metody metabolomiki, zdolnej do pomiaru wpływu na metabolizm kataboliczny.

Fenomika fagów: fizjologiczne podejścia do charakterystyki nowych białek wirusowych

Current investigations into phage-host interactions are dependent on extrapolating knowledge from (meta)genomes. Interestingly, 60 - 95% of all phage ...

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest przesiewanie i charakterystyka genów fagowych o nieznanych funkcjach. W pierwszej kolejności w E. coli ekspresowane są domniemane wirusowe otwarte ramki odczytu, zwane ORF.Klony E. coli wykazujące ekspresję faga Orff są szczepione na płytki do analizy wielofenotypowej lub mapy, które zawierają podłoże wzrostowe oraz różne substraty. Wzrost bakterii jest następnie monitorowany w czasie za pomocą spektrometrii jako drugiej metody analizy; E. coli wykazujące ekspresję genów faga są hodowane w kulturze ciągłej lub metodą seryjnych hodowli okresowych.Powstałe metabolity wzrostu są następnie zbierane i przesyłane do analizy metabolomicznej za pomocą chromatografii gazowej z detekcją spektrometrią mas czasu przelotu. Uzyskane dane pozwalają na stworzenie profilu fenotypowego powiązanego z ekspresją pojedynczej domniemanej otwartej ramki odczytu faga. Metoda ta została pierwotnie opracowana w celu wyjaśnienia funkcji nieznanych białek wirusowych.Można go również zastosować w badaniach analizujących związek między genotypami a fenotypami oraz przy badaniu interakcji między bakteriofagami a gospodarzami w różnych biomach. Rozpocznij tę procedurę od oznakowania sterylnych 96-dołkowych płytek mikrotitracyjnych numerem identyfikacyjnym klonu e coli oraz typem schematu mapy, który wskazuje substraty testowane w analizie. Aseptycznie przelej sterylną wodę do zbiornika z cieczą.Następnie za pomocą pipety wielokanałowej przenieść 60 µL wody do każdej studzienki płytki mikrotyturacyjnej. Następnie aseptycznie przenieść 3X pożywkę bazalną do zbiornika z cieczą. Następnie za pomocą pipety wielokanałowej przenieść 50 µL do każdej studzienki płytki mikrotyturacyjnej.Stosując tę samą technikę, pipetuj 50 µL każdego z mediów podstawowych użytych w schemacie mapy. Następnie przenieś 30 µL każdego substratu do odpowiedniego dołka. Na koniec, używając pipety wielokanałowej, przenieś 10 µL komórek bakteryjnych do każdego dołka.Należy pamiętać o zmianie końcówek przed ponownym zanurzeniem pipety w roztworze macierzystym hodowli. Każdą płytkę należy przykryć samoprzylepną folią do płytek. Folię należy mocno docisnąć nad studzienkami płytki oraz wzdłuż jej krawędzi, aby zapewnić szczelne i równomierne zamknięcie.Za pomocą sterylnej żyletki usuń nadmiar filmu z krawędzi płytki mikrotitracyjnej. Umieść przygotowaną płytkę w tacy wejściowej spektrofotometru wielkopłytkowego. Uruchom oprogramowanie czytnika płytek i utwórz protokół pomiaru absorbancji co 30 minut przez łącznie 32 godziny.Ustawiając czas wstrząsania pomiędzy odczytami na 60 sekund, ustaw temperaturę w urządzeniu na 37°C. Po wyrównaniu temperatury mapy do wartości zadanej, rozpocznij protokół po 32 godzinach, a następnie wyjmij mapę z otworu wyjściowego czytnika płytek. Każdy plik z danymi oznacz numerem identyfikacyjnym e coone, datą oraz typem schematu mapy.Przeanalizuj dane zgodnie z opisem w dołączonym dokumencie, aby ocenić wzrost oraz wzrost istotny biologicznie. Parametry z analizy metabolitów; komórki mogą być hodowane w trybie ciągłym lub w seriach przelewek (batch Turing), aby utrzymać stan stacjonarny.Poniżej zaprezentujemy metodę hodowli ciągłej. Należy wysterylizować elementy reaktora do hodowli ciągłej o pojemności 75 ml oraz butelkę z pożywką o pojemności 2 l zgodnie z opisem w towarzyszącym dokumencie. Po sterylizacji należy umieścić wszystkie materiały z autoklawu w komorze bezpieczeństwa biologicznego i włączyć lampę ultrafioletową na czas chłodzenia pożywki. Po ochłodzeniu pożywki należy dodać 0,1% L-arabinozy oraz 100 µg/ml.Dodaj ampicylinę do 75 milliliters litrów bulionu 0.5 XLB i przenieś go do reaktora ciągłego. Rozpakuj nakrętkę reaktora do hodowli ciągłej i przykręć ją do reaktora. Unikając dotykania rurki pobierczej, rozpakuj nakrętkę butelki z pożywką i przykręć ją do butelki.Należy unikać dotykania rurki pobierającej, zachowując sterylność przyłączonego do portu epsilon odcinka rurki o długości 18 cali. Rozwiń odcinek rurki o długości 18 cali oraz rurkę do pompy perystaltycznej. Dopasuj jeden koniec rurki o długości 18 cali do jednego końca adaptera rurki pompy perystaltycznej, a następnie przymocuj drugi koniec adaptera rurki pompy perystaltycznej do rurki o długości 18 cali.Do portu epsilon zakrętki butelki z pożywką oraz do portów beta i delta reaktora do ciągłej hodowli przymocuj jednostki filtrujące o rozmiarze porów 0,22 µm. Na adapterze portu alfa zamocuj jednostkę filtrującą o rozmiarze porów 0,22 µm. Następnie, w dygestorium biologicznym, podłącz do niej 18-calowy przewód.Zaszczep reaktor do hodowli ciągłej 100 µL nocnej hodowli e coli, przygotowanej zgodnie z opisem w dołączonym dokumencie. Dokręć pokrywy reaktora oraz butelki z pożywką, a następnie przenieś system do inkubatora ustawionego na 37 °C. Wykorzystując mieszadło magnetyczne i miniaturową pompę perystaltyczną, zamontuj adapter rurki w pompie perystaltycznej.Przewód z butelki z pożywką prowadzi do pompy, a następnie do reaktora. Ustaw pompę na tryb szybkiego przepływu, a następnie ją uruchom. Przełącz na bieg w przód, aby upewnić się, że pożywka zaczęła przepływać przez przewód.Umieść reaktor na magnetycznym mieszadle i rozpocznij mieszanie. Pozostaw reaktor do hodowli ciągłej na 24 godziny w celu osiągnięcia stanu równowagi przed pobraniem próbek następnego dnia. Aby pobrać próbkę z hodowli ciągłej, przykręć strzykawkę 5 ml z końcówką Luer-Lock do portu gamma i pobierz 4,5 ml hodowli.Użyj 500 µL hodowli do pomiaru gęstości optycznej przy 600 nm. Następnie wykorzystaj pozostałą część alikwotu do przygotowania czterech hodowli o objętości 1 mL i gęstości OD 600 wynoszącej 0,35 oraz probówek do mikrocentryfugi o pojemności 1,7 mL w celu przygotowania próbek do chromatografii gazowej sprzężonej z spektrometrią mas czasu przelotu (GC-TOFMS). Wirować komórki z prędkością 16 900 ×g przez dwie minuty w celu ich osadzenia.Po odwirowaniu i zlaniu nadsączu, należy przemyć osad 500 µL PBS. Powtórz tę czynność po raz drugi, zlej nadsącz po raz ostatni, a następnie zanurz probówki do mikrocentryfugi zawierające pellet komórek w ciekłym azocie.Do czasu ustania pęcherzykowania przechowuj próbki w zamrażarce w temperaturze -80 °C. Powtarzaj pobieranie próbek co 12 h przez cztery dni po zebraniu wszystkich próbek. Prześlij trzy próbki na klona na suchym lodzie do jednostki metabolomiki w celu przetworzenia próbek, analizy i normalizacji GC-MS w celu uzyskania wirusowych otwartych ramek odczytu.Wodę morską pobrano z wyspy Starbuck oraz z Caroline AOL w południowej części wysp Linii poniżej koralowej warstwy granicznej. Przy użyciu map oceniono wzrost bakteryjny 47 klonów w 72 specyficznych warunkach węglowych. Uzyskane dane wykorzystano następnie do skategoryzowania klonów pod kątem fenotypów: wzrostu oczekiwanego, nabycia funkcji, utraty funkcji oraz braku wzrostu.Aby przetestować hipotezę, że klony zawierające funkcjonalnie podobne białka posiadają określone profile metabolomiczne, określono medianowe poziomy obfitości metabolitów dla 84 klonów hodowanych w kulturze ciągłej przy użyciu GC TOF ms. Uzyskane dane wykorzystano następnie do hierarchicznego grupowania klonów na podstawie ich względnej obfitości metabolitów, którą zasygnalizowano kolorami.Najliczniejsze metabolity zaznaczono kolorem czerwonym, natomiast te o najniższej liczności kolorem ciemnoniebieskim. Wstępna analiza metabolomiczna wykazała, że choć geny strukturalne i metaboliczne nie oddzielają się od siebie w sposób wyraźny, to korelują ze sobą geny wykazujące podobny wpływ na gospodarza. Na przykład, adnotowany gen kapsydu tworzy bliski klaster z domniemanymi genami metabolicznymi wyróżnionymi w niniejszym badaniu; analizy EDT 24 40 oraz EDT 24 41 z wykorzystaniem publicznie dostępnego programu do predykcji topologii błony transmembranowej i peptydów sygnałowych wykazały, że oba domniemane geny metaboliczne posiadają pojedynczą domenę transmembranową.Co ciekawe, pięć z dziewięciu klonów w pierwszej grupie klastrów posiada przewidywane domeny transbłonowe o tej samej topologii. Zbiorczo dane te wskazują, że metoda ta jest w stanie dostarczyć informacji o profilach metabolitów klonów, potencjalnych klonach o powiązanych funkcjach oraz klonach będących wartościami odstającymi pod względem metabolitów. Podczas próby zastosowania tej procedury należy pamiętać, że przedstawione metody są w znacznym stopniu uwarunkowane fizjologią bakterii.Należy podjąć odpowiednie środki, aby zapewnić wykorzystanie niezależnych grup klonalnych w doświadczeniach, zapobiec kontaminacji oraz przetestować pojedynczą zmienną przy zastosowaniu właściwych kontroli.

phage-phenomics-physiological-approaches-to-characterize-novel-viral

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Genomika pojedynczych wirusów (SVG) to metoda izolacji i amplifikacji genomów pojedynczych wirionów. Zawiesiny wirusowe mieszaniny różnych szczepów są sortowane za pomocą cytometrii przepływowej na preparat mikroskopowy z osobnymi studzienkami zawierającymi agarozę, co pozwala na przechwycenie wirionu i ograniczenie fragmentacji genomu podczas dalszej obróbki. Amplifikacja całego genomu jest przeprowadzana za pomocą wielokrotnej amplifikacji z wypieraniem (MDA), w wyniku czego otrzymuje się...

Izolacja i analiza genomu pojedynczych wirionów z wykorzystaniem metody „Single Virus Genomics”

Nowa generacja bezkomórkowych platform transkrypcyjno-translacyjnych została zaprojektowana do budowy systemów biochemicznych in vitro poprzez wykonywanie obwodów genowych. W tym artykule opisujemy, w jaki sposób bakteriofagi, takie jak MS2, ΦΧ174 i T7, są syntetyzowane z ich genomu przy użyciu systemu TXTL wolnego od komórek E. coli.

Synteza zakaźnych bakteriofagów w bezkomórkowym systemie ekspresji opartym na E. coli

Celem tego protokołu jest specyficzne oznaczanie i selektywne izolowanie wirusowego DNA z zakażonych komórek w celu scharakteryzowania białek związanych z genomem wirusa.

Oczyszczanie DNA wirusa w celu identyfikacji powiązanych białek wirusowych i komórkowych

Opisane protokoły pozwalają na budowę, charakterystykę i selekcję (w stosunku do wybranego celu) biblioteki "domenomowej" wykonanej z dowolnego źródła DNA. Jest to możliwe dzięki procesowi badawczemu, który łączy różne technologie: wyświetlanie fagów, składany reporter i sekwencjonowanie nowej generacji z narzędziem internetowym do analizy danych.

Interactome-Seq: Protokół do budowania, walidacji i wyboru bibliotek domenomowych poprzez wyświetlanie fagów i sekwencjonowanie nowej generacji

Ten protokół umożliwia ujawnienie wpływu profagów na ich gospodarzy. Kultury bakteryjne są synchronizowane w warunkach, które najlepiej wspierają stan lizogeniczny, ograniczając spontaniczną indukcję. RT-qPCR jednoznacznie odróżnia geny ograniczone do profagów i te niesprzężone z kontroli fagów od tych, które ulegają ekspresji podczas cyklu replikacji litycznej.

Zrozumienie wpływu bakteriofagów strefy umiarkowanej na ich lizogeny poprzez transkryptomikę

Opisano metodę mikropłytek opartą na gęstości optycznej, która pozwala określić ilościowo długoterminowy wzrost bakterii w obecności bakteriofagów, odpowiednich dla promieniowców i innych wolno rosnących bakterii. Metoda ta obejmuje modyfikacje mające na celu zmniejszenie parowania i kondensacji pokrywy oraz kod R do obliczania wskaźników infekcji wirusowej, w tym obszaru pod krzywą, maksimum wzrostu i względnej zjadliwości.

Dostosowany test mikropłytkowy oparty na gęstości optycznej do charakteryzowania zakażenia promieniowcem

Bakteriofagi (fagi), wirusy infekujące bakterie, są integralnym składnikiem mikrobiomu jelitowego. Chociaż ci symbiotyczni mieszkańcy napędzają sprawność bakterii i dynamikę populacji, niewiele wiadomo o tym, jak wpływają na homeostazę i choroby jelit. W tym protokole bada się izolowane fagi T4 w modelu mysim, które można dostosować do innych par-bakteria.

Interakcja bakteriofaga T4 i E. coli w jelicie myszy: prototypowy model do badania dynamiki gospodarz-bakteriofag in vivo

Tutaj opisujemy nowo opracowany multipleksowy fluorescencyjny test immunologiczny, który wykorzystuje system cytometrii z podwójnym przepływem reporterowym do jednoczesnego wykrywania dwóch unikalnych epitopów białka kolca na nienaruszonych cząsteczkach wirusa SARS-CoV-2 (SARS-CoV-2) zespołu ciężkiej ostrej niewydolności oddechowej, które zostały wychwycone przez mikrosfery magnetyczne sprzężone z enzymem konwertującym angiotensynę.

Profilowanie epitopów białek powierzchniowych na cząsteczkach wirusa za pomocą strategii multipleksu dual-reporter

W tym miejscu opisano metody pobierania próbek ze stref eufotowych ekosystemów morskich i słodkowodnych w celu wyizolowania cyjanofagów (i ich gospodarzy) oraz procesy po pobraniu próbek, które wzbogacają pojedyncze genotypy i charakteryzują dynamikę interakcji wirus-gospodarz.

Pobieranie próbek środowiskowych mikroorganizmów fotosyntetycznych i ich wirusów: od terenu do laboratorium

Virochip to panwirulowa macierz mikroukładów zaprojektowana do jednoczesnego wykrywania wszystkich znanych wirusów, a także nowych wirusów, w oparciu o konserwatywną homologię sekwencji. W niniejszym materiale demonstrujemy, jak przeprowadzić badanie z użyciem Virochip w celu analizy próbek klinicznych pod kątem obecności wirusów znanych i nieznanych.

Wykorzystanie panwirusej macierzy mikroarray (Virochip) do przesiewowego badania próbek klinicznych w kierunku patogenów wirusowych

Poznaj fenomiczne podejścia do charakteryzacji genów fagowych z wykorzystaniem płytek MAP i analizy metabolomicznej w E. coli. Ta metoda pozwala badać funkcje białkowe wirusów i ich wpływ na metabolizm bakteryjny.

Fenomika fagów: fizjologiczne podejścia do charakterystyki nowych białek wirusowych

Przeglądaj więcej filmów