Name: Koimmunoprecypitacja mysiego białka Mx1 z nukleoproteiną wirusa grypy A (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: Poznaj koimmunoprecypitację białka Mx1 z nukleoproteiną wirusa grypy A. Ta metoda pozwala badać interakcje białkowe w komórkach ssaków i analizować mechanizmy antywirusowe.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca była wspierana przez FWO-Vlaanderen, projekt IOF IOF10/StarTT/027 oraz Ghent University Special Research Grant BOF12/GOA/014.

Uwaga: Dla formatu 9 cm szalki Petriego ustanowiono następujący protokół transfekcji i koimmunoprecypitacji. Po przeskalowaniu protokołu możliwe są również inne formaty.
1. Siew ludzkich komórek 293T z embrionalnej nerki (HEK)
<ol>
	<li>Wysiewać HEK293T komórek na dzień przed transfekcją w proporcji 1,2 x 106 komórek na 9 cm szalki Petriego w 12 ml zmodyfikowanej pożywki Eagle's Sole (DMEM) firmy Dulbecco uzupełnionej 10% płodową surowicą cielęcą, 2 mM L-glutaminy, 0,4 mM Na-pirogronianu, 0,1 mM aminokwasów endogennych, 100 U/ml penicyliny i 0,1 mg/ml streptomycyny.</li>
	<li>Hoduj komórki 16 godzin w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
	<li>Przed transfekcją należy wizualnie sprawdzić morfologię i żywotność komórek za pomocą mikroskopu z odwróconym światłem. Komórki muszą być sub-konfluentne, aby uzyskać optymalną wydajność transfekcji.</li>
</ol>
2. Transfekcja fosforanu wapnia HEK293T komórek
Uwaga: Użyj 0,5-1 μg pCAXL-NP lub pustego plazmidu pCAXL w połączeniu z 1-3 μg pCAXL-Mx1 na 9 cm szalkę. Stosować równą ilość całkowitego plazmidowego DNA we wszystkich próbkach; W razie potrzeby dostosować z pustym plazmidem.
<ol>
	<li>Przygotować następujące do transfekcji:
	<ol>
		<li>Przygotować Tris-EDTA (TE) o stężeniach 1,0 mM Tris-HCl pH 8,0 i 0,1 mM EDTA pH 8,0.</li>
		<li>Przygotować BS/HEPES o stężeniach 25 mM HEPES (5,96 g/L, kwas 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowy), 274 mM NaCl (16 g/L), 10 mM KCl (0,74 g/L), 1,5 mM NaHPO4·12H2O (0,5 g/L) i 11,1 mM dekstrozy (2 g/L). Dostosuj pH do 7,05.</li>
		<li>Przygotować CaCl2/HEPES o stężeniach 1,25 M CaCl2·2H2O (183,8 g/L) i 125 mM HEPES (29,79 g/L). Dostosuj pH do 7,05 za pomocą NaOH.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przed użyciem ogrzać transfekcyjne w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Przygotować próbki plazmidu, rozcieńczając plazmidowe DNA w 600 μl TE. Przygotuj te mieszaniny w dołkach na płytce 6-dołkowej.</li>
	<li>Dodać 150 μl CaCl2/HEPES kroplami do próbek plazmidu i wymieszać, pipetując 3 razy w górę i w dół.</li>
	<li>Przygotować roztwór do transfekcji, kroplami, dodając roztwór plazmidu (TE + DNA + CaCl2/HEPES; 750 μl) do 750 μl buforu BS/HEPES dostarczonego na świeżej płytce 6-dołkowej. Rozprowadzić roztwór plazmidu równomiernie w całej studzience zawierającej bufor BS/HEPES.</li>
	<li>Potrząsaj roztworem transfekcji na wytrząsarce płytkowej przez 90 sekund przy 1,000 obr./min.</li>
	<li>Inkubować mieszaninę przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Dodawać kroplami roztwór do transfekcji (1,5 ml) do komórek. Użyj mikropipety P1000, aby wlać roztwór do transfekcji na komórki. Rozprowadź mieszaninę na całej szalce Petriego o średnicy 9 cm i bardzo delikatnie potrząśnij płytką.</li>
	<li>Inkubować komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 6 godzin. Następnie usunąć pożywkę przez aspirację i natychmiast zastąpić ją 12 ml świeżej, wstępnie podgrzanej pożywki. Delikatnie dodaj świeżą pożywkę do komórek, aby zapobiec ich odklejeniu. W tym celu przyłóż końcówkę pipety do boku studzienki i delikatnie wypchnij pożywkę.</li>
	<li>Inkubować komórki przez dodatkowe 16 godzin w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
</ol>
3. Koimmunoprecypitacja
Uwaga: Przeprowadź koimmunoprecypitację 24 godziny po transfekcji.
<ol>
	<li>Przygotowanie buforu do lizy o niskiej zawartości soli i buforu do przemywania o wysokiej zawartości soli.
	<ol>
		<li>Przygotować roztwór podstawowy 2 M N-etylomaleimidu (NEM), ważąc ilość NEM i rozpuszczając go w absolutnym etanolu. Roztwór podstawowy NEM należy przygotować w stanie świeżym przed użyciem. 
		UWAGA: NEM jest bardzo toksyczny, przygotuj i użyj tego roztworu podstawowego w dygestorium.</li>
		<li>Przygotować niskosolny bufor do lizy o stężeniach 50 mM Tris-HCl pH 8, 150 mM NaCl, 5 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA), 1% NP40 i koktajl inhibitorów proteazy (rozpuścić 1 tabletkę w 50 ml buforu do lizy). Dodać NEM do końcowego stężenia 25 mM (tj. rozcieńczyć w stosunku 1:80). Przechowywać na lodzie po dodaniu inhibitorów proteazy i NEM. 
		Uwaga: Zawsze dodawaj inhibitory proteazy i NEM świeżo przed użyciem.</li>
		<li>Przygotować bufor do przemywania o wysokiej zawartości soli o stężeniach 50 mM Tris-HCl pH 8, 500 mM NaCl, 5 mM EDTA i 1% NP40. Należy pamiętać, że bufor do płukania o wysokiej zawartości soli nie zawiera NEM.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie lizatów komórkowych.
	<ol>
		<li>Usuń pożywkę i przemyj komórki 2 ml lodowatego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS). Bardzo delikatnie dodaj bufor do mycia, ponieważ HEK293T komórki łatwo się odłączają.</li>
		<li>Usunąć PBS i dodać 600 μl lodowatego buforu do lizy o niskiej zawartości soli na 9 cm szalkę Petriego.</li>
		<li>Inkubować płytki przez 20 minut na lodzie. Upewnij się, że płytki są trzymane poziomo, aby zapewnić całkowite pokrycie powierzchni płytki buforem do lizy. Delikatnie potrząsaj talerzami co 5 minut.</li>
		<li>Zebrać lizat komórkowy do probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml i wirować przez 3 minuty w temperaturze 4 °C i 16 000 x g w celu osadzenia frakcji nierozpuszczalnej.</li>
		<li>Przenieść frakcję rozpuszczalną, tj. lizat komórkowy, do świeżej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml i przechowywać na lodzie. Natychmiast kontynuuj protokół koimmunoprecypitacji, aby zapobiec dysocjacji oddziałujących białek. Wykonaj wszystkie poniższe czynności w miarę możliwości na lodzie lub w temperaturze 4 °C, aby ograniczyć aktywność proteolityczną w lizatach.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wytwarzanie kompleksów immunologicznych. 
	Uwaga: Na tym etapie interesujące białko jest wiązane przez odpowiednie przeciwciało. Do badania interakcji NP–Mx1 należy użyć mysiego przeciwciała monoklonalnego anty-NP.
	<ol>
		<li>Dla każdej próbki zmieszać 135 μl lizatu z 2 μl przeciwciała monoklonalnego anty-NP i 113 μl buforu do lizy o niskiej zawartości soli (całkowita objętość 250 μl). Pozostały lizat należy przechowywać w temperaturze -20 °C do dalszej analizy, takiej jak western blot, w celu udokumentowania poziomów ekspresji przypuszczalnych partnerów interakcji w transfekowanych komórkach. 
		Uwaga: Alternatywnie, należy zmierzyć stężenie białka w lizacie (np. za pomocą odczynnika Bradforda) i użyć ustalonej ilości białka całkowitego, np. 400 μg, dla każdego lizatu.</li>
		<li>Inkubować mieszaninę przeciwciał i lizatów przez 3 godziny na obracającym się kole w temperaturze 4 °C. Ten etap można rozszerzyć do inkubacji przez noc.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie kulek białkowych G. 
	Uwaga: Kulki białka G są wysyłane i przechowywane w 20% etanolu w celu konserwacji. Zawiesina perełek zwykle składa się w 50% z kulek, które muszą zostać umyte przed użyciem do immunoprecypitacji kompleksów immunologicznych.
	<ol>
		<li>Na każdą próbkę należy użyć 50 μl kulek, tj. 100 μl zawiesiny kulek. Umyj ilość kulek potrzebną dla wszystkich próbek w teście koimmunoprecypitacyjnym w jednej probówce. Odetnij końcówkę końcówki pipety o pojemności 1 ml, aby ułatwić pipetowanie zawiesiny kulkowej.</li>
		<li>Odwirować zawiesinę kulki białkowej G w temperaturze 8 000 x g i temperaturze 4 °C przez 30 sekund. Usunąć roztwór etanolu i dodać równą objętość buforu do lizy o niskiej zawartości soli. Odwirować zawiesinę kulek białkowych G w temperaturze 8 000 x g i temperaturze 4 °C przez 30 sekund i delikatnie usunąć supernatant. Powtórz ten krok prania 3 razy. 
		Uwaga: Bufor do lizy o niskiej zawartości soli używany do płukania kulek nie musi zawierać inhibitorów proteazy ani NEM.</li>
		<li>Oszacuj objętość kulek białka G i dodaj równą objętość buforu do lizy o niskiej soli, aby uzyskać nową 50% zawiesinę kulek w buforze do lizy o niskiej soli.</li>
		<li>Dla każdej próbki przenieść 100 μl zawiesiny perełkowej do świeżej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml i przechowywać na lodzie do czasu użycia. Uważaj, aby ponownie zawiesić zawiesinę koralików przed podziałem, ponieważ kulki te szybko osadzają się na dnie rury.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Immunoprecypitacja kompleksów immunologicznych przez kulki białka G i ich elucja.
	<ol>
		<li>Przed użyciem kulek białka G do immunoprecypitacji należy odwirować wszystkie probówki przez 30 sekund w temperaturze 8 000 x g i temperaturze 4 °C i sprawdzić wzrokowo, czy we wszystkich próbkach znajduje się taka sama ilość kulek. W razie potrzeby dostosować ilość kulek w niektórych próbkach i ponownie odwirować. Odrzucić supernatanty. Uważaj, aby nie naruszyć granulowanych kulek białka G.</li>
		<li>Krótko odwirować kompleksy immunologiczne (tj. lizaty z przeciwciałem, 250 μl) przez 30 sekund w temperaturze 8 000 x g i w temperaturze 4 °C, aby zebrać pełną próbkę na dnie probówki. Przenieś kompleksy immunologiczne do kulek białka G (50 μl).</li>
		<li>Inkubować 60 minut na obracającym się kole w temperaturze 4 °C. Nie inkubuj tych kompleksów immunologicznych dłużej niż 75 minut z kulkami, aby zmniejszyć niespecyficzne wiązanie białek z kulkami białka G.</li>
		<li>Odwirować kulki białka G (ze związanymi kompleksami immunologicznymi) przez 30 sekund w temperaturze 8 000 x g i temperaturze 4 °C i usunąć supernatanty. Uważaj, aby nie naruszyć granulowanych kulek białka G. Opcjonalnie: przechowywać te supernatanty w temperaturze 4 °C lub -20 °C do późniejszej analizy, np. w celu oszacowania ilości niezwiązanego białka.</li>
		<li>Płukać kulki białka G przez około 5 minut 900 μl buforu do lizy o wysokiej zawartości soli. Upewnij się, że kulki są całkowicie zawieszone w buforze myjącym, aby zapewnić optymalne mycie. Odwirować kulki białka G przez 30 sekund w temperaturze 8 000 x g i temperaturze 4 °C i odrzucić supernatanty. Powtórz ten krok prania 4 razy. Należy uważać, aby nie naruszyć granulowanych kulek białka G, aby uniknąć utraty materiału immunoprecypitowanego.</li>
		<li>Po ostatnim etapie płukania dodać 50 μl 2x buforu do próbki Laemmli do kulek i podgrzewać zawiesinę przez 10 minut w temperaturze 95 °C w celu wymycia białek (ko)immunoprecypitowanych.
		<ol>
			<li>Przygotować 10 ml 6 x Laemmli buforu z 1 g dodecylosiarczanu sodu, 3,5 ml glicerolu, 3,5 ml 1 M Tris-HCl pH 6,8 i 420 μl β-merkaptoetanolu. Doprowadzić do całkowitej objętości 10 ml, dodając wodę destylowaną. Rozcieńczyć 3 razy w wodzie destylowanej, aby uzyskać 2x bufor Laemmli. 
			UWAGA: β-merkaptoetanol jest toksyczny, należy przygotować i stosować bufor Laemmli w dygestorium.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Po podgrzaniu odwirować kulki białka G przez 30 sekund przy 8 000 x g i przechowywać próbki w temperaturze 4 °C (krótkotrwale) lub -20 °C (długotrwale).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Analizuj (współ)immunoprecypitowane białka
<ol>
	<li>Wizualizacja białek obecnych w lizacie komórkowym i eluacie koimmunoprecypitacji za pomocą SDS-PAGE20 i western blot21,22. Zazwyczaj połowę eluatu Laemmliego należy załadować na żel. Należy uważać, aby nie naruszyć granulowanych kulek białka G podczas pobierania próbek do ładowania żelem. Ekspresję Mx1 i NP ujawniono za pomocą przeciwciała anty-Mx1 i anty-NP, odpowiednio14. Pasma wykryto za pomocą chemiluminescencji opartej na HRP i wywoływacza filmu rentgenowskiego.</li>
</ol>

<ol><li>Verhelst, J., Hulpiau, P., Saelens, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mx+proteins%3A+antiviral+gatekeepers+that+restrain+the+uninvited%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Mol+Biol+Rev%22%5BJournal%5D)">Mx proteins: antiviral gatekeepers that restrain the uninvited.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 77 (4), 551-566 (2013).</li>
<li>Goujon, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+MX2+is+an+interferon-induced+post-entry+inhibitor+of+HIV-1+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Human MX2 is an interferon-induced post-entry inhibitor of HIV-1 infection.</a> Nature. 502 (7472), 559-562 (2013).</li>
<li>Kane, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MX2+is+an+interferon-induced+inhibitor+of+HIV-1+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">MX2 is an interferon-induced inhibitor of HIV-1 infection.</a> Nature. 502 (7472), 563-566 (2013).</li>
<li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interferon-inducible+MxB+protein+inhibits+HIV-1+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">The interferon-inducible MxB protein inhibits HIV-1 infection.</a> Cell Host Microbe. 14 (4), 398-410 (2013).</li>
<li>Kochs, G., Haller, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon-induced+human+MxA+GTPase+blocks+nuclear+import+of+Thogoto+virus+nucleocapsids%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Interferon-induced human MxA GTPase blocks nuclear import of Thogoto virus nucleocapsids.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (5), 2082-2086 (1999).</li>
<li>Flohr, F., Schneider-Schaulies, S., Haller, O., Kochs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+central+interactive+region+of+human+MxA+GTPase+is+involved+in+GTPase+activation+and+interaction+with+viral+target+structures%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">The central interactive region of human MxA GTPase is involved in GTPase activation and interaction with viral target structures.</a> FEBS Lett. 463 (1-2), 24-28 (1999).</li>
<li>Kochs, G., Haller, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GTP-bound+human+MxA+protein+interacts+with+the+nucleocapsids+of+Thogoto+virus+%28Orthomyxoviridae%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">GTP-bound human MxA protein interacts with the nucleocapsids of Thogoto virus (Orthomyxoviridae).</a> J Biol Chem. 274 (7), 4370-4376 (1999).</li>
<li>Mitchell, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution-guided+identification+of+antiviral+specificity+determinants+in+the+broadly+acting+interferon-induced+innate+immunity+factor+MxA%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Evolution-guided identification of antiviral specificity determinants in the broadly acting interferon-induced innate immunity factor MxA.</a> Cell Host Microbe. 12 (4), 598-604 (2012).</li>
<li>Patzina, C., Haller, O., Kochs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+requirements+for+the+antiviral+activity+of+the+human+MxA+protein+against+Thogoto+and+influenza+A+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Structural requirements for the antiviral activity of the human MxA protein against Thogoto and influenza A virus.</a> J Biol Chem. 289 (9), 6020-6027 (2014).</li>
<li>Turan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+MxA+proteins+form+a+complex+with+influenza+virus+NP+and+inhibit+the+transcription+of+the+engineered+influenza+virus+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Nuclear MxA proteins form a complex with influenza virus NP and inhibit the transcription of the engineered influenza virus genome.</a> Nucleic Acids Res. 32 (2), 643-652 (2004).</li>
<li>Dittmann, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza+A+virus+strains+differ+in+sensitivity+to+the+antiviral+action+of+Mx-GTPase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Influenza A virus strains differ in sensitivity to the antiviral action of Mx-GTPase.</a> J Virol. 82 (7), 3624-3631 (2008).</li>
<li>Zimmermann, P., Manz, B., Haller, O., Schwemmle, M., Kochs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+viral+nucleoprotein+determines+Mx+sensitivity+of+influenza+A+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">The viral nucleoprotein determines Mx sensitivity of influenza A viruses.</a> J Virol. 85 (16), 8133-8140 (2011).</li>
<li>Manz, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pandemic+influenza+A+viruses+escape+from+restriction+by+human+MxA+through+adaptive+mutations+in+the+nucleoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Pandemic influenza A viruses escape from restriction by human MxA through adaptive mutations in the nucleoprotein.</a> PLoS Pathog. 9 (3), e1003279(2013).</li>
<li>Verhelst, J., Parthoens, E., Schepens, B., Fiers, W., Saelens, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon-inducible+protein+Mx1+inhibits+influenza+virus+by+interfering+with+functional+viral+ribonucleoprotein+complex+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Interferon-inducible protein Mx1 inhibits influenza virus by interfering with functional viral ribonucleoprotein complex assembly.</a> J Virol. 86 (24), 13445-13455 (2012).</li>
<li>Brewer, C. F., Riehm, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+possible+nonspecific+reactions+between+N-ethylmaleimide+and+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Evidence for possible nonspecific reactions between N-ethylmaleimide and proteins.</a> Anal Biochem. 18 (2), 248-255 (1967).</li>
<li>Wu, C. Y., Jeng, K. S., Lai, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+SUMOylation+of+matrix+protein+M1+modulates+the+assembly+and+morphogenesis+of+influenza+A+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">The SUMOylation of matrix protein M1 modulates the assembly and morphogenesis of influenza A virus.</a> J Virol. 85 (13), 6618-6628 (2011).</li>
<li>Chen, Z., Zhou, J., Zhang, Y., Bepler, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+the+ribonucleotide+reductase+M1-gemcitabine+interaction+in+vivo+by+N-ethylmaleimide%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Modulation of the ribonucleotide reductase M1-gemcitabine interaction in vivo by N-ethylmaleimide.</a> Biochem Biophys Res Commun. 413 (2), 383-388 (2011).</li>
<li>Rennie, M. L., McKelvie, S. A., Bulloch, E. M., Kingston, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+dimerization+of+human+MxA+promotes+GTP+hydrolysis%2C+resulting+in+a+mechanical+power+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Transient dimerization of human MxA promotes GTP hydrolysis, resulting in a mechanical power stroke.</a> Structure. 22 (10), 1433-1445 (2014).</li>
<li>Gifford, J. L., Walsh, M. P., Vogel, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structures+and+metal-ion-binding+properties+of+the+Ca2%2B-binding+helix-loop-helix+EF-hand+motifs%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Structures and metal-ion-binding properties of the Ca2+-binding helix-loop-helix EF-hand motifs.</a> Biochem J. 405 (2), 199-221 (2007).</li>
<li>Separating Protein with SDS-PAGE. , JoVE. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.jove.com/science-education/5058/separating-protein-with-sds-page">http://www.jove.com/science-education/5058/separating-protein-with-sds-page</a> (2014).</li>
<li>Gallagher, S., Chakavarti, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoblot+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Immunoblot analysis.</a> J Vis Exp. (16), (2008).</li>
<li>Eslami, A., Lujan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Western+blotting%3A+sample+preparation+to+detection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Western blotting: sample preparation to detection.</a> J Vis Exp. (44), (2010).</li>
<li>Pavlovic, J., Haller, O., Staeheli, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+and+mouse+Mx+proteins+inhibit+different+steps+of+the+influenza+virus+multiplication+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Human and mouse Mx proteins inhibit different steps of the influenza virus multiplication cycle.</a> J Virol. 66 (4), 2564-2569 (1992).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Badanie interakcji między białkami przeciwwirusowymi a ich celami wirusowymi jest bardzo ważne dla zrozumienia szczegółów mechanizmu przeciwwirusowego tych białek. Może to dostarczyć nowych informacji na temat współewolucji wirusów i ich gospodarzy oraz stanowić podstawę do opracowania nowych strategii antywirusowych. Opisany tutaj zoptymalizowany protokół koimmunoprecypitacji pozwala na badanie interakcji między mysim białkiem Mx1 a jego celem wirusowym, białkiem NP grypy. Najważniejszym aspektem tego protokołu jest dod...

Białka odporności na myksowirusy (Mx) są ważną częścią wrodzonej obrony immunologicznej przed patogenami wirusowymi. Białka te są dużymi GTPazami podobnymi do dynaminy, które są indukowane przez interferony typu I i III. Odpowiednie geny Mx są obecne u prawie wszystkich kręgowców w jednej lub wielu kopiach, a ich produkty genowe hamują szeroką gamę wirusów, w tym Orthomyxoviridae (np. wirus grypy), Rhabdoviridae (np. wirus pęcherzykowego zapalenia jamy ustnej), Bunyaviridae (np. wirus la crosse) i Retroviridae (np. ludzki wirus niedoboru odporności-1)1-4. Nie jest jasne, w jaki sposób białka te rozpoznają tak szeroki wachlarz wirusów, bez widocznych wspólnych motywów sekwencji pierwszorzędowej w tych wirusach. Analiza interakcji białek Mx z ich celami wirusowymi, potencjalnie obejmujących kompleksy wyższego rzędu z innymi czynnikami komórek gospodarza, pomoże zrozumieć mechanizmy molekularne, które wyewoluowały w wyścigu zbrojeń między wirusami a ich gospodarzami.
Interakcja między białkami Mx ssaków a celami wirusowymi została najdokładniej zbadana dla ludzkiego MxA. Ludzki MxA może hamować replikację wielu wirusów, w tym ortomyksowirusów grypy A i wirusa Thogoto. MxA wiąże kompleksy rybonukleoproteinowe wirusa Thogoto (vRNP), zapobiegając w ten sposób ich wniknięciu do jądra, co skutkuje blokiem infekcji5. Ta interakcja między MxA i wirusem Thogoto vRNP została wykazana w eksperymentach z kosedymentacją i koimmunoprecypitacją6-9. To, w jaki sposób białka Mx hamują wirusy grypy A, jest mniej jasne. Jednym z głównych problemów jest to, że nie jest łatwo wykazać interakcję między białkiem Mx a produktem genu grypy. W jednym z raportów wykazano interakcję między ludzkim MxA a białkiem NP w komórkach zakażonych wirusem grypy A10. Tę interakcję można było wykazać za pomocą koimmunoprecypitacji tylko wtedy, gdy komórki zostały potraktowane odczynnikiem sieciującym dithiobis (propionian sukcynimidylu) przed lizą, co sugeruje, że interakcja jest przejściowa i / lub słaba. Nowsze badania wykazały, że zróżnicowana wrażliwość Mx różnych szczepów grypy A zależy od pochodzenia białka NP11,12. W związku z tym wirusy grypy A mogą częściowo wymykać się spod kontroli Mx poprzez mutację określonych reszt w białku NP13. Sugeruje to, że głównym celem wirusów grypy A dla gospodarza Mx jest białko NP, najprawdopodobniej NP złożone w kompleksy vRNP. Jednak żadne z tych nowszych badań nie wykazało interakcji między NP lub vRNP grypy a ludzkim MxA lub mysim Mx1.
Ostatnio po raz pierwszy pokazaliśmy interakcję między NP grypy a białkiem Mx1 myszy za pomocą zoptymalizowanego protokołu koimmunoprecypitacji14, który jest tutaj szczegółowo opisany. Ogólnie rzecz biorąc, koimmunoprecypitacja jest jednym z najczęściej stosowanych podejść biochemicznych do badania interakcji białko-białko. Technika ta jest często preferowana w stosunku do technik alternatywnych, np. drożdży hybrydowych, ponieważ pozwala badać interakcje białko-białko w ich naturalnym środowisku. Koimmunoprecypitację można przeprowadzić na białkach o endogennej ekspresji, jeśli dostępne są przeciwciała przeciwko białkom będącym przedmiotem zainteresowania. Alternatywnie, interesujące białka mogą ulegać ekspresji w komórce poprzez transfekcję lub infekcję i można użyć znacznika powinowactwa. Oprócz wyżej wymienionych zalet, opisany protokół koimmunoprecypitacji pozwala na wykrycie słabych i/lub przejściowych oddziaływań białek. Głównym składnikiem tego zoptymalizowanego protokołu jest dodanie N-etylomaleimidu (NEM) do buforu do lizy komórek. NEM jest odczynnikiem alkilującym, który reaguje z wolnymi grupami tiolowymi, takimi jak obecne w cysteinach, o pH 6,5-7,5, tworząc stabilny tioester (ryc. 1). Przy wyższym pH NEM może również reagować z grupami aminowymi lub ulegać hydrolizie15. NEM jest zwykle stosowany do blokowania wolnych grup tiolowych, aby zapobiec tworzeniu się wiązań dwusiarczkowych lub zahamować aktywność enzymatyczną. Na przykład NEM jest często używany do blokowania enzymów desumoilujących, którymi są proteazy cysteinowe. W opisanym protokole koimmunoprecypitacji NEM został początkowo włączony do buforu do lizy, ponieważ doniesiono, że sumoilacja białek grypy może wpływać na interakcję między białkami wirusa16. Nieoczekiwanie dodanie NEM okazało się kluczem do udokumentowania interakcji między NP grypy a mysim Mx1 poprzez koimmunoprecypitację. Nie jest jasne, dlaczego dodanie NEM ma kluczowe znaczenie dla wykrycia interakcji NP–Mx1. Możliwe, że interakcja jest zbyt przejściowa i/lub słaba. NEM może stabilizować interakcję, np. poprzez zachowanie specyficznej konformacji Mx1, białka wirusowego lub nawet nieznanego trzeciego składnika. Takie stabilizujące działanie NEM obserwowano już wcześniej, np. w przypadku interakcji między reduktazą rybonukleotydową M1 a jej inhibitorem gemcytabiną (F2dC)17. Zarówno Mx1, jak i NP zawierają wiele reszt cysteiny, które mogą być modyfikowane przez NEM. Na przykład niedawne badanie przeprowadzone przez Rennie i wsp. wykazało, że wariant MxA bez łodygi zawiera trzy reszty cysteiny wystawione na działanie rozpuszczalnika, które mogą być modyfikowane przez jodoacetamid. Mutacja tych reszt do seryny nie wpłynęła na aktywność enzymatyczną MxA, ale zapobiegła agregacji za pośrednictwem dwusiarczku18. Ponieważ te cysteiny są konserwatywne w Mx1, sugeruje to, że analogiczne cysteiny w Mx1 mogą być modyfikowane przez NEM i jako takie wpływają na jego konformację lub rozpuszczalność. Ponadto NEM może również wpływać na aktywność GTPazy Mx1, która jest niezbędna dla aktywności przeciwgrypowej Mx1, a tym samym stabilizować interakcję między Mx1 i NP. Jednak bezpośredni wpływ NEM na aktywność GTPazy Mx1 jest mało prawdopodobny, ponieważ NEM jest również wymagany do wykrycia interakcji między nieaktywnymi mutantami NP grypy i GTPazy białka Mx114. Oczywiste jest, że potrzebne są dalsze badania, aby odkryć wpływ NEM na interakcję NP-Mx1.
Podsumowując, opisany protokół koimmunoprecypitacji pozwala badać interakcję między białkiem przeciwwirusowym Mx1 a jego wirusowym celem, białkiem NP grypy. Protokół ten może być również wykorzystany do badania innych słabych lub przejściowych interakcji, które zależą od stabilizacji określonych konformacji białek. Interakcja białko-białko, która zależy od określonych konformacji, została opisana wcześniej, np. dla białek wiążących wapń, takich jak kalmodulina19. Wreszcie, korzystna rola NEM może być również wykorzystana w innych metodach wykrywania interakcji białko-białko, takich jak testy kosedymentacji.

<table><tbody><tr><td>DMEM wysoki poziom glukozy</td><td>Gibco</td><td>52100-047</td><td></td></tr><tr><td>N-etylomaleimid</td><td>Sigma</td><td>E-3876</td><td>Toksyczny</td></tr><tr><td>Igepal CA-630</td><td>Sigma</td><td>I-30212</td><td>znany również jako NP40</td></tr><tr><td>Koktajl inhibitorów proteazy</td><td>Roche</td><td>11 873 580 001</td><td></td></tr> przeciwciało <tr><td>monoklonalne anty-NP</td><td>NIH Biodefense and Emerging Infections Research Resources Repository</td><td>NR-4282</td><td>wodobrzusze mieszanka klonów A1 i A3</td></tr><tr><td>poliklonalna surowica anty-RNP</td><td>NIH Biodefense and Emerging Infections Research Resources Repository</td><td>NR-3133</td><td>skierowany przeciwko A/Scotland/840/74 (H3N2)</td></tr><tr><td>Protein G Sepharose 4FF</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0618-01</td><td></td></tr><tr><td>Hyperfilm ECL 18 x 24 cm</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9068-36</td><td></td></tr><tr><td>ECL western blot substrate</td><td>Pierce</td><td>Numer katalogowy: 32106</td><td></td></tr></tbody></table>

koimmunoprecypitacja mysiego białka mx1 z nukleoproteiną wirusa grypy a

Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein

Badanie interakcji między białkami jest kluczowe dla zrozumienia ich funkcji. Bardzo potężną metodą, która jest często stosowana do badania interakcji białek z innymi makrocząsteczkami w złożonej próbce, jest koimmunoprecypitacja. Opisany protokół koimmunoprecypitacji pozwala na wykazanie i dalsze badanie interakcji między białkiem oporności na myksowirusy przeciwwirusowe 1 (Mx1) a jednym z jego celów wirusowych, nukleoproteiną wirusa grypy A (NP). Protokół rozpoczyna się od transfekowanych komórek ssaków, ale możliwe jest również użycie komórek zakażonych wirusem grypy A jako materiału wyjściowego. Po lizie komórek wirusowe białko NP jest ściągane w dół za pomocą specyficznego przeciwciała, a powstałe kompleksy immunologiczne są wytrącane za pomocą kulek białka G. Skuteczne obniżenie NP i koimmunoprecypitacja przeciwwirusowego białka Mx1 są następnie ujawniane przez western blot. Warunkiem wstępnym udanej koimmunoprecypitacji Mx1 z NP jest obecność N-etylomaleimidu (NEM) w buforze do lizy komórek. Wolne grupy tiolowe alkilatów NEM. Przypuszczalnie reakcja ta stabilizuje słabą i/lub przejściową interakcję NP–Mx1 poprzez zachowanie specyficznej konformacji Mx1, jego celu wirusowego lub nieznanego trzeciego składnika. Istotnym ograniczeniem eksperymentów z koimmunoprecypitacją jest niezamierzone ściąganie białek zanieczyszczających, spowodowane niespecyficznym wiązaniem białek z kulkami białka G lub przeciwciałami. Dlatego bardzo ważne jest uwzględnienie ustawień kontrolnych, aby wykluczyć wyniki fałszywie dodatnie. Opisany protokół koimmunoprecypitacji może być wykorzystany do badania interakcji białek Mx różnych gatunków kręgowców z białkami wirusowymi, dowolną parą białek lub białka z innymi makrocząsteczkami. Korzystna rola NEM w stabilizacji słabych i/lub przejściowych oddziaływań musi być testowana indywidualnie dla każdej pary interakcji.

N-etylo-malesymid jest związkiem organicznym, który może być wykorzystywany do nieodwracalnej modyfikacji wolnych grup tiolowych, np. w celu inhibicji cysteinowych proteaz (Rycina 1).
Przeciwwirusowe białko Mx1 hamuje replikację wirusa grypy A poprzez oddziaływanie z wirusowym nukleoproteiną. Zoptymalizowany protokół koimmunoprecypitacji opisany w niniejszym opracowaniu pozwala na badanie tej interakcji NP–Mx1. Komórki HEK293T przetransfekowano wektorami ekspresyjnymi...

Ten protokół koimmunoprecypitacji pozwala badać interakcję między nukleoproteiną wirusa grypy A a przeciwwirusowym białkiem Mx1 w komórkach ludzkich. W protokole podkreślono znaczenie N-etylomaleimidu dla skutecznego koimmunoprecypitacji nukleoproteiny Mx1 i wirusa grypy A.

Koimmunoprecypitacja mysiego białka Mx1 z nukleoproteiną wirusa grypy A

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wykazanie interakcji między przeciwwirusowym białkiem MX1 a jego wirusowym celem, białkiem nukleowym wirusa grypy, za pomocą koimmunoprecypitacji. Osiąga się to najpierw poprzez lizę transfekowanych komórek zawierających oba białka w obecności detergentu. W drugim kroku dodaje się przeciwciało specyficzne dla białka nukleowego w celu związania białka nukleowego wirusa grypy oraz oddziałującego z nim białka MX1.Następnie powstałe kompleksy immunologiczne są wytrącane za pomocą kulek z białkiem G, a zanieczyszczające białka są usuwane poprzez wielokrotne przemycia. Ostatnim krokiem jest elucja białka nukleowego grypy oraz współwytrąconego białka MX1 z kulek z białkiem G. W końcowym etapie wykorzystuje się western blotting, aby wykazać oddziaływanie między białkiem nukleowym grypy a przeciwwirusowym białkiem MX1.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak te dwa systemy hybrydowe, jest fakt, że oddziałujące białka znajdują się w ich naturalnym środowisku, którym jest ludzka komórka. Metoda ta może dostarczyć wiedzy na temat oddziaływania między białkiem jądrowym wirusa grypy a przeciwwirusowym białkiem AMX1, ale m

co-immunoprecipitation-mouse-mx1-protein-with-influenza-virus

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Genom wirusa grypy typu A składa się z ośmiu oddzielnych kompleksów RNA i białek, zwanych wirusowymi kompleksami rybonukleoproteinowymi (vRNP). Niniejsza praca opisuje oczyszczanie vRNP wirusa grypy A w gradiencie glicerolu oraz ich wizualizację za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej.

Oczyszczanie i wizualizacja kompleksów rybonukleoprotein wirusa grypy A

Metoda ta opisuje zastosowanie systemu obrazowania opartego na barwnikach w podczerwieni do wykrywania H1N1 w płyku z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego (BAL) zakażonych myszy z wysoką czułością. Metodykę tę można przeprowadzić na płytce 96- lub 384-dołkowej, wymaga ona objętości materiału badawczego &lt;10 μl i umożliwia jednoczesny screening wielu patogenów.

Metoda wysokoprzepustowego wykrywania wirusa grypy

Wirusy grypy replikują swój genom RNA w powiązaniu z chromatyną komórki gospodarza. W niniejszej pracy przedstawiamy metodę oczyszczania nienaruszonych kompleksów wirusowych rybonukleoprotein z chromatyny zainfekowanych komórek. Oczyszczone kompleksy wirusowe można analizować zarówno za pomocą techniki Western blot, jak i metody przedłużania starterów w celu oceny zawartości białek i RNA.

Oczyszczanie powinowactwem kompleksów rybonukleoprotein wirusa grypy z chromatyny zakażonych komórek

Ten film demonstruje immunoprecypitację fragmentów DNA usieciowanych z białkiem docelowym z lizatów neuronów ruchowych pochodzących z komórek macierzystych za pomocą kulek magnetycznych pokrytych przeciwciałem specyficznym dla białka docelowego.

Immunoprecypitacja docelowych kompleksów białko-DNA z lizatu neuronu ruchowego

Istnieje ogólny brak wiedzy na temat działania szczepionek. W tym miejscu proponujemy połączone zastosowanie genetyki odwrotnej i chimerycznych myszy szpiku kostnego w celu uzyskania wglądu we wczesną odpowiedź immunologiczną gospodarza na szczepionki, ze szczególnym uwzględnieniem komórek dendrytycznych i odporności limfocytów T.

Donosowe podawanie rekombinowanych szczepionek przeciw grypie w chimerycznych modelach mysich w celu zbadania odporności błony śluzowej

Ten artykuł opisuje prosty i szybki protokół oceny oligomerycznego stanu białka GTPase MxA podobnego do dynaminy z lizatów komórek ludzkich przy użyciu kombinacji niedenaturującego PAGE z analizą western blot.

Charakterystyka wielopodjednostkowych kompleksów białkowych ludzkiego MxA przy użyciu niedenaturującej elektroforezy żelowej poliakryloamidu

Wirusy grypy typu A (IAV) są ważnymi ludzkimi patogenami układu oddechowego. Aby zrozumieć patogenność wirusów IAV i przeprowadzić badania przedkliniczne nowych metod szczepień, potrzebne są modele zwierzęce naśladujące ludzką fizjologię. W tym miejscu opisujemy techniki oceny patogenezy IAV, odpowiedzi humoralnych i skuteczności szczepionki przy użyciu mysiego modelu infekcji.

Badania wirusa grypy A w mysim modelu infekcji

W tym badaniu prezentujemy protokół do przeprowadzenia dwufotonowego obrazowania intravital i analizy interakcji komórkowych w mysiej błonie śluzowej tchawicy po zakażeniu wirusem grypy. Protokół ten będzie istotny dla naukowców badających dynamikę komórek odpornościowych podczas infekcji dróg oddechowych.

Obrazowanie interakcji komórkowej w błonie śluzowej tchawicy podczas zakażenia wirusem grypy za pomocą dwufotonowej mikroskopii przyżyciowej

Ten artykuł opisuje protokoły oceny odpowiedzi Tfh i GC B w mysim modelu infekcji wirusem grypy.

Ocena komórek pomocniczych pęcherzyków T i odpowiedzi centrum rozrodczego podczas infekcji wirusem grypy A u myszy

Odzyskiwanie wirusów grypy typu A z plazmidowego DNA jest podstawową i niezbędną techniką eksperymentalną, która pozwala badaczom grypy na generowanie wirusów rekombinowanych w celu badania wielu aspektów biologii wirusa grypy, a także do wykorzystania ich jako potencjalnych wektorów lub szczepionek.

Generowanie rekombinowanego wirusa grypy z plazmidowego DNA

Poznaj koimmunoprecypitację białka Mx1 z nukleoproteiną wirusa grypy A. Ta metoda pozwala badać interakcje białkowe w komórkach ssaków i analizować mechanizmy antywirusowe.

Koimmunoprecypitacja mysiego białka Mx1 z nukleoproteiną wirusa grypy A

Przeglądaj więcej filmów