Name: Generowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z zamrożonych płaszczy kożuchowych przy użyciu nieintegrujących plazmidów episomalnych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 52 s
Description: Poznaj metodę generowania indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z zamrożonych płaszczy kożuchowych przy użyciu nieintegrujących plazmidów episomalnych. Protokół ten jest bezwirusowy i opłacalny.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badanie było wspierane przez Ministerstwo Zdrowia i Departament Pomocy Edukacyjnej, Uniwersytet i Badania Autonomicznej Prowincji Bolzano oraz Fundację Południowotyrolskiej Sparkasse.

<ol><li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126 (4), 663-676 (2006).</li>
<li>Takahashi, K., Okita, K., Nakagawa, M., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+fibroblast+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from fibroblast cultures.</a> Nat. Protoc. 2 (12), 3081-3089 (2007).</li>
<li>Drews, K., Jozefczuk, J., Prigione, A., Adjaye, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+induced+pluripotent+stem+cells--from+mechanisms+to+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Med.+%28Berl%29%22%5BJournal%5D)">Human induced pluripotent stem cells--from mechanisms to clinical applications.</a> J. Mol. Med. (Berl). 90 (7), 735-745 (2012).</li>
<li>Bayart, E., Cohen-Haguenauer, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technological+overview+of+iPS+induction+from+human+adult+somatic+cells%29%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Technological overview of iPS induction from human adult somatic cells).</a> Curr. Gene Ther. 13 (2), 73-92 (2013).</li>
<li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131 (5), 861-872 (2007).</li>
<li>Sommer, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+from+peripheral+blood+using+the+STEMCCA+lentiviral+vector%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Generation of human induced pluripotent stem cells from peripheral blood using the STEMCCA lentiviral vector.</a> J. Vis. Exp. (68), e4327(2012).</li>
<li>Zhou, W., Freed, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenoviral+gene+delivery+can+reprogram+human+fibroblasts+to+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Adenoviral gene delivery can reprogram human fibroblasts to induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cells. 27 (11), 2667-2674 (2009).</li>
<li>Lieu, P. T., Fontes, A., Vemuri, M. C., Macarthur, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+with+CytoTune%2C+a+non-integrating+Sendai+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Generation of induced pluripotent stem cells with CytoTune, a non-integrating Sendai virus.</a> Methods Mol. Biol. 997, 45-56 (2013).</li>
<li>Woltjen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((piggyBac+transposition+reprograms+fibroblasts+to+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 458 (7239), 766-770 (2009).</li>
<li>Okita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+more+efficient+method+to+generate+integration-free+human+iPS+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">A more efficient method to generate integration-free human iPS cells.</a> Nat. Methods. 8 (5), 409-412 (2011).</li>
<li>Kim, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+by+direct+delivery+of+reprogramming+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of human induced pluripotent stem cells by direct delivery of reprogramming proteins.</a> Cell. Stem Cell. 4 (6), 472-476 (2009).</li>
<li>Warren, L., Ni, Y., Wang, J., Guo, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feeder-free+derivation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+with+messenger+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Feeder-free derivation of human induced pluripotent stem cells with messenger RNA.</a> Sci. Rep. 2, 657(2012).</li>
<li>Stadtfeld, M., Hochedlinger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotency%3A+history%2C+mechanisms%2C+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotency: history, mechanisms, and applications.</a> Genes Dev. 24 (20), 2239-2263 (2010).</li>
<li>Chou, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+human+iPS+cell+derivation+by+a+non-integrating+plasmid+from+blood+cells+with+unique+epigenetic+and+gene+expression+signatures%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Efficient human iPS cell derivation by a non-integrating plasmid from blood cells with unique epigenetic and gene expression signatures.</a> Cell Res. 21 (3), 518-529 (2011).</li>
<li>Kim, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+arrhythmogenic+right+ventricular+dysplasia+with+patient-specific+iPSCs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Studying arrhythmogenic right ventricular dysplasia with patient-specific iPSCs.</a> Nature. 494 (7435), 105-110 (2013).</li>
<li>Aasen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+rapid+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+human+keratinocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes.</a> Nat. Biotechnol. 26 (11), 1276-1284 (2008).</li>
<li>Streckfuss-Bomeke, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+study+of+human-induced+pluripotent+stem+cells+derived+from+bone+marrow+cells%2C+hair+keratinocytes%2C+and+skin+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+Heart+J%22%5BJournal%5D)">Comparative study of human-induced pluripotent stem cells derived from bone marrow cells, hair keratinocytes, and skin fibroblasts.</a> Eur. Heart J. 34 (33), 2618-2629 (2013).</li>
<li>Miyoshi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+mouse+and+human+cells+to+pluripotency+using+mature+microRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of mouse and human cells to pluripotency using mature microRNAs.</a> Cell. Stem Cell. 8 (6), 633-638 (2011).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells+from+human+hair+follicle+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell.+Rev%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells from human hair follicle mesenchymal stem cells.</a> Stem Cell. Rev. 9 (4), 451-460 (2013).</li>
<li>Beltrao-Braga, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feeder-free+derivation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+human+immature+dental+pulp+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">Feeder-free derivation of induced pluripotent stem cells from human immature dental pulp stem cells.</a> Cell Transplant. 20 (11-12), 1707-1719 (2011).</li>
<li>Haase, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+human+cord+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of induced pluripotent stem cells from human cord blood.</a> Cell. Stem Cell. 5 (4), 434-441 (2009).</li>
<li>Dowey, S. N., Huang, X., Chou, B. K., Ye, Z., Cheng, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+integration-free+human+induced+pluripotent+stem+cells+from+postnatal+blood+mononuclear+cells+by+plasmid+vector+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generation of integration-free human induced pluripotent stem cells from postnatal blood mononuclear cells by plasmid vector expression.</a> Nat. Protoc. 7 (11), 2013-2021 (2012).</li>
<li>Staerk, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+human+peripheral+blood+cells+to+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of human peripheral blood cells to induced pluripotent stem cells.</a> Cell. Stem Cell. 7 (1), 20-24 (2010).</li>
<li>Geti, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+and+efficient+cellular+substrate+for+the+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+adults%3A+blood-derived+endothelial+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">A practical and efficient cellular substrate for the generation of induced pluripotent stem cells from adults: blood-derived endothelial progenitor cells.</a> Stem Cells Transl. Med. 1 (12), 855-865 (2012).</li>
<li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypan+blue+exclusion+test+of+cell+viability%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">Trypan blue exclusion test of cell viability.</a> Curr Protoc Immunol. , Appendix 3-Appendix 3B (2001).</li>
<li>Hasegawa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+reprogramming+efficiency+between+transduction+of+reprogramming+factors%2C+cell-cell+fusion%2C+and+cytoplast+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Comparison of reprogramming efficiency between transduction of reprogramming factors, cell-cell fusion, and cytoplast fusion.</a> Stem Cells. 28 (8), 1338-1348 (2010).</li>
<li>Desjardins, P., Conklin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NanoDrop+microvolume+quantitation+of+nucleic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids.</a> J Vis Exp. (45), 2565(2010).</li>
<li>Fleige, S., Pfaffl, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+integrity+and+the+effect+on+the+real-time+qRT-PCR+performance%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Aspects+Med%22%5BJournal%5D)">RNA integrity and the effect on the real-time qRT-PCR performance.</a> Mol Aspects Med. 27 (2-3), 126-129 (2006).</li>
<li>Meraviglia, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+chorionic+villus+mesenchymal+stromal+cells+reveal+strong+endothelial+conversion+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Human chorionic villus mesenchymal stromal cells reveal strong endothelial conversion properties.</a> Differentiation. 83 (5), 260-270 (2012).</li>
<li>Caspersson, T., Zech, L., Johansson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+human+metaphase+chromosome+set+by+aid+of+DNA-binding+fluorescent+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Analysis of human metaphase chromosome set by aid of DNA-binding fluorescent agents.</a> Exp Cell Res. 253 (2), 302-304 (1999).</li>
<li>Alikani, M., Munne, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonviable+human+pre-implantation+embryos+as+a+source+of+stem+cells+for+research+and+potential+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell.+Rev%22%5BJournal%5D)">Nonviable human pre-implantation embryos as a source of stem cells for research and potential therapy.</a> Stem Cell. Rev. 1 (4), 337-343 (2005).</li>
<li>Tropel, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+derivation+of+human+embryonic+stem+cell+lines+following+pre-implantation+genetic+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cell.+Dev.+Biol.+Anim%22%5BJournal%5D)">High-efficiency derivation of human embryonic stem cell lines following pre-implantation genetic diagnosis.</a> In Vitro Cell. Dev. Biol. Anim. 46 (3-4), 376-385 (2010).</li>
<li>Hanna, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+cell+reprogramming+is+a+stochastic+process+amenable+to+acceleration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Direct cell reprogramming is a stochastic process amenable to acceleration.</a> Nature. 462 (72-73), 595-601 (2009).</li>
<li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ink4%2FArf+locus+is+a+barrier+for+iPS+cell+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The Ink4/Arf locus is a barrier for iPS cell reprogramming.</a> Nature. 460 (7259), 1136-1139 (2009).</li>
<li>Kim, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+memory+in+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Epigenetic memory in induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 467 (7313), 285-290 (2010).</li>
<li>Lindner, S. E., Sugden, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+plasmid+replicon+of+Epstein-Barr+virus%3A+mechanistic+insights+into+efficient%2C+licensed%2C+extrachromosomal+replication+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Plasmid%22%5BJournal%5D)">The plasmid replicon of Epstein-Barr virus: mechanistic insights into efficient, licensed, extrachromosomal replication in human cells.</a> Plasmid. 58 (1), 1-12 (2007).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W przeszłości jedynym sposobem na uzyskanie ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych niosących określoną mutację genetyczną była rekrutacja rodziców poddawanych preimplantacyjnej diagnostyce genetycznej i generowanie embrionalnych komórek macierzystych z ich odrzuconych blastocyst31,32. Korzystając z podejścia opartego na przeprogramowaniu, naukowcy mogą teraz generować iPSC od pacjentów będących nosicielami praktycznie dowolnego genotypu. Możliwość rozpoczęcia od specyficznej dla pacjenta linii komór...

W 2006 roku grupa Shinya Yamanaka1 po raz pierwszy zademonstrowała, że komórki somatyczne od dorosłych myszy i ludzi mogą zostać przekształcone w stan pluripotencjalny poprzez ektopową ekspresję czterech czynników przeprogramowujących (Oct-4, Sox-2, Klf-4 i c-Myc), generując tak zwane Indukowane Pluripotencjalne Komórki Macierzyste (iPSC)2. Specyficzne dla pacjenta iPSC są bardzo podobne do ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC) pod względem morfologii, proliferacji i zdolności do różnicowania się w trzy typy komórek rozrodczych (mezodermę, endodermę i ektodermę), a jednocześnie nie mają obaw etycznych związanych ze stosowaniem hESC i omijaniem ewentualnego odrzucenia immunologicznego3. W związku z tym iPSC wydają się być jednym z najważniejszych źródeł komórek specyficznych dla pacjenta do badań podstawowych, badań przesiewowych leków, modelowania chorób, oceny toksyczności i celów medycyny regeneracyjnej4.
Do generowania iPSC zastosowano kilka podejść: wektory integrujące wirusa (retrowirus5, lentiwirus6), wektory nieintegrujące wirusa (adenowirus7), wirus Sendai8, transpozony BAC9, wektory epizodyczne10, białka11 lub dostarczanie RNA12. Chociaż zastosowanie metod za pośrednictwem wirusa może prowadzić do przeprogramowania o wysokiej wydajności, wektory wirusowe integrują się z genomem komórek gospodarza, a zatem nie można wykluczyć potencjalnej losowej mutagenezy insercyjnej, trwałej zmiany ekspresji genów i reaktywacji wyciszonych transgenów podczas różnicowania13.
Aby uczynić iPSC bezpieczniejszymi dla medycyny regeneracyjnej, podjęto wysiłki w celu uzyskania iPSC bez integracji egzogennego DNA z genomami komórkowymi. Chociaż opracowano wektory wirusowe i transpozony podlegające akcyzie, nadal nie jest jasne, czy krótkie sekwencje wektorów, które nieuchronnie pozostają w transdukowanych komórkach po wycięciu i ekspresji transpozazy, mogą wywołać zmiany w funkcji komórkowej13. Pomimo wysokiej wydajności przeprogramowywania, wirus Sendai stanowi kosztowne podejście, a problemy z uzyskaniem licencji w firmie, która opracowała ten system, mogą potencjalnie ograniczyć jego zastosowanie w badaniach translacyjnych. Co więcej, potrzeba bezpośredniego wprowadzania białek i RNA wymaga wielokrotnego dostarczania cząsteczek przeprogramowujących z nieodłącznymi ograniczeniami technicznymi, które to wprowadza, a ogólna wydajność przeprogramowania jest bardzoniska14. Warto zauważyć, że z powodzeniem opisano opłacalne, wolne od wirusów i nieintegrujące się metody oparte na wykorzystaniu plazmidów episomalnych do przeprogramowania fibroblastów skóry15. W szczególności w niniejszej pracy zdecydowaliśmy się użyć dostępnych komercyjnie plazmidów episomalnych wolnych od integracji, jak wcześniej informowano10,15.
Do tej pory fibroblasty skóry reprezentują najpopularniejszy typ komórek dawcy5. Jednak inne źródła komórek zostały z powodzeniem przeprogramowane w iPSC, w tym keratynocyty16, mezenchymalne komórki macierzyste szpiku kostnego17, komórki zrębu tłuszczowego18, mieszki włosowe19 i komórki miazgi zębowej20. Izolacja tych komórek wymaga zabiegów chirurgicznych, a do ekspansji komórek in vitro potrzeba kilku tygodni w celu ustanowienia pierwotnej hodowli komórkowej.
W tym świetle, wybór początkowego typu komórki jest krytyczny i równie ważne jest możliwość produkcji iPSC z łatwo dostępnych i mniej inwazyjnych tkanek, takich jak krew. Zarówno komórki jednojądrzaste krwi pępowinowej (CBMNC)21,22, jak i komórki jednojądrzaste krwi obwodowej (PBMNC)14,22-24 stanowią odpowiednie źródła komórek do wyprowadzania iPSC.
Chociaż skuteczność przeprogramowania dorosłych PBMNC jest 20-50 razy niższa niż w przypadku CBMNC22, pozostają one najwygodniejszym typem komórek do celów próbkowania. W rzeczywistości próbkowanie PBMNC ma tę zaletę, że jest minimalnie inwazyjne, a ponadto komórki te nie wymagają rozległej ekspansji in vitro przed eksperymentami z przeprogramowaniem. Do tej pory różne protokoły donosiły, że PBMNC po separacji gradientu gęstości mogą być zamrażane i rozmrażane od kilku miesięcy po zamrożeniu i rozpędzane przez kilka dni przed przeprogramowaniem do iPSC22,23. Niemniej jednak, o ile nam wiadomo, żadne raporty nie opisywały przeprogramowania PBMNC z mrożonych kożuchów. Co ważne, zamrożone kożuchy pobrane bez separacji gradientu gęstości stanowią najczęstsze próbki krwi przechowywane w dużych biobankach z badań populacyjnych, stanowiąc w ten sposób łatwo dostępną pulę materiału do produkcji iPSC, która pozwala uniknąć dalszego pobierania próbek.
Tutaj po raz pierwszy przedstawiamy generację wolnych od wirusów iPSC z ludzkich mrożonych kożuchów, w oparciu o wcześniej opisany protokół22. Ponadto iPSC wygenerowano z zamrożonych PBMNC uzyskanych po separacji gradientu gęstości, jako protokół kontrolny dla wyników PBMNC oczyszczonych w gradinie bez gęstości.

<table><tbody><tr><td>Plastikowa rurka Venosafe buforowana cytrynianem sodu</td><td>Terumo</td><td>VF-054SBCS07</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek amodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9434</td><td></td></tr><tr><td>Wodorowęglan potasu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60339</td><td></td></tr><tr><td>EDTA disodowy proszek</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5134</td><td>0,5 M roztwór</td></tr><tr><td>Ficoll-Paque Premium&nbsp;</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-5442-02</td><td>Roztwór polisacharozy do wirowania w gradicynie gradientu gęstości</td></tr><tr><td>Zmodyfikowana pożywka Dulbecco firmy Iscove (IMDM)&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>21056-023</td><td>Bez czerwonego fenolu</td></tr><tr><td>Ham's F-12</td><td>Mediatech</td><td>10-080-CV</td><td></td></tr><tr><td>Insulina-Transferyna-Selen-Etanoloamina (ITS -X)</td><td>Gibco</td><td>51500-056&nbsp;</td><td>1X (Standard: 100X)</td></tr><tr><td>Chemicznie zdefiniowany koncentrat lipidowy</td><td>Gibco</td><td>11905031</td><td>1X (Stock: 100X)</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>Kwas L-askorbinowy 2-fosforan sól seskwimagnezowa hydrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8960</td><td></td></tr><tr><td>1-tioglicerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6145</td><td>Końcowe stężenie przy 200 &mikro; </td></tr><tr><td>M Rekombinowany czynnik ludzkich komórek macierzystych (SCF)</td><td>PeproTech</td><td>300-07</td><td>100 ng / ml (Magazyn: 100 &mikro; g/ml)&nbsp;</td></tr><tr><td>Rekombinowana ludzka interleukina-3 (IL-3)</td><td>PeproTech</td><td>200-03</td><td>10 ng/ml (Magazyn: 10 &mikro; g / ml)</td></tr> <tr><td>Rekombinowany ludzki insulinopodobny czynnik wzrostu (IGF-1)</td> <td>PeproTech</td><td>100-11</td><td>40 ng / ml (Magazyn: 40 i mikro; g/ml)</td></tr><tr><td>Rekombinowana ludzka erytropoetyna (EPO)</td><td>R& D Systems&nbsp;</td><td>287-TC-500</td><td>2 U/ml (Stan magazynowy: 50 U/ml)</td></tr><tr><td>Deksametazon&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2915</td><td>1 &mu; M (Stock: 1 mM)</td></tr><tr><td>Ludzka holo-transferyna</td><td>R& D Systems&nbsp;</td><td>2914-HT</td><td>100 &mu; g/ml (Podstawa: 20 mg/ml)</td></tr><tr><td>Amniomax II</td><td>Gibco</td><td>11269016</td><td>Pożywka do analizy cytogenetycznej</td></tr><tr><td>mTeSR1</td><td>StemCell Technologies</td><td>5850</td><td>Pożywka do hodowli iPSC bez karmnika</td></tr><tr><td>Nokaut DMEM</td><td>Gibco</td><td>10829-018</td><td></td></tr><tr><td>Zamiennik surowicy nokautującej</td><td>Gibco</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina (200 mM)</td><td>Gibco</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>MEM Roztwór aminokwasów endogennych (100X)</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>31350-010</td><td>0,1 mM (Magazyn: 50 mM)</td></tr><tr><td>Maślan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B5887</td><td>0,25 mM (Magazyn: 0,5 m)</td></tr><tr><td>Rekombinowany ludzki FGF zasadowy, 145 aa&nbsp;</td><td>R& D Systems&nbsp;</td><td>4114-TC</td><td>10 ng/ml (Stan magazynowy: 10 &mikro; g/ml)</td></tr><tr><td>Y-27632 dichlorowodorek</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y0503&nbsp;</td><td>10 &mikro; M (Magazyn: 10 mM)</td></tr><tr><td>Zdefiniowana przez płód surowica bydlęca</td><td>Hyclon</td><td>SH 30070.03</td><td></td></tr><tr><td>EmbryoMax 0,1% roztwór żelatyny</td><td>Merck-Millipore</td><td>ES-006-B</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel Matryca błony podstawnej Zredukowany czynnik wzrostu</td><td>BD Biosciences</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza, typ IV</td><td>Gibco</td><td>17104-019</td><td>1 mg / ml (Magazyn: 10 mg / ml)</td></tr> <tr><td>Accutase</td><td>PAA Laboratories GmbH</td><td>L11-007</td><td>Roztwór do odłączania komórek</td></tr><tr><td>Mysi fibroblast embrionalny (CF1)</td><td>Global Stem</td><td>GSC-6201G</td><td>1*106 cells/płytka 6-dołkowa</td></tr><tr><td>Plazmid pCXLE-hOCT3/4-shp53-F</td><td>Addgene&nbsp;</td><td>27077</td><td>1 &mikro; g (Magazyn: 1 i mikro; g/&mikro; l)</td></tr><tr><td>Plazmid pCXLE-hSK</td><td>Addgene&nbsp;</td><td>27078</td><td>1 &mikro; g (Magazyn: 1 i mikro; g/&mikro; l)</td></tr><tr><td>Plazmid pCXLE-hUL</td><td>Addgene&nbsp;</td><td>27080</td><td>1 &mikro; g (Magazyn: 1 i mikro; g/&mikro; l)</td></tr><tr><td>Plazmid pCXLE-EGFP</td><td>Addgene&nbsp;</td><td>27082</td><td>1 &mikro; g (Magazyn: 1 i mikro; g/&mikro; l)</td></tr> <tr><td>Zestaw do barwienia fosfatazy alkalicznej</td><td>Stemgent</td><td>00-0009</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-swoistego antygenu embrionalnego 4 (SSEA-4)</td><td>Przeciwciało Merck-Millipore</td><td>MAB4304</td><td>1/250</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-TRA-1-60</td><td>Merck-Millipore</td><td>MAB4360</td><td>1/250</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-TRA-1-81</td><td>Merck-Millipore</td><td>MAB4381</td><td>1/250</td></tr><tr><td>Anti-Oct-3/4</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-9081</td><td>1/500</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-Nanog</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-33759</td><td>1/500</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-troponiny I</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-15368</td><td>1/500</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-&alfa;-aktyninowe (sarkomeryczne)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7732</td><td>1/250</td></tr><tr><td>Neuronalna klasa III &szlig;-tubulina (TUJ1)</td><td>Przeciwciało Covance Produkty badawcze Inc&nbsp;</td><td>MMS-435P-100</td><td>1/500</td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciw hydroksylazie tyrozynowej (TH)</td><td>Calbiochem</td><td>657012</td><td>1/200</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Koza Anty-Mysz&nbsp;</td><td>Sondy molekularne</td><td>A-11029</td><td>1/1000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 Kozie sondy</td><td>molekularne</td> przeciw królikom <td>A-21429</td><td>1/1000</td></tr><tr><td>Ultra-Low Attachment Cell Culture 6-dołkowa płytka</td><td>Corning</td><td>3471</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Odczynnik Ambion</td><td>15596-018&nbsp;</td><td>odczynnik do ekstrakcji RNA</td></tr><tr><td>SuperScript VILO Zestaw do syntezy cDNA</td><td>Invitrogen</td><td>11754050</td><td>Zestaw do odwrotnej transkryptazy</td></tr><tr><td>iTaq Uniwersalny SYBR Green Supermix</td><td>Bio-Rad</td><td>172-5124</td><td></td></tr><tr><td>CFX96 System wykrywania PCR w czasie rzeczywistym</td><td>Bio-Rad</td><td>185-5195</td><td></td></tr><tr><td>Automatyczny system elektroforezy Experion</td><td>Bio-Rad</td><td>700-7000</td><td>Przyrząd do sprawdzania integralności RNA</td></tr><tr><td>Experion RNA Zestaw do analizy Highsense</td> Zestaw odczynników <td>Bio-Rad</td><td>7007105</td><td>do sprawdzania integralności RNA</td></tr><tr><td>Mikroskop preparacyjny (SteREO Discovery V12)</td> <td>Zeiss</td><td>495007</td><td></td></tr><tr><td>NeonTransfection System 100 &micro; l Zestaw</td><td>odczynników Invitrogen</td><td>MPK10025</td><td>do elektroporacji</td></tr><tr><td>System transfekcji neonowej</td><td>Invitrogen</td><td>MPK5000</td><td>Przyrząd do elektroporacji</td></tr><tr><td>Spektrofotometr NanoDrop UV/Vis</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-2000</td><td>Przyrząd do kwantyfikacji DNA/RNA</td></tr><tr><td>EndoFree Plasmid Maxi Kit</td><td>Qiagen</td><td>12362</td><td>Zestaw do oczyszczania plazmidu</td></tr></tbody></table>

generowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z zamrożonych płaszczy kożuchowych przy użyciu nieintegrujących plazmidów episomalnych

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Frozen Buffy Coats using Non-integrating Episomal Plasmids

Komórki somatyczne mogą być przeprogramowane w indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) poprzez wymuszenie ekspresji czterech czynników transkrypcyjnych (Oct-4, Sox-2, Klf-4 i c-Myc), zazwyczaj wyrażanych przez ludzkie embrionalne komórki macierzyste (hESC). Ze względu na podobieństwo do komórek macierzystych (hESC), komórki iPS stały się ważnym narzędziem w potencjalnej medycynie regeneracyjnej specyficznej dla pacjenta, unikając problemów etycznych związanych z ludzkimi zarodkowymi komórkami macierzystymi. Aby uzyskać komórki nadające się do zastosowania klinicznego, należy wygenerować iPSC wolne od transgenów, aby uniknąć reaktywacji transgenu, zmienionej ekspresji genów i błędnego różnicowania. Co więcej, wysoce wydajna i niedroga metoda przeprogramowania jest niezbędna do uzyskania wystarczającej ilości iPSC do celów terapeutycznych. Biorąc pod uwagę tę potrzebę, preferowanym wyborem do oznaczania iPSC jest skuteczne podejście oparte na plazmidzie nieintegrującym się z episomalnym plazmidem. Obecnie najczęstszym typem komórek wykorzystywanym do celów przeprogramowania są fibroblasty, których izolacja wymaga biopsji tkanki, czyli inwazyjnego zabiegu chirurgicznego pacjenta. Dlatego ludzka krew obwodowa stanowi najbardziej dostępną i najmniej inwazyjną tkankę do wytwarzania iPSC.
W tym badaniu, ekonomiczny i wolny od wirusów protokół wykorzystujący nieintegrujące plazmidy episomalne jest raportowany do generowania iPSC z ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMNC) uzyskanych z zamrożonych kożuchów po odwirowaniu krwi pełnej i bez separacji gradientu gęstości.

W niniejszym badaniu przedstawiono prosty i skuteczny protokół generowania wolnych od wirusów iPSC poprzez reprogramowanie PBMNC wyizolowanych z mrożonych warstw leukocytarnych (buffy coats) po wirowaniu krwi pełnej oraz porównano go z reprogramowaniem PBMNC uzyskanych po separacji w gradiencie gęstości. Rysunek 1A przedstawia schematyczny przebieg szczegółowego protokołu. Po rozmrożeniu wyizolowane PBMNC, wykazujące typowy zaokrąglony kształt, są namnażane w specyficznej pożywce do hodowli krwi przez 14...

Indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) stanowią źródło tkanek specyficznych dla pacjenta do zastosowań klinicznych i badań podstawowych. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół przeprogramowania ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMNC) uzyskanych z zamrożonych kożuchów w wolne od wirusa iPSC przy użyciu nieintegrujących plazmidów episomalnych.

Generowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z zamrożonych płaszczy kożuchowych przy użyciu nieintegrujących plazmidów episomalnych

Somatic cells can be reprogrammed into induced pluripotent stem cells (iPSCs) by forcing the expression of four transcription factors (Oct-4, Sox-2, ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest generowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z ludzkich mononuklearnych komórek krwi obwodowej uzyskanych z zamrożonych warstw leukocytarnych (buffy coats) przy użyciu kosztowo efektywnego i wolnego od wirusów protokołu. Jest to osiągane najpierw poprzez izolację PB MNCs z warstw leukocytarnych po wirowaniu krwi pełnej bez zastosowania gradientu gęstości, a następnie poprzez ich namnażanie w specyficznej pożywce do hodowli krwi. Drugim krokiem jest transfekcja PB MNCs z warstw leukocytarnych plazmidami episomalnymi za pomocą elektroporacji.Następnie przetransfekowane PB MNC wysiewa się na świeże komórki zasilające z fibroblastów embrionalnych myszy. Ostatnim krokiem jest ręczne wyselekcjonowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z hodowli i przeniesienie ich na nowe płytki z komórkami zasilającymi w celu ekspansji. Ostatecznie efektywne przeprogramowanie PB MNC w indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste o typowej ludzkiej morfologii można wykazać za pomocą immunofluorescencji oraz pomiaru ekspresji genów.Główną zaletą tej techniki w stosunku do istniejących metod jest to, że regeneracja wolnych od wirusów IPC z zamrożonych OTs zmniejsza koszty, czas pracy oraz liczbę czynności manualnych wykonywanych przez operatorów podczas przetwarzania próbek. Kolejną zaletą tej techniki jest możliwość wykorzystania zamrożonych OTs przechowywanych w dużych biobankach zgromadzonych w ramach badań populacyjnych jako materiału wyjściowego do produkcji IPS. Należy rozpocząć od pobrania ośmiu mililitrów krwi obwodowej z żyły do plastikowej probówki z buforem cytrynianu sodu.Przechowywać krew w temperaturze 25 °C i poddać ją obróbce w ciągu 12 godzin. Pierwszym etapem obróbki jest wirowanie krwi przy 2000 Gs przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Należy użyć rotora z koszykami wahadłowymi i nie stosować hamulców wirówki podczas separacji.Zebierz mętny frakcję tzw. „buffy coat”. Jest to warstwa znajdująca się pomiędzy górną fazą osocza a fazą dolną. Buffy coat stanowi wzbogaconą frakcję P-B-M-N-C; przenieś około 500 µL z każdej próbki o objętości ośmiu mililitrów do probówki kriogenicznej.Obecnie zawiesić warstwę leukocytową (buffy coat), dodając taką samą objętość dwukrotnego medium do mrożenia, a następnie zamrozić probówkę w pojemniku do mrożenia o kontrolowanej szybkości w temperaturze -80 °C przez maksymalnie jeden tydzień. Do dłuższego przechowywania komórki można przechowywać w ciekłym azocie. Aby rozpocząć rozmrażanie, zamrożoną 1 mL zawiesinę PB MNCs otrzymaną z zamrożonych warstw leukocytowych umieścić w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C. Następnie rozcieńczyć komórki do 2 mL za pomocą PBS.Następnie przenieś rozcieńczenie do probówki o pojemności 50 ml i dodaj 10 ml buforu do lizy erytrocytów. Pozostaw tę mieszaninę do inkubacji w temperaturze pokojowej przez około 10 minut. Po 10 minutach uzupełnij całkowitą objętość do 50 ml za pomocą sterylnego PBS.Następnie odwiruj komórki przy 300 Gs przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Po wirowaniu odlej nadkopuł i przemyj osad 50 mililitrami PBS. Teraz ponownie odwiruj komórki i resuspenduj je w jednym mililitrze medium PBM and C.Pobrać alikwot resuspenderowanych komórek i zmierzyć gęstość komórkową za pomocą komory licznikowej. Następnie dostosować ją do poziomu 2 milionów komórek na mililitr. Teraz przygotować kulturę w zawiesinie.Przenieś komórki do dołka standardowej płytki 12-dołkowej i inkubuj je przez 48 godzin. Wymieniaj pożywkę co drugi dzień, odessij komórki za pomocą pipety i przenieś je do 15 ml probówki stożkowej. Odwiruj zawartość probówki przy 300 GS przez 10 minut w temperaturze pokojowej.Następnie odlej supernatant i resuspenduj komórki w jednym mililitrze świeżej pożywki PB MNC. W pierwszych dniach hodowli PB MNC zazwyczaj występuje kontaminacja erytrocytami. Przed przeniesieniem komórek do nowej hodowli, dokładnie sprawdź je pod mikroskopem odwróconym; gdy osiągną około 80% konfluencji, podziel hodowlę podczas transferu.Dwa tygodnie po rozpoczęciu hodowli PB MNC komórki powinny być gotowe do transfekcji. Przygotuj cztery plazmidy: jeden niosący T3, T4 i shRNA przeciwko P53, jeden niosący SOX2 i KLF4, jeden niosący LIN28 i lmic oraz jeden plazmid niosący EGFP. Na początek zbierz PB MNC do 15 ml probówki stożkowej i policz liczbę żywych komórek przy użyciu błękitu trypanu.Następnie przygotować 2 miliony żywych komórek, odwirować je, a następnie resuspendować w mieszaninie do transfekcji zawierającej 100 µL buforu do resuspensji T oraz po jednym mikrogramie każdego z czterech plazmidów. Teraz wypełnić pojemnik do transfekcji trzema mililitrami buforu elektrolitycznego E dwa, pobrać mieszaninę do transfekcji za pomocą końcówki 100 µL i wstrzyknąć próbkę pionowo do przygotowanej probówki do elektroporacji.Następnie poddano komórki działaniu trzech impulsów. Po elektroporacji zawieszono komórki ponownie w dwóch mililitrach podgrzanego medium PBM i C z dodatkiem 0,25 mM maślanu sodu. Następnie policzono liczbę żywych komórek w sposób opisany wcześniej i przeniesiono zawiesinę do jednej studni niepowlekanej płytki 6-dołkowej. Płytkę inkubowano przez 24 godziny przy łagodnym mieszaniu.Utrzymuj transfekowane komórki bez pasażowania przez trzy dni od dnia transfekcji w dniach naprzemiennych. Jeden dzień przed ustanowieniem kokultury wymień pożywkę na 2 ml świeżo przygotowanej pożywki P-B-M-N-C z 0,25 mM maślanu sodu, przygotuj pierwszą warstwę MES, wypełniając studzienki płytki 6-dołkowej 1 ml macierzy błony podstawnej i inkubuj płytki w temperaturze 37 °C przez 15 minut. Następnie odessaj macierz błony podstawnej i wysiej 200 000 MEF do każdej studzienki w 2 ml DMEM zawierającego 10% FBS; następnego dnia zbierz PB MNCs za pomocą końcówki 1 ml.Przenieś je do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i odwiruj. Odlej supernatant i resuspenduj osad w dwóch mililitrach świeżej pożywki. Następnie wysiej komórki do studni pokrytych meth i inkubuj płytkę przez dwa dni.Wymień medium na 2 mL medium dla iPSC z dodatkiem 0,25 mM maślanu sodu i kontynuuj wymianę medium dla iPSC co drugi dzień. Po około 22 do 25 dniach powinny pojawić się pierwsze kolonie iPSC, które będą widoczne do 30–35 dnia. Kolonie powinny być gotowe do pobrania i przesiania w dniu poprzedzającym przeniesienie płytki z koloniami iPSC na komórki zasilające (feeder cells) do otworu 12.Płytkę wielodołkową wysiąć w zagęszczeniu 125 000 komórek na dołek i inkubować przez noc. Następnego dnia zastąpić pożywkę w dołkach z komórkami meth jednym mililitrem uzupełnionego medium iPSC. Następnie, korzystając z mikroskopu stereoskopowego, za pomocą igły wybierać pojedynczo kolonie, w przypadku większych kolonii tworzących małe skupiska.Przenieś je pojedynczo za pomocą pipety, przenosząc jedną kolonię do każdej studzienki płytki powlekanej matrygelem, a następnie inkubuj płytkę do czasu pasażowania. W przypadku kolonii iPSC początkowo stosuje się tę samą technikę wycinania, jednak po dwóch lub trzech pasażach należy zastosować procedurę opartą na enzymach. Izolowane PB MNCs, wykazujące typowy zaokrąglony kształt, namnażano w specyficznej pożywce do hodowli krwi przez 14 dni, a następnie transfekowano plazmidami episomalnymi. Małe, zaokrąglone, jasne kolonie o wyraźnych marginesach i morfologii przypominającej embrionalne komórki macierzyste zaczęły pojawiać się około 20 do 30 dni po transfekcji.Pojawiły się wysoce zwarte kolonie iPSCs o ostrych krawędziach, które powiększały się, aż osiągnęły rozmiar umożliwiający ich pobranie do pierwszych kilku etapów pasażowania. Kolonie iPSCs zachowały stan niedróżnicowany i wykazywały morfologię typową dla ludzkich embrionalnych komórek macierzystych. Przy większym powiększeniu widoczne są poszczególne komórki w obrębie kolonii oraz wysoki stosunek jądra do cytoplazmy.Wybrane klony IPSE pasażowano dodatkowo około 10 do 15 razy. W celu oceny stabilności genetycznej przeanalizowano około 20 metafaz z kilku niezależnych kultur. Wszystkie próbki wykazały prawidłowy kariotyp po od pięciu do 10 ekspansji in vitro.Klony te poddano charakterystyce pod kątem cech macierzystości i pluripotencji. Klony wykazano jako dodatnie w barwieniu na fosfatazę alkaliczną. Ilościowa R-T-P-C-R potwierdziła, że klony wykazują znacznie wyższy poziom ekspresji endogennych genów pluripotencji niż wyjściowe PB MNCs.Podczas gdy poziomy endogennego cmic i KLA four pozostały w niewielkim stopniu niezmienione, nie wykryto ekspresji egzogennego transgenu episomalnego w IPC, co wskazuje na skuteczną aktywację endogennych genów pluripotencji. Wreszcie analiza immunofluorescencyjna wykazała, że IPC wykazują ekspresję markerów pluripotencji, takich jak OC three four, SSEA four, TRA 180 1, SOX two oraz TRA one 60. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać wiedzę na temat tego, jak w sposób kosztowo efektywny i przy użyciu nieintegrujących się plazmidów episomalnych generować IPC z ko izolowanych z ludzkiej krwi obwodowej.

generation-induced-pluripotent-stem-cells-from-frozen-buffy-coats

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Przedstawiamy protokół generowania indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z ludzkich komórek somatycznych przy użyciu dostarczania czynników ludzkich Oct4, Sox2, Nanog i Lin28 za pomocą lentiwirusów. Pluripotencjalność potwierdzono na podstawie morfologii oraz obecności markerów specyficznych dla embrionalnych komórek macierzystych (ES).

Generowanie indukowanych pluripotentnych komórek macierzystych poprzez przeprogramowanie ludzkich fibroblastów za pomocą zestawu ludzkich lentiwirusów TF firmy Stemgent

W niniejszym materiale przedstawiamy prosty i skuteczny protokół generowania ludzkich iPSC z 3-4 ml krwi obwodowej przy użyciu pojedynczego lentiwirusowego wektora reprogramującego. Reprogramowanie łatwo dostępnych komórek krwi daje nadzieję na przyspieszenie wykorzystania technologii iPSC poprzez udostępnienie jej szerszemu gronu badaczy.

Generowanie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z krwi obwodowej przy użyciu wektora lentiwirusowego STEMCCA

Tutaj opisujemy protokół generowania ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z krwi obwodowej przy użyciu strategii przeprogramowania opartej na episomach i inhibitorów deacetylazy histonowej.

Wydajne wytwarzanie komórek iPS z krwi przy użyciu episomów i inhibitorów HDAC

Ten manuskrypt przedstawia krok po kroku procedurę pozyskiwania i utrzymywania ludzkich keratynocytów z wyrwanych włosów oraz późniejszej generacji wolnych od integracji ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC) za pomocą wektorów epizodycznych.

Generowanie bezintegracyjnych, indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu keratynocytów pochodzących z włosów

Ten protokół opisuje, jak generować indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) z ludzkich obwodowych limfocytów T w warunkach wolnych od karmy, używając kombinacji wektorów matrigelu i wirusa Sendai zawierających czynniki przeprogramowujące.

Wytwarzanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z ludzkich obwodowych limfocytów T przy użyciu wirusa Sendai w warunkach wolnych od żywiciela

Proponujemy protokół przeprogramowania komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC) na indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC). Poprzez posiew transdukowanych komórek krwi na płytkach pokrytych matrycą za pomocą wirowania, iPSC są z powodzeniem indukowane z komórek pływających. Technika ta sugeruje prosty i skuteczny protokół przeprogramowania komórek, takich jak PBMC i CBMC.

Indukowane pluripotencjalne wytwarzanie komórek macierzystych z komórek krwi za pomocą wirusa Sendai i wirowania

Ten protokół opisuje szczegółową metodę efektywnego generowania bezintegracyjnych iPSC z ludzkich dorosłych komórek krwi obwodowej. Za pomocą czterech wektorów episomalnych opartych na oriP/EBNA do ekspresji czynników przeprogramowujących, KLF4, MYC, BCL-XL lub OCT4 i SOX2, z 1 ml krwi obwodowej można uzyskać tysiące kolonii iPSC.

Generowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych bez integracji z ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej przy użyciu wektorów episomalnych

Przeprogramowanie komórek wymaga wprowadzenia kluczowych genów, które regulują i utrzymują pluripotencjalny stan komórki. Opisany protokół umożliwia tworzenie kolonii indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) z ludzkich fibroblastów skóry bez metod wirusowych/integrujących, ale przy użyciu niemodyfikowanych RNA (NM-RNA) w połączeniu z czynnikami unikania odporności zmniejszającymi mechanizmy obrony komórkowej.

Izolacja dorosłych ludzkich fibroblastów skórnych ze skóry brzucha i wytwarzanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu metody nieintegrującej

Obecny protokół szczegółowo opisuje kroki rozwiązywania problemu z indukowanych pluripotentnych komórek macierzystych (iPSC) z obwodowych komórek monojądrowych (PBMC) z próbek pacjentów, które trudno było przeprogramować zgodnie z instrukcjami producenta. Protokół ten jest specyficzny dla mrożonych próbek Buffy Coat, ale może być również stosowany do przeprogramowania oczyszczonych PBMC.

Przeprogramowanie indukowanych pluripotentnych linii komórek macierzystych z próbek zamrożonego płaszcza Buffy

Tutaj opisujemy protokół generowania ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z synowicytów podobnych do fibroblastów pochodzących od pacjenta, przy użyciu systemu lentiwirusowego bez komórek zasilających.

Wytwarzanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu synowiocytów podobnych do fibroblastów wyizolowanych ze stawów pacjentów z reumatoidalnym zapaleniem stawów

Poznaj metodę generowania indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z zamrożonych płaszczy kożuchowych przy użyciu nieintegrujących plazmidów episomalnych. Protokół ten jest bezwirusowy i opłacalny.

Generowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z zamrożonych płaszczy kożuchowych przy użyciu nieintegrujących plazmidów episomalnych (Wideo) | JoVE Journal

Generowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z zamrożonych płaszczy kożuchowych przy użyciu nieintegrujących plazmidów episomalnych

Przeglądaj więcej filmów