Name: Ustalenie i charakterystyka UTI i CAUTI w modelu mysim (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: Poznaj metodę ustalania zakażeń dróg moczowych i związanych z cewnikiem w modelu mysim. Technika obejmuje inokulację bakteryjną, cewnikiowanie i ocenę obciążenia bakteriami oraz społeczności bakteryjne wewnątrzkomórkowe.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Finansowanie tej pracy zostało zapewnione przez ORWH SCOR P50 DK064540, RO1 DK 051406, RO1 AI 108749-01, F32 DK 101171, oraz F32 DK 104516-01.

Oświadczenie etyczne: Komitet Badań nad Zwierzętami Uniwersytetu Waszyngtońskiego zatwierdził wszystkie infekcje i procedury myszy w ramach protokołu numer 20150226, który wygasa 12/10/2018. Ogólna opieka nad zwierzętami była zgodna z Przewodnikiem dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych opracowanym przez National Research Council oraz Przewodnikiem USDA Animal Care Resource Guide. Procedury eutanazji są zgodne z "Wytycznymi AVMA dotyczącymi eutanazji zwierząt wydanie 2013".
1. Protokół UPEC UTI, przygotowanie igły do inokulacji (Rysunek S1)
<ol>
	<li>Zdjąć osłonkę z igły 30 G. Nawlecz około 1 cala rurki PE10 na trzon igły. Promieniowanie UV sterylizuje zespoły igieł przez noc. Cewnikowane igły mogą być przechowywane przez czas nieokreślony w sterylnych płytkach Petriego.</li>
</ol>
2. Preparat inokulum bakteryjnego UPEC
<ol>
	<li>Przygotowanie inokulum UTI89 (rozpocząć 72 godziny przed dniem szczepienia)
	<ol>
		<li>Nałóż UTI89 na płytkę agarową LB (Luria-Bertani) z zamrożonego bulionu. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C. Wybrać kolonię i zaszczepić ją w 10 ml LB w kolbie o pojemności 125 ml. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 24 godziny, statycznie.</li>
		<li>Inokulować 10 μl nocnej kultury w 10 ml LB w nowej kolbie o pojemności 125 ml przez dodatkowe 24 godziny w temperaturze 37 °C, statycznie.</li>
		<li>Przenieś 3 ml (będzie się różnić w zależności od szczepu i pożądanej wielkości inokulum) do sterylnych probówek 1,5 ml i odwiruj przy 7 000 x g przez 3 minuty i ponownie zawieś osad w 1x PBS i odwiruj po raz drugi. Zawiesić osad bakteryjny w 1 ml 1x PBS.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zmierz gęstość optyczną bakterii i dostosuj stężenie do pożądanej gęstości inokulum. Standardowe stężenie użytego inokulum to 107 bakterii; Może się to jednak różnić ze względu na konstrukcję badania.</li>
</ol>
3. Inokulacja bakteryjna
<ol>
	<li>Wyczyść stację roboczą 70% etanolem i przykryj obszar chłonnym papierem (lub użyj sterylnego okapu przepływowego).</li>
	<li>Pobrać do 0,9 ml przygotowanego inokulum bakteryjnego do strzykawki o pojemności 1 ml (TB) (usunąć pęcherzyki powietrza). Przymocuj przygotowaną sterylną igłę do inokulacji z rurką PE10 do strzykawki zawierającej inokulum, a następnie sterylnie przyciąć rurkę polietylenową. 
	UWAGA: Pozostaw 1 mm rurki nad końcówką igły, aby uniknąć przebicia pęcherza.</li>
	<li>Wytnij kwadratowy kawałek parafilmu o średnicy 1 cala i nałóż na wierzch odrobinę lubrykantu chirurgicznego (mniej więcej wielkości dziesięciocentówki).</li>
	<li>Znieczulenie samic myszy C3H/HeN poprzez umieszczenie ich w komorze parownika (zgodnie z protokołem producenta) do utraty przytomności, ale nadal normalnie oddychających (1 oddech/s). 
	UWAGA: Niektóre komitety IACUC nie zgadzają się na używanie waporyzatora. Postępuj zgodnie ze wskazówkami komitetu IACUC swojej instytucji. 
	UWAGA: Izofluran jest środkiem znieczulającym wziewnym. Stosować w dobrze wentylowanym pomieszczeniu i zminimalizować wdychanie.</li>
	<li>Wyjmij mysz z waporyzatora i połóż ją na plecach na ręczniku papierowym i rozłóż nóżki.</li>
	<li>Zakryj nos myszy stożkiem nosowym (rurka podłączona do waporyzatora, która zapewnia kontrolowaną dawkę izoflurancji, która jest wyposażona w niektóre waporyzatory), aby utrzymać znieczulenie.</li>
	<li>Delikatnie kołataj pęcherz, aby wywołać oddawanie moczu i upewnić się, że pęcherz jest opróżniony. Przetrzyj obszar okołocewkowy chusteczką 100% etanolu. Wklepać igłę/strzykawkę do zaszczepiania, skierowaną do przodu, w lubrykant chirurgiczny.</li>
	<li>Zaszczepić każdą mysz 50 μl roztworu bakterii, wprowadzając igłę do inokulacji przezcewkowo, około 12 mm i delikatnie naciskając tłok strzykawki, aby delikatnie dozować inokulum do pęcherza moczowego (10 μl/s). Wyjąć igłę do zaszczepiania z myszy. 
	UWAGA: Natychmiastowy powrót inokulum do ujścia cewki moczowej po rozpoczęciu inokulacji wskazuje na niewłaściwe lub niepełne wprowadzenie igły.</li>
	<li>Wyjmij mysz ze stożka nosowego i umieść ją z powrotem w klatce. Powtórz kroki 3.3-3.8 dla każdej myszy. Kiedy/jeśli zmieniasz warunki/szczepy inokulum, wyrzuć strzykawkę i igłę do zaszczepiania do zatwierdzonego pojemnika na ostre przedmioty i rozpocznij ponownie krok 3.2. 
	UWAGA: Szczepienie organizmami urochotwórczymi na ogół nie powoduje silnych objawów bólowych. Jednak w rzadkich przypadkach podawanie dużych dawek patogenów może powodować gorączkę, zmniejszenie spożycia pokarmu i wody oraz nieprawidłowe zachowanie. Zdrowie zwierząt powinno być monitorowane przez cały czas trwania doświadczenia. W przypadku zauważenia jawnych objawów bólowych można zastosować lek przeciwbólowy, taki jak buprenorfina (0,05-0,1 mg/kg podawana podskórnie). Procedury powinny być zgodne z IACUC każdej instytucji.</li>
</ol>
4. Określanie obciążeń bakteryjnych
<ol>
	<li>Przygotować oddzielne probówki o pojemności 5 ml dla każdej pary pęcherza moczowego i nerki, która ma zostać pobrana. Dodaj 1ml 1x PBS / tubę / pęcherz myszy do pobrania. Dodać 0,8 ml 1x PBS/probówka/para nerek myszy do pobrania. Oznacz każdą rurkę tak, aby odpowiadała danej myszy. Przygotować 96-dołkową płytkę zawierającą 180 μl 1x PBS w każdym dołku do seryjnych rozcieńczeń w stosunku 1:10.</li>
	<li>Oczyść miejsce pracy 70% etanolem i przykryj je chłonnym pokrowcem lub ręcznikiem papierowym.</li>
	<li>Znieczulij mysz izofluranem (patrz krok 3.4), aż mysz przestanie oddychać na około 1 minutę, a następnie umieść ją na chłonnym pokrowcu lub ręczniku papierowym. Inne metody eutanazji są również akceptowane przez komitety IACUC, takie jak dwutlenek węgla, i mogą być zastąpione w przypadku przedawkowania izofluranu.</li>
	<li>Poświęć mysz przez szybkie zwichnięcie szyjki macicy, które polega na przytrzymaniu szyi u podstawy głowy i odciągnięciu ogona poziomo od ciała, aż do wystąpienia zwichnięcia. 
	UWAGA: Większość komitetów IACUC wymaga dodatkowego środka eutanazji, a zwichnięcie szyjki macicy jest powszechną metodą. Można jednak zastosować inne metody, jeśli zostaną zatwierdzone przez komitet IACUC.</li>
	<li>Połóż martwą mysz na plecach i spryskaj brzuch 70% etanolem. Wypreparuj mysz, zbierz pęcherz moczowy i nerki, w tej kolejności, aby zminimalizować potencjalne zanieczyszczenie krwi po rozwarstwieniu nerki. Umieścić narządy niezależnie w przygotowanych probówkach o pojemności 5 ml zawierających 1 PBS (patrz krok 4.1). 
	UWAGA: Używaj różnych nożyczek do sekcji zewnętrznej i do pobierania narządów, aby zminimalizować zanieczyszczenie.</li>
	<li>Dotknij rurki, aby upewnić się, że narządy znajdują się w 1x PBS. Powtórz kroki 4.3-4.5 dla każdej myszy. Wyczyść nożyczki i kleszcze w 70% etanolu po każdej myszy.</li>
</ol>
5. Odbudowa bakteryjna
<ol>
	<li>Homogenizować pobrany pęcherz moczowy i nerki w probówkach o pojemności 5 ml za pomocą homogenizatora tkankowego, 15 sekund na nerkę i 30 sekund na pęcherz. Przepłukać homogenizator sekwencyjnie w 1x PBS, 70% etanolu i 1x PBS między próbkami.</li>
	<li>Wykonaj seryjne rozcieńczenia 1:10 do 10-8 i umieść każde rozcieńczenie dla CFU (jednostek tworzących kolonie) na płytkach agarowych LB. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C przez noc i policzyć kolonie następnego dnia.</li>
</ol>
6. Wyliczenie IBC
<ol>
	<li>Aseptycznie wyjmij pęcherz i umieść go w 1x PBS na 6-dołkowej płytce z silikonowym dnem. Płytki można przygotować za pomocą zestawu elastomerów silikonowych i wlać około 1 cm silikonu do każdej studzienki, patrz instrukcja producenta. Przetnij pęcherz na pół za pomocą nożyczek.</li>
	<li>Za pomocą małych metalowych szpilek delikatnie rozchyl pęcherz tak, aby światło pęcherza było skierowane do góry. Pamiętaj, aby umieścić szpilki na najbardziej zewnętrznych krawędziach odcinków pęcherza, aby upewnić się, że maksymalna ilość nabłonka dróg moczowych jest odsłonięta.</li>
	<li>Po rozłożeniu delikatnie umyj pęcherz raz za pomocą 1x PBS. Usunąć 1x PBS za pomocą pipety. Napraw pęcherz, dodając tyle 3% paraformaldehydu, aby pokryć cały rozłożony pęcherz. UWAGA: Paraformaldehyd jest rakotwórczy. Przez cały czas należy nosić odpowiedni sprzęt ochronny, w tym rękawice. Utylizacja powinna być zgodna z wytycznymi instytucjonalnymi.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Usunąć roztwór paraformaldehydu. Umyj raz 1x PBS.</li>
	<li>Umyć roztworem myjącym LacZ (2 mM MgCl2, 0,01% deoksycholanu sodu i 0,02% nonidet-p40in 1x PBS) trzy razy przez 5 minut na pranie.</li>
	<li>Usunąć roztwór płuczący i dodać wystarczającą ilość barwnika LacZ (9,5 ml roztworu do płukania LacZ, 0,4 ml 25 mg/ml X-gal i 0,1 ml 100 mM K-żelazocyjanku/K-żelazocyjanku), aby pokryć pęcherze. Inkubować w temperaturze 30 °C przez noc, chroniąc przed światłem.</li>
	<li>Wyjmij rozłożone pęcherze z inkubatora i obserwuj IBC, które wyglądają jak niebieskie puncta, jak pokazano za pomocą lunety sekcyjnej, powiększenie 40-60x. 
	UWAGA: Czasami mysz może oddać mocz przed umieszczeniem rurki pod cewką moczową. W takim przypadku odczekaj 15-20 minut przed ponowną próbą zebrania moczu.</li>
</ol>
7. Zbieranie moczu w celu wyliczenia bakteriurii CFU (nie dotyczy CAUTI)
<ol>
	<li>Aby zebrać mocz przed lub po infekcji, delikatnie przytrzymuj mysz, trzymając ogon i umieszczając go na płaskiej, podwyższonej powierzchni (górnej części klatki dla myszy).</li>
	<li>Trzymaj sterylną probówkę o pojemności 1,5 ml pod cewką moczową myszy. Delikatnie naciśnij grzbiet myszy w pobliżu ogona, aby wywrzeć nacisk na pęcherz. Złap mocz do probówki o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Wykonać seryjne rozcieńczenia w stosunku 1:10 do 10-7 i rozlać każde rozcieńczenie na odpowiednie LB. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C przez noc i policzyć kolonie następnego dnia.</li>
</ol>
8. Protokół modelu CAUTI, przygotowanie igły cewnika do modelu CAUTI (rysunek S2)
<ol>
	<li>Zdjąć osłonkę z igły 30 G. Wytnij 7-milimetrowy kawałek rurki PE10 i 5-milimetrowy kawałek rurki silikonowej, takiej jak RenaSIL. Nawlecz igłę z rurką PE10, aż rurka dotknie podstawy igły.</li>
	<li>Następnie nałóż 5 mm kawałek na igłę zawierającą PE10. Sterylizuj UV zespoły igieł przez noc. 
	UWAGA: Podczas ładowania rurki silikonowej pozostaw około 1 mm rurki wystającej poza końcówkę igły.</li>
</ol>
9. Preparat inokulum bakteryjnego E. faecalis OG1RF
<ol>
	<li>Przygotować inokulum OG1RF zaczynając 48 godzin przed dniem inokulacji. Nałóż OG1RF na płytkę BHI (napar z serca) z zamrożonego bulionu.</li>
	<li>Wybierz kolonię i zaszczep ją w 10 ml BHI i hoduj statycznie przez 18 godzin w temperaturze 37 °C. Odwirować kulturę i umyć osad (3 razy) w objętościach 1 ml sterylnego 1x PBS.</li>
	<li>Ponownie zawiesić osad bakteryjny w 1x PBS. Zmierz gęstość optyczną bakterii i dostosuj stężenie do pożądanej wielkości inokulum. Standardowe stężenie użytego inokulum wynosi 107; Może się to jednak różnić ze względu na konstrukcję badania</li>
</ol>
10. Implantacja cewnika
<ol>
	<li>Wyczyść stanowisko pracy 70% etanolem i przykryj obszar chłonnym pokrowcem (lub użyj sterylnego kaptura przepływowego).</li>
	<li>Podłączyć igłę cewnika do pustej strzykawki o pojemności 1 ml (TB). Wytnij kwadratowy kawałek parafilmu o średnicy 1 cala i nałóż na wierzch odrobinę lubrykantu chirurgicznego (mniej więcej wielkości dziesięciocentówki). 
	UWAGA: Dwie różne igły są używane do osadzania cewnika i do inokulum, aby zminimalizować przypadkowe inokulację z powodu manipulacji mechanicznej niezbędnej do implantacji cewnika. Pozwala to również na wygodę przygotowania mniejszej liczby igieł do zaszczepiania.</li>
	<li>Znieczulenie myszy C57BL / 6, umieszczając je w szklanym słoiku o pojemności 32 uncji zawierającym kulkę do zaparzania herbaty z wacikami nasączonymi 3 ml izofluranu lub komorą parownika (zgodnie z protokołem producenta), aż stracą przytomność, ale nadal będą normalnie oddychać (1 oddech / s).</li>
	<li>Następnie połóż mysz na plecach na ręczniku papierowym i rozłóż nogi. Przykryj nos myszy stożkiem nosowym lub stożkową rurką o pojemności 50 ml wacikami zawierającymi niewielką ilość (około 1-2 ml) izofluranu. 
	UWAGA: Izofluran jest środkiem znieczulającym wziewnym. Używaj w dobrze wentylowanym pomieszczeniu i zminimalizuj wdychanie przez badacza.</li>
	<li>Delikatnie kołataj pęcherz, aby wywołać oddawanie moczu i upewnić się, że pęcherz jest opróżniony. Przetrzyj obszar okołocewkowy chusteczką 100% etanolu.</li>
	<li>Zdezynfekuj obszar okołocewkowy 10% roztworem jodu powidonu za pomocą aplikatora z bawełnianą końcówką. Wklepać igłę/strzykawkę do zaszczepiania, wskazując do przodu, w lubrykant chirurgiczny. 
	UWAGA: Do implantacji cewnika stosuje się jod powidyny, który jest silniejszym roztworem aseptycznym niż alkohol. Implantacja cewnika wymaga większej manipulacji mechanicznej w celu wprowadzenia cewnika, a tym samym większego ryzyka zanieczyszczenia.</li>
	<li>Wprowadzić cewnik do otworu cewki moczowej. Po wejściu do środka użyj pęsety, aby popchnąć długi kawałek (7 mm PE10) w kierunku pęcherza, w konsekwencji popychając mały cewnik (silikon o średnicy 5 mm) i umieszczając go w pęcherzu. Natychmiast wyjmij igłę, trzymając rurkę 7 mm na swoim miejscu.</li>
</ol>
11. Inokulacja bakteryjna
<ol>
	<li>Postępuj zgodnie z protokołem inokulacji bakteryjnej w sekcji 3, używając przygotowanego inokulum z sekcji 9. Wyjmij mysz ze stożka nosowego i umieść ją z powrotem w klatce</li>
</ol>
12. W każdym momencie poświęcenia
<ol>
	<li>Przygotować probówki o pojemności 5 ml do pęcherza moczowego i nerek (w przypadku narządów należy postępować zgodnie z krokiem 4.1) oraz probówkę Eppendorfa o pojemności 1,5 ml do cewników. Dodać 1 ml 1x PBS do 1,5 ml probówki Eppendorf do próbek cewnika</li>
	<li>Wykonaj kroki od 4.3 do 4.5. Wypreparować mysz, pobierając pęcherz moczowy, nerki i cewnik, umieszczając tkanki niezależnie w probówkach o pojemności 5 ml zawierających 1x PBS, a cewnik w 1,5 ml Eppendorfa (patrz krok 12.1). 
	UWAGA: Używaj różnych nożyczek do zewnętrznego rozwarstwiania oraz do pobierania narządów i pobierania cewnika, aby zminimalizować zanieczyszczenie</li>
	<li>Następnie wykonaj krok 4.6.</li>
</ol>
13. Odzyskiwanie bakterii
<ol>
	<li>W przypadku narządów wykonaj kroki 5.1 i 5.2. W celu odzyskania bakterii z cewników, wiruj z maksymalną prędkością przez 30 sekund, sonikuj próbki cewnika przez 5 minut za pomocą sonikatora do kąpieli, a następnie wiruj z maksymalną prędkością przez dodatkowe 30 sekund.</li>
	<li>Wykonaj seryjne rozcieńczenia 1:10 do 10-8 i umieść każde rozcieńczenie do oznaczenia CFU na płytkach BHI. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C przez noc i policzyć kolonie następnego dnia.</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Nieskomplikowane zakażenie układu moczowego nabyte przez społeczność jest powszechną i kosztowną infekcją, która każdego roku powoduje kilka milionów wizyt w podstawowej opiece zdrowotnej 46. Ponadto CAUTI są powszechną infekcją nabytą w opiece zdrowotnej, która stała się niezwykle kosztowna dla świadczeniodawców, ponieważ Centra Usług Medicare i Medicaid nie zwracają już świadczeniodawcom dodatkowych kosztów leczenia wynikających z nabytego w szpitalu CAUTI 45. Mysie modele ZUM, zarówno niepowikłan...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/52892/establishment-and-characterization-of-uti-and-cauti-in-a-mouse-model">Establishment and Characterization of UTI and CAUTI in a Mouse Model</a>. The Protocol section has been updated.
The ethics statement has been updated from:
Ethics statement: The Washington University Animal Studies Committee approved all mouse infections and procedures as part of protocol number 20120216, which was approved 01/11/2013 and expires 01/11/2016. Overall care of the animals was consistent with The guide for the Care and Use of Laboratory Animals from the National Research Council and the USDA Animal Care Resource Guide. Euthanasia procedures are consistent with the &#8220;AVMA guidelines for the Euthanasia of Animals 2013 edition.&#8221;
to:
Ethics statement: The Washington University Animal Studies Committee approved all mouse infections and procedures as part of protocol number 20150226, which expires 12/10/2018. Overall care of the animals was consistent with The Guide for the Care and Use of Laboratory Animals from the National Research Council and the USDA Animal Care Resource Guide. Euthanasia procedures are consistent with the &#8220;AVMA guidelines for the Euthanasia of Animals 2013 edition.&#8221;
Step 3 has been updated from:
3. Bacterial Inoculation
<ol>
	<li>Clean the workstation with 70% ethanol and cover area with absorbent paper (or use sterile flow hood).</li>
	<li>Draw up to 0.9 ml of the prepared bacterial inoculum into a 1 ml (TB) syringe (remove air bubbles). Attach a prepared sterile inoculation needle with PE10 tubing, onto the syringe containing the inoculum, then sterilely trim the polyethylene tubing. 
	NOTE: Leave 1 mm of tubing above the tip of the needle to avoid puncturing the bladder.</li>
	<li>Cut a 1 inch square piece of parafilm and put a dab of surgical lubricant (approximately the size of a dime) on top.</li>
	<li>Anesthetize female C3H/HeN mice by putting them in a 32 ounce glass jar containing a tea-infuser ball with cotton balls soaked with 3 ml of isoflurane or vaporizer chamber (following manufactures protocol) until unconscious but still breathing normally (1 breath/sec). 
	NOTE: Some IACUC committees do not approve the use of a jar or vaporizer. Please follow the indication of the IACUC committee of your institution. 
	NOTE: If glass jar with tea-ball and/or nose cone with isoflurane-soakd cotton balls are used, the animal must be carefully observed to avoid anesthetic overdose and death. The advantage of using a vaporizer and anesthesia chamber is that it provides controlled isoflurane administration that avoids accidental overdoses. CAUTION: Isoflurane is an inhalation anesthetic. Use in a well-ventilated area and minimize inhalation.</li>
	<li>Remove the mouse from the jar/vaporizer and place it on its back on a paper towel and spread the legs.</li>
	<li>Cover the nose of the mouse with a nose cone (a tube connected to the vaporizer that provides a controlled isoflurance dose that comes equipped on some vaporizer units) or 50 ml conical tube with a cotton ball containing a small amount (approximately 1-2 ml) of isoflurane.</li>
	<li>Gently palpitate the bladder to induce urination and ensure a voided bladder. Wipe the periurethral area with 100% ethanol wipe. Dab the inoculation needle/syringe, point first, into the surgical lubricant.</li>
	<li>Inoculate each mouse with 50 &#181;l of the bacteria solution by inserting the inoculation needle transurethrally, approximately 12 mm, and pressing down on the syringe plunger gently to dispense the inoculum into the bladder gently (10 &#181;l/sec). Remove the inoculation needle from the mouse. 
	NOTE: Immediate return of inoculum at the urethral opening when beginning to inoculate indicates improper or incomplete insertion of the needle.</li>
	<li>Remove the mouse from nose cone and return it to its cage. Repeat steps 3.3-3.8 for each mouse. When/if switching inoculum conditions/strains, dispose of the syringe and inoculation needle in an approved sharps container and start again step 3.2.&#160;&#160; 
	NOTE: Inoculation with uropathogenic organisms generally does not cause severe pain symptoms. However, in rare instances, administering large doses of pathogens may cause fever, reduction in food and water intake and abnormal behavior. Animal health should be monitored throughout the experiment. If overt pain symptoms are notice, an analgesic, such as Buprenorphine (0.05&#8722;0.1 mg/kg given subcutaneously), can be applied. Procedures should be in accordance with each institution&#8217;s IACUC.</li>
</ol>
to:
3. Bacterial Inoculation
<ol>
	<li>Clean the workstation with 70% ethanol and cover area with absorbent paper (or use sterile flow hood).</li>
	<li>Draw up to 0.9 ml of the prepared bacterial inoculum into a 1 ml (TB) syringe (remove air bubbles). Attach a prepared sterile inoculation needle with PE10 tubing, onto the syringe containing the inoculum, then sterilely trim the polyethylene tubing. 
	NOTE: Leave 1 mm of tubing above the tip of the needle to avoid puncturing the bladder.</li>
	<li>Cut a 1 inch square piece of parafilm and put a dab of surgical lubricant (approximately the size of a dime) on top.</li>
	<li>Anesthetize female C3H/HeN mice by putting them in a vaporizer chamber (following manufactures protocol) until unconscious but still breathing normally (1 breath/sec). 
	NOTE: Some IACUC committees do not approve the use of a vaporizer. Please follow the indication of the IACUC committee of your institution. 
	CAUTION: Isoflurane is an inhalation anesthetic. Use in a well-ventilated area and minimize inhalation.</li>
	<li>Remove the mouse from the vaporizer and place it on its back on a paper towel and spread the legs.</li>
	<li>Cover the nose of the mouse with a nose cone (a tube connected to the vaporizer that provides a controlled isoflurance dose that comes equipped on some vaporizer units) to maintain anesthetization.</li>
	<li>Gently palpitate the bladder to induce urination and ensure a voided bladder. Wipe the periurethral area with 100% ethanol wipe. Dab the inoculation needle/syringe, point first, into the surgical lubricant.</li>
	<li>Inoculate each mouse with 50 &#181;l of the bacteria solution by inserting the inoculation needle transurethrally, approximately 12 mm, and pressing down on the syringe plunger gently to dispense the inoculum into the bladder gently (10 &#181;l/sec). Remove the inoculation needle from the mouse. 
	NOTE: Immediate return of inoculum at the urethral opening when beginning to inoculate indicates improper or incomplete insertion of the needle.</li>
	<li>Remove the mouse from nose cone and return it to its cage. Repeat steps 3.3-3.8 for each mouse. When/if switching inoculum conditions/strains, dispose of the syringe and inoculation needle in an approved sharps container and start again step 3.2.&#160;&#160; 
	NOTE: Inoculation with uropathogenic organisms generally does not cause severe pain symptoms. However, in rare instances, administering large doses of pathogens may cause fever, reduction in food and water intake and abnormal behavior. Animal health should be monitored throughout the experiment. If overt pain symptoms are notice, an analgesic, such as Buprenorphine (0.05&#8722;0.1 mg/kg given subcutaneously), can be applied. Procedures should be in accordance with each institution&#8217;s IACUC.</li>
</ol>

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/52892/establishment-and-characterization-of-uti-and-cauti-in-a-mouse-model">Establishment and Characterization of UTI and CAUTI in a Mouse Model</a>. The Protocol section has been updated.

Erratum: Establishment and Characterization of UTI and CAUTI in a Mouse Model

Infekcje dróg moczowych (ZUM) są jednymi z najczęstszych infekcji bakteryjnych i można je podzielić na dwie kategorie w zależności od mechanizmu nabycia, ZUM nabyte w pobliżu i szpitalne. Pozaszpitalne ZUM często występują u zdrowych kobiet, a badania wykazały, że około 50% kobiet będzie miało co najmniej jedno ZUM w ciągu swojego życia 1. Dodatkowo poważnym problemem jest nawrót. Kobieta, u której wystąpiła początkowa ostra infekcja, ma 25-40% szans na drugą infekcję w ciągu sześciu miesięcy pomimo odpowiedniego leczenia antybiotykami, a wiele kobiet nadal ma częste nawroty 2. Bakterie, które powodują te infekcje, stają się również coraz bardziej odporne na antybiotyki, co dodatkowo zakłóca protokoły leczenia 3-6. Zakażenie układu moczowego dotyka miliony osób każdego roku, kosztując około 2,5 miliarda dolarów wydatków związanych z opieką zdrowotną w USA, co podkreśla wpływ i rozpowszechnienie choroby 1,7. Szpitalne nabyte ZUM są głównie związane z obecnością ciał obcych, takich jak cewniki na stałe. Zakażenia układu moczowego związane z cewnikiem (CAUTI) pozostają najczęstszymi szpitalnymi zakażeniami układu moczowego, stanowiąc ~70-80% takich zakażeń 8. Ponadto CAUTI wiąże się ze zwiększoną zachorowalnością i śmiertelnością oraz jest najczęstszą przyczyną wtórnych zakażeń krwi 9.
Uważa się, że zakażenia dróg uliczne nabyte przez społeczność związaną z UPEC są spowodowane wprowadzeniem bakterii do pęcherza moczowego z rezerwuarów w przewodzie pokarmowym poprzez manipulację mechaniczną podczas stosunku płciowego, złą higienę lub inną dynamikę populacji mikrobiologicznej między różnymi niszami gospodarza 10. Po dostaniu się do pęcherza moczowego UPEC wykorzystuje liczne czynniki wirulencji, w tym kapsułkę, systemy pozyskiwania żelaza, toksyny, plazmid wirulencji, tRNA, wyspy patogenności i czynniki kolonizacyjne, które, jak wykazano, odgrywają rolę w patogenezie 11-14. Kluczowe znaczenie dla ustanowienia kolonizacji UPEC, UPEC koduje również wiele rodzajów pilusów adhezyjnych szlaków opiekuńczych (CUP), które rozpoznają receptory o swoistości stereochemicznej 15. Pilusy typu 1, zakończone adhezyną FimH, są wyrażane przez UPEC i wiążą mannozylowane uroplakiny 16 i integryny α-1, β-3 17, które ulegają ekspresji na powierzchni światła pęcherzy moczowych zarówno ludzkich, jak i mysich 18. Te interakcje, w których pośredniczy FimH, ułatwiają kolonizację bakteryjną i inwazję powierzchownych komórek nabłonka19,20. Po wejściu do komórki UPEC może uciec do cytoplazmy, gdzie pojedyncza bakteria może szybko się podzielić, tworząc wewnątrzkomórkową społeczność bakteryjną (IBC), która po dojrzewaniu może zawierać ~104 bakterie 21. Tworzenie IBC wykazano w co najmniej sześciu różnych szczepach myszy, C3H/HeN, C3H/HeJ, C57Bl/6, CBA, FVB/NJ i BALB/c, a także w wielu różnych szczepach UPEC i innych Enterobacteriaceae 22-24. Jednak czasowe i przestrzenne różnice w tworzeniu IBC mogą się różnić w zależności od tła myszy i infekującego szczepu UPEC. U myszy C3H/HeN zakażonych prototypowymi szczepami UPEC UTI89 lub CFT073, tworzenie IBC można uwidocznić jako małe biomasy bakterii już po 3 hpi (hr po zakażeniu). Społeczność ta nadal się rozwija i osiąga "środek" rozwoju około 6 hpi, gdy bakterie w kształcie pręcików zajmują duży procent przestrzeni cytoplazmatycznej terminalnie zróżnicowanych powierzchownych komórek parasolowych Te wczesne IBC tworzą się w stosunkowo synchroniczny sposób, przy czym większość z nich wykazuje podobne wymiary i morfologie. ~ 8 hpi bakterie w IBC zmieniają morfologię z pałeczek na kokcy. Kontenery IBC mają charakter przejściowy. Tak więc dojrzewanie IBC od 12 do 18 hpi powoduje ciągłą ekspansję populacji bakterii, a następnie ich filamentację i dyspersję z komórki, a następnie rozprzestrzenianie się na sąsiednie komórki 23. W ten sposób nisza IBC pozwala na szybki wzrost bakterii w środowisku chronionym przed odpowiedziami immunologicznymi gospodarza i antybiotykami 25. Odrębne etapy infekcji UPEC, które obserwuje się u myszy, obserwuje się również u ludzi, takie jak IBC i filamentacja, co potwierdza mysi model ZUM jako korzystne narzędzie, które można wykorzystać do modelowania ZUM u ludzi 22,26-28.
Podczas gdy większość kobiet doświadcza ZUM w swoim życiu, wynik tych infekcji może wahać się od ostrej samoograniczającej się infekcji bez nawrotu, do częstego nawracającego zapalenia pęcherza moczowego. Co więcej, badania wykazały silne rodzinne występowanie ZUM, co sugeruje, że komponent genetyczny przyczynia się do podatności na ZUM 29. Odkryliśmy, że różne wyniki ZUM obserwowane w klinikach mogą być odzwierciedlone przez różne wyniki eksperymentalnego zakażenia UPEC wśród wsobnych szczepów myszy 30. Na przykład myszy C3H/HeN, CBA, DBA i C3H/HeOuJ są podatne, w sposób zakaźny zależny od dawki, na długotrwałe, przewlekłe zapalenie pęcherza moczowego charakteryzujące się utrzymującymi się bakteriami o wysokim mianie (>104 jednostki tworzące kolonie (CFU)/ml), obciążeniem pęcherza bakteryjnego o wysokim mianie w momencie uśmiercenia >4 tygodnie po zakażeniu (WPI), przewlekłym zapaleniem i martwicą dróg moczowych. Myszy te wykazują również podwyższone poziomy IL-6, G-CSF, KC i IL-5 w surowicy w ciągu pierwszych 24 hpi, które służą jako biomarkery rozwoju przewlekłego zapalenia pęcherza moczowego. Może to dokładnie odzwierciedlać naturalny przebieg ZUM u niektórych kobiet, ponieważ badania placebo wykazały, że duży odsetek kobiet doświadczających ZUM utrzymuje wysoki poziom bakterii w moczu przez kilka tygodni po wystąpieniu pierwszych objawów zapalenia pęcherza moczowego, jeśli nie zostanie podany antybiotykoterapię 31,32. Ponadto, używając myszy C3H/HeN, odkryliśmy, że przewlekłe zapalenie pęcherza moczowego w wywiadzie jest istotnym czynnikiem ryzyka kolejnych ciężkich, nawracających infekcji. Nawracające ZUM jest najbardziej znaczącym objawem klinicznym ZUM, a mysz C3H/HeN jest obecnie jedynym badanym modelem, który podsumowuje zwiększoną predyspozycję po wcześniejszej ekspozycji. Drugi wynik ZUM jest rekapitulowany u myszy C57Bl / 6, u których ostra infekcja UPEC ustępuje samoistnie, z ustąpieniem zapalenia pęcherza moczowego i bakteriurii w ciągu około tygodnia. Co ciekawe, w tym modelu UPEC łatwo tworzy spoczynkowe rezerwuary wewnątrzkomórkowe w tkance pęcherza moczowego, z których UPEC jest w stanie wyjść ze stanu uśpienia, aby ponownie zainicjować aktywne ZUM, potencjalnie wyjaśniając jeden mechanizm dla tego samego nawracającego szczepu ZUM u ludzi 33,34.
Oprócz genetycznych wpływów na podatność na ZUM, wprowadzenie cewnika do pęcherza znacznie zwiększa prawdopodobieństwo infekcji, jak również zwiększa zakres bakterii zdolnych do wywołania infekcji. Wykazano, że cewnikowanie moczu u człowieka powoduje zmiany histologiczne i immunologiczne w pęcherzu moczowym spowodowane obciążeniem mechanicznym, które powoduje silną reakcję zapalną, złuszczanie, obrzęk blaszki właściwej i podśluzówki, ścieńczenie dróg moczowych i uszkodzenie błony śluzowej nabłonka dróg moczowych i nerek 35,36. Dodatkowo cewnik zapewnia powierzchnię do przyczepiania się bakterii, tworząc w ten sposób środowisko wykorzystywane przez kilka gatunków do wywoływania CAUTI. Podczas gdy UPEC jest nadal głównym współtwórcą, Enterococcus faecalis odpowiada za 15% tych CAUTI 37. E. faecalis staje się coraz bardziej oporny na antybiotyki i pojawia się oporność na wankomycynę, co stanowi poważny problem zdrowotny 38. E. faecalis posiada liczne czynniki wirulencji, w tym toksyny i adhezyny niezbędne do przyczepienia się zarówno do cewnika, jak i nabłonka 38. Podczas cewnikowania moczu gospodarz jest podatny na adhezję, namnażanie i rozsiewanie drobnoustrojów w drogach moczowych 39,40. E. faecalis tworzy biofilm na cewniku jako część mechanizmu utrzymywania się w pęcherzu moczowym i rozprzestrzeniania się do nerek, który jest odtwarzany w mysim modelu CAUTI41. Ostatnio wykazano, że podczas cewnikowania moczu fibrynogen (Fg) jest uwalniany do pęcherza moczowego w ramach odpowiedzi zapalnej. Fg gromadzi się w pęcherzu moczowym, powleka cewnik i jest niezbędny do tworzenia biofilmu E. faecalis, działając jako rusztowanie przyczepowe. W mysim modelu CAUTI C57BL/6 odkryliśmy, że tworzenie biofilmu E. faecalis na cewniku, a tym samym utrzymywanie się w pęcherzu, było zależne od pilusa Ebp, a konkretnie od jego adhezyny końcówki EbpA. Odkryliśmy, że N-końcowa domena EbpA specyficznie wiąże się z Fg pokrywającym cewnik. Ponadto stwierdzono, że E. faecalis wykorzystuje Fg jako źródło metabolitu podczas infekcji, zwiększając w ten sposób tworzenie biofilmu 42.
Modele mysie okazały się kluczowe dla zrozumienia i przewidywania klinicznych objawów ZUM i CAUTI 41. W tym artykule pokazujemy, jak przygotować inokulum izolatu UPEC UTI89 do zapalenia pęcherza moczowego i inokulację przezcewkową myszy C3H/HeN. Dodatkowo demonstrujemy protokół wprowadzania cewnika u myszy C57BL/6 i inokulacji szczepu E. faecalis OG1RF. Obie te techniki prowadzą do spójnego i niezawodnego UTI lub CAUTI u myszy. Prezentujemy również techniki stosowane do obserwacji powstawania IBC podczas ostrego zapalenia pęcherza moczowego oraz zbierania moczu do analizy przewlekłego lub nawracającego zapalenia pęcherza moczowego. Myszy C3H/HeN wykorzystano do badania aspektów patogenezy UPEC, w tym początkowej inwazji bakterii, tworzenia IBC, filamentacji i rozwoju przewlekłego zapalenia pęcherza moczowego 23,33,43. Te parametry wirulencji badano również na wielu innych środowiskach myszy 22,33. W przypadku CAUTI model C57BL/6 pozwala na zagnieżdżenie się ciała obcego do pęcherza moczowego, a następnie kolonizację bakteryjną, która może utrzymywać się przez 7 dni po zakażeniu 41. Modele te okazały się przydatne do oceny mechanizmów wirulencji bakterii, odpowiedzi gospodarza na ZUM oraz mechanizmów obalania odpowiedzi gospodarza, z których wiele zostało następnie podsumowanych lub zaobserwowanych w klinicznych populacjach ludzkich.

<table><tbody><tr><td>Materiał do przygotowania cewnika i igły:</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>igły 30 G</td><td>BD Precision Glide</td><td>305106</td><td>30 G x &frac12; (0,3 mm x 13 mm)</td></tr><tr><td>Rurka polietylenowa PE10</td><td>BD</td><td>427400</td><td>Średnica wewnętrzna -0,011 cala (0,28 mm); średnica zewnętrzna &ndash; 0,024 cala (0,61 mm)</td></tr><tr><td>Rurki silikonowe utwardzane platyną RenaSIL 025</td><td>Braintree Scientific, Inc</td><td>SIL 025</td><td>średnica wewnętrzna-0,012 x średnica zewnętrzna 0,025, cewka</td></tr><tr> 25 ft<td colspan="4">Materiał na infekcje:</td></tr><tr><td>Izoflouran &ndash; Isothesia</td><td>Butler Schein</td><td>29405</td><td>250 ml</td></tr><tr><td>Przezroczysty szklany prosty słoik</td><td>Kimble Chase</td><td>5413289V 21</td><td></td></tr><tr><td>Zaparzacz do herbaty ze stali nierdzewnej</td><td>Schefs-Amazon</td><td></td><td>Premium Luźny zaparzacz do herbaty liściastej firmy Schefs - Stal nierdzewna - Duża pojemność -</td></tr> <tr><td>Niesterylne waciki</td><td>Fisherbrand</td><td>22-456-880</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Probówki Falcon</td><td>VWR</td><td>89039-660</td><td></td></tr><tr><td>Isotec 3 -waporyzator</td><td>Ohmeda</td><td>1224478</td><td></td></tr><tr><td>Dziurkacz do uszu</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-812-201</td><td>(w razie potrzeby)</td></tr><tr><td>Roztwór betadyny</td><td>Roztwór</td><td></td> Betadine <td>10% Povidie-jodowy roztwór do stosowania miejscowego</td></tr><tr><td>Q-tips</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-037-924</td><td>6 cali</td></tr><tr><td>Pieluchy na ławkę</td><td>Fisherbrand</td><td>14206 63</td><td>Podkłady chłonne (20" Wyświetlacz X36" maty)</td></tr><tr><td>Smar chirurgiczny</td><td>Surgilube</td><td>0281-0205-36</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki preparacyjne</td><td>Narzędzia do nauk ścisłych, INC</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze Micro-Adson</td><td>Narzędzia do nauk ścisłych, INC</td><td>11018-12</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka 1 ml</td><td>BD</td><td>309659</td><td>Końcówka tuberkulinowa</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Bemis</td><td>PM996</td><td>4 cale x 125 FT</td></tr><tr><td>Stojak Eppendorf</td><td>Fisherbrand</td><td>05-541-1</td><td></td></tr><tr><td>Probówki Eppendorf</td><td>MIDSCI</td><td>AVX-T-17-C</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Pobieranie cewników, pęcherzy i nerek:</td></tr><tr><td>Homogenizator</td><td>PRO Scientific INC</td><td>Bio-Gen Pro 200</td><td></td></tr><tr><td>5 ml polipropylenowa rurka okrągłodenna</td><td>BD</td><td>352063</td><td>do homogenizacji narządów</td></tr><tr><td>Ręcznik papierowy</td><td>Georgia-Pacific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Pharmco-AAPER</td><td>11100020S</td><td>200 proof</td></tr><tr><td>Costar&trade; Przezroczyste płytki 96-dołkowe z polistyrenu</td><td>Corning</td><td>3788</td><td></td></tr><tr><td>1x sól sodowa fosforanowa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3813</td><td></td></tr><tr><td>Myjka ultradźwiękowa BRANSONIC 1210</td><td>Branson Ultrasonics Corporation</td><td>1210</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Materiały IBC:</td></tr> <tr><td>6-dołkowa płytka do badania kultur tkankowych</td><td>Produkty z tworzyw sztucznych</td><td>92006</td><td></td></tr><tr><td>Szpilki</td><td>Narzędzia do nauki</td><td>26002-20</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184</td><td>Dow Corning</td><td>3097358-1004</td><td>Zestaw elastomerów silikonowych</td></tr><tr><td>X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galaktozyd)</td><td>Invitrogen</td><td>15520-034</td><td>Ultraczysty</td></tr><tr><td>N, N-dimetyloformamid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D4551</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 (chlorek magnezu)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Deoksycholan sodu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D6750</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet-P40</td><td>Roche</td><td>11754599001</td><td>Oktylofenolpoli(eter glikolu etylenowego)n</td></tr><tr><td>Trójwodny heksacyjanożelazian(II) potasu (K-żelazocyjanek)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3289</td><td></td></tr><tr><td>Heksacyjanożelazian(III) potasu (K-żelazocyjanek)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>60299</td><td></td></tr></tbody></table>

ustalenie i charakterystyka uti i cauti w modelu mysim

Establishment and Characterization of UTI and CAUTI in a Mouse Model

Infekcje dróg moczowych (ZUM) są bardzo powszechne, stanowią istotną przyczynę zachorowalności i są coraz bardziej odporne na leczenie antybiotykami. Kobiety są nieproporcjonalnie częściej dotknięte ZUM: 50% wszystkich kobiet będzie miało ZUM w ciągu swojego życia. Ponadto 20-40% tych kobiet, które mają początkowe ZUM, będzie cierpieć na nawrót, przy czym niektóre będą cierpieć na częste nawroty z poważnym pogorszeniem jakości życia, bólem i dyskomfortem, zakłóceniami codziennych czynności, zwiększonymi kosztami opieki zdrowotnej i niewielkimi możliwościami leczenia innymi niż długoterminowa profilaktyka antybiotykowa. Uropatogenna Escherichia coli (UPEC) jest głównym czynnikiem wywołującym zakażenie układu moczowego nabytego przez społeczność. Zakażenie układu moczowego związanego z cewnikiem (CAUTI) jest najczęstszą infekcją szpitalną, która odpowiada za milion przypadków rocznie w USA i ogromne koszty opieki zdrowotnej. Podczas gdy UPEC jest również główną przyczyną CAUTI, inne czynniki sprawcze mają coraz większe znaczenie, w tym Enterococcus faecalis. Tutaj wykorzystujemy dwa dobrze znane modele mysie, które podsumowują wiele cech klinicznych tych chorób u ludzi. W przypadku ZUM model C3H/HeN podsumowuje wiele cech wirulencji UPEC obserwowanych u ludzi, w tym odpowiedzi gospodarza, tworzenie IBC i filamentację. W przypadku CAUTI wykazano, że model wykorzystujący myszy C57BL/6, które zachowują implanty pęcherza moczowego z cewnikiem, jest podatny na zakażenie pęcherza E. faecalis. Te reprezentatywne modele są wykorzystywane do uzyskania nowych, uderzających informacji na temat patogenezy choroby ZUM, co prowadzi do opracowania nowych metod leczenia i strategii leczenia lub profilaktyki.

Wewnątrz pęcherzykowe modele niepowikłanych oraz związanych z cewnikowaniem ZUM dostarczają elastycznych platform do wyjaśniania molekularnych mechanizmów patogenezy bakteryjnej, wpływu tych chorób na tkankę gospodarza oraz opracowywania i testowania nowych podejść do leczenia tych powszechnych i kosztownych infekcji. W zależności od szczepu myszy i patogenu, inokulacja wewnątrz pęcherzykowa może być wykorzystana do badania interakcji gospodarz-patogen w celu wyjaśnienia czynników niezbędnych do inicjacji lub modulowania...

Zdolność do modelowania infekcji dróg moczowych (ZUM) jest kluczowa, aby móc zrozumieć patogenezę bakterii i zapoczątkować rozwój nowych terapii. Celem tej pracy jest zademonstrowanie mysich modeli eksperymentalnego ZUM i ZUM związanego z cewnikiem, które podsumowują i przewidują wyniki obserwowane u ludzi.

Ustalenie i charakterystyka UTI i CAUTI w modelu mysim

Urinary tract infections (UTI) are highly prevalent, a significant cause of morbidity and are increasingly resistant to treatment with antibiotics. ...

Ogólnym celem tej procedury jest przedstawienie niezawodnej metody wywoływania zakażeń dróg moczowych (UTI) oraz zakażeń dróg moczowych związanych z cewnikowaniem (caUTI) w modelu mysim, a następnie ocena tych zakażeń. Jest to realizowane poprzez odpowiednie przygotowanie inokulum bakteryjnego, cewnika oraz igły, a następnie poprzez dokalecznienie i cewnikowanie dróg moczowych myszy z podaniem inokulum do pęcherza.Następnie pobiera się tkanki dróg moczowych oraz cewniki w celu oceny infekcji. Na koniec określa się stopień infekcji poprzez wyznaczenie ładunku bakteryjnego w tkankach, moczu i cewniku oraz poprzez analizę wewnątrzkomórkowych społeczności bakteryjnych lub tworzenia się IBC. Ostatecznie, do wykazania ustanowienia, trwałości i nasilenia kolonizacji dróg moczowych w modelu mysim wykorzystuje się liczenie jednostek tworzących kolonie (CFU) oraz barwienie laktofenolem.Główną zaletą tej techniki jest opracowanie wiarygodnego modelu naśladującego ludzkie ZUM, w celu odkrycia krytycznych etapów patogenezy TI. Model ten pomógł w opracowaniu nowych metod leczenia i środków terapeutycznych na ZUM. Wizualna prezentacja tej metody jest kluczowa, ponieważ inokulacja, izacja oraz ocena wewnątrzkomórkowych społeczności bakteryjnych są trudne do opanowania, gdyż manipulacje w obrębie cewki moczowej i tkanki pęcherza nie są intuicyjne.Aby rozpocząć, nawlecz około jednej cala rurki PE 10 na trzpień igły 30G. Sterylizuj w promieniach UV przez noc i przygotuj inokulum bakteryjne. Zgodnie z protokołem tekstowym, w sterylnej stacji roboczej pobierz do strzykawki o pojemności 1 ml do 0,9 mililitra przygotowanego inokulum bakteryjnego.Przymocuj przygotowaną sterylną igłę z inokulum wraz z drenem PE do strzykawki i za pomocą sterylnych nożyczek przytnij dren do długości 1 mm. Po znieczuleniu samicy myszy zgodnie z protokołem tekstowym, ułóż ją na plecach na ręczniku papierowym i rozstaw kończyny dolne. Załóż myszy stożek nosowy i zapewnij kontrolowaną podaż izofluranu.Delikatnie palpuj pęcherz, aby wywołać mikcję i upewnić się, że pęcherz jest pusty, a następnie użyj gazika nasączonego 100% etanolem do oczyszczenia obszaru okołocewkowego. Zanurz końcówkę igły strzykawki do inokulacji w lubrykancie chirurgicznym. Następnie wprowadź igłę do cewki moczowej na głębokość około 12 milimetrów i delikatnie naciśnij tłok strzykawki, aby podać 50 µL roztworu bakteryjnego do pęcherza.Aby pobrać mocz, przed lub po infekcji, delikatnie unieruchom mysz, trzymając ją za ogon i umieszczając na płaskiej, podwyższonej powierzchni, np. na górnej pokrywie klatki dla myszy. Przytrzymaj sterylną probówkę o pojemności 1,5 ml pod cewką moczową myszy i delikatnie naciśnij grzbiet zwierzęcia w pobliżu ogona, aby wywrzeć nacisk na pęcherz. Zbierz mocz do probówki.Po przygotowaniu rozcieńczeń seryjnych moczu i inkubacji przez noc, należy policzyć kolonie w celu przeprowadzenia protokołu C-A-U-T-I. Rozpocznij od odcięcia siedmiomilimetrowego odcinka rurki PE 10 oraz pięciomilimetrowego odcinka rurki silikonowej, takiej jak reil. Zdejmij nasadkę z igły o rozmiarze 30 G i użyj rurki PE 10, aby nawlec ją na igłę aż do podstawy.Następnie wprowadź rurkę silikonową do PE 10. Aby zaimplantować cewnik, przymocuj igłę cewnika do pustej strzykawki o pojemności 1 ml. Wytnij kwadratowy kawałek paraformy o boku jednej uncji i nałóż na jego wierzch niewielką ilość lubrykantu chirurgicznego.Po znieczuleniu myszy umieść ją na plecach na ręczniku papierowym i załóż maskę nosową do podawania izofluranu. Delikatnie uciśnij pęcherz moczowy, aby wywołać mikcję i upewnić się, że pęcherz jest pusty. Następnie użyj gazika nasączonego 100% etanolem, aby oczyścić obszar okołocewkowy.Następnie należy użyć 10% roztworu jodku powidonu i aplikatora z bawełnianą końcówką do dezynfekcji obszaru okocewkowego, a następnie zanurzyć końcówkę igły do inokulacji w lubrykancie chirurgicznym. Następnie wprowadź cewnik do ujścia cewki moczowej. Użyj pęsety, aby przesunąć rurkę PE w stronę pęcherza, co pozwoli na wprowadzenie mniejszego cewnika silikonowego do wnętrza pęcherza.Następnie natychmiast wyjmij igłę z wciąż przymocowaną rurką o średnicy 7 mm. Po przygotowaniu inokulum bakteryjnego EFA, zaszczep nim pęcherz moczowy i zwróć zwierzę do klatki przed oznaczeniem ładunku bakteryjnego zgodnie z poniższą procedurą. Po uśpieniu zwierzęcia ułóż je na plecach i spryskaj brzuch 70% etanolem, dokonaj sekcji myszy, pobierając kolejno pęcherz moczowy, a następnie nerki, i umieść organy w osobnych probówkach o pojemności 5 ml zawierających XPBS.Jeśli mysz posiada cewnik, należy usunąć go z pęcherza i umieścić w oddzielnej probówce. Po zhomogenizowaniu narządów, przygotowaniu rozcieńczeń seryjnych i nocnym inkubowaniu na agarze LB w warunkach tlenowych, należy policzyć kolonie w celu wyznaczenia liczby IBC. Po pobraniu pęcherza, należy umieścić go w studzience płytki sześcio-studzienkowej z powłoką silikonową wypełnionej PBS i za pomocą nożyczek przeciąć go na pół.Używając małych metalowych pinsetów umieszczonych wzdłuż zewnętrznych krawędzi, delikatnie rozchyl pęcherz tak, aby światło było skierowane do góry, a maksymalna powierzchnia urothelium była odsłonięta. Po wykonaniu barwienia XI zgodnie z protokołem tekstowym, obserwuj IBC, które pod mikroskopem stereoskopowym pojawiają się jako niebieskie punkty. Przedstawione tutaj dane obrazują kolonizację dróg moczowych w fazie ostrej przez prototypowy izolat zapalenia pęcherza moczowego up e UTI 89.Na tej rycinie przedstawiono CFU występujące cztery tygodnie po inokulacji myszy C3 HHEN dawką 2 × 10⁷ CFU szczepu U UTI I 89. W tych warunkach eksperymentalnych u 20-50% zakażonych myszy rozwija się przewlekłe zapalenie pęcherza moczowego, podczas gdy u pozostałych 50-80% myszy następuje ustąpienie zakażenia. Ilościowe oznaczenie IBC jest informacyjnym miernikiem obciążenia bakteryjnego podczas ostrego zapalenia pęcherza moczowego, a wysokie poziomy IBC korelują z ryzykiem rozwoju przewlekłego zapalenia pęcherza moczowego. Jak widać tutaj, przy zastosowaniu barwienia LAE becyase, IBC pojawiają się jako niebiesko-fioletowe punkty na urothelium, które można policzyć w tle C3 HHEN. Średnio w pęcherzu można zaobserwować około 50 IBC.Dane przedstawione w tym miejscu pochodzą z mysiego modelu implantu pęcherza w przypadku CAUTI i reprezentują 24-godzinne infekcje szczepem E. coli OG1-RF. Gdy 1 × 10⁷ CFU OG1-RF zostaną zaszczepione wewnątrz pęcherza nieimplantowanego, infekcja zaczyna ustępować do 24 HPI i zostaje całkowicie rozdzielona do 3D PI. Odwrotnie, zaszczepienie OG1-RF do pęcherza z implantem skutkuje kolonizacją zarówno cewnika, jak i pęcherza, przy czym poziomy kolonizacji w 24 HPI są dziesięciokrotnie wyższe niż w pęcherzach nieimplantowanych. Po zastosowaniu tej procedury można wykorzystać inne techniki, takie jak mikroskopia konfokalna i elektronowa, aby dalej ocenić tworzenie się IBC oraz lokalizację bakterii.Po opracowaniu techniki tej, wielu badaczy z obszaru ZPI poczuło potrzebę zbadania czynników wirulencji bakteryjnej oraz odpowiedzi gospodarza u myszy w sposób, który odzwierciedla patogenezę ludzką.

establishment-and-characterization-of-uti-and-cauti-in-a-mouse-model

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

W tym filmie zostaną zaprezentowane metody transuretralnego indukowania zakażeń dróg moczowych u myszy oraz sposoby ilościowego określania zakresu powstałych infekcji.

Transuretralna indukcja infekcji dróg moczowych u myszy

Źródło: Luyts, N. i inni. Podłużna kontrola infekcji dróg moczowych i ich leczenia u myszy za pomocą obrazowania bioluminescencji. J. Vis. Exp. (2021).Ten film pokazuje indukcję i śledzenie infekcji dróg moczowych w modelu mysim z wykorzystaniem bioluminescencyjnego E. coli wstrzykniętego do pęcherza, gdzie zachodzi adhezja, inwazja i replikacja wewnątrzkomórkowa bakterii. Światło emitowane z bioluminescencyjnego operonu służy jako wskaźnik w czasie rzeczywistym obciążenia bakteryjnego podczas...

Wizualizacja infekcji dróg moczowych w modelu myszy z wykorzystaniem bioluminescencji

Źródło: Conover, M. S. i in., J. Ustanowienie i charakterystyka ZUM i CAUTI w modelu myszym. J. Vis. Exp. (2015)Ten film pokazuje procedurę montażu i wszczepienia cewnika transurethralnego u samicy myszy, po czym następuje szczepienie bakteryjne w celu wywołania zakażenia dróg moczowych związanych z cewnikami oraz badania interakcji gospodarza z patogenem wygenerowanym przez biofilm.

Zakażenie dróg moczowych związane z cewnikami w modelu mysim

Ten film opisuje procedurę generowania eksperymentalnego modelu mysiego ksenoprzeszczepu, który może być wykorzystany do badania progresji raka urotelialnokomórkowego.

Ksenografacja guza pochodząca od pacjenta: technika generowania eksperymentalnego modelu myszy do oceny raka urotelialnego

W tym filmie opisujemy technikę dopęcherzowego podawania bakterii uropatogennych w celu wygenerowania modelu infekcji dróg moczowych u myszy. Model ten może być wykorzystany do zrozumienia rozprzestrzeniania się uropatogennej infekcji bakteryjnej w obrębie układu moczowego oraz mechanizmów określających podatność na ZUM.

Generowanie modelu infekcji dróg moczowych: technika podawania bakterii uropatogennych u myszy w celu opracowania modelu infekcji dróg moczowych

Ten film pokazuje proces zapoczątkowania uropatogennej infekcji Escherichia coli u samicy pęcherza myszy poprzez przezcewkowe wkroplenie cewnika. Wstrzyknięte bakterie z powodzeniem wywołują infekcję dróg moczowych w obrębie pęcherza moczowego, stanowiąc cenną platformę do badania chorób związanych z opieką zdrowotną związanych z drogami moczowymi.

Cewnikowanie przezcewkowe i inokulacja bakteryjna w celu wygenerowania modelu infekcji dróg moczowych u samców myszy

Opracowanie modelu infekcji dróg moczowych u samic myszy

Infekcja prostaty może być czynnikiem przyczyniającym się do pośredniczenia w bólu miednicy w przewlekłym zapaleniu gruczołu krokowego. Opisujemy procedurę przygotowania standaryzowanego inokulum bakteryjnego, wkraplania bakterii do cewki moczowej samców myszy oraz metodologii pomiaru allodynii dotykowej u myszy w czasie.

Pomiar dotykowej allodynii w mysim modelu bakteryjnego zapalenia gruczołu krokowego

Ustalony model przezcewkowego cewnikowania myszy pozwala na badanie patologii pęcherza moczowego, w tym infekcji dróg moczowych, ale może być wykonywane tylko u samic. Zaprezentowany tu nowy model wkraplania przezcewkowego u mężczyzn umożliwi prowadzenie badań w obszarze charakteryzującym się silnymi różnicami klinicznymi i epidemiologicznymi między płciami.

Zakażenie dróg moczowych w modelu małego zwierzęcia: cewnikowanie przezcewkowe samców i samic myszy

Pokazano mysi model przezcewkowej inokulacji uropatogennej E. coli (UPEC) w celu stworzenia utajonych wewnątrzkomórkowych zbiorników pęcherza moczowego, a następnie ekspozycji pęcherza moczowego na G. vaginalis w celu wywołania nawrotu UPEC UTI. Zademonstrowano również liczenie bakterii, cytologię moczu oraz utrwalanie i przetwarzanie pęcherza moczowego in situ w skaningowej mikroskopii elektronowej.

Nawracające zakażenie dróg moczowych Escherichia coli wywołane ekspozycją pęcherza moczowego Gardnerella vaginalis u myszy

Ten manuskrypt opisuje dopęcherzowe podawanie bakterii uropatogennych za pomocą operonu luksa w celu wywołania infekcji dróg moczowych u myszy i późniejszą podłużną analizę in vivo obciążenia bakteryjnego za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego.

Podłużna obserwacja zakażeń dróg moczowych i ich leczenie u myszy za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego

Poznaj metodę ustalania zakażeń dróg moczowych i związanych z cewnikiem w modelu mysim. Technika obejmuje inokulację bakteryjną, cewnikiowanie i ocenę obciążenia bakteriami oraz społeczności bakteryjne wewnątrzkomórkowe.

Ustalenie i charakterystyka UTI i CAUTI w modelu mysim

Przeglądaj więcej filmów