Metoda zadawania urazowego uszkodzenia mózgu z zamkniętą głową u Drosophila

Tutaj opisujemy metodę zadawania zamkniętego urazowego uszkodzenia mózgu (TBI) u Drosophila. Metoda ta stanowi bramę do badania mechanizmów komórkowych i molekularnych, które leżą u podstaw patologii TBI, przy użyciu szerokiej gamy narzędzi i technik eksperymentalnych dostępnych dla much.

Ogólnym celem tej procedury jest spowodowanie urazu mózgu w zamkniętej głowie. W muchach. Osiąga się to poprzez uprzednie umieszczenie much w fiolce jeden cal od dna.

Drugim krokiem jest przymocowanie fiolki do urządzenia HIIT. Następnie sprężyna jest odchylana pod określonym kątem, a fiolka jest zwalniana i pozostawiana do całkowitego spoczynku. Ostatecznie można zastosować różne behawioralne testy morfologiczne i molekularne do scharakteryzowania konsekwencji wynikającego z tego urazowego uszkodzenia mózgu.

Główną przewagą tej metody nad istniejącymi metodami, takimi jak metoda zmniejszania masy ciała gryzoni, jest to, że wiele zwierząt można badać w krótkim czasie. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie urazowego uszkodzenia mózgu, takie jak to, dlaczego konsekwencje urazowego uszkodzenia mózgu różnią się u różnych osób. Aby rozpocząć, zbierz surowce wymienione w tabeli pierwszej dołączonego protokołu tekstowego.

Zegnij zaciski za pomocą szczypiec tak, aby ściśle przylegały do sprężyny. Następnie wyśrodkuj zaciski względem szerokości deski i dociśnij je do siebie zewnętrznym zaciskiem równo z krawędzią deski. Wyreguluj sprężynę tak, aby leżała równolegle do długości deski, a następnie przymocuj zaciski do sprężyny i do deski za pomocą czterech.

Następnie owiń pasek taśmy klejącej na rzepy. Po znalezieniu się w pobliżu wolnego końca sprężyny zewnętrzna krawędź rzepu powinna być zlicowana z końcem sprężyny. Umieść pokrywę wiaderka na lód do góry nogami, wyśrodkowaną i mocno przylegającą do drewnianej deski.

Ustaw podniesiony obszar pokrywy pojemnika na lód tak, aby długa krawędź była równoległa do szerokości deski. Dosuń całe urządzenie do stałego przedmiotu, takiego jak ściana, tak aby pokrywa pojemnika na lód zaklinowała się między deską a przedmiotem i nie poruszała się. Następnie przyklej kątomierz do papieru do spodu kartonu, tackę na fiolki muchowe i ustaw ją na krawędzi przy długości deski, tak aby znak 90 stopni był wyrównany ze sprężyną.

Po przywróceniu do idealnie pionowej pozycji umieść od jednej do 60 much znieczulonych dwutlenkiem węgla w pustej fiolce i zakorkuj fiolkę za pomocą ciasno przylegającego wacika. Następnie narysuj linię na fiolce w odległości jednego cala od jej podstawy, strącić muchy z boków fiolki i wepchnij wacik, aż dopasuje się do nowo narysowanej linii. Poczekaj pięć minut, aż muchy odzyskają mobilność dzięki dwutlenkowi węgla.

Następnie włożyć koniec sprężyny do fiolki, aż wewnętrzna krawędź rzepu zrówna się z górną częścią fiolki. To mocuje fiolkę do sprężyny, tworząc szczelne złącze zaciskowe, w którym sprężyna leży płasko. Upewnij się, że w tym czasie jeden cal fiolki zachodzi na podniesiony obszar pokrywy pojemnika na lód.

Założyć ochronniki słuchu, ponieważ uderzenie fiolki o pokrywę pojemnika na lód powoduje głośny dźwięk. Następnie przytrzymaj fiolkę w okolicy rzepów za pomocą kciuka i palca wskazującego lewej ręki prawą ręką, przytrzymaj deskę mocno do blatu stołu. Następnie pociągnij sprężynę idealnie prosto z powrotem pod żądanym kątem, a następnie zwolnij sprężynę.

Poczekaj, aż sprężyna całkowicie się zatrzyma, a następnie wyjmij fiolkę ze sprężyny. Umieść fiolkę na blacie stołu i pozwól muchom dojść do siebie przez co najmniej pięć minut. W tym czasie muchy powoli odzyskują swój normalny ruch.

Następnie przenieś muchy do fiolki z pokarmem dla much w celu późniejszej analizy lub poddaj muchy kolejnemu uderzeniu, fiolki mogą być ponownie użyte. Celem eksperymentu było określenie wpływu ciężkości urazu na wskaźnik śmiertelności po 24 godzinach. O ciężkości urazu decydował kąt odchylenia sprężyny od zera do 90 stopni przed zwolnieniem.

Eksperyment przeprowadzono na muchach w dwóch różnych wieku, muchach w wieku od zera do siedmiu dni i muchach w wieku od 20 do 27 dni. Wyniki pokazują, że poważniejsze urazy powodują wyższy wskaźnik śmiertelności. Starsze muchy miały zwiększony wskaźnik śmiertelności w porównaniu z młodszymi muchami, gdy odchylenie sprężyny wynosiło 50 stopni lub więcej.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak zadać urazowe uszkodzenie mózgu za pomocą much.