Name: Wytwarzanie przeciwciał poliklonalnych specyficznych dla Nurr-1 wolnych od reaktywności krzyżowej przeciwko jego bliskim homologom, Nor1 i Nur77 (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 30 s
Description: Poznaj metodę usuwania przeciwciał o reaktywności krzyżowej w celu zwiększenia specyficzności przeciwciał przeciwko homologicznym białkom Nurr-1, Nor1 i Nur77.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty NIH (NS070577 i NS084869).

Uwaga: Skład wszystkich rozwiązań wymienionych poniżej można znaleźć w Tabeli Materiałów/Sprzętu.
1. Oczyszczanie przeciwciał w kolumnie białka A
<ol>
	<li>Przed rozpoczęciem zabiegu należy zrównoważyć kolumnę wirową białka A i wszystkie wymagane do temperatury pokojowej przez 15 minut.</li>
	<li>Rozcieńczyć surowicę immunologiczną w stosunku 1:1 buforem wiążącym białko A IgG. (zalecane 5 ml surowicy).</li>
	<li>Delikatnie postukaj w kolumnę wirującą z białkiem A na blacie stołu, aby usunąć żywicę, która może utknąć w nasadce. Zdejmij górną nasadkę i delikatnie oderwij dolne zamknięcie. Umieścić kolumnę w probówce zbiorczej o pojemności 15 ml i odczekać, aż roztwór do przechowywania spłynie.</li>
	<li>Dodać 5 ml buforu wiążącego białko A IgG i odczekać, aż roztwór odpłynie.</li>
	<li>Nanieść rozcieńczoną surowicę immunologiczną na kolumnę i zebrać przepływ. Aby uzyskać najlepsze wyniki, dodaj objętość próbki, która zawiera stężenie przeciwciał mniejsze niż 80% zdolności kolumny do wiązania przeciwciał</li>.
	<li>Przepłukać kolumnę 15 ml buforu wiążącego białko A IgG lub do momentu, gdy absorbancja przy 280 nm spadnie poniżej 0,1.</li>
	<li>Dodać 100 μl buforu neutralizującego do pięciu oznakowanych probówek zbiorczych.</li>
	<li>Dodać 5 ml buforu elucyjnego IgG do kolumny z białkiem A i zebrać 1 ml frakcji w każdej z probówek zawierających 100 μl buforu neutralizującego.</li>
	<li>Zmierzyć absorbancję każdej frakcji przy 280 nm i frakcjach pulowych o absorbancji większej niż 0,5. Trzymaj zebrane frakcje na lodzie, aż będą gotowe do dializy.</li>
	<li>Zregenerować kolumnę, dodając 8 ml buforu elucyjnego IgG i pozwolić, aby roztwór przepłynął przez kolumnę.</li>
	<li>Przepłukać kolumnę roztworem wiążącym białko A IgG, aż pH eluentu powróci do 7,4.</li>
	<li>Przechowywać kolumnę, dodając 5 ml roztworu do przechowywania (0,02% azydku sodu w PBS). Gdy w kolumnie pozostanie około 3 ml, zakryj dno i zabezpiecz górną nakrętkę. Przechowywać kolumnę w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Określ potrzebną długość rurki do dializy zgodnie z instrukcjami producenta. Używając rurki o płaskiej średnicy 16 mm, użyj 5,47 cm długości rurki na ml roztworu, który ma być dializowany. Przeciąć rurkę i płukać PBS pH 7,4 przez 15 do 30 minut.</li>
	<li>Złożyć i zapiąć jeden koniec rurki do dializy, przenieść zebrane frakcje zawierające IgG do rurki dializacyjnej o pH 7,4 i zamknąć drugi koniec.</li>
	<li>Dializować w temperaturze pokojowej w stosunku do 200 objętości PBS o pH 7,4 przez 2 godziny.</li>
	<li>Zmienić bufor dializacyjny (świeży PBS pH 7,4) i dializować przez kolejne 2 godziny w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Zmienić bufor do dializy (świeży PBS o pH 7,4) i dializować przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przechowywać dializowany roztwór przeciwciała w temperaturze 4 °C do momentu, gdy będzie on gotowy do przejścia do dalszych etapów oczyszczania.</li>
	<li>Ocenić stężenie przeciwciał, wykorzystując ich absorbancję przy 280 nm i molowy współczynnik absorpcji przeciwciał przy 280 nm wynoszący 210 000 M-1 cm-112.</li>
</ol>
2. Sprzężenie białek LBD z żywicą sprzęgającą AminoLink
<ol>
	<li>Przygotuj dwie kolumny, jedną dla Nor1, a drugą dla Nur77. Postępuj zgodnie z tym samym protokołem dla obu białek.</li>
	<li>Rozmrozić białko, które ma być sprzężone z żywicą na lodzie. Oznaczyć stężenie białka za pomocą jego molowego współczynnika ekstynkcji i jego absorbancji przy 280 nm12.
	<ol>
		<li>Alternatywnie można zastosować test oznaczania białka, taki jak test kwasu bicinchoninowego13. Jeśli białko jest rozpuszczone w buforze zawierającym aminy, dializuj lub wymieniaj bufor z buforem sprzęgającym. Jeśli białko znajduje się w odpowiednim buforze (bez wolnych amin), rozcieńcz je 4-krotnie w buforze sprzęgającym.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Użyj 2 ml żywicy na 2 mg białka. Wszystkie poniższe kroki dotyczą 2 ml żywicy w kolumnie o pojemności 10 ml. Na 1 ml żywicy (2 ml zawiesiny w proporcji 1:1) można połączyć do 10 mg białka</li>.
	<li>Przygotować kolumnę o pojemności 10 ml, popychając frytę na dno i przepuszczając przez nią PBS o pH 7,4. Zakryć dno kolumny i dodać 2 ml buforu sprzęgającego.</li>
	<li>Dodać żądaną objętość gnojowicy (4 ml w celu uzyskania 2 ml żywicy) do kolumny, zdjąć dolną nasadkę i pozwolić kolumnie spłynąć. Przepłukać kolumnę łącznie 6 ml (3 objętości złoża żywicy) buforu sprzęgającego i pozostawić kolumnę do opróżnienia. Po opróżnieniu bufora sprzęgającego załóż dolną zaślepkę.</li>
	<li>Dodać 2-4 ml białka zawieszonego w buforze sprzęgającym do kolumny (zachować podwielokrotność roztworu białkowego w celu oceny skuteczności sprzęgania przez porównanie stężenia białka w eluacie w kroku 2.11 przy użyciu absorbancji przy 280 nm lub testu bicynchoninowego). Zakręć i wymieszaj od końca do końca, aby uzyskać jednorodny roztwór.</li>
	<li>Zważyć pustą probówkę do mikrowirówki o pojemności 1,8 ml i przenieść do dygestorium. Ostrożnie przenieść NaCNBH3 (około 0,05 g) do wstępnie zważonej probówki. Zamknąć probówkę i zważyć probówkę zawierającą NaCNBH3. Nie otwieraj rurki na zewnątrz maski.</li>
	<li>W oparciu o masę NaCNBH3 przeniesionego do probówki, należy przygotować 5 M roztwór, dodając 1 M NaOH. Masa cząsteczkowa NaCNBH3 wynosi 62.84 g, dlatego 0.05 g jest równe (0.05/62.84 = 7.96 x 10-4 mole) 7.96 x 10-4 mole. Aby przygotować 5 M roztwór, dodać (7,96 x 10-4 /5) 159 μl 1 M NaOH.</li>
	<li>Zmierz całkowitą objętość reakcji, biorąc pod uwagę objętość żywicy. Dodać 10 μl 5 M NaCNBH3 na ml reakcji.
	<ol>
		<li>Na przykład: dla objętości reakcyjnej 4 ml dodać 40 μl 5 M NaCNBH3. Na 1 ml żywicy i 3 ml dodanego białka całkowita objętość wynosi 4 ml.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zakryj kolumnę i mieszaj koniec po końcu. Zabezpieczyć kolumnę na rotatorze rurowym i pozostawić reakcję na noc w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Rano przynieś kolumnę do okapu chemicznego i ostrożnie zdejmij nasadkę, ponieważ mógł powstać trochę gazu. Opróżnić kolumnę do czystej probówki i zachować eluat do pomiaru stężenia białka przy użyciu metodyabsorbancji 280 nm 12 lub testu kwasu bicinchoninowego i porównać go z wyjściowym stężeniem białka w kroku 2.6.</li>
	<li>Umyć żywicę 4 ml buforu sprzęgającego i pozwolić kolumnie spłynąć.</li>
</ol>
3. Blokowanie pozostałych stron
<ol>
	<li>Przemyć żywicę 4 ml buforu hartującego. Opróżnij i załóż dolną nakrętkę. Dodać 2 ml buforu hartowniczego i zawiesić żywicę.</li>
	<li>Ocenić całkowitą objętość reakcji, mierząc objętość żywicy i objętość buforu hartującego, a następnie dodać 10 μl 5 M NaCNBH3 na ml objętości reakcyjnej.</li>
	<li>Mieszaj delikatnie w temperaturze pokojowej przez 30 minut od końca. Po 30 minutach umieścić kolumnę w dygestorium. Ostrożnie zdejmij górną część, a następnie zdejmij dolną nasadkę i pozwól, aby kolumna spłynęła do rurki odpływowej.</li>
	<li>Przemyć kolumnę 5 objętościami żywicy roztworu do mycia. Monitorować płukanie pod kątem obecności resztek białek, mierząc absorbancję eluatu przy 280 nm. Niesprzężone białka są wypłukiwane przez wysokie stężenie soli.</li>
	<li>Przemyć żywicę 6 ml odgazowanego PBS o pH 7,4 zawierającego 0,02% azydku sodu. Utrzymywać kolumnę w temperaturze 4 °C do czasu, gdy będzie potrzebna.</li>
</ol>
4. Oczyszczanie przeciwciał specyficznych dla Nurr1
<ol>
	<li>Przepłukać sprzężoną kolumnę Nur77 LBD 10 ml PBS o pH 7,4 i pozwolić kolumnie spłynąć. Zakryj dno kolumny i umieść opróżnioną kolumnę sprzężoną z Nur77 LBD w nowej probówce zbiorczej o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Dodać 5 ml oczyszczonych przeciwciał anty-Nurr1 z białka A, zakryć kolumnę i umieścić na rotatorze w temperaturze 4 °C na 1 godzinę. Zdjąć górną i dolną nakrętkę i zebrać przepływ. Odstawić na lód, aż będzie gotowy do dodania do kolumny sprzężonej Nor1 LBD.</li>
	<li>Przepłukać kolumnę sprzężoną z Nor1 LBD 10 ml PBS o pH 7,4 i pozwolić kolumnie spłynąć. Zakryj dno kolumny i umieść sprzężoną kolumnę Nor1 LBD w probówce zbiorczej o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Dodać przepływ z kolumny sprzężonej Nur77 LBD, zakryć kolumnę i umieścić na rotatorze w temperaturze 4 °C na 1 godzinę. Zdejmij górną i dolną zaślepkę i zbierz przepływ.</li>
	<li>Zmierzyć stężenie przeciwciał, mierząc absorbancję przy 280 nm.</li>
</ol>
5. Analiza oczyszczonego przeciwciała anty-Nurr1 oparta na teście ELISA
<ol>
	<li>Dodać 100 μl białka (2,5 μg/ml) do dołków płytki 96-dołkowej. W przypadku badania 3 różnych białek, dodać 100 μl białka 1 do studzienek A1 do H4, 100 μl białka 2 do studzienek A5 do H8 i 100 μl białka 3 do dołków A9 do H12. Przykryć płytkę i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przemyć powlekane studzienki dwukrotnie 300 μl na studzienkę o pH PBS 7,4 i dodać 300 μl buforu blokującego ELISA do wszystkich studzienek pokrytych antygenem i inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Podczas gdy płytka się blokuje, należy przygotować pożądane początkowe rozcieńczenie oczyszczonego przeciwciała anty-Nurr1 (w zakresie od 10 do 100 μg/ml) w buforze blokującym ELISA.</li>
	<li>Po 2 godzinach blokowania zastąp bufor blokowy ELISA 100 μl świeżego bufora blokowego ELISA do wszystkich studzienek.</li>
	<li>Dodać 100 μl rozcieńczonego, oczyszczonego przeciwciała anty-Nurr1 do wszystkich studzienek w rzędzie A. Seryjnie rozcieńczyć przeciwciała, przenosząc 100 μl roztworu z rzędu A do studzienek w rzędzie B, a następnie przenieść 100 μl roztworu z rzędu B do rzędu C, kontynuując w dół do rzędu G. Po wymieszaniu roztworów w studzienkach w rzędzie G wyrzucić dodatkowe 100 μl. Studzienki w rzędzie H otrzymują tylko początkowe 100 μl buforu blokującego. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.</li>
	<li>Umyj płytkę trzy (3) razy 300 μl na studzienkę 0,05% Tween 20 w PBS pH 7,4 i osusz płytkę, aby usunąć nadmiar buforu do mycia.</li>
	<li>Dodać 100 μl sprzężonej z peroksydazą chrzanową (HRP) koziej anty-króliczej IgG rozcieńczonej w buforze blokowym ELISA (rozcieńczenie 1:8 000; typowy zakres wynosi od 1:5 000 do 1:25 000). Inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.</li>
	<li>Umyć płytkę trzy (3) razy, jak opisano w ppkt 5.6. Przepłucz wszystkie studzienki, napełniając je 300 μl wody dejonizowanej. Zetrzyj nadmiar wody, odwracając płytkę na papier absorpcyjny.</li>
	<li>Dodać 100 μl 3, 3', 5, 5' tetrametylobenzydyny (ogrzanej do temperatury pokojowej) do wszystkich studzienek i inkubować 15 do 30 minut w ciemności w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Zatrzymać reakcję przez dodanie 50 μl 2 N H2SO4.</li>
	<li>Odczyt absorbancji przy 450 nm, odejmowanie tła przy 650 nm.</li>
</ol>

<ol><li>Hawk, J. D., Abel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+NR4A+transcription+factors+in+memory+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res.+Bull%22%5BJournal%5D)">The role of NR4A transcription factors in memory formation.</a> Brain Res. Bull. 85 (1-2), 21-29 (2011).</li>
<li>Law, S. W., Conneely, O. M., DeMayo, F. J., O'Malley, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+new+brain-specific+transcription+factor%2C+NURR1%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Identification of a new brain-specific transcription factor, NURR1.</a> Mol. Endocrinol. 6 (12), 2129-2135 (1992).</li>
<li>Zetterström, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+neuron+agenesis+in+Nurr1-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Dopamine neuron agenesis in Nurr1-deficient mice.</a> Science. 276 (5310), 248-250 (1997).</li>
<li>Kadkhodaei, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nurr1+is+required+for+maintenance+of+maturing+and+adult+midbrain+dopamine+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Nurr1 is required for maintenance of maturing and adult midbrain dopamine neurons.</a> J. Neurosci. 29 (50), 15923-15932 (2009).</li>
<li>Decressac, M., Volakakis, N., Björklund, A., Perlmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NURR1+in+Parkinson+disease--from+pathogenesis+to+therapeutic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurol%22%5BJournal%5D)">NURR1 in Parkinson disease--from pathogenesis to therapeutic potential.</a> Nat Rev Neurol. 9 (11), 629-636 (2013).</li>
<li>Peña de Ortiz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hippocampal+Expression+of+the+Orphan+Nuclear+Receptor+Gene+hzf-3%2Fnurr1+during+Spatial+Discrimination+Learning%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Learn+Mem%22%5BJournal%5D)">Hippocampal Expression of the Orphan Nuclear Receptor Gene hzf-3/nurr1 during Spatial Discrimination Learning.</a> Neurobiol Learn Mem. 74 (2), 161-175 (2000).</li>
<li>Vecsey, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+deacetylase+inhibitors+enhance+memory+and+synaptic+plasticity+via+CREB%3ACBP-dependent+transcriptional+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Histone deacetylase inhibitors enhance memory and synaptic plasticity via CREB:CBP-dependent transcriptional activation.</a> J. Neurosci. 27 (23), 6128-6140 (2007).</li>
<li>Colón-Cesario, W. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knockdown+of+Nurr1+in+the+rat+hippocampus%3A+implications+to+spatial+discrimination+learning+and+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Learn+Mem%22%5BJournal%5D)">Knockdown of Nurr1 in the rat hippocampus: implications to spatial discrimination learning and memory.</a> Learn Mem. 13 (6), 734-744 (2006).</li>
<li>McQuown, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HDAC3+is+a+critical+negative+regulator+of+long-term+memory+formation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">HDAC3 is a critical negative regulator of long-term memory formation.</a> J. Neurosci. 31 (2), 764-774 (2011).</li>
<li>Hawk, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NR4A+nuclear+receptors+support+memory+enhancement+by+histone+deacetylase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">NR4A nuclear receptors support memory enhancement by histone deacetylase inhibitors.</a> J. Clin. Invest. 122 (10), 3593-3602 (2012).</li>
<li>Bridi, M. S., Abel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+NR4A+orphan+nuclear+receptors+mediate+transcription-dependent+hippocampal+synaptic+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Learn+Mem%22%5BJournal%5D)">The NR4A orphan nuclear receptors mediate transcription-dependent hippocampal synaptic plasticity.</a> Neurobiol Learn Mem. 105, 151-158 (2013).</li>
<li>Gill, S. C., von Hippel, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calculation+of+protein+extinction+coefficients+from+amino+acid+sequence+data%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Calculation of protein extinction coefficients from amino acid sequence data.</a> Anal. Biochem. 182 (2), 319-326 (1989).</li>
<li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Anal. Biochem. 150 (1), 76-85 (1985).</li>
<li>Zetterström, R. H., Williams, R., Perlmann, T., Olson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+expression+of+the+immediate+early+transcription+factors+Nurr1+and+NGFI-B+suggests+a+gene+regulatory+role+in+several+brain+regions+including+the+nigrostriatal+dopamine+system%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res.+Mol.+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Cellular expression of the immediate early transcription factors Nurr1 and NGFI-B suggests a gene regulatory role in several brain regions including the nigrostriatal dopamine system.</a> Brain Res. Mol. Brain Res. 41 (1-2), 111-120 (1996).</li>
<li>Xiao, Q., Castillo, S. O., Nikodem, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+messenger+RNAs+for+the+orphan+nuclear+receptors+Nurr1+and+Nur77+%28NGFI-B%29+in+adult+rat+brain+using+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Distribution of messenger RNAs for the orphan nuclear receptors Nurr1 and Nur77 (NGFI-B) in adult rat brain using in situ hybridization.</a> Neuroscience. 75 (1), 221-230 (1996).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Sukces tego protokołu zależy od dostępności czystych białek do scharakteryzowania przeciwciał podniesionych przeciwko określonemu członkowi rodziny białek będących przedmiotem zainteresowania. Nie ma potrzeby oczyszczania przeciwciał za pomocą białka A/G, dopóki nie zostanie wyraźnie ustalone, że istnieją znaczące reaktywności krzyżowe za pomocą testu ELISA i Western blot.
Jak stwierdzono w tekście, ważne jest, aby unikać zawieszania białka (białek), które mają być usieciowane w kolumnie w buf...

Czynnik transkrypcyjny Nurr1 i jego homologi (Nur77 i Nor1) należą do podrodziny receptorów jądrowych 4A (NR4A)1. Są również receptorami sierocymi, ponieważ ich endogenne ligandy nie są jeszcze zidentyfikowane. Nurr1 został po raz pierwszy sklonowany w 1992 roku i chociaż wiadomo, że ulega ekspresji w mózgu2, jego zasadnicza rola w rozwoju i utrzymaniu neuronów dopaminowych w śródmózgowiu została ujawniona w badaniach na myszach z nokautem3. Ponadto jego ważna rola w utrzymaniu neuronów dopaminowych w śródmózgowiu została niedawno wykazana w badaniu z warunkowym nokautem4. Ze względu na te eleganckie badania pokazujące krytyczną rolę Nurr1 dla neuronów dopaminy śródmózgowia, wiele późniejszych badań w dużej mierze koncentrowało się na neuronach dopaminowych w śródmózgowiu i zaburzeniu neurodegeneracyjnym związanym z dopaminą, chorobie Parkinsona (PD)5.
Warto zauważyć, że Nurr1 jest wyrażany nie tylko w neuronach dopaminy śródmózgowia (mDA), ale także w różnych obszarach mózgu2, co sugeruje, że może pełnić funkcjonalne role w wielu obszarach nie-DA, co jest silnie wspierane przez nowsze badania pokazujące, że Nurr1 odgrywa ważną rolę w różnych funkcjach mózgu. Na przykład wykazano, że czynności indukujące pamięć, takie jak uczenie się lub inne zadania zależne od hipokampa, powodują regulację w górę ekspresji Nurr1 w hipokampie6,7. Ponadto, obniżenie ekspresji Nurr1 w hipokampie było wystarczające do upośledzenia pamięci długotrwałej i/lub plastyczności synaptycznej8-11, co silnie sugeruje, że Nurr1 odgrywa różne role w wielu obszarach mózgu. Tak więc, aby lepiej zrozumieć specyficzną dla typu komórki i subkomórkową ekspresję Nurr1, pożądane jest użycie przeciwciał specyficznych dla Nurr1, które nie wykazują żadnej reaktywności krzyżowej z jego homologami Nur77 lub Nor1. W artykule opisano protokół wstępnej adsorpcji w celu wytworzenia przeciwciał specyficznych dla Nurr1 i przedstawiono dodatkowe dane pokazujące jego specyficzność.

<table><tbody><tr><td>Oczyszczona domena wiążąca ligand z Nurr1, Nor 1 i Nur77</td><td></td><td></td><td>Roztwór do przechowywania kolumn</td></tr><tr><td>Żywica sprzęgająca AminoLink i zestaw</td><td>Thermo Scientific</td><td>44890</td><td></td></tr><tr><td>Kolumna wirowa białka</td><td>A Thermo Scientific</td><td>89978</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco</td><td></td><td>Corning 21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>96 well Płyty z płaskim dnem, wysoki kołnierz, 330 &mu; l</td><td>Thermo Scientific</td><td>3455</td><td></td></tr><tr><td>10% Normalna surowica kozia</td><td>KPL</td><td>50-675-69</td><td></td></tr><tr><td>Rozcieńczalnik do mleka / Koncentrat blokujący&nbsp;</td><td>KPL</td><td>50-82-01</td><td></td></tr><tr><td>Bufor elucyjny IgG</td><td>Thermo Scientific</td><td>21004</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania białek Micro BCA</td><td>Thermo Scientific</td><td>23235</td><td></td></tr><tr><td>Anty-królicza IgG (H+L) sprzężona z peroksydazą chrzanowa kozia Thermo</td> <td>Scientific</td><td>31460</td><td></td></tr><tr><td>Żywica Ni-NTA</td><td>Thermo Scientific</td><td>88221</td><td></td></tr><tr><td>3, 3', 5, 5' Tetramethylbenzydine</td><td>Thermo Scientific</td><td>34028</td><td></td></tr><tr><td>2N H2SO4</td><td>Macron Fine Chemicals</td><td>H381 05</td><td></td></tr><tr><td>Bufor wiążący białko A IgG</td><td>Thermo Scientific</td><td>21001</td><td></td></tr><tr><td>Bufor elucyjny IgG</td><td>Thermo Scientific</td><td>21004</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór do przechowywania</td><td></td><td></td><td>kolumn Bufor fosforanowy Sól fizjologiczna zawierająca 0,02% azydek sodu</td></tr><tr><td>Spectra/Por 7 wstępnie obrobione rurki dializacyjne</td><td>Spectrum Labs</td><td>132128</td><td></td></tr><tr><td>10 ml Kolumny jednorazowe</td><td>Thermo Scientific</td><td>29924</td><td></td></tr><tr><td>Bufor</td><td></td><td></td> sprzęgający AminoLink <td>0,1 M fosforan sodu, 0,05% NaN3, pH 7,0</td></tr><tr><td>Bufor</td><td></td><td></td> hartujący <td>1M Tris. HCI, 0,05% NaN3, pH 7,4</td></tr><tr><td>Roztwór</td><td></td><td></td> myjący <td>1M NaCl, 0,05% NaN3</td></tr><tr><td>ELISA Bufor</td><td></td><td></td> blokujący <td>1% Normalna surowica końska (NHS), 1% Normalna surowica kozia (NGS) w 1X Rozcieńczalnik do mleka KPL</td></tr><tr><td>Roztwór</td><td></td><td></td> do przechowywania <td>PBS pH 7,4 zawierający 0,02% azydku sodu</td></tr><tr><td>Mikropipety: 10 &mu; l; 20 &mu; l; 200 &mu; l; 1000 &mu; l</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

wytwarzanie przeciwciał poliklonalnych specyficznych dla nurr-1 wolnych od reaktywności krzyżowej przeciwko jego bliskim homologom, nor1 i nur77

Production of Nurr-1 Specific Polyclonal Antibodies Free of Cross-reactivity Against Its Close Homologs, Nor1 and Nur77

Podrodzina receptorów jądrowych 4 (NR4A) składa się z 3 powiązanych białek dzielących domenę wiążącą DNA (DBD) i domenę wiążącą ligand (LBD). Białko 1 związane z receptorem jądrowym (Nurr1 lub NR4A2) odgrywa kluczową rolę w utrzymaniu układu dopaminergicznego. Dysfunkcje dopaminy związane z genem Nurr1 obejmują między innymi chorobę Parkinsona, schizofrenię i depresję maniakalną. Co więcej, ostatnie dowody wskazują, że Nurr1 ulega również ekspresji w innych obszarach mózgu, takich jak hipokamp i odgrywa kluczową rolę w uczeniu się i pamięci. Pozostali członkowie rodziny to czynnik wzrostu nerwów IB (Nur77 lub NR4A1) i receptor sierocy pochodzenia neuronalnego 1 (NOR1 lub NR4A3). Aby pomóc w zbadaniu dokładnych funkcjonalnych ról Nurr1 w dysfunkcjach neuronalnych związanych z dopaminergią i innymi regionami mózgu, potrzebne były przeciwciała pozbawione reaktywności krzyżowej przeciwko Nur77 i NOR1. Ponieważ białka są bardziej rozbieżne w swoich LBD niż w ich domenach wiążących DNA, immunizacja oczyszczonymi LBD powinna dać przeciwciała specyficzne dla Nurr1 z minimalnymi reaktywnościami przeciwko Nur77 i / lub NOR1. Chociaż udało się wytworzyć przeciwciała anty-Nurr1, wykazały one znaczną immunoreaktywność w stosunku do innych członków rodziny. Chromatografia powinowactwa nad unieruchomionym białkiem A, a następnie wstępna adsorpcja przeciwko unieruchomionym LBD Nur77 i NOR1 dała przeciwciała specyficzne dla Nurr1 wolne od reaktywności krzyżowej. W tym przypadku selektywnie celujemy w przeciwciała przeciwko określonemu członkowi wysoce konserwatywnej rodziny białek, immunizując zwierzęta ich najbardziej rozbieżnymi regionami, a następnie usuwając przeciwciała reagujące krzyżowo przez wstępną adsorpcję. Celem protokołu jest zwiększenie swoistości przeciwciał poliklonalnych poprzez wstępną adsorpcję przeciwko antygenom reagującym krzyżowo.

Porównanie przeciwciał specyficznych dla Nurr1 oczyszczonych na kolumnie z Proteiną A z przeciwciałami anty-Nurr1 oczyszczonymi Proteiną A, a następnie przepuszczonymi przez kolumny z LBD Nur77 i LBD Nor1, przedstawiono na Rysunku 1. Jak widać, przeciwciało Nurr1 oczyszczone Proteiną A wykazało silne wiązanie z LBD Nurr1. Wykazało ono jednak również znaczące wiązanie z LBD Nur77 oraz LBD Nor1. Po dodatkowym oczyszczaniu przeciwciał Nurr1 oczyszczonych Proteiną A przeciwko LBD Nur77 i LBD Nor1, końcowe pr...

Tutaj selektywnie celujemy w przeciwciała przeciwko określonemu członkowi wysoce konserwatywnej rodziny białek, immunizując zwierzęta ich najbardziej rozbieżnymi regionami, a następnie usuwając przeciwciała reagujące krzyżowo przez wstępną adsorpcję.

Wytwarzanie przeciwciał poliklonalnych specyficznych dla Nurr-1 wolnych od reaktywności krzyżowej przeciwko jego bliskim homologom, Nor1 i Nur77

The nuclear receptor subfamily 4 (NR4A) is composed of 3 related proteins sharing a DNA binding domain (DBD) and a ligand-binding domain (LBD). The ...

Ogólnym celem tej procedury jest zwiększenie swoistości przeciwciał skierowanych przeciwko białkom o bliskim pokrewieństwie poprzez usunięcie przeciwciał wykazujących reaktywność krzyżową. Osiąga się to najpierw poprzez zidentyfikowanie domen białkowych o największej dywergencji pomiędzy białkami homologicznymi. Drugim krokiem jest ekspresja i oczyszczanie tych domen białkowych.Następnie domeny białkowe te są łączone poprzez terminal N lub C z macierzą chromatograficzną. W niniejszej demonstracji zastosowano Spheros. Ostatnim etapem jest inkubacja serum odpornościowego z żywicami sprzężonymi z każdą z domen reaktywnych krzyżowo.Ostatecznie, w celu oceny skuteczności procedury przeprowadzane są testy ELISA oraz Western blotting. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak zastosowanie przeciwciał monoklonalnych lub oczyszczanie powinowactwem, jest możliwość zachowania powinowactwa do pożądanego celu przy jednoczesnym wyeliminowaniu znanych epitopów krzyżowo reagujących. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają trudności ze względu na niestabilność białka, które starają się badać.Procedurę tę zaprezentuje dr Uri Kim, stażysta postdoctoralny z naszego laboratorium. Badanie to wymaga zastosowania dwóch kolumn: jednej dla neuronowego osieroconego receptora (nor1) oraz drugiej dla czynnika wzrostu NER IB (nor77). Ponieważ ten sam protokół odnosi się do obu białek, zademonstrowane zostanie przygotowanie tylko jednej kolumny.Odmrozić na lodzie białko przeznaczone do sprzężenia z żywicą, a następnie wyznaczyć stężenie białka, korzystając z jego molowego współczynnika wymierania oraz absorbancji przy 280 nanometrach. Użyć 2 ml żywicy na 2 mg białka. Wszystkie kolejne kroki dotyczą 2 ml żywicy.W kolumnie o pojemności 10 ml przygotuj kolumnę 10 ml, dociskając FR do dna i przepuszczając przez nią PBS pH 7,4. Zamknij dno kolumny i dodaj dwa mililitry buforu sprzęgającego. Dodaj do kolumny cztery mililitry zawiesiny, aby uzyskać dwa mililitry żywicy.Zdejmij dolną zatyczkę i pozwól kolumnie całkowicie się opróżnić. Przepłucz kolumnę łącznie sześcioma mililitrami lub trzema objętościami złoża żywicy buforu do sprzęgania, a następnie pozwól kolumnie spłynąć. Po odpłynięciu buforu do sprzęgania załóż ponownie dolną zatyczkę.Następnie do kolumny należy dodać od dwóch do czterech mililitrów białka zawieszonego w buforze sprzęgającym. Należy zachować alikwot roztworu białka w celu oceny wydajności sprzęgania. Następnie należy zamknąć kolumnę i wymieszać ją metodą odwracania.Aby przygotować jednorodny roztwór, zmierz całkowitą objętość reakcji, uwzględniając objętość żywicy, a następnie dodaj 10 µL pięciomolarnego borowodorku sodu na każdy mililitr reakcji. Zamknij kolumnę i wymieszaj. Umieść kolumnę w rotatorze do probówek i pozostaw reakcję na noc.Następnego ranka, w temperaturze 4°C, przenieś kolumnę do dygestorium i ostrożnie zdejmij korek, ponieważ mogły powstać gazy. Zlej zawartość kolumny do czystej probówki i zachowaj eluat. Następnie zmierz stężenie białka w eluacie i porównaj je z początkowym stężeniem białka.Aby ocenić wydajność sprzęgania, należy przemyć żywicę czterema mililitrami buforu do sprzęgania i pozwolić kolumnie całkowicie spłynąć. Po sprzęganiu domeny wiążącej ligand lub LBD z żywicą, kolejnym krokiem jest zablokowanie pozostałych miejsc. Aby rozpocząć tę procedurę, należy przemyć żywicę czterema mililitrami buforu gaszącego, odczekać do spłynięcia i założyć dolną zatyczkę.Dodaj dwa mililitry buforu gaszącego i zresuspenduj żywicę. Określ całkowitą objętość reakcji, mierząc objętość żywicy oraz objętość buforu gaszącego. Dodaj 10 µL pięcio molowego cyjanoborowodorku sodu na każdy mililitr objętości reakcji.Mieszaj delikatnie w temperaturze pokojowej przez 30 minut, obracając kolumnę koniec w koniec. Po 30 minutach przenieś kolumnę do dygestorium. Ostrożnie zdejmij górną zatyczkę, a następnie zdejmij dolną zatyczkę i pozwól zawartości kolumny spłynąć do probówki z odpadami.Przemyj kolumnę pięciokrotnością objętości żywicy roztworem do płukania. Monitoruj proces płukania pod kątem obecności resztkowych białek, mierząc absorbancję wycieku przy 280 nm; białka niepołączone zostaną usunięte dzięki wysokiemu stężeniu soli. Na koniec przemyj żywicę sześcioma mililitrami PBS DGAs zawierającego 0,02% azotku sodu i przechowuj kolumnę w temperaturze 4 °C do czasu użycia.Rozpocznij procedurę oczyszczania swoistych przeciwciał przeciwko NORE 1, płucząc kolumnę z unieruchomioną domeną LBD NORE 77 10 mililitrami PBS i pozwalając na spływ cieczy. Zakręć dół kolumny i umieść opróżnioną kolumnę z unieruchomioną domeną LBD NORE 77 w nowej probówce kolektorycznej o pojemności 15 mililitrów. Dodaj do kolumny pięć mililitrów białka zawierającego oczyszczone przeciwciała anty-NORE 1 i zakręć ją. Umieść kolumnę na rotatorze w temperaturze 4 °C na jedną godzinę.Następnie zdejmij górną i dolną zatyczkę i zbierz przelew. Odstaw przelew na lód do momentu, aż będzie należało dodać go do jednej kolumny sprzężonej LBD.Przepłucz kolumnę z unieruchomionym LBD 10 mililitrami PBS i poczekaj, aż kolumna zostanie opróżniona; załóż zatyczkę na dno kolumny i umieść kolumnę z unieruchomionym LBD w probówce zbierającej o pojemności 15 mililitrów. Dodaj prześwit z kolumny z unieruchomionym LBD. Zamknij kolumnę i umieść ją w rotorze w temperaturze czterech stopni Celsjusza na jedną godzinę.Po jednej godzinie należy zdjąć górną i dolną nasadkę i zebrać ciecz przejściową. Stężenie przeciwciał należy określić, mierząc absorbancję przy 280 nanometrach.Oczyszczone przeciwciało anty-nore1 jest następnie analizowane za pomocą testu ELISA. Do studni płytki 96-dołkowej należy dodać 100 µL białka. W przypadku badania trzech różnych białek, dodać 100 µL białka 1 do studni A1–H4, 100 µL białka 2 do studni A5–H8 oraz 100 µL białka 3 do studni A9–H12.Przykryć płytkę i inkubować przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego ranka dwukrotnie przemyć powlekane studzienki 300 µL PBS na studzienkę. Następnie dodać 300 µL buforu blokującego do ELISA do wszystkich studnienek powlekanych antygenem i inkubować w temperaturze pokojowej przez dwie godziny.Po dwóch godzinach blokowania należy zastąpić bufor blokujący ELISA w każdej studzience 100 µL świeżego buforu blokującego ELISA. Do wszystkich studzienek w rzędzie A dodaje się 100 µL rozcieńczonego, oczyszczonego przeciwciała anty-EU1. Inkubować w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę.Przemyj płytkę trzykrotnie roztworem 0,05% tween 20; po trzecim przemyciu osusz płytkę, aby usunąć nadmiar buforu do mycia. Do każdej studni dodaj 100 µL peroksydazy chrzanowej, sprzężonej z kozim przeciwciałem anty-rabbit IgG, rozcieńczonym w buforze blokującym do ELISA; inkubuj w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę. Po upływie godziny przemyj płytkę trzykrotnie roztworem 0,05% tween 20 w sposób opisany wcześniej; po trzecim przemyciu.Wypłucz wszystkie dołki, wypełniając je 300 µL wody dejonizowanej, a nadmiar wody usuń, odwracając płytkę na papier chłonny. Do wszystkich dołków dodaj 100 µL 3',5',5'-tetraetylobendydyny o temperaturze pokojowej i inkubuj przez 15–30 minut w ciemności w temperaturze pokojowej. Zatrzymaj reakcję, dodając 50 µL 2 N kwasu siarkowego do każdego dołka.Na koniec odczytaj absorbancję przy 450 nanometrach. Odejmij tło przy 650 nanometrach. Porównanie białek. Oczyszczone, nieswoiste przeciwciała z białkiem.Oczyszczone przeciwciała anty-NorV1 po przepuszczeniu przez kolumny z LBD NorV77 oraz LBD NorV1 wykazały, że oczyszczone przeciwciała anty-NorV1 wiążą się silnie z LBD NorV1. Wykazano również istotne wiązanie z LBD NorV77 oraz z LBD NorV1. Dalsze oczyszczanie anty-NorV1 przeciwko LBD NorV77 i LBD NorV1 całkowicie usunęło tę reaktywność krzyżową. Specyficzność tę potwierdzono analizą Western blot ekstraktów z komórek transfektowanych wektorami ekspresyjnymi niosącymi pełnowymiarowe białka NorV1 i NorV77 z tagiem Myc; przeciwciała anty-Myc ujawniły, że każde pełnowymiarowe białko było eksprimowane w oczekiwanym ciężarze cząsteczkowym. Oczyszczone przeciwciała anty-NorV1 skutecznie wykryły pełnowymiarowe białko NorV1, ale wykryły również NorV1 i NorV77, choć z mniejszą wydajnością.W przeciwieństwie do tego, w pełni oczyszczone przeciwciało przeciwko nor1 nie wykazywało żadnej wykrywalnej reaktywności krzyżowej z nor1 i nor77. Analiza immunohistochemiczna neuronów dopaminergicznych śródmózgia z użyciem w pełni oczyszczonego przeciwciała przeciwko nor1 potwierdziła wyraźną ekspresję nor1 w badaniu immunohistochemicznym. Zastosowanie tyrozynowej hydroksylazy dodatkowo wykazało, że neuro1 jest również wyłącznie ekspresywne w jądrach neuronów dopaminergicznych śródmózgia w obszarze istoty czarnej. Po opanowaniu tej techniki można ją przeprowadzić w ciągu dwóch dni, pod warunkiem prawidłowego wykonania. Należy pamiętać, że praca z jonami sodu lub wodorkami może być niezwykle niebezpieczna i podczas wykonywania tej procedury zawsze należy przestrzegać środków ostrożności, takich jak praca pod wyciągiem chemicznym.

production-nurr-1-specific-polyclonal-antibodies-free-cross

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ten film demonstruje procedurę produkcji rekombinowanych przeciwciał przeciwko metallopeptydazie. Rekombinowane plazmidy przenoszące geny przeciwciała, białka zielonej fluorescencji i oporności na antybiotyki są transfekowane do komórek nabłonka za pomocą lipofektaminy. Transfekowane komórki są selekcjonowane i hodowane w celu wytworzenia rekombinowanych przeciwciał.

Metoda wytwarzania rekombinowanych przeciwciał przeciwko metallopeptydazie

W ostatnich latach testy oparte na żywych komórkach były z powodzeniem wykorzystywane do wykrywania przeciwciał przeciwko antygenom powierzchniowym i konformacyjnym. W tym miejscu opisano metodę wykorzystującą wysokoprzepustową cytometrię przepływową, umożliwiającą analizę dużych kohort pacjentów. Wykrycie nowych przeciwciał poprawi diagnostykę i leczenie zaburzeń o podłożu immunologicznym.

Wysokoprzepustowy test cytometrii przepływowej oparty na komórkach do wykrywania przeciwciał przeciwko receptorowi N-metylo-D-asparaginianu lub receptorowi dopaminy-2 w ludzkiej surowicy

Tutaj opisujemy metodę ekspresji i oczyszczania wysokiej jakości domen wystających (P) norowirusa (P) w E. coli do wykorzystania w badaniach krystalografii rentgenowskiej. Metoda ta może być stosowana do innych domen kaliciwirusa P, a także białek niestrukturalnych, tj. białka wirusa sprzężonego z genomem (VPg), proteazy i polimerazy RNA zależnej od RNA (RdRp).

Wytwarzanie wystających domen ludzkiego norowirusa w E. coli do krystalografii rentgenowskiej

Tutaj autorzy prezentują prosty i skuteczny protokół definiowania liniowego epitopu antygenowego za pomocą oczyszczonego przeciwciała monoklonalnego i skanowania peptydowego poprzez hybrydyzację kropkowo-plamową. Zidentyfikowany epitop może być następnie wykorzystany w zastosowaniach terapeutycznych i diagnostycznych.

Wspomagana skanowaniem peptydowym identyfikacja liniowego epitopu limfocytów B rozpoznanego przez przeciwciało monoklonalne

Opisujemy metodę produkcji ludzkich przeciwciał specyficznych dla interesującego nas antygenu, zaczynając od rzadkich limfocytów B krążących w ludzkiej krwi. Wytwarzanie tych naturalnych przeciwciał jest wydajne i szybkie, a uzyskane przeciwciała mogą rozróżniać wysoce spokrewnione antygeny.

Wytwarzanie dyskryminujących ludzkich przeciwciał monoklonalnych z rzadkich limfocytów B specyficznych dla antygenu B krążących we krwi

Ektopowo wyraziliśmy podjednostkę NR1 receptora NMDA oznaczoną zielonym białkiem fluorescencyjnym w ludzkich komórkach embrionalnych (HEK293) jako antygen do wykrywania autoprzeciwciał przeciwko receptorowi NMDA we krwi pacjentów z podejrzeniem autoimmunologicznego zapalenia mózgu. Ta prosta metoda może być odpowiednia do celów przesiewowych w warunkach klinicznych.

Prosty test immunofluorescencyjny oparty na komórkach do wykrywania autoprzeciwciał przeciwko receptorowi N-metylo-D-asparaginianu (NMDA) we krwi

Ten artykuł zawiera szczegółowy protokół przygotowania i oceny przeciwciał monoklonalnych przeciwko naturalnym produktom do wykorzystania w różnych testach immunologicznych. Procedura ta obejmuje immunizację, fuzję komórek, pośredni kompetycyjny test ELISA do dodatniego badania przesiewowego klonów oraz przygotowanie hybrydoma monoklonalnego. Podano również specyfikacje dotyczące charakterystyki przeciwciał za pomocą analiz MALDI-TOF-MS i ELISA.

Wytwarzanie przeciwciał monoklonalnych przeciwko produktom naturalnym

Tutaj prezentujemy metodę cytometrii przepływowej opartej na komórkach do wykrywania przeciwciał neutralizujących lub innych czynników, które zakłócają pobieranie przez komórkę enzymatycznych terapii zastępczych w ludzkiej matrycy, takich jak płyn mózgowo-rdzeniowy (CSF) lub ludzka surowica.

Wykrywanie przeciwciał, które neutralizują wychwyt komórkowy enzymatycznych terapii zastępczych za pomocą testu komórkowego

Białko rekombinowanego przeciwciała wyrażone w komórkach pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO oraz przeciwciała monoklonalne wytworzone przy użyciu tradycyjnej technologii hybrydoma mogą rozpoznawać i wiązać się z białkiem N (APN) aminopeptydazy świni.

Wytwarzanie przeciwciał monoklonalnych skierowanych przeciwko aminopeptydazie N w nabłonku błony śluzowej jelit świń

Pomiar momentu obrotowego odchylenia (yaw torque) przywiązanej muchy Drosophila za pomocą miernika momentu obrotowego pozwala neurobiologowi na precyzyjną kontrolę warunków stymulacji zwierzęcia doświadczalnego. W połączeniu z unikalnymi narzędziami genetycznymi dostępnymi u muszki owocówki, paradygmat ten jest wykorzystywany w szerokim zakresie badań neurobiologicznych.

Uczenie instrumentalne muszek *Drosophila* przy użyciu torquemetru

Poznaj metodę usuwania przeciwciał o reaktywności krzyżowej w celu zwiększenia specyficzności przeciwciał przeciwko homologicznym białkom Nurr-1, Nor1 i Nur77.

Wytwarzanie przeciwciał poliklonalnych specyficznych dla Nurr-1 wolnych od reaktywności krzyżowej przeciwko jego bliskim homologom, Nor1 i Nur77 (Wideo) | JoVE Journal

Wytwarzanie przeciwciał poliklonalnych specyficznych dla Nurr-1 wolnych od reaktywności krzyżowej przeciwko jego bliskim homologom, Nor1 i Nur77

Przeglądaj więcej filmów