Name: Izolacja i pierwotna hodowla komórek śródbłonka aorty myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 20 s
Description: Naucz się izolować i hodować komórki śródbłonka z aorty myszy bez specjalistycznego sprzętu. Ta metoda zapewnia wysoką żywotność komórek i jest przydatna w badaniach fizjopatologii śródbłonka.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

To badanie jest wspierane przez American Heart Association Scientist Development Grant 13SDG16930098 oraz National Science Foundation of China Youth Award 81300240 (PI: Wang). Dziękujemy Roberto Mendezowi z Wayne State University za pomoc w przygotowaniu manuskryptu.

1. Izolacja aorty od myszy
Wszystkie opisane tutaj procedury zostały zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Stanowego Wayne.
<ol>
	<li>Umieść mysz w komorze indukcyjnej aparatu do znieczulenia. Ustawić przepływ izofluranu na 4% w połączeniu z 25% świeżego powietrza i 75%O2. Znieczulić mysz poprzez inhalację izofluranu (4% do indukcji, ± 1,0% do konserwacji) w połączeniu z 25% świeżym powietrzem i 75%O2 przez komorę indukcyjną, a następnie dedykowany stożek nosowy. UWAGA: Znieczulenie izofluranem może być podawane w 75% tlenu/25% powietrza lub w 100% tlenie. </li>
	<li>Sprawdzaj mysz co 5 minut, aż do osiągnięcia odpowiedniego poziomu znieczulenia (brak wycofania do uszczypnięcia palców).</li>
	<li>Wyjmij mysz z komory indukcyjnej i kontynuuj inhalację izofluranu przez dedykowany stożek nosowy, który jest podłączony do aparatu do znieczulania. Zmienić przepływ izofluranu na 1%, aby utrzymać znieczulenie.</li>
	<li>Gdy mysz jest pod narkozą, umieść ją na podkładce chirurgicznej, umieszczonej na jej plecach. Użyj taśmy laboratoryjnej, aby zabezpieczyć kończyny.</li>
	<li>Użyj lampy grzewczej, aby utrzymać mysz w cieple. Trzymaj lampę w odpowiedniej odległości od myszy, aby mysz się nie przegrzała.</li>
	<li>Spryskaj klatkę piersiową 70% etanolem.</li>
	<li>Użyj nożyczek preparacyjnych, aby otworzyć brzuch od linii środkowej i odsłonić aortę brzuszną. Otwórz klatkę piersiową i odsłoń serce i płuca.</li>
	<li>Przetnij aortę brzuszną pośrodku nożyczkami preparacyjnymi, aby uwolnić krew.</li>
	<li>Napełnij strzykawkę o pojemności 1 ml (igłą 25 G) 1 ml PBS zawierającej 1 000 j./ml heparyny. Wstrzyknąć PBS zawierający 1 000 j./ml heparyny do lewej komory i wykonać perfuzję aorty. Popchnij serce i płuca kleszczami na wielkich tętnicach po prawej stronie myszy, aby odsłonić aortę piersiową.</li>
	<li>Szybko usuń aortę piersiową za pomocą kleszczy do mikropreparacji i umieść ją w lodowatym 1x PBS (sterylnym), a następnie przetransportuj pojemnik do okapu z laminarnym przepływem powietrza.</li>
	<li>Włożyć strzykawkę o pojemności 1 ml wyposażoną w igłę 25 G do jednego końca aorty i delikatnie przepłukać aortę lodowatym PBS, aby usunąć krew.</li>
	<li>Użyj kleszczy do mikropreparacji, aby usunąć jak najwięcej przyczepionej tkanki tłuszczowej i małych naczyń bocznych.</li>
	<li>Natychmiast przenieś aortę na śródbłonkowe podłoże wzrostowe.</li>
	<li>Przetnij aortę na pierścienie o średnicy 1 mm za pomocą sterylnego ostrza skalpela. Zbierz około 8 - 10 pierścieni na aortę.</li>
	<li>Otwórz każdy pierścień aorty za pomocą nożyczek do mikropreparacji.</li>
</ol>
2. Zasiewanie segmentów aorty na matrycy
<ol>
	<li>Gdy nie jest używany, utrzymuj matrycę o obniżonym współczynniku wzrostu w temperaturze -20 °C, aby zapobiec krzepnięciu. Matrycę o obniżonym współczynniku wzrostu należy umieścić w temperaturze 4 °C co najmniej na noc, aby umożliwić całkowite rozmrożenie.</li>
	<li>Schłodzić 6-dołkową płytkę i końcówki pipet do temperatury -20 °C przez co najmniej 10 minut. Umieścić 6-dołkową płytkę na lodzie i pokryć jedno zagłębienie płytki 1 ml matrycy, nie wprowadzając żadnych pęcherzyków powietrza. Umieścić płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 °C na 20 minut, aby umożliwić zestalenie się matrycy.</li>
	<li>Wszczepić fragmenty aorty na zestaloną matrycę za pomocą sterylnych kleszczy do mikropreparacji. Umieść kawałki światłem do dołu na matrycy, nie dotykając śródbłonka. Umieść 3 - 4 segmenty aorty blisko siebie na macierzy.</li>
	<li>Dodaj tylko tyle pożywki do wzrostu komórek śródbłonka, aby segmenty były mokre (~ 200 μL).</li>
	<li>Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C w temperaturze 5% CO2 przez 4–6 godzin. Pod koniec dnia dodaj tylko tyle pożywki, aby pokryć segmenty aorty.</li>
	<li>Obserwuj okresowe kiełkowanie odcinka aorty pod mikroskopem z kontrastem fazowym. Każdego dnia sprawdzaj poziom podłoża i wzrost komórek. W razie potrzeby dodać pożywkę, aby utrzymać zakryte segmenty aorty.</li>
	<li>W 4dniu delikatnie usuń pożywkę i usuń segmenty aorty z macierzy za pomocą sterylnej igły, nie przerywając wzrostu komórek śródbłonka.</li>
	<li>Dodaj 2 ml nowej pożywki do wzrostu komórek śródbłonka i pozwól komórkom śródbłonka nadal namnażać się na macierzy przez 2-3 dni.</li>
</ol>
3. Początkowe pasażowanie komórek śródbłonka aorty myszy
<ol>
	<li>Pokryć nową kolbę T12.5 żelatyną (0,1%), inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut.</li>
	<li>Ostrożnie umyć płytki matrycy sterylnym PBS w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Dodać 2 ml obojętnej proteinazy (50 j./ml) do płytek matrycowych i inkubować w temperaturze pokojowej na kołysce platformy, od czasu do czasu wstrząsając. Sprawdź komórki pod mikroskopem z kontrastem fazowym, aby upewnić się, że większość komórek jest odłączona.</li>
	<li>Dodaj 2 ml D-Val, aby dezaktywować neutralną proteinazę.</li>
	<li>Ostrożnie zebrać sklarowany osad w probówce wirówkowej o pojemności 15 ml. Umyć płytkę 2 ml D-Val i zebrać supernatant.</li>
	<li>Odwirować zawiesinę komórkową o sile 900 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Zawiesić osad komórkowy w 4 ml pożywki do wzrostu komórek śródbłonka i płytkę w kolbie T12,5 pokrytej żelatyną. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 2 godziny.</li>
	<li>Wymień nośnik. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C, 5% CO2 do momentu, aż osiągną 85% - 90% zlewania się.</li>
</ol>
4. Pasażowanie komórek śródbłonka aorty myszy
<ol>
	<li>Pokryć dwie nowe kolby T12,5 żelatyną (0,1%), inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut. Podgrzać wstępnie trypsynę-EDTA (0,25% trypsyny, 0,02 EDTA w PBS) i sterylny PBS w temperaturze 37 °C przez około 15 minut.</li>
	<li>Ostrożnie umyć komórki sterylnym PBS w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Dodać 0,5 ml trypsyny-EDTA (0,25% trypsyny, 0,02 EDTA w PBS) i inkubować w temperaturze 37 °C przez ~ 1 minutę lub do momentu, gdy większość komórek się obróci</li>.
	<li>Dodaj 2 ml pożywki do wzrostu komórek śródbłonka, aby zatrzymać trawienie. Kilkakrotnie odpipetować zawiesinę komórek w górę i w dół w kolbie. W razie potrzeby użyj skrobaka do komórek, aby zebrać komórki.</li>
	<li>Zebrać zawiesinę komórek w probówce wirówkowej o pojemności 15 ml. Odwirować zawiesinę komórkową o sile 900 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Ponownie zawiesić osad komórkowy w 4 ml pożywki do wzrostu komórek śródbłonka i umieścić ją na płytce w 2 kolbach T12,5 pokrytych żelatyną. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 2 godziny.</li>
	<li>Wymień nośnik. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C, 5% CO2 do momentu, aż osiągną 85% - 90% zlewania się.</li>
	<li>Użyj mysich komórek śródbłonka aorty po 2-3 przejściach.</li>
</ol>
5. Charakterystyka komórek śródbłonka aorty myszy
<ol>
	<li>Ponownie pokryj komórki.
	<ol>
		<li>Pokryć 6-dołkową płytkę żelatyną (0,1%), inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 min. Przepłukać płytkę PBS.</li>
		<li>Podgrzej Trypsynę-EDTA i sterylny PBS do temperatury 37 °C przez około 15 minut.</li>
		<li>Umyj komórki sterylnym PBS 3 razy. Dodać 0,5 ml trypsyny/EDTA do komórek, inkubować przez ~1 minutę w temperaturze 37 °C lub do momentu, gdy większość komórek się obróci</li>.
		<li>Dodaj 2 ml pożywki do wzrostu komórek śródbłonka, aby zatrzymać trawienie. Kilkakrotnie odpipetować zawiesinę komórek w górę i w dół w kolbie. W razie potrzeby użyj skrobaka do komórek, aby zebrać komórki.</li>
		<li>Zebrać zawiesinę komórek w probówce wirówkowej o pojemności 15 ml. Odwirować zawiesinę komórkową o sile 900 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Odrzucić supernatant, ponownie zawiesić komórki w pożywce do wzrostu komórek śródbłonka. Wysiewać komórki na 6-dołkowej płytce pokrytej żelatyną o gęstości 3 x 105/dołek.</li>
		<li>Inkubować komórki przez noc w temperaturze 37 °C, 5% CO2 , aby umożliwić komórkom przyczepienie się do powierzchni hodowli.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wychwyt Dil-ac-LDL i wiązanie Ulex-lektyny.
	<ol>
		<li>Acetylowany LDL (Dil-ac-LDL) znakowany nadchloranem 1,1'-dioktadecylo-3,3',3'-tetrametyloindo-karbocyjaniny znakowany nadchloranem katechiny należy przechowywać w temperaturze -20 °C. Przed barwieniem rozmrozić Dil-ac-LDL na lodzie. Podstawowy roztwór Dil-ac-LDL wynosi 1 mg/ml. Przechowywać znakowaną FITC aglutyninę Ulex europaeus (Ulex-Lectin, 1 μg/ml) w temperaturze 4 °C. Podstawowy roztwór Ulex-Lectin wynosi 1 mg/ml. Przechowywać Hoechst 33342 w temperaturze 4 °C. Podstawowy roztwór Hoechst 33342 ma 100 μg/ml.</li>
		<li>Dodać 10 μl roztworu podstawowego Dil-ac-LDL do 1 ml pożywki hodowlanej, aby uzyskać końcowe stężenie 10 μg/ml.</li>
		<li>Przed barwieniem usuń stare podłoże i umyj komórki w każdym dołku nowym podłożem.</li>
		<li>Usuń nowe podłoże i dodaj podłoże barwiące Dil-ac-LDL.</li>
		<li>Inkubować komórki w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 1 godzinę.</li>
		<li>Umyj komórki sterylnym 1x PBS 3 razy.</li>
		<li>Dodaj 1 ml 10% formaliny, aby utrwalić komórki. Umieść talerz w temperaturze pokojowej na około 30 min.</li>
		<li>Umyj komórki sterylnym 1x PBS 3 razy. Unikaj światła.</li>
		<li>Dodać 1 ml sterylnego 1x PBS, który zawiera 10 μl Ulex-Lectin.</li>
		<li>Inkubować komórki w temperaturze pokojowej w ciemności przez 1 godzinę.</li>
		<li>Usuń Ulex-Lektynę, myjąc komórki sterylnym 1x PBS 3 razy.</li>
		<li>Dodać Hoechst 33342 do końcowego stężenia 1 μg/ml, inkubować przez 10 minut w ciemności.</li>
		<li>Zobacz fluorescencję Dil-ac-LDL (czerwony, długość fali wzbudzenia 576 nm), Ulex-Lectin (zielony, długość fali wzbudzenia 519 nm) i Hoechst (niebieski, długość fali wzbudzenia 361 nm) za pomocą odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Barwienie fluorescencyjne dla CD31, VEGFR2, eNOS, VE-Kadheryny i Kalponiny.
	<ol>
		<li>Przeciwciało anty-mysie CD31 sprzężone z FITC należy przechowywać, przeciwciało eNOS, przeciwciało VE-kadheryna, anty-królicze IgG sprzężone z FITC w temperaturze 4 °C w ciemności. Przeciwciało VEGFR2 należy przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
		<li>Umyj komórki sterylnym 1x PBS 3 razy.</li>
		<li>Dodaj 1 ml 10% formaliny, aby utrwalić komórki. Umieść talerz w temperaturze pokojowej na około 30 min.</li>
		<li>Umyj komórki sterylnym 1x PBS 3 razy.</li>
		<li>Aby wybarwić CD31, dodaj 1 ml sterylnego 1x PBS, który zawiera 10 μl przeciwciała CD31-FITC. Aby wybarwić VEGFR2, eNOS, VE-Kadherynę lub kalponinę, dodaj 1 ml sterylnego 1x PBS, który zawiera odpowiednio 4 μl pierwszorzędowego przeciwciała VEGFR2, eNOS, VE-Kadheryny lub kalponiny.</li>
		<li>Inkubuj komórki na lodzie przez 1 godzinę w ciemności.</li>
		<li>Usuń przeciwciała, przemywając komórki sterylnym PBS 3 razy.</li>
		<li>Do barwienia VEGFR2, eNOS, VE-kadheryny lub kalponiny dodać 1 ml sterylnego 1x PBS, który zawiera 10 μl anty-króliczej IgG sprzężonej z FITC. Inkubuj komórki na lodzie przez 1 godzinę w ciemności. Usuń IgG, przemywając komórki sterylnym PBS 3 razy.</li>
		<li>Dodać Hoechst 33342 do końcowego stężenia 1 μg/ml, inkubować przez 10 minut w ciemności.</li>
		<li>Zobacz fluorescencję CD31, VEGFR2, eNOS, VE-Cadherin, kalponiny (kolor zielony, długość fali wzbudzenia 518-535 nm) i Hoechsta (kolor niebieski, długość fali wzbudzenia 361 nm) za pomocą odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Simionescu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implications+of+early+structural-functional+changes+in+the+endothelium+for+vascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+thrombosis%2C+and+vascular+biology%22%5BJournal%5D)">Implications of early structural-functional changes in the endothelium for vascular disease.</a> Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 27, 266-274 (2007).</li>
<li>Cid, M. C., Segarra, M., Garcia-Martinez, A., Hernandez-Rodriguez, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cells%2C+antineutrophil+cytoplasmic+antibodies%2C+and+cytokines+in+the+pathogenesis+of+systemic+vasculitis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+rheumatology+reports%22%5BJournal%5D)">Endothelial cells, antineutrophil cytoplasmic antibodies, and cytokines in the pathogenesis of systemic vasculitis.</a> Current rheumatology reports. 6, 184-194 (2004).</li>
<li>Wang, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C-Reactive+protein-induced+endothelial+microparticle+generation+in+HUVECs+is+related+to+BH4-dependent+NO+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+vascular+research%22%5BJournal%5D)">C-Reactive protein-induced endothelial microparticle generation in HUVECs is related to BH4-dependent NO formation.</a> Journal of vascular research. 44, 241-248 (2007).</li>
<li>Wang, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+circulating+CD31%2B%2FCD42-+microparticles+are+associated+with+impaired+systemic+artery+elasticity+in+healthy+subjects%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+hypertension%22%5BJournal%5D)">Increased circulating CD31+/CD42- microparticles are associated with impaired systemic artery elasticity in healthy subjects.</a> American journal of hypertension. 20, 957-964 (2007).</li>
<li>Mackay, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterisation+of+human+pulmonary+microvascular+endothelial+cells+from+patients+with+severe+emphysema%5BTitle%5D)+AND+%22Respiratory+research%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterisation of human pulmonary microvascular endothelial cells from patients with severe emphysema.</a> Respiratory research. 14, 23(2013).</li>
<li>Marelli-Berg, F. M., Peek, E., Lidington, E. A., Stauss, H. J., Lechler, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+endothelial+cells+from+murine+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunological+methods%22%5BJournal%5D)">Isolation of endothelial cells from murine tissue.</a> Journal of immunological methods. 244, 205-215 (2000).</li>
<li>Bowden, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+alpha4+integrin+and+VCAM-1+in+CD18-independent+neutrophil+migration+across+mouse+cardiac+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+research%22%5BJournal%5D)">Role of alpha4 integrin and VCAM-1 in CD18-independent neutrophil migration across mouse cardiac endothelium.</a> Circulation research. 90, 562-569 (2002).</li>
<li>Lu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Palmitate+induces+apoptosis+in+mouse+aortic+endothelial+cells+and+endothelial+dysfunction+in+mice+fed+high-calorie+and+high-cholesterol+diets%5BTitle%5D)+AND+%22Life+sciences%22%5BJournal%5D)">Palmitate induces apoptosis in mouse aortic endothelial cells and endothelial dysfunction in mice fed high-calorie and high-cholesterol diets.</a> Life sciences. 92, 1165-1173 (2013).</li>
<li>Atkins, G. B., Jain, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+differentiation%3A+molecular+mechanisms+of+specification+and+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+thrombosis%2C+and+vascular+biology%22%5BJournal%5D)">Endothelial differentiation: molecular mechanisms of specification and heterogeneity.</a> Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 31, 1476-1484 (2011).</li>
<li>Aitsebaomo, J., Portbury, A. L., Schisler, J. C., Patterson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brothers+and+sisters%3A+molecular+insights+into+arterial-venous+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+research%22%5BJournal%5D)">Brothers and sisters: molecular insights into arterial-venous heterogeneity.</a> Circulation research. 108, 929-939 (2008).</li>
<li>Shimamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drugs+and+foods+on+contraction+of+endothelial+cells+as+a+key+mechanism+in+atherogenesis+and+treatment+of+atherosclerosis+with+endothelial-cell+relaxants+%28cyclic+AMP+phosphodiesterase+inhibitors%29%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+experimental+medicine+and+biology%22%5BJournal%5D)">Drugs and foods on contraction of endothelial cells as a key mechanism in atherogenesis and treatment of atherosclerosis with endothelial-cell relaxants (cyclic AMP phosphodiesterase inhibitors).</a> Advances in experimental medicine and biology. 60, 77-105 (1975).</li>
<li>Chiu, J. J., Chien, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+disturbed+flow+on+vascular+endothelium%3A+pathophysiological+basis+and+clinical+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+reviews%22%5BJournal%5D)">Effects of disturbed flow on vascular endothelium: pathophysiological basis and clinical perspectives.</a> Physiological reviews. 91, 327-387 (2011).</li>
<li>Gimbrone, M. A. Jr, Topper, J. N., Nagel, T., Anderson, K. R., Garcia-Cardena, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+dysfunction%2C+hemodynamic+forces%2C+and+atherogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Endothelial dysfunction, hemodynamic forces, and atherogenesis.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 902, 239-240 (2000).</li>
<li>Rostgaard, J., Qvortrup, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscopic+demonstrations+of+filamentous+molecular+sieve+plugs+in+capillary+fenestrae%5BTitle%5D)+AND+%22Microvascular+research%22%5BJournal%5D)">Electron microscopic demonstrations of filamentous molecular sieve plugs in capillary fenestrae.</a> Microvascular research. 53, 1-13 (1997).</li>
<li>Brutsaert, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+endothelial-myocardial+signaling%3A+its+role+in+cardiac+growth%2C+contractile+performance%2C+and+rhythmicity%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+reviews%22%5BJournal%5D)">Cardiac endothelial-myocardial signaling: its role in cardiac growth, contractile performance, and rhythmicity.</a> Physiological reviews. 83, 59-115 (2003).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Badanie to demonstruje prostą metodę izolowania i hodowli komórek śródbłonka z aorty myszy bez specjalnego sprzętu. Barwienie immunofluorescencyjne wykazało, że większość komórek była komórkami śródbłonka po drugim pasażu. Sugeruje się, że komórki w okresie od drugiego do trzeciego pasażu nadają się do eksperymentów in vitro i in vivo w celu zbadania biologii śródbłonka.
Kluczowe uwagi zawarte w niniejszym Protokole
W procedurze je...

Śródbłonek naczyniowy to nie tylko warstwa barierowa, która oddziela krew od tkanki, jest uważany za rozległy gruczoł dokrewny, który rozciąga się na całym drzewie naczyniowym o powierzchni 400 metrów kwadratowych1. Dobre samopoczucie śródbłonka jest niezbędne dla homeostazy naczyń krwionośnych. Dysfunkcyjny śródbłonek uczestniczy w różnych zaburzeniach sercowo-naczyniowych, w tym miażdżycy, zapaleniu naczyń i urazach niedokrwiennych/reperfuzyjnych itp. 2-4. Do tej pory specyficzne mechanizmy komórkowe i molekularne związane z tymi chorobami nie są dobrze poznane ze względu na rozlany anatomiczny charakter śródbłonka.
Mysz jest ważnym modelem do badań, ponieważ techniki manipulacji genetycznej są bardziej rozwinięte u myszy niż u jakiegokolwiek innego gatunku ssaków. Jednak izolacja pierwotnych mysich komórek śródbłonka aorty jest uważana za szczególnie trudną, ponieważ mały rozmiar aorty sprawia, że trawienie enzymatyczne śródbłonka jest niepraktyczne. Niektóre zgłoszone procedury izolacji i oczyszczania EC wymagają 5-7.
Celem tego protokołu jest użycie prostej metody do izolowania i rozszerzania komórek śródbłonka z aorty myszy bez użycia specjalnego sprzętu. W tym protokole świeżo wyizolowana aorta jest cięta na małe segmenty i umieszczana na matrycy ze śródbłonkiem skierowanym w dół, aby umożliwić kiełkowanie śródbłonka. Po usunięciu segmentów komórki śródbłonka są namnażane w pożywce preferowanej przez śródbłonek i są gotowe do eksperymentów po dwóch lub trzech pasażach. Zaletą opisanej metody jest: 1) z jednej aorty pobiera się znacznie dużą liczbę komórek śródbłonka; 2) żywotność komórek jest dobrze zachowana; oraz 3) nie jest wymagany żaden specjalny sprzęt ani technika. Stanowi skuteczny sposób identyfikacji specyficznych mechanizmów komórkowych i molekularnych w patofizjologii komórek śródbłonka. Dla tych, którzy są zainteresowani badaniem pierwotnych hodowanych komórek śródbłonka od myszy z nokautem genowym, myszy z nokautem genowym lub mysiego modelu choroby, protokół ten jest bardzo przydatny i łatwy do przećwiczenia.

<table><tbody><tr><td>4- lub 6-tygodniowe myszy</td><td>Jackson Laboratory</td><td>#000664</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne 1x sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>Gibco</td><td>#10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Sterylna 1x PBS zawierająca 1,000 U/ml heparyny</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3149</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka do wzrostu komórek śródbłonka (Dulbeccos' Zmodyfikowany orzeł" s Średni [DMEM] z 25&nbsp; mM HEPES [Gibco, #12320-032], uzupełniony o 100&nbsp; &mu; g/mL suplement na wzrost komórek śródbłonka z bydlęcej tkanki nerwowej [ECGS, Sigma, #2759], 10% płodowa surowica bydlęca [FBS, Gibco, #10082-147], 1,000&nbsp; U/mL heparyny [Sigma Aldrich, H3149], 10 000&nbsp; U/ml penicyliny i 10&nbsp; mg / ml streptomycyna [Gibco, #15140-122])</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matryca zredukowana czynnikiem wzrostu</td><td>BD Biosciences</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>Neutralna proteinaza (Pipeza, 1&nbsp; U/mL, Fisher Scientific, #CB-40235) i pożywka D-Val (D-walina, 0,034&nbsp; g/L, Sigma, #1255), w Dulbeccos' Zmodyfikowany orzeł" s Średni, niski poziom glukozy (Gibco, #12320-032)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylino-carbocyano-perchloran acetylowany LDL (Dil-ac-LDL)</td><td>Life Technologies</td><td>L3484</td><td></td></tr><tr><td>Znakowana FITC Ulex europaeus aglutynina (Ulex-Lectin)</td><td>Sigma</td><td>L9006</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało sprzężone anty-mysie CD31-FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>553372</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciw receptorowi 2 czynnika wzrostu śródbłonka naczyń myszy</td><td>Sygnalizacja komórkowa</td><td>9698</td><td></td></tr><tr><td>Anty-mysia śródbłonek syntazy tlenku azotu</td><td>Abcam</td><td>ab5589</td><td></td></tr><tr><td>Anty-mysi śródbłonek naczyniowy-kadheryna</td><td>Abcam</td><td>33168</td><td></td></tr><tr><td>Kalponina przeciw myszom</td><td>Abcam</td><td>700</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka anty-królicza IgG</td><td>Sigma</td><td>F6005</td><td></td>z FITC</tr> 1 <tr><td>ml wyposażona w igłę 25 G</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-900-04222</td><td></td></tr><tr><td>Szalki Peri 100 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-202-516</td><td></td></tr><tr><td>Sześciodołkowe płytki do hodowli komórkowych</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-1B</td><td></td></tr><tr><td>T12.5 kolba</td><td>hodowlana Fisher Scientific</td><td>50-202-076</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki, kleszcze, nożyczki i kleszcze do mikrodysekcji, ostrze skalpela</td><td>Fine Science Tools, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aparat anestezjologiczny z izofluranem</td><td>Webster Zasilanie weterynaryjne</td><td>07-806-3204</td><td></td></tr><tr><td>lampa</td><td></td><td></td><td></td>grzewcza</tr><tr><td>Wirówka</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr>Mikroskop <td></td><td></td><td></td>z<td>odwróconym kontrastem fazowym</td></tr><tr><td>Odwrócony mikroskop</td><td></td><td></td><td></td> fluorescencyjny</tr></tbody></table>

izolacja i pierwotna hodowla komórek śródbłonka aorty myszy

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

Śródbłonek naczyniowy jest niezbędny do utrzymania prawidłowej homeostazy naczyń krwionośnych. Jego dysfunkcja uczestniczy w różnych zaburzeniach sercowo-naczyniowych. Mysz jest ważnym modelem w badaniach nad chorobami sercowo-naczyniowymi. Badanie to demonstruje prostą metodę izolowania i hodowli komórek śródbłonka z aorty myszy bez specjalnego sprzętu. Aby wyizolować komórki śródbłonka, aorta piersiowa jest szybko usuwana z ciała myszy, a przyczepiona tkanka tłuszczowa i tkanka łączna są usuwane z aorty. Aorta jest cięta na pierścienie o średnicy 1 mm. Każdy pierścień aorty jest otwierany i umieszczany na matrycy o obniżonym czynniku wzrostu ze śródbłonkiem skierowanym w dół. Segmenty są hodowane w pożywce do wzrostu komórek śródbłonka przez około 4 dni. Kiełkowanie śródbłonka rozpoczyna się już w 2 dniu. Segmenty są następnie usuwane, a komórki są hodowane w sposób ciągły, aż osiągną zbieg. Komórki śródbłonka są zbierane przy użyciu neutralnej proteinazy i hodowane w pożywce wzrostu komórek śródbłonka przez kolejne dwa pasaże, zanim zostaną wykorzystane do eksperymentów. Barwienie immunofluorescencyjne wykazało, że po drugim pasażu większość komórek była podwójnie dodatnia pod względem wychwytu Dil-ac-LDL, wiązania lektyny i barwienia CD31, typowych cech komórek śródbłonka. Sugeruje się, że komórki w pasażach od drugiego do trzeciego nadają się do eksperymentów in vitro i in vivo w celu zbadania biologii śródbłonka. Nasz protokół zapewnia skuteczny sposób identyfikacji określonych mechanizmów komórkowych i molekularnych w fizjopatologii komórek śródbłonka.

Wypuszczanie wypustek przez komórki śródbłonka
Spontaniczne pączkowanie komórek śródbłonka rozpoczęte z segmentu aorty mysiej. Segment aorty mysiej inkubowano na macierzy z obniżoną zawartością czynników wzrostu, a następnie w pożywce do wzrostu komórek śródbłonka przez 4 dni. Pączkowanie komórek śródbłonka pojawia się zazwyczaj w ciągu 2 – 4 dni. Mikrofotografie wykonano w 4. dniu (Rysunek 1). Jak pokazano na zdjęciach, liczne komórki śródbłonka migrują z seg...

Komórki śródbłonka naczyniowego odgrywają znaczącą rolę w wielu ważnych zaburzeniach sercowo-naczyniowych. W tym artykule opisano prostą metodę izolowania i rozszerzania komórek śródbłonka z aorty myszy bez użycia specjalnego sprzętu. Nasz protokół zapewnia skuteczny sposób identyfikacji mechanizmów w fizjopatologii komórek śródbłonka.

Izolacja i pierwotna hodowla komórek śródbłonka aorty myszy

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Ogólnym celem tej procedury jest wykorzystanie prostej metody do izolacji i namnażania komórek śródbłonka z aorty myszy bez użycia specjalistycznego sprzętu. Inne metody stosowane do izolacji komórek śródbłonka są w większości przeznaczone dla serca lub płuc, a nie dla aorty. Technika ta, zastosowana do aorty, zapewnia znacznie wyższą wydajność, wysoką żywotność komórek i nie wymaga specjalistycznego sprzętu ani technik.Metody te mają zastosowanie w badaniach nad pierwotnymi komórkami śródbłonka pochodzącymi zarówno z myszy z nokautem genowym, jak i myszy szczepowych, które stanowią podstawę większości modeli chorobowych. Niniejszy protokół jest bardzo użyteczny i łatwy w realizacji. Należy rozpocząć procedurę na początku dnia.Po znieczuleniu myszy i potwierdzeniu braku odruchów, ułóż zwierzę na plecach na podkładce chirurgicznej i umieść nad nim lampę grzewczą w celu utrzymania temperatury ciała. Następnie zdezynfekuj brzuch, spryskując go 70% etanolem. Kolejno, za pomocą nożyczek chirurgicznych, otwórz brzuch wzdłuż linii środkowej, aby odsłonić aortę brzuszną.Następnie otwórz jamę klatki piersiowej, aby odsłonić serce i płuca. Teraz upuść krew z myszy, wykonując nacięcie wzdłuż

isolation-and-primary-culture-of-mouse-aortic-endothelial-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

W niniejszej pracy opisujemy protokół izolacji i hodowli mysich komórek śródbłonka płuc. Metoda ta obejmuje mechaniczną i enzymatyczną dysocjację tkanki płucnej oraz dwuetapowy proces oczyszczania z wykorzystaniem przeciwciał anty-PECAM-1 oraz anty-ICAM-2 sprzężonych z kuleczkami magnetycznymi, co pozwala na uzyskanie czystej populacji komórek śródbłonka pochodzenia głównie naczyniowego mikroskopowego.

Izolacja i hodowla komórek śródbłonka płuc noworodków myszy

Komórki śródbłonka mikronaczyniowego mózgu (BMEC) są połączone specyficznymi białkami połączeniowymi, tworząc wysoce regulowaną barierę oddzielającą krew od ośrodkowego układu nerwowego (OUN), tak zwaną barierę krew-mózg (BBB). Izolacja pierwotnych mysich komórek śródbłonka mikronaczyniowego mózgu, jak omówiono w tym protokole, umożliwia szczegółowe badania in vitro bariery krew-mózg.

Izolacja pierwotnych mysich komórek śródbłonka mikronaczyniowego mózgu

Celem tego protokołu jest zademonstrowanie technik izolacji i hodowli mysich pierwotnych komórek mięśni gładkich naczyń krwionośnych (VSMC) z krążenia wieńcowego. Po wyizolowaniu VSMC można je stosować w wielu standardowych technikach hodowli.

Izolacja mysich komórek mięśni gładkich naczyń wieńcowych

Ten protokół jest przygotowany, aby podzielić się naszą metodą izolowania komórek śródbłonka naczyń wieńcowych myszy w celu obrazowania lub przeprowadzania eksperymentów z biologii molekularnej.

Izolacja mysich komórek śródbłonka naczyń wieńcowych

Mikronaczyniowe komórki śródbłonka mięśni szkieletowych (MMEC) kształtują wewnętrzną ścianę naczyń włosowatych mięśni i regulują zarówno wymianę płynów/molekuł, jak i migrację komórek (immunologicznych) między tkanką mięśniową a krwią. Opisana tutaj izolacja pierwotnego mysiego MMEC umożliwia kompleksowe badania in vitro "jednostki mięśniowo-naczyniowej".

Izolacja pierwotnych mysich komórek śródbłonka mikronaczyniowego mięśni szkieletowych

Opisana jest skuteczna metoda enzymatyczna do izolacji pierwotnych komórek śródbłonka aorty świńskiej (pAEC) od miniaturowych świń. Wyizolowane pierwotne pAEC mogą być wykorzystane do zbadania odpowiedzi immunologicznej i krzepnięcia w ksenotransplantacji.

Izolacja i hodowla pierwotnych komórek śródbłonka aorty od miniaturowych świń

Tutaj przedstawiamy i demonstrujemy protokół izolacji pierwotnych komórek śródbłonka sinusoidalnego wątroby myszy (LSEC). Protokół opiera się na perfuzji kolagenazy wątrobowej, oczyszczaniu komórek niemiąższowych przez wirowanie z niską prędkością oraz selekcji kulek magnetycznych CD146. Zajmujemy się również fenotypowaniem i charakteryzacją tych izolowanych LSEC za pomocą cytometrii przepływowej i skaningowej mikroskopii elektronowej.

Izolacja i charakterystyka pierwotnych sinusoidalnych komórek śródbłonka wątroby myszy

Przedstawiamy metodę izolowania komórek i jąder śródbłonka od światła tętnic szyjnych myszy wystawionych na stabilne lub zaburzone warunki przepływu w celu przeprowadzenia eksperymentów omicznych na pojedynczych komórkach.

Izolacja komórek śródbłonka ze światła tętnic szyjnych myszy do eksperymentów multiomicznych na pojedynczych komórkach

W tym artykule, pierwotne komórki śródbłonka płuc zostały wyizolowane i wyhodowane od nowonarodzonych myszy.

Izolacja pierwotnych komórek śródbłonka płuc myszy

Przedstawiono protokół do izolacji i pierwotnej kultury komórek endotelialnych drobnych naczyń krwionośnych mózgu (BMEC) z mózgu mysiego noworodka w celu stworzenia solidnego modelu in vitro do badania funkcji bariery krew-mózg w warunkach fizjologicznych i patologicznych.

Izolacja i hodowla komórek endoteliowych mikrokrążenia mózgu myszy

Naucz się izolować i hodować komórki śródbłonka z aorty myszy bez specjalistycznego sprzętu. Ta metoda zapewnia wysoką żywotność komórek i jest przydatna w badaniach fizjopatologii śródbłonka.

Izolacja i pierwotna hodowla komórek śródbłonka aorty myszy

Przeglądaj więcej filmów