Name: Model in vitro do pomiaru odpowiedzi immunologicznej na malarię w kontekście współzakażenia wirusem HIV (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: Poznaj model in vitro do badania odpowiedzi immunologicznej na malarię przy współzakażeniu HIV. Metoda wykorzystuje hodowlę Plasmodium falciparum i analizę cytometryczną cytokin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

C.A.M.F. i L.S. brali udział w projektowaniu protokołu, pozyskiwaniu i analizie danych oraz redagowaniu artykułu. 
Autorzy pragną podziękować Dr. Kainowi, Dr. Loutfy'emu, Dr. Wasmuthowi i Dr. Ayi za ich wkład.
C.F. był wspierany przez stypendium podoktorskie CTN/Ontario HIV Treatment Network (OHTN). L.S. jest wspierany przez OHTN Junior Investigator Development Award. Obecne prace były wspierane przez grant operacyjny Canadian Institutes of Health Research (CIHR) (MOP-13721 i 115160) oraz grant CIHR New Investigator Catalyst.

<ol><li>Graham, A. L., Cattadori, I. M., Lloyd-Smith, J. O., Ferrari, M. J., Bjørnstad, O. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmission+consequences+of+coinfection%3A+cytokines+writ+large%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+parasitology%22%5BJournal%5D)">Transmission consequences of coinfection: cytokines writ large.</a> Trends in parasitology. 23 (6), 284-291 (2007).</li>
<li>French, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+rates+of+malarial+fever+with+deteriorating+immune+status+in+HIV-1-infected+Ugandan+adults%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS+%28London%2C+England%29%22%5BJournal%5D)">Increasing rates of malarial fever with deteriorating immune status in HIV-1-infected Ugandan adults.</a> AIDS (London, England). 15 (7), 899-906 (2001).</li>
<li>Hoffman, I. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+Plasmodium+falciparum+malaria+on+HIV-1+RNA+blood+plasma+concentration%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS+%28London%2C+England%29%22%5BJournal%5D)">The effect of Plasmodium falciparum malaria on HIV-1 RNA blood plasma concentration.</a> AIDS (London, England). 13 (4), 487-494 (1999).</li>
<li>Kamya, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+HIV-1+infection+on+antimalarial+treatment+outcomes+in+Uganda%3A+a+population-based+study%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+infectious+diseases%22%5BJournal%5D)">Effect of HIV-1 infection on antimalarial treatment outcomes in Uganda: a population-based study.</a> The Journal of infectious diseases. 193 (1), 9-15 (2006).</li>
<li>Kublin, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+Plasmodium+falciparum+malaria+on+concentration+of+HIV-1-RNA+in+the+blood+of+adults+in+rural+Malawi%3A+a+prospective+cohort+study%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Effect of Plasmodium falciparum malaria on concentration of HIV-1-RNA in the blood of adults in rural Malawi: a prospective cohort study.</a> Lancet. 365 (9455), 233-240 (2005).</li>
<li>Mermin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+co-trimoxazole+prophylaxis%2C+antiretroviral+therapy%2C+and+insecticide-treated+bednets+on+the+frequency+of+malaria+in+HIV-1-infected+adults+in+Uganda%3A+a+prospective+cohort+study%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Effect of co-trimoxazole prophylaxis, antiretroviral therapy, and insecticide-treated bednets on the frequency of malaria in HIV-1-infected adults in Uganda: a prospective cohort study.</a> Lancet. 367 (9518), 1256-1261 (2006).</li>
<li>Patnaik, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+HIV-1+serostatus%2C+HIV-1+RNA+concentration%2C+and+CD4+cell+count+on+the+incidence+of+malaria+infection+in+a+cohort+of+adults+in+rural+Malawi%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+infectious+diseases%22%5BJournal%5D)">Effects of HIV-1 serostatus, HIV-1 RNA concentration, and CD4 cell count on the incidence of malaria infection in a cohort of adults in rural Malawi.</a> The Journal of infectious diseases. 192 (6), 984-991 (2005).</li>
<li>Whitworth, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+HIV-1+and+increasing+immunosuppression+on+malaria+parasitaemia+and+clinical+episodes+in+adults+in+rural+Uganda%3A+a+cohort+study%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Effect of HIV-1 and increasing immunosuppression on malaria parasitaemia and clinical episodes in adults in rural Uganda: a cohort study.</a> Lancet. 356 (9235), 1051-1056 (2000).</li>
<li>Xiao, L., Owen, S. M., Rudolph, D. L., Lal, R. B., Lal, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmodium+falciparum+antigen-induced+human+immunodeficiency+virus+type+1+replication+is+mediated+through+induction+of+tumor+necrosis+factor-alpha%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+infectious+diseases%22%5BJournal%5D)">Plasmodium falciparum antigen-induced human immunodeficiency virus type 1 replication is mediated through induction of tumor necrosis factor-alpha.</a> The Journal of infectious diseases. 177 (2), 437-445 (1998).</li>
<li>Francesconi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV%2C+malaria+parasites%2C+and+acute+febrile+episodes+in+Ugandan+adults%3A+a+case-control+study%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS+%28London%2C+England%29%22%5BJournal%5D)">HIV, malaria parasites, and acute febrile episodes in Ugandan adults: a case-control study.</a> AIDS (London, England). 15 (18), 2445-2450 (2001).</li>
<li>Finney, C. A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+infection+deregulates+Tim-3+expression+on+innate+cells%3A+combination+antiretroviral+therapy+results+in+partial+restoration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+acquired+immune+deficiency+syndromes%22%5BJournal%5D)">HIV infection deregulates Tim-3 expression on innate cells: combination antiretroviral therapy results in partial restoration.</a> Journal of acquired immune deficiency syndromes. 63 (2), 161-167 (2013).</li>
<li>Finney, C. A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+infection+deregulates+innate+immunity+to+malaria+despite+combination+antiretroviral+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS+%28London%2C+England%29%22%5BJournal%5D)">HIV infection deregulates innate immunity to malaria despite combination antiretroviral therapy.</a> AIDS (London, England). 27 (3), 325-335 (2013).</li>
<li>Ljungstrom, I., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLjungstrom%2C+I+%22Methods+in+Malaria+Research%22">Methods in Malaria Research</a>. , 4th edition, MR4/ATCC. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.mr4.org/Publications/MethodsinMalariaResearch.aspx">http://www.mr4.org/Publications/MethodsinMalariaResearch.aspx</a> (2013).</li>
<li>Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J., Williams, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real+time+quantitative+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Real time quantitative PCR.</a> Genome Res. 6 (10), 986-994 (1996).</li>
<li>Universal SYBR green quantitative PCR protocol [Internet]. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/protocols/biology/sybr-green-qpcr.html">http://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/protocols/biology/sybr-green-qpcr.html</a> (2014).</li>
<li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2-DDCT+method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-DDCT method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li>
<li>Hensmann, M., Kwiatkowski, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+basis+of+early+cytokine+response+to+Plasmodium+falciparum%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+immunity%22%5BJournal%5D)">Cellular basis of early cytokine response to Plasmodium falciparum.</a> Infection and immunity. 69 (4), 2364-2371 (2001).</li>
<li>Artavanis-Tsakonas, K., Riley, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+immune+response+to+malaria%3A+rapid+induction+of+IFN-gamma+from+human+NK+cells+by+live+Plasmodium+falciparum-infected+erythrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Innate immune response to malaria: rapid induction of IFN-gamma from human NK cells by live Plasmodium falciparum-infected erythrocytes.</a> J Immunol. 169 (6), 2956-2963 (2002).</li>
<li>Lambros, C., Vanderberg, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synchronization+of+Plasmodium+falciparum+erythrocytic+stages+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+parasitology%22%5BJournal%5D)">Synchronization of Plasmodium falciparum erythrocytic stages in culture.</a> The Journal of parasitology. 65 (3), 418-420 (1979).</li>
<li>Ludlow, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+inhibits+phagocytosis+and+inflammatory+cytokine+responses+of+human+monocyte-derived+macrophages+to+P.+falciparum+infected+erythrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">HIV-1 inhibits phagocytosis and inflammatory cytokine responses of human monocyte-derived macrophages to P. falciparum infected erythrocytes.</a> PloS one. 7 (2), e32102(2012).</li>
<li>Weinberg, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viability+and+functional+activity+of+cryopreserved+mononuclear+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+diagnostic+laboratory+immunology%22%5BJournal%5D)">Viability and functional activity of cryopreserved mononuclear cells.</a> Clinical and diagnostic laboratory immunology. 7 (4), 714-716 (2000).</li>
<li>Fowke, K. R., Behnke, J., Hanson, C., Shea, K., Cosentino, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis%3A+a+method+for+evaluating+the+cryopreservation+of+whole+blood+and+peripheral+blood+mononuclear+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunological%22%5BJournal%5D)">Apoptosis: a method for evaluating the cryopreservation of whole blood and peripheral blood mononuclear cells.</a> Journal of immunological. 244 (1-2), 139-144 (2000).</li>
<li>Jeurink, P. V., Vissers, Y. M., Rappard, B., Savelkoul, H. F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+responses+in+fresh+and+cryopreserved+peripheral+blood+mononuclear+cells%3A+kinetics+of+cell+viability%2C+cellular+subsets%2C+proliferation%2C+and+cytokine+production%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">T cell responses in fresh and cryopreserved peripheral blood mononuclear cells: kinetics of cell viability, cellular subsets, proliferation, and cytokine production.</a> Cryobiology. 57 (2), 91-103 (2008).</li>
<li>Kvarnström, M., Jenmalm, M. C., Ekerfelt, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+cryopreservation+on+expression+of+Th1+and+Th2+cytokines+in+blood+mononuclear+cells+from+patients+with+different+cytokine+profiles%2C+analysed+with+three+common+assays%3A+an+overall+decrease+of+interleukin-4%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Effect of cryopreservation on expression of Th1 and Th2 cytokines in blood mononuclear cells from patients with different cytokine profiles, analysed with three common assays: an overall decrease of interleukin-4.</a> Cryobiology. 49 (2), 157-168 (2004).</li>
<li>Venkataraman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+cryopreservation+of+immune+responses.+XI.+Heightened+secretion+of+tumor+necrosis+factor-alpha+by+frozen+human+peripheral+blood+mononuclear+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Effects of cryopreservation of immune responses. XI. Heightened secretion of tumor necrosis factor-alpha by frozen human peripheral blood mononuclear cells.</a> Cryobiology. 34 (3), 276-283 (1997).</li>
<li>Venkataraman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+cryopreservation+on+immune+responses.+X.+Decrease+in+interleukin-12+production+by+frozen+human+peripheral+blood+mononuclear+cells+is+mediated+by+the+endogenously+hypersecreted+interleukin-10%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Effects of cryopreservation on immune responses. X. Decrease in interleukin-12 production by frozen human peripheral blood mononuclear cells is mediated by the endogenously hypersecreted interleukin-10.</a> Cryobiology. 33 (5), 581-588 (1996).</li>
<li>Reimann, K. A., Chernoff, M., Wilkening, C. L., Nickerson, C. E., Landay, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preservation+of+lymphocyte+immunophenotype+and+proliferative+responses+in+cryopreserved+peripheral+blood+mononuclear+cells+from+human+immunodeficiency+virus+type+1-infected+donors%3A+implications+for+multicenter+clinical+trials%5BTitle%5D)+AND+%22The+ACTG+Immunology+Advanced.+Clinical+and+diagnostic+laboratory+immunology%22%5BJournal%5D)">Preservation of lymphocyte immunophenotype and proliferative responses in cryopreserved peripheral blood mononuclear cells from human immunodeficiency virus type 1-infected donors: implications for multicenter clinical trials.</a> The ACTG Immunology Advanced. Clinical and diagnostic laboratory immunology. 7 (3), 352-359 (2000).</li>
<li>Bennett, S., Breit, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variables+in+the+isolation+and+culture+of+human+monocytes+that+are+of+particular+relevance+to+studies+of+HIV%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+leukocyte+biology%22%5BJournal%5D)">Variables in the isolation and culture of human monocytes that are of particular relevance to studies of HIV.</a> Journal of leukocyte biology. 56 (3), 236-240 (1994).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Nasz protokół został zoptymalizowany w celu jak najbardziej realistycznego badania koinfekcji HIV i malarii in vitro. Po pierwsze, świeże ludzkie krwinki czerwone i surowica są niezbędne do hodowli pasożytów malarii. Jest to niezbędne do uzyskania zdrowej populacji pasożytów malarii. Lizaty pasożytów nie mogą zastąpić żywych pasożytów, ponieważ produkcja cytokin jest znacznie szybsza i intensywniejsza w przypadku stosowania żywych RBC zakażonych P. falciparum (PfRBC) 17,18. Ponadto aktywacja ...

Współinfekcja, infekcja z wieloma równoczesnymi infekcjami, jest normą w naturalnym środowisku. Koinfekcja może mieć duży wpływ na patologię choroby i na kliniczne postępowanie w każdej infekcji. W kontekście koinfekcji może to mieć negatywny wpływ na skuteczność szczepionek i leków, a także na testy diagnostyczne (omówione w punkcie 1). Jednak pomimo jego znaczenia, większość badań nad patogenami bierze pod uwagę tylko pojedyncze infekcje.
Malaria i HIV-1 (HIV) są głównymi przyczynami zachorowalności i śmiertelności na całym świecie. Obszary występowania malarii i endemiczności wirusa HIV w dużym stopniu pokrywają się geograficznie, co naraża miliony ludzi na ryzyko koinfekcji, a w konsekwencji na ryzyko cięższej choroby klinicznej 2–10. Te dwie choroby negatywnie na siebie oddziałują. U osób zakażonych wirusem HIV wyższe miano wirusa HIV i tymczasowe spadki liczby limfocytów T CD4 + można zaobserwować podczas infekcji malarią, podczas gdy obciążenie pasożytami malarii i ryzyko klinicznej i ciężkiej malarii są wyższe u osób zakażonych jednocześnie 2,3,5,7,8,10. Mechanizmy, za pomocą których HIV zwiększa nasilenie malarii, nie są w pełni poznane i wymagają dalszych badań.
Tutaj opisujemy metodę, za pomocą której można badać jednocześnie malarię i zakażenie wirusem HIV in vitro. W szczególności metoda ta pozwala na badanie odpowiedzi immunologicznej specyficznej dla malarii w kontekście zakażenia wirusem HIV. Nasz protokół opisuje wszechstronny system kohodowli wykorzystujący świeżo izolowane komórki jednojądrzaste krwi obwodowej (PBMC) wyizolowane od dawców przewlekle zakażonych wirusem HIV oraz erytrocyty pasożytnicze P. falciparum (PfRBC) z hodowli in vitro. Wpływ terapii antyretrowirusowej HIV na te odpowiedzi można również zbadać za pomocą prospektywnie pobranych PBMC od dawców HIV(+) przed i po terapii.
Użyliśmy tego systemu do zbadania wpływu zakażenia wirusem HIV na wrodzone odpowiedzi immunologiczne specyficzne dla malarii 11,12 i byliśmy w stanie ustalić, że specyficzne dla malarii odpowiedzi IFNγ i TNF są upośledzone w komórkach NK, komórkach NKT, limfocytach T γδ od dawców HIV(+) przed i po terapii antyretrowirusowej HIV. Dodatkowo udało nam się wykorzystać ten system do określenia, że funkcje monocytowe są również upośledzone u dawców HIV(+), ale wracają do terapii antyretrowirusowej po zakażeniu HIV.

<table><tbody><tr><td>przeciwciała alaninowe</td><td>Sigma</td><td>A7377</td><td></td></tr><tr><td>(patrz inna tabela)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD Cytofix/Cytoperm z BD GolgiPlug</td><td>BD</td><td>555028</td><td>zawiera brefeldynę A, bufor cytofix/cytoperm i bufor do trwałej ondulacji/płukania</td></tr><tr><td>BD Vacutainer ACD Roztwór A</td><td>BD</td><td>364506</td><td></td></tr><tr><td>BD Vacutainer Heparyna sodowa</td><td>BD</td><td>17-1440-02</td><td></td></tr><tr><td>DPBS (bez wapnia, bez magnezu)</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td><td>płodu Sigma</td><td>F1051</td><td>inaktywacja termiczna przed użyciem</td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PLUS</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-02</td><td></td></tr><tr><td>gentamycyna (10 mg / ml)</td><td>Gibco</td><td>15710-064</td><td></td></tr><tr><td>Hema3 Zestaw do barwienia</td><td>Fisher</td><td>122-911</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher</td><td>BP310-500</td><td></td></tr><tr><td>hipoksantyna</td><td>Sigma</td><td>H9636</td><td></td></tr><tr><td>Jonomycyna</td><td>Sigma</td><td>I3909</td><td></td></tr><tr><td>MEM aminokwasy endogenne (10 mM)</td><td>Gibco</td><td>11140</td><td></td></tr><tr><td>PMA</td><td>Sigma</td><td>P8139</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 proszek</td><td>Life-Technologies</td><td>31800-022</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 z L-glutaminą i HEPES</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30255.01</td><td></td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu (proszek, hodowla komórkowa)</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Pirogronian sodu (100 mM)</td><td>Gibco</td><td>11360</td><td></td></tr><tr><td>Tris (baza Trizma)</td><td>Sigma</td><td>T6066</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Ambion</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue (0,4%)</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>BD CompBead</td><td>BD</td><td>552843, 552845</td><td>zależy od zastosowanych przeciwciał</td></tr><tr><td>Mieszanina gazów pasożytniczych</td><td>Na specjalne zamówienie</td><td></td><td>3% CO2, 1% O2, równowaga N2</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,2 &#956; m jednostka</td><td></td><td></td><td></td>filtrująca</tr><tr><td>Szkiełka szklane</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kolby</td><td></td><td></td><td></td>T25</tr><tr><td>Kolby</td><td></td><td></td><td></td>T75</tr><tr><td>Probówki 50 ml</td> 24-dołkowe <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>płytki hodowlane</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>odłączone Pipety</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pasteura zatkane Pipety</td><td></td> <td>Pasteura</td><td></td></tr><tr><td>sterylne pipety</td><td></td><td></td><td></td>transferowe</tr><tr><td>hemocytometr</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>cytometr przepływowy (3 lasery)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>< silne > przeciwciała stosowane do cytometrii przepływowej</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-TNF</td><td>eBiosciences</td><td>551487</td><td>FITC (fluorofor)
2 &#956; l</td></tr><tr><td>Anty-IFN&#947;</td><td>Biolegend</td><td>506507</td><td>PE (fluorofor) 
20 &#956; l</td></tr><tr><td>Anti-CD8</td><td>Biolegend</td><td>300914</td><td>PE-Cy7 (fluorofor) 
1 &#956; l</td></tr><tr><td>Anti-CD14</td><td>Biolegend; BD Biosciences</td><td>325624; 551487</td><td>Biotyna (fluorofor) 
0,5 &#956; l
Streptavin PE-TR (fluorofor) 
0,1 i #956; l</td></tr><tr><td>Anti-CD56</td><td>Biolegend</td><td>318322</td><td>PerCP/Cy5.5 (fluorofor) 
5 &#956; l</td></tr><tr><td>Anty-&#947; &#948;</td><td>Biolegend</td><td>331212</td><td>APC (fluorofor)
5 &#956; l</td></tr><tr><td>Anti-CD3</td><td>Biolegend</td><td>300426</td><td>APC-Cy7 (fluorofor) 
5 &#956; l</td></tr><tr><td>Anti-CD4</td><td>Biolegend</td><td>317424</td><td>Pacific Blue (fluorofor)
1 &#956; l</td></tr></tbody></table>

model in vitro do pomiaru odpowiedzi immunologicznej na malarię w kontekście współzakażenia wirusem hiv

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

Jednoczesne zakażenie malarią i wirusem HIV jest rosnącym priorytetem zdrowotnym. Jednak większość badań nad malarią lub HIV koncentruje się obecnie na każdej infekcji z osobna. Chociaż zrozumienie dynamiki choroby dla każdego z tych patogenów niezależnie jest niezbędne, ważne jest również, aby zbadać i zrozumieć interakcje między tymi patogenami. 
Opracowaliśmy wszechstronny model in vitro jednoczesnego zakażenia HIV i malarii, aby badać odpowiedzi immunologiczne gospodarza na malarię w kontekście zakażenia HIV. Nasz model pozwala na badanie czynników wydzielanych w supernatantach komórkowych, powierzchniowych i wewnątrzkomórkowych markerów białkowych, a także poziomów ekspresji RNA. Zastosowany projekt eksperymentalny i metody ograniczają zmienność oraz promują wiarygodność i odtwarzalność danych. 
Wszystkie patogeny użyte w tym modelu są naturalnymi ludzkimi patogenami (Plasmodium falciparum i HIV-1), a wszystkie zainfekowane komórki są naturalnie zakażone i używane na świeżo. Wykorzystujemy ludzkie erytrocyty pasożytujące na P. falciparum i utrzymywane w ciągłej hodowli in vitro. Uzyskujemy świeżo wyizolowane komórki jednojądrzaste krwi obwodowej od ochotników przewlekle zakażonych wirusem HIV. Każdy zastosowany stan ma odpowiednią kontrolę (P. falciparum spasożytowany vs. normalne erytrocyty), a każdy dawca zakażony wirusem HIV ma kontrolę niezakażoną wirusem HIV, z której komórki są pobierane tego samego dnia. Model ten zapewnia realistyczne środowisko do badania interakcji między pasożytami malarii a ludzkimi komórkami odpornościowymi w kontekście zakażenia wirusem HIV.

Wykresy przedstawiają poziomy produkcji IFNγ przez komórki NKT (Rysunek 2), z wykorzystaniem bramkowania CD56+CD3+γδ- w celu uzyskania populacji komórek NKT (dane nie zostały przedstawione). Komórki hodowano przez 72 hr przed barwieniem. Po zabarwieniu, za pomocą cytometru przepływowego przeanalizowano 100 000 komórek CD3+, aby uzyskać wystarczająco duże populacje komórek NK, NKT i γδ (komórki będące przedmiotem analizy). Na każdym wykresie przedstawiono minimum 5 600 komórek NKT. Produkcję TNF określono...

Współinfekcja człowieka jest trudna do odtworzenia in vitro. Jednak ludzkie pasożyty malarii mogą być łatwo hodowane in vitro, podobnie jak świeżo wyizolowane ludzkie komórki jednojądrzaste krwi obwodowej naturalnie zakażone wirusem HIV. Stanowi to doskonały model do badania wczesnych odpowiedzi immunologicznych na pasożyty malarii w kontekście współzakażenia wirusem HIV.

Model in vitro do pomiaru odpowiedzi immunologicznej na malarię w kontekście współzakażenia wirusem HIV

Malaria and HIV co-infection is a growing health priority. However, most research on malaria or HIV currently focuses on each infection individually. ...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest obserwacja wrodzonej odpowiedzi odpornościowej na malarię w warunkach przewlekłej infekcji HIV. Osiąga się to poprzez najpierw hodowlę żywych pasożytów P. falciparum w ludzkich erytrocytach, a w drugim kroku współhodowlę mononuklearnych komórek krwi obwodowej, pobranych od dawców HIV-dodatnich oraz niezakażonych, z erytrocytami zakażonymi pasożytem malarii.Ostatecznie analiza cytometryczna przepływowo używana jest do oceny aktywności cytokinowej komórek odporności wrodzonej u osób żyjących z HIV w porównaniu do niezakażonej grupy kontrolnej. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie koinfekcji. Na przykład, w jaki sposób obecność jednej infekcji, takiej jak HIV, wpływa na odpowiedź immunologiczną przy drugiej infekcji, np. malarii. Aby zsynchronizować pasożyty, odwiruj kulturę pasożytów i poddaj lizie pasożyty w stadium trofozoitów w osadzie, dodając 19 objętości roztworu alaniny o temperaturze 37 °C w temperaturze pokojowej. Po 15 minutach odwiruj komórki w RPMI 0 dwa razy.Dostosowanie hematokrytu do 3% w R-P-M-I-A po drugim płukaniu. Następnie nasyć kolbę gazem i przenieś ją z powrotem do inkubatora w temperaturze 37 °C, aż trofozoity osiągną poziom pasożytnictwa od 5 do 10%, aby obliczyć poziom pasożytnictwa w próbce. Nanieś 10 µL próbki z warstwy krwi na szkiełko przedmiotowe i użyj drugiego szkiełka do przygotowania cienkiego rozmazu krwi, a następnie poczekaj, aż krew wyschnie.Przebarw preparat za pomocą zestawu do barwienia HEMA three zgodnie z protokołem producenta. Aby obliczyć całkowitą liczbę zainfekowanych erytrocytów, należy policzyć 300 komórek pod mikroskopem świetlnym i porównać liczbę ciemnofioletowych, zabarwionych erytrocytów z pasożytami do liczby jasnoróżowych, niezainfekowanych komórek w celu wyznaczenia hematokrytu.Użyj hemocytometru, aby określić liczbę czerwonych krwinek na mililitr hodowli pasożytów. Następnie ponownie odwiruj hodowlę pasożytów i resuspenduj komórki w RPMI plus w stężeniu 6 × 10⁶ zainfekowanych erytrocytów na mililitr. Aby wyizolować ludzkie PBMC, rozcieńcz próbki krwi pobrane od dawców HIV-dodatnich lub HIV-ujemnych w równym objętościowo zimnym DPBS. Następnie do każdej probówki o pojemności 50 ml dodaj 15 ml Ficollu w temperaturze pokojowej.25 ml roztworu DPBS do krwi, a następnie ostrożne warstwowanie do 25 ml krwi z roztworem DPBS. Za pomocą sterylnej plastikowej pipety transferowej oddziel komórki poprzez wirowanie, a następnie użyj sterylnej plastikowej pipety transferowej, aby zebrać PBMC z warstwy przejściowej. Przenieś alikwoty PBMC o objętości do 20 ml do oddzielnych probówek 50 ml.Następnie dopełnić objętość w każdej probówce do 50 mililitrów, używając sterylnego zimnego DPBS. Ponownie odwirować komórki, a po ostatnim płukaniu ponownie zawiesić osad w 50 mililitrach świeżego sterylnego DPBS, powtarzając czynność dwukrotnie. Zawiesić komórki w 10 mililitrach RPMI-1640 w celu ich przeliczenia, a następnie dostosować stężenie PBMC do końcowego poziomu 10 × 10⁶ komórek na mililitr w RPMI-1640, aby przygotować koinfekcję.Kultury rozpoczyna się od wysiania 1x10⁶ świeżo wyizolowanych PBMC od osób HIV-dodatnich i HIV-ujemnych w 100 µL pożywki R-P-M-I-S plus na każdą studnią płyty 24-dołkowej. Objętość w każdej studni należy uzupełnić do 500 µL, dodając 400 µL pożywki R-P-M-I-S plus, a następnie w trzech powtórzeniach i w całkowitej objętości 500 µL na studnię dodać 3x10⁶ niezakażonych erytrocytów lub 3x10⁶ erytrocytów zakażonych pasożytami do komórek zakażonych i niezatkażonych HIV. Płytę do koinfekcji należy umieścić w inkubatorze do kultur komórkowych.Następnie, po odpowiednim czasie trwania eksperymentu, odwiruj komórki i pobierz 700 µL supernatantu hodowli z każdej studni. Odwiruj supernatant, aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia, a następnie rozdziel próbki na odpowiednie aliquoty. Opisz probówki i zamroź je w temperaturze -20 °C lub niższej do późniejszej analizy.Od sześciu do ośmiu godzin przed analizą produkcji cytokin specyficznych dla komórek. Po zakończeniu inkubacji potraktować próbki jednym mikrolitrem 1000 D per felden na każdą studzinkę. Umieścić płytkę na lodzie na 15 minut.Następnie za pomocą sterylnej pipety pobierz komórki z dna płytki i przenieś je do oznakowanych probówek do mikrocentryfugi. Teraz odwiruj komórki i resuspender osady w 500 µL buforu do cytometrii przepływowej. Podziel komórki w taki sposób, aby każda próbka posiadała co najmniej jedną probówkę do pełnego barwienia przeciwciałami.Jedna probówka do barwienia przeciwciałami w układzie fluorescent minus one (FMO) powinna zawierać również pojedynczą kontrolę niebarwioną do cytometrii przepływowej. Następnie należy oznakować komórki poddane pełnemu barwieniu przeciwciałami oraz komórki w kontroli FMO w 50 µL buforu do cytometrii przepływowej, stosując uprzednio miareczkowane stężenie czterech przeciwciał koniugowanych z fluorochromami, skierowanych przeciwko pożądanym markerom powierzchniowym komórek, w temperaturze 4 °C i z osłoną przed światłem przez 20 minut.Przemyj próbki w 1 ml buforu do cytometrii przepływowej i dodaj 100 µl roztworu cyto fixed cyto perm do każdej probówki. Po 20 minutach w temperaturze 4 °C w ciemności przemyj komórki w 1 ml buforu do przemywania po permeabilizacji, odwiruj komórki i resuspenduj osady w 100 µl buforu do przemywania po permeabilizacji, dodając wcześniej tytrowane stężenie przeciwciał koniugowanych z fluoro four przeciwko wybranym markerom wewnątrzkomórkowym do próbek przeznaczonych do barwienia.Inkubuj wszystkie probówki przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, chroniąc je przed światłem. Następnie przemyj próbki w 1 ml buforu do płukania po permeabilizacji na każdą probówkę. Na koniec utrwal osady w 300 µL buforu do cytometrii o niskiej zawartości białek, uzupełnionego o 1% paraformaldehydu, przez 15 minut w celu neutralizacji HIV przed analizą metodą cytometrii przepływowej. Na przedstawionych wykresach pokazano poziomy produkcji interferonu gamma z komórek NK T u osób HIV-dodatnich i HIV-ujemnych poddanych działaniu zainfekowanych erytrocytów lub kontrolnych niezinfekowanych erytrocytów.Należy zauważyć, że w przypadku PBMC od osób HIV-dodatnich zaobserwowano stłumioną wrodzoną odpowiedź odpornościową na zakażenie malarią, co objawiało się brakiem produkcji interferonu gamma w obecności zarażonych erytrocytów, w przeciwieństwie do silnej produkcji cytokin występującej w PBMC od osób HIV-ujemnych. Należy zatem pamiętać, że praca z HIV jest niezwykle niebezpieczna i podczas wykonywania tych protokołów należy przestrzegać środków ostrożności, takich jak przeprowadzanie wszystkich etapów w komorze bezpiecznej typu klasy II, noszenie odpowiedniego sprzętu ochronnego oraz unikanie używania szklanych przedmiotów ostrych i aspiratora.

an-vitro-model-for-measuring-immune-responses-to-malaria-context-hiv

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Opracowaliśmy model koinfekcji malarią i HIV-1 in vitro, aby zbadać wpływ Plasmodium falciparum na cykl replikacyjny HIV-1 w ludzkich pierwotnych makrofagach pochodzących z monocytów. Ten wszechstronny system można łatwo dostosować do innych typów komórek pierwotnych podatnych na zakażenie HIV-1.

Model koinfekcji In vitro do badania interakcji między Plasmodium falciparum a HIV-1 w ludzkich pierwotnych komórkach odpornościowych pochodzących z monocytów

Ten film pokazuje ex vivo zakażenie ludzkiej tkanki błony śluzowej macicy ludzkim wirusem niedoboru odporności typu 1, HIV-1, oraz ich utrzymanie na gąbkach żelatynowych na granicy powietrze-ciecz. Metoda ta pozwala na monitorowanie replikacji i patogenezy HIV-1 w tkankach ludzkich.

Model zakażenia błony śluzowej szyjki macicy u człowieka do badania patogenezy HIV w warunkach ex vivo

Ten film demonstruje generowanie modelu hodowli komórkowej in vitro z jednoczesną infekcją malarią i HIV. Zakażone wirusem HIV jednojądrzaste komórki krwi obwodowej hodowane wspólnie z erytrocytami pasożytującymi na Plasmodium falciparum potencjalnie wspierają się nawzajem i dostarczają informacji na temat odpowiedzi immunologicznych i postępu choroby w koinfekcjach HIV i malarii.

Opracowanie modelu hodowli komórkowej in vitro dla jednoczesnego zakażenia malarią i HIV

Wideo demonstruje technikę generowania humanizowanego modelu myszy z opartą na komórkach macierzystych odpornością przeciwko ludzkiemu wirusowi niedoboru odporności (HIV). Ludzka tkanka grasicy płodu i zmodyfikowane hematopoetyczne komórki macierzyste (HSC) są wszczepiane do torebki nerkowej myszy z poważnie obniżoną odpornością. HSC, które wyrażają chimeryczne receptory antygenowe (CAR) przeciwko wirusowi HIV, są mieszane w galaretowatej mieszaninie białek, która sprzyja ich kolokalizacji z...

Budowa humanizowanego modelu myszy z inżynieryjną odpornością na HIV

Opracowaliśmy test in vitro, aby zbadać rolę szlaków immunoregulacyjnych w regulacji wydzielania cytokin przez limfocyty T CD4 specyficzne dla HIV.

In vitro Test do oceny wpływu szlaków immunoregulacyjnych na funkcję efektora limfocytów T CD4 specyficznych dla HIV

Gruźlica i malaria to dwie z najbardziej rozpowszechnionych infekcji u ludzi oraz główne przyczyny zachorowalności i śmiertelności w zubożałych populacjach w tropikach. Stworzyliśmy eksperymentalny system modelowy do badania wyników koinfekcji malarią i gruźlicą u myszy po prowokacji obydwoma patogenami za pośrednictwem ich naturalnej drogi zakażenia.

Model eksperymentalny do badania koinfekcji gruźlicą i malarią po naturalnym przenoszeniu Mycobacterium tuberculosis i Plasmodium berghei

Pasożyt malarii atakuje i replikuje się w czerwonych krwinkach. Dokładna ocena inwazji merozoitu i parazytemii ma zatem kluczowe znaczenie w ocenie przebiegu zakażenia malarią. W tym miejscu opisujemy protokół oparty na cytometrii przepływowej do pomiaru tych parametrów w mysim modelu malarii.

In vivo (in vivo) Ocena pasożytytemii zarodźca gryzoni i inwazji merozoitu za pomocą cytometrii przepływowej

Ten protokół opisuje metody konstruowania humanizowanego modelu myszy szpiku kostnego/wątroby/grasicy z opartą na komórkach macierzystych odpornością na zakażenie wirusem HIV.

Zmodyfikowana odporność na zakażenie wirusem HIV oparta na komórkach macierzystych w humanizowanym modelu myszy

Opisujemy mysi model eksperymentalnej malarii mózgowej i pokazujemy, jak można śledzić stan zapalny i patologię mikrokrążenia in vivo za pomocą rezonansu magnetycznego.

In vivo (in vivo) Śledzenie rozwoju obrzęku i patologii mikrokrążenia w modelu eksperymentalnej malarii mózgowej z wykorzystaniem rezonansu magnetycznego

Ogólnym celem tego protokołu jest dostarczenie instrukcji, jak mierzyć zdolność przeciwciał obecnych w surowicach lub osoczu osób, naturalnie narażonych na zakażenie Plasmodium falciparum, do opsonizacji i indukowania fagocytozy erytrocytów zakażonych pasożytami (IE).

Pomiar naturalnie nabytych przeciwciał indukujących fagocytozę przeciwko pasożytom Plasmodium falciparum za pomocą testu opartego na cytometrii przepływowej

Tutaj opisujemy nową metodę, która pomaga wyjaśnić mechanizmy odporności komórkowej na Plasmodium podczas fazy infekcji krwi. Jest to test in vitro, który mierzy zabijanie zakażonych krwinek czerwonych przez limfocyty cytotoksyczne.

In vitro Test zabijania krwinek czerwonych zakażonych zarodźcem przez limfocyty cytotoksyczne

Poznaj model in vitro do badania odpowiedzi immunologicznej na malarię przy współzakażeniu HIV. Metoda wykorzystuje hodowlę Plasmodium falciparum i analizę cytometryczną cytokin.

Model in vitro do pomiaru odpowiedzi immunologicznej na malarię w kontekście współzakażenia wirusem HIV

Przeglądaj więcej filmów