Name: Przygotowanie substratów miki i krzemu do analizy DNA origami i eksperymentów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 3 s
Description: Naucz się przygotowywać substraty miki i krzemu do badań DNA origami. Poznaj metody czyszczenia RCA, funkcjonalizacji powierzchni i nanoszenia nanostruktur DNA.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Dr. Gary'emu Bernsteinowi za użycie AFM.

1. Planowanie eksperymentu i przygotowanie materiału
<ol>
	<li>Określ projekt, stężenie i funkcjonalność origami DNA, które zostaną użyte w eksperymentach. 14-16 Tutaj używamy prostokąta origami DNA przygotowanego w 1x roztworze TAE/Mg2+ (40 mM Tris-zasada, 20 mM kwas octowy, 2 mM EDTA i 12 mM octan magnezu, pH 8,0). 17</li>
	<li>Autoklaw wszystkie końcówki, rurki i pojemniki, które mają być używane. Wszystkie te materiały muszą być kompatybilne z autoklawem.</li>
	<li>Przygotuj zapas sterylnej wody do płukania. Napełnij sterylny słoik około 500 ml wody o wymiarach 18 MΩ x cm, umieść na płycie grzejnej, gotuj przez 5 minut ze zdjętą nakrętką, zdejmij słoik z płyty grzejnej i pozostaw do ostygnięcia z pokrywką umieszczoną na pojemniku, ale nie dokręconą. Przechowuj w lodówce i przygotowuj nowy zapas co miesiąc lub w razie potrzeby.</li>
</ol>
2. Przygotowanie podłoża z miki
<ol>
	<li>Przytnij podłoża do odpowiedniego rozmiaru (kwadraty 1 cm x 1 cm) za pomocą nożyczek. Mika jest cienka i krucha. Alternatywnie kup mikę w formie krążka, która nie wymaga cięcia.</li>
	<li>Rozetnij mikę za pomocą taśmy dwustronnej. Mika składa się z warstw minerałów oddzielonych jonami interkalacyjnymi, każda warstwa może zostać oderwana po przyklejeniu do taśmy dwustronnej. Rozdział 18
	<ol>
		<li>Umieść kwadraty miki na taśmie dwustronnej jeszcze w dyspenserze taśmy, upewniając się, że są mocno przyklejone do taśmy. Ostrożnie wsuń pęsetę między mikę a taśmę, górna warstwa zostanie usunięta i pozostanie na taśmie. Natychmiast po usunięciu kwadrat miki będzie miał czystą stronę skierowaną w dół. Pamiętaj, aby odwrócić mikę przed przechowywaniem w pojemniku.</li>
		<li>Powtórz to trzy do czterech razy, aby zapewnić całkowite usunięcie wierzchniej warstwy i odpowiednie czyszczenie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Alternatywnie, przyklej mikę do pojemnika lub blatu za pomocą kawałka dwustronnej taśmy i użyj drugiego kawałka, aby przykleić i oderwać najwyższą warstwę miki. W obu przypadkach mika zostanie odpowiednio oczyszczona, chociaż alternatywna metoda utrudnia osadzanie DNA oraz płukanie i suszenie próbki ze względu na drugą przyczepność do podłoża.</li>
</ol>
3. Deponowanie DNA Origami na mice
<ol>
	<li>Krótko mówiąc, wymieszaj fiolkę origami DNA za pomocą mieszalnika wirowego, aby zapewnić równomierne rozproszenie nanostruktur w roztworze.</li>
	<li>Odpipetować 4 μl roztworu na mikę, upewniając się, że końcówka pipety nie dotyka podłoża. Pozostaw origami DNA na mice na około 10 minut, aby zapewnić odpowiednie pokrycie. Czas osadzania będzie się różnił w zależności od stężenia użytego origami DNA, a także pożądanego pokrycia (ryc. 2 i 3).
	<ol>
		<li>Wypłucz roztwór origami DNA z podłoża miki, używając 100 μl sterylnej wody nad zlewem lub innym pojemnikiem na płyny. Podnieś mikę za pomocą pęsety. Odpipetuj wodę z podłoża, tak aby kropla płynęła w kierunku końcówki pęsety. Potrząśnij miką ostrym ruchem w dół, aby usunąć nadmiar wody. Trzymaj pęsetę pionowo, aby woda spływała w kierunku pęsety, aby uniknąć zanieczyszczenia próbki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Suszyć podłoże stałym strumieniem azotu (N2) przez 1 minutę. Upewnij się, że nadmiar wody został usunięty. Powtórz płukanie z dodatkowymi 100 μl sterylnej wody. Suszyć podłoże za pomocą N2 przez dodatkowe 3 minuty. Całkowicie suche podłoże jest niezbędne do udanej analizy mikroskopii sił atomowych (AFM) (ryc. 4).</li>
	<li>Przeanalizować podłoże za pomocą AFM lub przechowywać w zamkniętym pojemniku.</li>
</ol>
4. Konfiguracja czyszczenia CMOS/Silicon
<ol>
	<li>UWAGA: Podczas korzystania z konfiguracji CMOS należy zawsze używać środków ochrony osobistej. Odczynniki obejmują mocne kwasy, mocne zasady, kwas fluorowodorowy (HF) i silne środki utleniające, które mogą reagować z rozpuszczalnikami odpadowymi, jeśli odczynniki nie zostaną odpowiednio zutylizowane. Przestrzegaj następujących środków ostrożności:
	<ol>
		<li>Umieść ławkę CMOS w okapie chemicznym bez żadnych innych procesów ani konfiguracji.</li>
		<li>Podczas korzystania z ławki CMOS należy nosić rękawice nitrylowe, fartuch laboratoryjny, okulary ochronne, duże przemysłowe rękawice nitrylowe, fartuch przeciwpowodziowy i osłonę twarzy.</li>
		<li>Użyj plastikowych pojemników jako wtórnego zabezpieczenia, gdy przygotowywane są roztwory.</li>
		<li>Użyć miarki z obojętnego fluorowanego polimeru do manipulowania stężonym HF.</li>
		<li>Przygotuj maść z glukonianu wapnia jako pierwszą pomoc w przypadku każdego kontaktu ze skórą.</li>
		<li>Do wykonania tego procesu należy pozwolić wyłącznie odpowiednio przeszkolonemu personelowi.</li>
		<li>W nagłych wypadkach zawsze upewnij się, że inny członek laboratorium jest obecny.</li>
		<li>Przechowuj informacje o karcie charakterystyki dla wszystkich chemikaliów w pobliżu maski.</li>
		<li>Zapoznaj się z zasadami instytucji lub firmy dotyczącymi wycieków chemicznych i narażenia. 
		Uwaga: HF łatwo przenika przez skórę i jest wymiataczem wapnia, wpływając na kości i uszkadzając nerwy, jeśli dojdzie do ekspozycji. Narażenie skóry na kilka mililitrów stężonego kwasu fluorowodorowego może być niebezpieczne, a nawet śmiertelne. Ustal niezbędne środki ostrożności, aby zapobiec narażeniu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonaj RCA1 i RCA2 w oddzielnych szklanych zlewkach o pojemności 250 ml na oddzielnych płytach grzejnych. Każda zlewka powinna zawierać mieszadło. Monitoruj temperaturę roztworu za pomocą termometrów zaciśniętych tak, aby mieszadło nie uderzało w bańkę. Przykryj zlewki szkiełkiem zegarkowym, aby zmniejszyć skutki parowania.</li>
	<li>Przygotowanie do RCA1
	<ol>
		<li>Umieścić 50 ml wody o wymiarach 18 MΩ x cm do wyznaczonej zlewki RCA1 za pomocą miarki.</li>
		<li>Dodać 15 ml stężonego wodorotlenku amonu (NH4OH) do zlewki. Przepłukać miarkę 25 ml wody i dolać wody do płukania do zlewki RCA1.</li>
		<li>Włącz ogień i zamieszaj na płycie grzejnej i doprowadź kąpiel RCA1 do 70 °C.</li>
		<li>Dodać 15 ml 30% nadtlenku wodoru (H2O2) do zlewki RCA1. Roztwór RCA1 należy zużyć w ciągu 1 godziny po dodaniuH2O2. Kąpiel może być używana kilka razy w ciągu trzech dni, jeśli za każdym razem do kąpieli dodaje się 15 ml nadtlenku.</li>
		<li>Miarkę dokładnie wypłukać wodą i wyrzucić do odpowiedniego pojemnika na odpady RCA1.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie do RCA2
	<ol>
		<li>Dodać 70 ml wody o sile 18 MΩ x cm do wyznaczonej zlewki RCA2 za pomocą dokładnie wypłukanej miarki.</li>
		<li>Dodać 15 ml stężonego kwasu solnego (HCl). Przepłukać miarkę 20 ml wody i włożyć ją do zlewki RCA2.</li>
		<li>Zwiększ temperaturę i szybkość mieszania płyty grzejnej, aż roztwór osiągnie 70 °C.</li>
		<li>Dodać 15 ml 30% H2O2 . Podobnie jak w przypadku kąpieli RCA1, należy użyć tego roztworu w ciągu 1 godziny od dodaniaH2O2; dodatkowo kąpiel może być ponownie użyta kilka razy w ciągu trzech dni, jeśli przed każdym użyciem doda się 15 mlH2O2.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie roztworu HF
	<ol>
		<li>Umieścić 50 ml wody w obojętnej zlewce z fluorowanego polimeru.</li>
		<li>Odmierzyć 4 ml stężonego kwasu fluorowodorowego (49%) w plastikowej miarce i dodać do zlewki z obojętnego fluorowanego polimeru.</li>
		<li>Plastikową miarkę wypłukać łącznie 50 ml wody, dodając wodę do płukania do zlewki HF. Miarkę dokładnie umyć wodą, a popłuczyny wyrzucić do przeznaczonego do tego pojemnika na odpady HF.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Przygotowanie i czyszczenie podłoża silikonowego
<ol>
	<li>Cięcie wafli krzemowych na wióry
	<ol>
		<li>Zidentyfikuj prostopadłe i równoległe kierunki sieci na płaskiej, polerowanej powierzchni płytki krzemowej. Te wskazówki są używane, aby ułatwić rozszczepianie kwadratów. Poniższe instrukcje dotyczą rozszczepiania krzemu <110> i mogą nie być odpowiednie dla innych orientacji kryształów.</li>
		<li>Połóż wafel silikonowy wypolerowaną stroną do góry na miękkiej powierzchni, takiej jak serwetka. Za pomocą pisaka z diamentową końcówką delikatnie naciąć spód wafla wzdłuż głównej płaskiej krawędzi. Umieść mały drucik, taki jak spinacz do papieru, poniżej nacięcia i delikatnie dociśnij wafel, umieszczając palce lub pęsetę po obu stronach nacięcia i dociskając w dół. W ten sposób rozdzielisz wafel na dwie połówki wzdłuż linii sieci krystalicznej w naturalnym kierunku rozszczepienia.</li>
		<li>Na innej serwetce za pomocą ołówka i linijki odmierz żądaną szerokość kwadratów, zaznaczając kropki zarówno na górze, jak i na dole serwetki. Połącz te kropki liniami prostymi. Będzie to służyć jako wskazówka dla nawet kwadratowych kształtów.</li>
		<li>Umieść jedną z połówek wafla krawędzią do przodu między zmierzonymi liniami na serwetce równo z linią i powtórz w kroku 5.1.2 Świeżo połamane prostopadłe kawałki powinny teraz mieć szerokość rozłupanych kwadratów. Obróć wafel poziomo na serwetce. Umieść go między prostopadłymi liniami i powtórz proces opisany w kroku 5.1.2.</li>
		<li>Przechowuj świeżo rozdrobnione chipsy waflowe w czystej fiolce wypełnionej wodą DI, aby zapobiec zarysowaniu. Chipy krzemowe mogą być przechowywane w nieskończoność, ale należy je wyczyścić przed rozpoczęciem eksperymentów.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Czyszczenie CMOS krzemu
	<ol>
		<li>Gdy roztwór RCA1 osiągnie odpowiednią temperaturę, zanurz od ośmiu do dziesięciu chipów krzemowych o wymiarach 1 cm x 1 cm w roztworze za pomocą obojętnego kosza z fluorowanego polimeru o średnicy 2 cali. Na wiórach i ściankach zlewki utworzą się pęcherzyki tlenu. Jeśli nie występuje bąbelkowanie,H2O2ulega degradacji. Pozostaw frytki w roztworze na 10 do 20 minut, mieszając kosz w górę iw dół co kilka minut, aby frytki się nie sklejały.</li>
		<li>Podnieś kosz zawierający wióry silikonowe do góry i dobrze odcedź. Przełożyć kosz do zlewki na odpady i dokładnie spłukać wodą o stężeniu 18 MΩ x cm. Zanurzyć w zmywarce i podskakiwać w górę i w dół przez 20 sekund. Opróżnij kosz i dokładnie spłucz zlewkę z wodą na odpady. Opróżnij zlewkę na odpady do przeznaczonej do tego butelki na odpady RCA1 i napełnij ją wodą.</li>
		<li>Po zakończeniu czyszczenia RCA1 umieść kosz w zlewce HF 1:50 na 10 do 20 sekund. Delikatnym ruchem w górę iw dół wymieszaj frytki i HF. Podnieś wiadro do namaczania, aby HF całkowicie odpłynął. 
		Uwaga: Powierzchnie wiórów powinny być hydrofobowe; Woda nie zwilży chipa, ale zamiast tego utworzy kropelki o dużych kątach zwilżania. Oznacza to, że tlenek krzemu został wytrawiony, a chip jest teraz zakończony wiązaniami Si-H.</li>
		<li>Umieścić zlewkę do płukania i płukać w pojemniku z tworzywa sztucznego, przesunąć kosz nad zlewką do płukania i spłukać wodą o stężeniu 18 MΩ x cm. Zanurzyć kosz w zlewce do mycia i mieszać przez 20 sekund.</li>
		<li>Zakończ drugi cykl opróżniania i płukania wodą o wymiarach 18 MΩ x cm. Wlej wodę z płukania do zlewki do płukania i ponownie napełnij zlewkę do płukania wodą. Wlej wszystkie odpady do wyznaczonej plastikowej butelki na odpady HF.</li>
		<li>Gdy roztwór RCA2 osiągnie odpowiednią temperaturę, zanurz chipy krzemowe w roztworach za pomocą kosza. Pozostaw w roztworze na 10 do 20 minut. Chip będzie teraz hydrofilowy ze względu na wzrost cienkiej (1-2 nm) warstwy tlenku.</li>
		<li>Usuń po odpowiednim czasie i postępuj zgodnie z tymi samymi procedurami płukania, co w przypadku RCA1. Odpady należy utylizować do odpowiedniego pojemnika na odpady RCA2. Wyjmij każdy wiór z kosza plastikową pęsetą, spłucz wodą i wysusz azotem.</li>
		<li>Przechowuj chipsy w plastikowym pudełku na wafle lub w fiolce o wymiarach 18 MΩ x cm wody. Silikon pozostanie czysty, jeśli będzie przechowywany w wodzie przez około trzy dni po czyszczeniu. Upewnij się, że obszar roboczy jest odpowiednio oczyszczony, a zewnętrzna strona rękawic CMOS została umyta. Pozostaw rękawice CMOS w kapturze do wyschnięcia.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Osadzanie DNA Origami na krzemie funkcjonalizowanym APTES
<ol>
	<li>Samodzielne tworzenie monowarstw na krzemie
	<ol>
		<li>Ogrzej APTES do RT przed otwarciem. Jeśli butelka jest zbyt zimna, może dojść do kondensacji, powodując hydrolizę APTES podczas przechowywania. Dodać 1 980 μl wody o stężeniu 18 MΩ x cm i 20 μl APTES do czystej fiolki scyntylacyjnej i zamieszać do wymieszania. Użyj tego rozwiązania natychmiast.</li>
		<li>Umieść oczyszczony chip silikonowy odblaskową stroną do góry w fiolce scyntylacyjnej, zakryj go i pozostaw na 20 minut. Usuń wiór za pomocą pęsety i spłucz 200 μl wody i susz przez 1 minutę strumieniem N2.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Osadzanie origami DNA na APTES Funkcjonalizowany Krzem 
	Uwaga: Etapy osadzania origami DNA na funkcjonalizowanym krzemie są analogiczne do tych deponowania na mice.
	<ol>
		<li>Krótko wymieszać fiolkę origami DNA i odpipetować 4 μl roztworu na substrat krzemowy. Jeśli to konieczne, zwiększ objętość roztworu origami DNA używanego do pokrycia całego substratu, ponieważ funkcjonalizowany krzem jest bardziej hydrofobowy niż substrat miki. Użyj szklanego szkiełka nakrywkowego, aby docisnąć roztwór do osadzania i zapobiec parowaniu podczas długiego osadzania.</li>
		<li>Pozostawić roztwór na czas niezbędny do zastosowanego stężenia i pożądanego pokrycia (zob. rysunki 2 i 3 w celu zapoznania się z wpływem czasu i stężenia na pokrycie powierzchni). Podłoże przepłukać 100 μl sterylnej wody o wymiarach 18 MΩ x cm i wysuszyć roztworem N2 przez 1 min.</li>
		<li>Powtórzyć płukanie dodatkowymi 100 μl sterylnej wody i suszyć podłożeN2 przez 3 minuty.</li>
		<li>Przechowywać próbkę w czystym pojemniku do czasu przeprowadzenia dalszych eksperymentów lub obrazowania. Próbki zaczynają wykazywać nagromadzenie cząstek stałych po około jednym do dwóch tygodni przechowywania, w zależności od tego, jak często są przetwarzane.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. Obrazowanie AFM i analiza obrazu próbek DNA origami
<ol>
	<li>Użyj AFM w trybie stukania w powietrzu do celów obrazowania. Tryb gwintowania zapewnia, że do delikatnych nanostruktur zostanie przyłożona minimalna siła w porównaniu z trybem kontaktowym. 
	Uwaga: Parametry obrazowania będą zależeć od instrumentu. Wszystkie prezentowane obrazy zostały wykonane za pomocą MultiMode Nanoscope IIIa.</li>
	<li>Wybierz sondy AFM do trybu bezdotykowego/stukania w powietrzu, ze złotą powłoką odblaskową, częstotliwością rezonansową (nominalną) ~300 kHz, stałą siły 40 N/m i promieniem końcówki <10 nm.</li>
	<li>Przetwarzaj i analizuj obrazy AFM za pomocą oprogramowania do analizy NanoScope. Wykonaj obliczenia pokrycia za pomocą ImageJ. Rozdział 19</li>
</ol>

<ol><li>Rothemund, P. W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folding+DNA+to+create+nanoscale+shapes+and+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Folding DNA to create nanoscale shapes and patterns.</a> Nature. 440, 297-302 (2006).</li>
<li>Anderson, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembly+of+a+nanoscale+DNA+box+with+a+controllable+lid%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Self-assembly of a nanoscale DNA box with a controllable lid.</a> Nature. 459, 73-77 (2009).</li>
<li>Wang, Z., Ding, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+DNA+Self-Assemblies+as+Templates+for+Functional+Nanostructures%5BTitle%5D)+AND+%22Acc.+Chem.+Res%22%5BJournal%5D)">Engineering DNA Self-Assemblies as Templates for Functional Nanostructures.</a> Acc. Chem. Res. 47, 1654-1662 (2014).</li>
<li>Xu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Graphene+Visualizes+the+First+Water+Adlayers+on+Mica+at+Ambient+Conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Graphene Visualizes the First Water Adlayers on Mica at Ambient Conditions.</a> Science. 329, 1188-1191 (2010).</li>
<li>Bustamante, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circular+DNA-molecules+imaged+in+air+by+scanning+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Circular DNA-molecules imaged in air by scanning force microscopy.</a> Biochemistry. 31, 22-26 (1992).</li>
<li>Hsueh, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localized+Nanoscopic+Surface+Measurements+of+Nickel-Modified+Mica+for+Single-Molecule+DNA+Sequence+Sampling%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Appl+Mater.+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Localized Nanoscopic Surface Measurements of Nickel-Modified Mica for Single-Molecule DNA Sequence Sampling.</a> ACS Appl Mater. Interfaces. 2, 3249-3256 (2010).</li>
<li>Pastre, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anionic+polyelectrolyte+adsorption+on+mica+mediated+by+multivalent+cations%3A+A+solution+to+DNA+imaging+by+atomic+force+microscopy+under+high+ionic+strengths%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Anionic polyelectrolyte adsorption on mica mediated by multivalent cations: A solution to DNA imaging by atomic force microscopy under high ionic strengths.</a> Langmuir. 22, 6651-6660 (2006).</li>
<li>Woo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembly+of+two-dimensional+DNA+origami+lattices+using+cation-controlled+surface+diffusion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Self-assembly of two-dimensional DNA origami lattices using cation-controlled surface diffusion.</a> Nature Communications. 5, 4889(2014).</li>
<li>Vesenka, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate+preparation+for+reliable+imaging+of+DNA+molecules+with+the+scanning+force+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">Substrate preparation for reliable imaging of DNA molecules with the scanning force microscope.</a> Ultramicroscopy. 42-44, 1243-1249 (1992).</li>
<li>Adsorption studies of DNA origami on silicon dioxide. Albrechts, B., et al. 21st Micromechanics and Micro Systems Europe Workshop 2010, , (2010).</li>
<li>Sarveswaran, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesion+of+DNA+Nanostructures+and+DNA+Origami+to+lithographically+patterned+self-assembled+monolayers+in+Si%5B100%5D%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+of+SPIE-Soc.+Opt.+Eng%22%5BJournal%5D)">Adhesion of DNA Nanostructures and DNA Origami to lithographically patterned self-assembled monolayers in Si[100].</a> Proc. of SPIE-Soc. Opt. Eng. 7637, 76370M-1(2010).</li>
<li>Kern, W., Puotien, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleaning+solutions+based+on+hydrogen+peroxide+for+use+in+silicon+semiconductor+technology%5BTitle%5D)+AND+%22RCA+Rev%22%5BJournal%5D)">Cleaning solutions based on hydrogen peroxide for use in silicon semiconductor technology.</a> RCA Rev. 31, 187-206 (1970).</li>
<li>Pillers, M., Goss, V., Lieberman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron-Beam+Lithography+and+Molecular+Liftoff+for+Directed+Attachment+of+DNA+Nanostructures+on+Silicon%3A+Top-down+Meets+Bottom-up%5BTitle%5D)+AND+%22Acc.+Chem.+Res%22%5BJournal%5D)">Electron-Beam Lithography and Molecular Liftoff for Directed Attachment of DNA Nanostructures on Silicon: Top-down Meets Bottom-up.</a> Acc. Chem. Res. 47, 1759-1767 (2014).</li>
<li>Saccá, B., Niemery, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+Origami%3A+The+Art+of+Folding+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">DNA Origami: The Art of Folding DNA.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 51, 58-66 (2012).</li>
<li>Douglas, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+prototyping+of+3D+DNA-origami+shapes+with+caDNAno%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Rapid prototyping of 3D DNA-origami shapes with caDNAno.</a> Nucleic Acids Res. 37, 5001-5006 (2009).</li>
<li>Ben-Ishay, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designing+a+Bio-responsive+Robot+from+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Origami.+J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Designing a Bio-responsive Robot from DNA.</a> Origami. J. Vis. Exp. (77), e50268(2013).</li>
<li>Woo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmable+molecular+recognition+based+on+the+geometry+of+DNA+nanostructures%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Programmable molecular recognition based on the geometry of DNA nanostructures.</a> Nature Chemistry. 3, 620-627 (2011).</li>
<li>Schlegel, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cation+sorption+on+the+muscovite+%28001%29+surface+in+chloride+solutions+using+high-resolution+X-ray+reflectivity%5BTitle%5D)+AND+%22Geochim.+Cosmochim.+Acta%22%5BJournal%5D)">Cation sorption on the muscovite (001) surface in chloride solutions using high-resolution X-ray reflectivity.</a> Geochim. Cosmochim. Acta. 70, 3549-3565 (2006).</li>
<li>Rasband, W. S., Howarter, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((National+Institutes+of+Health%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">National Institutes of Health.</a> Langmuir. 22, Bethesda, Maryland, USA. 11142-11147 (2006).</li>
<li>Kershner, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Placement+and+orientation+of+individual+DNA+shapes+on+lithographically+patterned+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Placement and orientation of individual DNA shapes on lithographically patterned surfaces.</a> Nature Nanotechnology. 4, 557-561 (2009).</li>
<li>Hung, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-area+spatially+ordered+arrays+of+gold+nanoparticles+directed+by+lithographically+confined+DNA+origami%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Large-area spatially ordered arrays of gold nanoparticles directed by lithographically confined DNA origami.</a> Nature Nanotechnology. 5, 121-126 (2010).</li>
<li>Sarveswaran, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((et+al.Adhesion+of+DNA+nanostructure+and+DNA+origami+to+lithographically+patterned+self-assembled+monolayers+on+Si%5B100%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+SPIE-Int.+Soc.+Opt.+Eng%22%5BJournal%5D)">et al.Adhesion of DNA nanostructure and DNA origami to lithographically patterned self-assembled monolayers on Si[100.</a> Proc. SPIE-Int. Soc. Opt. Eng. 7637, 76370M(2010).</li>
<li>Pillers, M. A., Lieberman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermal+stability+of+DNA+origami+on+mica%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vac.+Sci.+Technol.+B%22%5BJournal%5D)">Thermal stability of DNA origami on mica.</a> J. Vac. Sci. Technol. B. 32, 040602(2014).</li>
<li>Song, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+Visualization+of+Transient+Thermal+Response+of+a+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Origami.+J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Direct Visualization of Transient Thermal Response of a DNA.</a> Origami. J. Am. Chem. Soc. 134, 9844(2012).</li>
<li>Wei, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+the+thermal+behavior+of+DNA+origami+nanostructures%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Mapping the thermal behavior of DNA origami nanostructures.</a> J. Am. Chem. Soc. 135 (16), 6165-6176 (2013).</li>
<li>Hyojeong Kim,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stability+of+DNA+Origami+Nanostructures+under+Diverse+Chemical+Environments%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Mater%22%5BJournal%5D)">Stability of DNA Origami Nanostructures under Diverse Chemical Environments.</a> Chem. Mater. 26, 5265-5273 (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Istnieje kilka kroków, na które należy położyć nacisk, aby osiągnąć spójne i idealne wyniki. W przypadku próbek miki, przestrzeganie ścisłego i dokładnego reżimu płukania i suszenia, jak w krokach 3.3 i 3.4, zapewni uzyskanie wysokiej jakości obrazów poszczególnych origami DNA przy użyciu AFM bez różnych problemów opisanych w sekcji Reprezentatywne wyniki. Podstawowe znaczenie dla próbek krzemu ma czystość podłoża. Dokładne i skrupulatne postępowanie zgodnie z procedurami czyszczenia opisanymi w kroku 5.2 zapewni uzyskan...

Po raz pierwszy wprowadzone w 2006 roku, origami DNA wykorzystuje samoorganizującą się naturę oligonukleotydów DNA do tworzenia zaprojektowanych i wysoce uporządkowanych nanostruktur. 1 Opisano niezliczoną ilość struktur, od uśmiechniętych buźek po zatrzaskiwane trójwymiarowe pudełka. 2 Origami DNA może być funkcjonalizowane za pomocą różnych biomolekuł i nanostruktur, co daje początek zastosowaniom badawczym w nanoelektronice, medycynie i komputerach kwantowych. 3 Jednak analiza i wiele przyszłych zastosowań zależy nie tylko od projektu strukturalnego, ale także od przyczepności nanostruktur origami DNA do powierzchni. Metody opisane w tym manuskrypcie dotyczą przygotowania próbek DNA origami na dwóch rodzajach substratów: mice i funkcjonalizowanym tlenku krzemu.
Mika jest substratem z wyboru do badań origami DNA, ponieważ jest atomowo płaska, z wysokością warstwy 0,37 nm ± 0,02 nm. 4 Jest również łatwy do czyszczenia, co ułatwia przygotowanie próbki i badania mikroskopią sił atomowych (AFM). Mika muskowitowa zawiera dużą gęstość potasu w każdej płaszczyźnie rozszczepienia, ale jony te dyfundują z powierzchni miki, gdy znajdują się w wodzie. Aby pośredniczyć w wiązaniu origami DNA z substratem miki, Mg2+ służy do odwrócenia ujemnego ładunku miki i elektrostatycznego wiązania szkieletu fosforanu DNA z substratem (ryc. 1A). 5 Mieszaniny wyżarzonego DNA w obecności dużych nadmiarów nici zszywek dają wysokie pokrycie i dobre obrazy na mice, ponieważ adhezja origami DNA do powierzchni zakończonej Mg2+ jest znacznie silniejsza niż adhezja jednoniciowych oligonukleotydów (nici zszywkowych). Inne dodatnio naładowane jony, w tym Ni2+ i Co2+ mogą być używane do kontrolowania adhezji DNA do miki. 6,7 Zmiana stężenia kationów jednowartościowych i dwuwartościowych w roztworze może pośredniczyć w adhezji i szybkości dyfuzji powierzchniowej origami DNA. 8 Jednak protokół przygotowania substratów mikowych oraz deponowania i płukania origami często nie jest wyraźnie opisany w opublikowanych manuskryptach. 9 Bez jasnego protokołu uzyskanie powtarzalnych wyników może być trudne.
Mika jest izolatorem, więc nie nadaje się jako podłoże do niektórych zastosowań w nanoelektronice. Krzem pasywowany cienkim natywnym tlenkiem ma pożądane właściwości elektroniczne, w tym kompatybilność z wcześniejszym komplementarnym przetwarzaniem półprzewodników metalowo-tlenkowych (CMOS) w celu tworzenia struktur wejściowych/wyjściowych i cech topograficznych. Wafle krzemowe przechowywane w powietrzu są pasywowane grubym tlenkiem termicznym lub cienką natywną warstwą tlenku, która jest stosunkowo brudna, z dużą liczbą cząstek stałych. Tlenek krzemu ma znacznie niższą gęstość ładunku powierzchniowego niż mika, a gęstość ładunku jest w dużym stopniu zależna od przygotowania i historii tlenku. Przy stężeniach jonów magnezu powyżej 150 mM można osiągnąć dobre pokrycie (do 4/μm2) prostokątnym origami DNA na podłożach krzemowych poddanych plazmie tlenowej; Jednak to stężenie i pokrycie mogą się zmieniać w zależności od wielkości i konstrukcji stosowanych nanostruktur. 10 Alternatywnym protokołem dostrajania ładunku powierzchniowego jest dołączenie do tlenku kationowej, samoorganizującej się monowarstwy 3-aminopropylotrietoksysilanu (APTES) (rysunek 1B). Pierwszorzędowa amina na APTES może być protonowana przy wartościach pH poniżej 9, modyfikując ładunek i hydrofobowość substratu. 11 Aby pomyślnie zdeponować całą monowarstwę APTES, krzem musi zostać odpowiednio oczyszczony przy użyciu protokołów Radio Corporation of America (RCA). Protokoły te obejmują zabiegi w roztworach wodorotlenku amonu i nadtlenku wodoru (RCA1) w celu usunięcia pozostałości organicznych i zanieczyszczeń cząstkowych. Krótkie wytrawienie w wodnym roztworze kwasu fluorowodorowego usuwa natywną warstwę tlenku wraz z wszelkimi zanieczyszczeniami jonowymi, które przylegają do tlenku. Na koniec próbki są wystawiane na działanie roztworu kwasu solnego i nadtlenku wodoru (RCA2) w celu usunięcia zanieczyszczeń metalowych i jonowych oraz utworzenia cienkiej, jednolitej warstwy tlenku. 12 Większość pomieszczeń czystych ma wyznaczone okapy do protokołów czyszczenia CMOS, z surowymi zasadami dotyczącymi tego, co można używać w tych obszarach. Częstym problemem są jony, takie jak sód, które mogą zakłócać właściwości elektroniczne struktur CMOS poprzez tworzenie pułapek o średniej przerwie energetycznej. 13 Jony powszechnie stosowane w do przygotowywania i osadzania origami DNA mogą zanieczyszczać kąpiele CMOS i powodować problemy dla innych badaczy korzystających z pomieszczenia czystego. Z tego powodu nasza grupa korzysta z "brudnego" stołu do czyszczenia CMOS, przygotowanego specjalnie dla małych próbek używanych do badań DNA origami. Proces ten jest dobrą alternatywą dla tradycyjnej konfiguracji w pomieszczeniach czystych i może być odpowiedni dla laboratoriów, które nie mają dostępu do stołu CMOS w pomieszczeniach czystych.

<table><tbody><tr><td>Eppendorf epT.I.P.S. Przeładowania, pojemność 2-200&nbsp; &mu; l</td><td>VWR International, LLC</td><td>22491733</td><td>10 tac załadowczych z 96 końcówkami</td></tr><tr><td>Probówki do mikrowirówek, polipropylen</td><td>VWR International, LLC</td><td>87003-290</td><td>0,65 ml, naturalny</td></tr><tr><td>Research Plus Pippete - jednokanałowy - 20-200&nbsp; &mu; l</td><td>A. Daigger & Spółka, Inc.</td><td>EF8960F-3120000054 KAŻDY</td><td>Pipeta o regulowanej objętości</td></tr><tr><td>Research Plus - Pojedynczy kanał - 2-20&nbsp; &mu; l</td><td>A. Daigger & Spółka, Inc.</td><td>EF8960D-3120000038 KAŻDY</td><td>Taśma o regulowanej objętości</td></tr><tr><td>Scotch 237 Stała taśma dwustronna</td><td>Office Depot, Inc.</td><td>602710</td><td>3/4" x 300", zestaw 2 szt</td></tr>. <tr><td>Mikser Vortex</td><td>Thermo Scientific</td><td>M37610-33Q</td><td></td></tr><tr><td>Pojemnik na wafle pojedyncze, 2" (50 mm), 60 mm x 11&nbsp; mm</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>64917-2</td><td>6 w opakowaniu</td></tr><tr><td>6 "Wafel, typ P, < Orientacja 100>, z głównym płaskim Nova</td><td>Electronic Materials, Ltd.</td><td></td><td></td>GC49266</tr><tr><td>Bezpudrowe nitrylowe rękawice diagnostyczne</td><td>VWR International, LLC</td><td>82062-428</td><td>Numer katalogowy dotyczy dużych</td></tr><tr><td>sond bezkontaktowych o wysokiej dokładności z powłoką odblaskową Au</td><td>K-Tek Nanotechnology, Inc.</td><td>HA_NC/15</td><td></td></tr><tr><td>Autoklaw Pan</td><td>A. Daigger & Spółka, Inc.</td><td>NAL692-5000 EF25341C</td><td></td></tr><tr><td>Rękawice agresywne Sol-Vex II, rozmiar: 9-9,5; 15 mil, 13 cali - 1 dz</td><td>Spectrum Chemical Mfg. Corp.</td><td>106-15055</td><td>Przed użyciem spłukać wodą i wyszorować, aż na rękawicach nie utworzą się pęcherzyki.</td></tr><tr><td>Pęseta PTFE 200 mm kwadratowa</td><td>Dynalon Corp.</td><td>316504-0002</td><td></td></tr><tr><td>Arkusze miki moskiewskiej V-5 Jakość</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>71850-01</td><td>10 w opakowaniu</td></tr><tr><td>Krążek miki, 10 mm</td><td>Ted Pella, Inc</td><td>50</td><td>krążków z miki jest opcjonalnych</td></tr><tr><td>Pisak Diamon Pen do wyrobów szklanych</td><td>VWR International, LLC</td><td>52865-005</td><td></td></tr><tr><td>Fiolki scyntylacyjne, szkło borokrzemianowe, z zakrętką - 20 ml</td><td>VWR International, LLC</td><td>66022-060</td><td>Skrzynka 500, z dołączoną nasadką z polipropylenu i wkładką z folii celulozowej</td></tr><tr><td>4 x 5 cali górna płyta grzejna PC-200, 120 V/60 Hz</td><td>Dot Scientific, Inc.</td><td>6759-200</td><td></td></tr><tr><td>Słoiki szklane o prostych ściankach, szerokie usta</td><td>VWR International, LLC</td><td>89043-554</td><td>Opakowanie 254, nakrętki z dołączoną wkładką z masy celulozowej/winylu</td></tr><tr><td>Zlewka ze szkła standardowego, 250 ml Pojemność</td><td>VWR International, LLC</td><td>173506</td><td></td></tr><tr><td>Zlewki, PTFE</td><td>VWR International, LLC</td><td>89026-022</td><td>Do użytku ze</td></tr><tr><td>szkiełkiem zegarkowym HF o płytkiej formie, 3"</td><td>VWR International, LLC</td><td>66112-107</td><td>Skrzynka 12</td></tr><tr><td>plastikowych pojemników do przechowywania</td><td>VWR International, LLC</td><td>470195-354</td><td>Do pojemnika wtórnego</td></tr><tr><td>Termometry szklane ogólnego przeznaczenia do cieczy</td><td>VWR International, LLC</td><td>89095-564</td><td></td></tr><tr><td>Precyzyjna i bardzo cienka pęseta</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>78310-0</td><td></td></tr><tr><td>Osłona twarzy z poliwęglanu</td><td>Fisher ScientificInc.</td><td>18-999-4542</td><td></td></tr><tr><td>Fartuch neoprenowy</td><td>Fisher Scientific, Inc.</td><td>19-810-609</td><td></td></tr><tr><td>Glukonian wapnia, Calgonate</td><td>WW Grainger, Inc.</td><td>13W861</td><td>Probówka, 25 g</td></tr><tr><td>Nadtlenek wodoru 30% CR ACS 500 ml</td><td>Fisher Scientific, Inc.</td><td>H325 500</td><td>SZKODLIWY, TOKSYCZNY</td></tr><tr><td>3-aminopropylotrietoksysilan</td><td>Gelest Inc.</td><td>SIA0610.0-25GM</td><td>Przed użyciem ogrzej się do temperatury pokojowej.</td></tr><tr><td>Wodorotlenek amonu, 2,5 l</td><td>Fisher Scientific, Inc.</td><td>A669-212</td><td>SZKODLIWY, TOKSYCZNY</td></tr><tr><td>Kwas solny</td><td>Fisher Scientific, Inc.</td><td>A144-212</td><td>SZKODLIWY, TOKSYCZNY</td></tr><tr><td>Kwas fluorowodorowy</td><td>Fisher Scientific, Inc.</td><td>A147-1LB</td><td>SZKODLIWY, TOKSYCZNY</td></tr><tr><td>MultiMode Nanoscope IIIa</td><td>Veeco Instruments, Inc.</td><td></td><td>Do analizy nadaje się każdy AFM z trybem gwintowania</td></tr><tr><td>Kosz do zanurzania</td><td>Wykonane w laboratorium Wyprodukowano</td><td>w laboratorium</td><td>Kosz do zanurzania został wykonany przy użyciu dna butelki z PTFE z wywierconymi otworami, uchwytem z PTFE i wszystkimi z PTFE.</td></tr></tbody></table>

przygotowanie substratów miki i krzemu do analizy dna origami i eksperymentów

Preparation of Mica and Silicon Substrates for DNA Origami Analysis and Experimentation

Zaprojektowana natura i kontrolowana, jednogarnkowa synteza origami DNA dostarcza ekscytujących możliwości w wielu dziedzinach, szczególnie w nanoelektronice. Wiele z tych zastosowań wymaga interakcji i adhezji nanostruktur DNA do podłoża. Ze względu na swoją atomowo płaską i łatwą do czyszczenia naturę, mika była podłożem z wyboru do eksperymentów origami DNA. Jednak praktyczne zastosowania miki są stosunkowo ograniczone w porównaniu z substratami półprzewodnikowymi. Z tego powodu przedstawiono tutaj prosty, stabilny i powtarzalny proces adhezji DNA origami do derywatyzowanego tlenku krzemu. Aby ułatwić przyleganie nanostruktur DNA do powierzchni tlenku krzemu, samoorganizująca się monowarstwa 3-aminopropylotrietoksysilanu (APTES) jest osadzana z roztworu wodnego, który jest kompatybilny z wieloma fotorezystami. Podłoże musi zostać oczyszczone ze wszystkich zanieczyszczeń organicznych i metalowych za pomocą procesów czyszczenia Radio Corporation of America (RCA), a natywna warstwa tlenku musi zostać wytrawiona, aby zapewnić płaską, funkcjonalną powierzchnię. Pomieszczenia czyste są wyposażone w urządzenia do czyszczenia krzemu, jednak wiele składników i roztworów origami DNA często nie jest w nich dozwolonych ze względu na obawy przed zanieczyszczeniem. Niniejszy manuskrypt opisuje konfigurację i protokół czyszczenia krzemu w laboratorium na małą skalę dla badaczy, którzy nie mają dostępu do pomieszczenia czystego lub chcieliby włączyć procesy, które mogłyby spowodować zanieczyszczenie czystego stanowiska CMOS w pomieszczeniu czystym. Dodatkowo omówiono zmienne regulujące pokrycie oraz opisano sposoby rozpoznawania i unikania typowych problemów z przygotowaniem próbek.

Stopień pokrycia podłoża przez origami DNA zależy od dwóch zmiennych: stężenia roztworu oraz czasu ekspozycji. Charakterystyka adsorpcji origami DNA na miki oraz tlenku krzemu funkcjonalizowanym APTES została opisana we wcześniejszych publikacjach.13 Zależność między stężeniem origami DNA w roztworze do osadzania a końcowym stopniem pokrycia miki podsumowano w Tabeli 1 oraz na Rysunku 2, co wskazuje, że wzrost stężenia prowadzi do zwiększenia pokrycia powierzchni. Zależność wi...

Opisano powtarzalne procesy czyszczenia substratów używanych w badaniach origami DNA, w tym czyszczenie RCA na stole i derywatyzację tlenku krzemu. Zilustrowano protokoły przygotowania powierzchni, osadzania origami DNA, parametrów suszenia i prostych konfiguracji eksperymentalnych.

Przygotowanie substratów miki i krzemu do analizy DNA origami i eksperymentów

The designed nature and controlled, one-pot synthesis of DNA origami provides exciting opportunities in many fields, particularly nanoelectronics. Many of ...

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest przygotowanie dwóch rodzajów podłoży do eksperymentów z NANOSTRUKTURAMI DNA: miki oraz funkcjonalizowanego tlenku krzemu. W przypadku obu podłoży cel ten osiąga się na dwa różne sposoby. Wierzchnią warstwę miki usuwa się za pomocą taśmy dwustronnej w szybkim i łatwym procesie.Z kolei podłoża krzemowe muszą zostać oczyszczone za pomocą metody RCA, która obejmuje trawienie warstwy tlenków oraz usuwanie zanieczyszczeń metalicznych i organicznych. Pozwala to na uzyskanie czystej, gładkiej warstwy tlenku krzemu, która może zostać poddana dalszej funkcjonalizacji. Następnie powierzchnię MICA nasyca się jonami magnezu w celu wytworzenia powierzchni o ładunku dodatnim.Analogiczną powierzchnię tworzy się na podłożu z tlenku krzemu poprzez formowanie dodatnio naładowanej samoporządkującej się monowarstwy, takiej jak aminopropylotrietoksysilan. Następnie podłoże poddaje się działaniu roztworu origami DNA, aby wspomóc adhezję ujemnie naładowanego DNA do dodatnio naładowanych podłoży. Stopień pokrycia zależy od rodzaju podłoża, stężenia roztworu oraz czasu osadzania – czynników, które mogą być zmieniane w zależności od przeprowadzanego eksperymentu.Główną zaletą tej techniki jest to, że APT tworzy monowarstwę kowalencyjnie przyłączoną do powierzchni krzemu. Można go nanosić w określonym wzorze za pomocą litografii wiązką elektronów oraz techniki zwanej molekularnym liftoffem. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą mają trudności z opanowaniem specyficznych technik manipulacji niezbędnych przy małych podłożach, a także z dopracowaniem odpowiedniego protokołu nanoszenia i rysowania.Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa, ponieważ etapy manipulacji podłożem, czyszczenia RCA oraz protokoły bezpieczeństwa są trudne do opisania w formie tekstowej. Wizualne przedstawienie tych niezbędnych kroków bezpieczeństwa jest istotne dla promowania bezpiecznych praktyk laboratoryjnych. W pierwszej kolejności należy przygotować podłoże, wycinając nożyczkami kwadraty o wymiarach 1 cm na 1 cm z podłoża MICA.Odetnij kawałek miki, używając taśmy dwustronnej. Umieść prostokąt z miki na taśmie dwustronnej, która wciąż znajduje się w dyspenserze. Ostrożnie wsuń pęsetę między mikę a taśmę i zdejmij mikę.Najwyższa warstwa zostanie usunięta i pozostanie na taśmie. Następnie nanieś pipetą 4 µL odpowiednio wymieszanego w vortexie roztworu DNA origami na mikę, dbając o to, aby końcówka pipety nie dotknęła podłoża. Pozostaw DNA origami na mice na około 10 minut.Aby zapewnić odpowiednie pokrycie, spłucz roztwór origami DNA z podłoża MICA, używając 100 µl sterylnej wody nad zlewem lub innym naczyniem na ciecze. W tym celu chwyć podłoże MICA pęsetą. Naniesie pipetą wodę na podłoże tak, aby kropla spływała w stronę końcówki pęsety.Osusz podłoże stałym strumieniem azotu przez jedną minutę. Powtórz płukanie (RIN) dodatkowymi 100 µL sterylnej wody przed ponownym osuszeniem podłoża azotem przez kolejne trzy minuty. W celu przygotowania roztworu RCA 1 (Radio Corporation of America), odmierz za pomocą zlewki 50 mL wody o oporności 18 MΩ·cm i wlej ją do wyznaczonego zlewki na roztwór RCA 1, a następnie dodaj do zlewki 15 mL stężonego wodorotlenku indu.Wypłucz zlewkę pomiarową 25 mililitrami wody i przelej wodę z płukania do zlewki z roztworem RCA 1. Włącz grzanie i mieszanie na płycie grzejnej, a następnie doprowadź kąpiel RCA 1 do temperatury 70 stopni Celsjusza. Następnie dodaj do zlewki z roztworem RCA 1 15 mililitrów 30% nadtlenku wodoru.Należy zużyć roztwór RCA 1 w ciągu jednej godziny od dodania nadtlenku wodoru. Zlewkę pomiarową należy dokładnie wypłukać wodą, a popłuczyny wylać do odpowiedniej butelki na odpady RCA 1 firmy Radio Corporation of America. Przygotowanie roztworu RCA 2.Do wyznaczonego zlewki RCA 2 należy wlać 70 ml wody o rezystywności 18 MΩ·cm, korzystając z dokładnie odmierzonego zlewki miernej. Następnie dodaje się 15 ml stężonego kwasu solnego. Zlewkę mierną płucze się 20 ml wody i przelewa ją do zlewki RCA 2.Zwiększ temperaturę i prędkość mieszania na płycie grzejnej, aż roztwór osiągnie 70 °C. Następnie dodaj 15 ml 30% nadtlenku wodoru. Podobnie jak w kąpieli RCA 1.Roztworu należy użyć w ciągu jednej godziny od dodania nadtlenku wodoru. Aby przygotować roztwór fluorowodoru, należy wlać 50 mililitrów wody do zlewki z obojętnego polimeru fluorowanego. Odmierzyć cztery mililitry stężonego kwasu fluorowodorowego w plastikowym zlewce miarowej i dodać go do zlewki z obojętnego polimeru fluorowanego.Wypłucz plastikowy zlewkę mierniczą łącznie 50 mililitrami wody, dodając wodę z płukania do zlewki z fluorowodorem. Na koniec dokładnie umyj zlewkę mierniczą wodą, a powstałe popłuczyny wlej do wyznaczonego pojemnika na odpady z fluorowodorem. Podziel wafelek krzemowy na mniejsze fragmenty, kładąc go stroną polerowaną do góry na miękkiej powierzchni, np. na serwetce.Używając rysika z diamentową końcówką, delikatnie nacinamy spód wafla wzdłuż głównej krawędzi płaskiej. Pod nacięciem umieszczamy mały drut, na przykład spinacz do papieru, a następnie delikatnie wywieramy nacisk na wafla, kładąc palce lub pęsetę po obu stronach nacięcia i dociskając go do drugiej serwetki za pomocą ołówka i linijki. Odmierzamy pożądaną szerokość kwadratów, zaznaczając kropki zarówno na górnej, jak i dolnej części serwetki.Umieść jedną z połówek wafla krawędzią pierwszą pomiędzy liniami pomiarowymi na serwetce, przylegając do linii, a następnie powtórz procedurę cięcia. Świeżo przełamane prostopadłe fragmenty powinny mieć teraz szerokość kwadratów klocków. Obróć wafel poziomo na serwetce i umieść go pomiędzy liniami prostopadłymi przed ponownym powtórzeniem procedury cięcia.Gdy roztwór RCA osiągnie odpowiednią temperaturę, zanurz od ośmiu do 10 krzemowych chipów o wymiarach 1 cm na 1 cm w roztworze na 10 do 20 minut. Używając odwróconego koszyka z polimeru fluorowanego o średnicy dwóch cali, podnieś koszyk z chipami krzemowymi i odcedź roztwór. Następnie przenieś koszyk nad zlew z odpadami i dokładnie wypłucz wodą o oporności 18 MΩ·cm. Zanurz koszyk w naczyniu z wodą do płukania i poruszaj nim góra-dół przez 20 sekund.Opróżnij koszyk i dokładnie wypłucz go wodą nad zlewkiem z odpadami. Po zakończeniu jednego cyklu czyszczenia RCA, umieść koszyk w zlewce zawierającej roztwór fluorowodoru na 10 do 20 sekund. Wykonuj delikatne ruchy góra-dół, aby wymieszać płytki z fluorowodorem.Następnie podnieś koszyk zanurzeniowy, aby pozwolić na całkowite spłynięcie fluorowodoru. Umieść zlewki do przemywania i zlewki do płukania w plastikowej kuwecie. Przesuń koszyk nad zlewkę do płukania i wypłucz go wodą o oporności 18 mega ohm centymetr.Zanurz koszyk w zlewce z wodą do płukania i mieszaj przez 20 sekund. Następnie przeprowadź drugi cykl odlewania i płukania wodą o oporności 18 mega ohm centymetr. Wylej wodę do płukania do zlewki na odpady i ponownie napełnij zlewkę do płukania wodą.Po osiągnięciu przez roztwór RCA 2 odpowiedniej temperatury, zanurz płytki krzemowe w roztworach za pomocą koszyka. Pozostaw płytki w roztworze na 10 do 20 minut. Wyjmij płytki po upływie odpowiedniego czasu i zastosuj te same procedury płukania.W przypadku czyszczenia RCA 1, czyste płytki przechowuj w wodzie o wysokiej czystości w czystej fiolce przez maksymalnie trzy dni w celu formowania monowarstwy samoorganizującej się na krzemie; dodaj 1 980 µL wody o rezystywności 18 MΩ·cm oraz 20 µL APTE do czystej fiolki do scyntylacji i zamieszaj ruchem wirowym. Po wymieszaniu roztwór należy wykorzystać niezwłocznie. Umieść czystą płytkę krzemową stroną refleksyjną do góry w fiolce do scyntylacji, zakręć ją i pozostaw na 20 minut.Wyjmij chip za pomocą pęsety i opłucz go 200 µL wody, a następnie osusz przez jedną minutę strumieniem gazu azotowego. Aby osadzić origami DNA na funkcjonalizowanym krzemie APT, krótko wymieszaj fiolkę z origami DNA i nanieś pipetą 4 µL roztworu na podłoże krzemowe. Pozostaw roztwór na czas niezbędny dla zastosowanego stężenia i pożądanego stopnia pokrycia.Następnie należy opłukać podłoże 100 µL sterylnej wody o oporności 18 MΩ·cm i osuszyć strumieniem azotu. Przez jedną minutę należy powtórzyć płukanie kolejnymi 100 µL sterylnej wody, a następnie suszyć podłoże azotem przez trzy minuty. Przedstawiono tutaj reprezentatywne wyniki wpływu zmiany stężenia origami DNA na stopień pokrycia podłoża.Zwiększenie stężenia prowadzi do zwiększenia stopnia pokrycia podłoży z MICA; pokrycie DNA origami na MICA i krzemie wykazuje wysoką początkową absorpcję, a nasycenie następuje po około jednej godzinie. Procent pokrycia na MICA jest również konsekwentnie wyższy niż w przypadku tego samego stężenia i czasu na funkcjonalizowanym krzemie w całej próbce. Protokół płukania i suszenia jest niezbędny do prawidłowego przygotowania próbek DNA origami.Nieskuteczne płukanie i suszenie mogą prowadzić do powstawania wysp agregacji rozpuszczalnika origami DNA lub mostkowania nanostruktur w próbkach o wysokim stopniu pokrycia. Po opanowaniu techniki przygotowania podłoża Micah można przeprowadzić w 20 minut lub krócej. Próbki krzemowe można przygotować w mniej niż dwie godziny, jeśli proces zostanie wykonany prawidłowo.Litografia wiązką elektronów oraz molekularny liftoff mogą zostać zintegrowane z tym procesem w celu stworzenia nowych wzorów i urządzeń do dalszych eksperymentów. Należy pamiętać, że praca z kwasem fluorowodorowym może być niezwykle niebezpieczna; należy zachować odpowiednie środki ostrożności, takie jak noszenie osobistego sprzętu ochronnego oraz zapewnienie zapasów glukonianu wapnia na wypadek sytuacji awaryjnej podczas wykonywania tej procedury.

preparation-mica-silicon-substrates-for-dna-origami-analysis

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

Niniejszy protokół demonstruje prostą technikę mikroskopii fluorescencyjnej pojedynczych cząsteczek służącą do wizualizacji replikacji DNA przez poszczególne replisomy w czasie rzeczywistym.

Wizualizacja replikacji pojedynczych cząsteczek DNA za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Celem tych badań było stworzenie syntetycznej tkanki ściany komórkowej roślinnej przy użyciu warstwa po warstwie składania włókienek nanocelulozowych i izolowanej ligniny złożonej z rozcieńczonych zawiesin wodnych. Techniki pomiaru powierzchni mikrowagi kryształów kwarcu i mikroskopii sił atomowych zostały wykorzystane do monitorowania tworzenia polimerowo-polimerowego materiału nanokompozytowego.

W kierunku biomimiki drewna: wytwarzane wolnostojące folie z nanocelulozy, ligniny i syntetycznej polikacji

Prezentujemy metodę przygotowania dwuwarstwowych lipidów na podłożu miki do mikroskopii o wysokiej rozdzielczości. Mika jest przezroczysta i płaska w skali atomowej, ale rzadko stosowana w obrazowaniu ze względu na trudności w obsłudze; Nasze przygotowanie skutkuje równomiernym osadzaniem się arkusza miki i zmniejsza ilość materiału używanego do przygotowania dwuwarstwowego.

Przygotowanie dwuwarstw lipidowych na podłożu miki do obrazowania mikroskopii optycznej o wysokiej rozdzielczości

Kafelkowanie DNA jest skutecznym podejściem do tworzenia programowalnych nanostruktur. Opisujemy protokoły konstruowania złożonych dwuwymiarowych kształtów poprzez samoorganizację jednoniciowych płytek DNA.

Samoorganizacja złożonych dwuwymiarowych kształtów z jednoniciowych płytek DNA

W tym artykule opisujemy międzyfazową syntezę sprzężonych mikroporowatych polimerów (CMP) na podłożach protektorowych oraz rozpuszczanie substratu do przygotowania wolnostojących nanomembran CMP. Ponadto opiszemy, w jaki sposób kruche nanomembrany mogą być przenoszone na inne podłoża.

Synteza i transfer warstwa po warstwie wolnostojących mikroporowatych nanomembran polimerowych

Artykuł ma na celu wprowadzenie standardowej i niezawodnej procedury produkcji dla rozwoju przyszłej niskowymiarowej nanoelektroniki.

Standardowa i niezawodna metoda wytwarzania dwuwymiarowej nanoelektroniki

Opisujemy prostą procedurę litograficzną do unieruchamiania cząsteczek DNA o długości genu na powierzchni, która może być użyta do przeprowadzenia eksperymentów z ekspresją genów na biochipach bez komórek.

Funkcjonalne powierzchniowe unieruchomienie genów za pomocą wieloetapowej litografii przemieszczenia nici

Tutaj prezentujemy protokół charakteryzujący cząstki nukleosomów na poziomie pojedynczej cząsteczki za pomocą technik obrazowania statycznej i poklatkowej mikroskopii sił atomowych (AFM). Opisana metoda funkcjonalizacji powierzchni pozwala na uchwycenie struktury i dynamiki nukleosomów w wysokiej rozdzielczości w nanoskali.

Badanie struktury i dynamiki nukleosomów za pomocą obrazowania mikroskopowego sił atomowych

Tutaj opisujemy protokół tworzenia dyskretnych i dokładnych nieorganicznych nanostruktur na podłożach, używając kształtów origami DNA jako szablonów prowadzących. Metoda jest demonstrowana poprzez tworzenie plazmonicznych złotych anten w kształcie muszki na przezroczystym podłożu (szafirze).

Nanowzorce substratów DNA origami struktur nieorganicznych do zastosowań detekcyjnych

Ten protokół demonstruje pomiary jednocząsteczkowego wzmocnionego powierzchniowo rozpraszania Ramana (SERS) za pomocą nanoanteny DNA origami (DONA) w połączeniu z kolokalizowaną mikroskopią sił atomowych (AFM) i pomiarami Ramana.

Pomiary rozpraszania Ramana wzmocnionego powierzchniowo pojedynczej cząsteczki możliwe dzięki nanoantenom origami plazmonicznego DNA

Naucz się przygotowywać substraty miki i krzemu do badań DNA origami. Poznaj metody czyszczenia RCA, funkcjonalizacji powierzchni i nanoszenia nanostruktur DNA.

Przygotowanie substratów miki i krzemu do analizy DNA origami i eksperymentów

Przeglądaj więcej filmów