Wykonany na zamówienie projekt sondy do mikrodializy
21 lipca 2015
Mikrodializa jest powszechnie stosowaną techniką w badaniach neurobiologicznych. Dlatego sondy komercyjne są bardzo poszukiwane. W tej pracy szczegółowo wyjaśniono montaż sondy, aby zbudować niezawodną, koncentryczną, wykonaną na zamówienie sondę do mikrodializy za mniej niż 10 USD.
Ogólnym celem tej procedury jest opisanie procesu wykonania sondy do mikrodializy na zamówienie. Jest to realizowane poprzez przycięcie rurek z politetrafluoroetylenu oraz krzemionki topionej do odpowiednich wymiarów. Drugim krokiem jest wprowadzenie krzemionki topionej do rurki przy użyciu kaniuli jako prowadnicy.
Następnie na stopionej krzemionce umieszcza się membranę dializacyjną. Ostatnim krokiem jest nasunięcie metalowej tulejki na pozostałą część stopionej krzemionki oraz zastosowanie żywicy epoksydowej do uszczelnienia połączeń i zapewnienia długości wymiany wynoszącej dwa milimetry. W rezultacie instrukcje w tym filmie pokażą, jak zbudować wytrwałą i niezawodną, wykonaną na zamówienie sondę do mikrodializy jako alternatywę dla sondy komercyjnej, która może precyzyjnie mierzyć in vitro odzysk neuropeptydów i małych cząsteczek.
Główną zaletą tej techniki jest to, że szczegółowo opisany zespół sondy do mikrodializy może zostać dostosowany do dowolnej aplikacji i może zostać wykonany kosztem mniejszym niż 10. Na początek należy odciąć kawałek rurki z politetrafluoroetylenu o grubości ścianek 1,6 millimeter i średnicy wewnętrznej 350 micron na odcinki o długości 2,5 centimeter. Jeden koniec odcinka należy uciąć pod kątem 45 degree, aby ułatwić podłączenie rurki odpływowej.
Następnie należy użyć papieru ściernego, aby zmatowić powierzchnię zewnętrzną rurki z PTFE w celu zwiększenia przyczepności kleju epoksydowego. Odciąć fragment topolonej krzemionki o długości 2,25 centymetra. Wprowadzić igłę o rozmiarze 30 G do pustej w środku rurki z PTFE w odległości jednego centymetra od płaskiego końca.
Zgiąć PTFE i przebić osłonkę w miejscu zgięcia. Wprowadzić topioną krzemionkę do rurki PTFE, używając kaniuli igłowej jako prowadnicy. Następnie ostrożnie usunąć kaniulę igłową i ustawić topioną krzemionkę tak, aby 5 mm wystawało poza płaski koniec rurki PTFE.
Użyj kropli kleju cyjanoakrylowego, aby zabezpieczyć stopiony krzemionkowy włóknem w miejscu nakłucia i pozostaw do utwardzenia na noc. Przygotuj klej epoksydowy, dodając 30 części żółtego utwardzacza do 70 części czarnego kleju epoksydowego i delikatnie mieszając. Następnie naciągnij polisulfonową membranę dializacyjną o progu odcięcia 30 kilodalton, średnicy wewnętrznej 210 mikronów i średnicy zewnętrznej 245 mikronów.
Ostrożnie nad topioną krzemionką. Wsuń membranę do rurki z PTFE i przytnij membranę do długości 5,5 milimetra za pomocą ostrego skalpela. Zaznacz punkt na membranie cienkim pisakiem, aby określić długość wymiany wynoszącą dwa milimetry od końca membrany.
Następnie za pomocą cienkiej igły nanieś niewielką ilość kleju epoksydowego, aby pokryć koniec membrany. W kolejnym kroku użyj kleju epoksydowego, aby uszczelnić połączenie między membraną dializacyjną a włóknem PTFE. Teraz wróć i dodaj odpowiednią ilość kleju epoksydowego na membranę, aż do punktu oznaczenia.
Aby zapewnić długość wymiany dyfuzyjnej wynoszącą zaledwie dwa milimetry, należy pozostawić klej epoksydowy do utwardzenia przez noc. Za pomocą szczypiec należy ostrożnie odłamać centymetrowe kawałki igły o rozmiarze 25 gauge w celu wykonania metalowych tulejek. Następnie należy nasunąć metalową tulejkę na pozostałą część stopionego krzemienia i użyć pozostałego kleju epoksydowego do uszczelnienia połączenia między metalową tulejką a rurką z PTFE.
Metalowa tuleja umożliwia późniejsze połączenie rurki doprowadzającej z sondą do mikrodializy. Na koniec nałożyć klej na gorąco wokół rozgałęzienia sondy w celu dodatkowego zamocowania i stabilizacji urządzenia. Ten schemat przedstawia zbliżenie na wewnętrzne mechanizmy sondy do mikrodializy.
Na końcu sondy odsłonięte są dwa milimetry polisulfonowej membrany dializacyjnej, co umożliwia odzyskiwanie metabolitów o niskiej masie cząsteczkowej, takich jak glukoza, ATP i acetylocholina. Przedstawiono tutaj zdolność sondy do odzyskiwania w warunkach in vitro małych cząsteczek o niskiej masie cząsteczkowej, takich jak glukoza, mleczan, acetylocholina i ATP. Procent odzysku jest znacznie wyższy w przypadku tych cząsteczek, których masa wynosi około 500 Daltonów, niż w przypadku większych cząsteczek, takich jak angiotensyna II, substancja P i somatostatyna, których masa przekracza 1000 Daltonów.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć, jak zbudować wytrzymałe i niezawodne sondy do mikrodializy jako alternatywę dla produktów komercyjnych.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł opisuje proces wytwarzania niestandardowej sondy do mikrodializy, która stanowi kosztowo efektywną alternatywę dla sond komercyjnych. Procedura przedstawia kroki niezbędne do stworzenia niezawodnej sondy zdolnej do pomiaru neuropeptydów i małych cząsteczek in vitro.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Techniki mikrodializy
- Wytwarzanie sond
Wstęp
- Mikrodializa jest szeroko stosowana w badaniach z zakresu neuronauki.
- Istnieje duże zapotrzebowanie na niezawodne sondy do mikrodializy.
- Sondy wykonane na zamówienie mogą być bardziej opłacalne niż opcje komercyjne.
- Zrozumienie konstrukcji tych sond może zwiększyć możliwości badawcze.
Cel badania
- Aby dostarczyć szczegółowych instrukcji budowy niestandardowej sondy do mikrodializy.
- Aby zaoferować przystępną cenowo alternatywę dla sond komercyjnych.
- Aby zapewnić dokładny pomiar neuropeptydów i małych cząsteczek.
Zastosowane metody
- Docinanie rurek z politetrafluoroetylenu oraz krzemionki topionej do określonych wymiarów.
- Wprowadzanie krzemionki topionej do rurki przy użyciu kaniuli jako prowadnicy.
- Umieszczanie membrany dializacyjnej na krzemionce topionej.
- Mocowanie całego układu za pomocą metalowej tulei i żywicy epoksydowej w celu zapewnienia trwałości.
Główne wyniki
- Można skonstruować niezawodną i wytrzymałą, wykonaną na zamówienie sondę do mikrodializy.
- Sonda umożliwia dokładny pomiar odzysku neuropeptydów in vitro.
- Całkowity koszt zestawu sondy wynosi mniej niż $10.
Wnioski
- Własnoręcznie wykonane sondy do mikrodializy stanowią realną alternatywę dla rozwiązań komercyjnych.
- Szczegółowe instrukcje mogą umożliwić badaczom samodzielne wykonanie sond.
- Metoda ta może zwiększyć dostępność technik mikrodializy w badaniach z zakresu neuronauki.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Własnay wyrób sond do mikrodializy stanowi kosztowo efektywne rozwiązanie dla badań w dziedzinie neuronauki, umożliwiając precyzyjne monitorowanie dynamiki neurochemicznej w płynie mózgowo-rdzeniowym. Dzięki obniżeniu kosztów produkcji sond poniżej 10 USD, metoda ta zwiększa dostępność dla instytucji publicznych i wspiera skalowalne wdrożenia w badaniach przedklinicznych. Podejście to ułatwia walidację celów oraz ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez dostarczanie wiarygodnych danych o odzysku małych cząsteczek i neuropeptydów, co pozwala na podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu prac w ramach wczesnych etapów procesów odkrywania leków.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez ilościowe odzyskiwanie glukozy, mleczanu, acetylocholiny, ATP oraz neuropeptydów w zakresie 100-1 600 Da.
- Wartość operacyjna: Wspiera ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez dostarczanie powtarzalnych wskaźników odzysku in vitro (~20% dla małych cząsteczek, 2-6% dla neuropeptydów) w celu wyjaśnienia stopnia zaangażowania celu i modulacji szlaków.
- Wartość prognostyczna: Generuje wnioski mechanistyczne, które usprawniają selekcję portfolio poprzez rozróżnianie efektów działania związków na podstawie masy cząsteczkowej i właściwości fizykochemicznych.
Przesiewy i opracowanie testów
- Wartość naukowa: Przygotowuje zwalidowane systemy biologiczne do dalszych etapów analizy poprzez zastosowanie membrany dializacyjnej o określonym progu odcięcia molekularnego (30 kDa) i długości wymiany (2 mm).
- Wartość operacyjna: Sprzyja standaryzacji i powtarzalności testów dzięki spójnym wymiarom sond oraz stałej wydajności membrany dla różnych klas substancji.
- Skalowalność: Umożliwia ponowne wykorzystanie platformy i adaptację do większych długości wymiany dla zróżnicowanych modeli zwierzęcych, wspierając gotowość do wysokoprzepustowych przesiewów.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Łączy pomiary neurochemiczne z fazy odkrywania z walidacją przedkliniczną poprzez monitorowanie substancji istotnych dla patologii choroby.
- Postęp dostosowany do ryzyka: Wspiera przedkliniczne decyzje typu go/no-go dzięki ilościowym danym o odzysku, które odzwierciedlają przepuszczalność bariery krew-mózg oraz dostępność celu.
- Dopasowanie biomarkerów: Wspiera rozwój biomarkerów translacyjnych, umożliwiając wykrywanie neuropeptydów i metabolitów w płynie pozakomórkowym.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z kontinuum procesu odkrywczego – od testowania hipotez po identyfikację związków wiodących – dostarczając ilościowych odczytów neurochemicznych, które wspierają zrozumienie mechanizmów i priorytetyzację związków.
- Biologia odkrywcza: Ułatwia testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych poprzez pomiar odzysku endogennych neurotransmiterów i metabolitów in vitro.
- Przesiewy: Dostarcza gotowe do analizy systemy o powtarzalnych wynikach do oceny wpływu związków na przepływ neurochemiczny.
- Analityka: Zapewnia ilościowe pomiary zmiennej zależnej (procenty odzysku), które umożliwiają porównanie między różnymi warunkami oraz analizę zależności struktura-aktywność.
- Badania translacyjne: Łączy fazę odkryć z pracami przedklinicznymi poprzez generowanie danych istotnych dla oddziaływania na cel w systemach odpowiadających jednostkom chorobowym.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Ustanawia możliwość powtarzalnego monitorowania neurochemicznego, którą można dostosować do różnych projektów i systemów modelowych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną w walidacji celu poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej dzięki bezpośredniemu pomiarowi neurochemicznemu.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzację, powtarzalność i skalowalność dzięki niskokosztowemu, konfigurowalnemu montażowi sond.
- Wartość strategiczna: Poprawia decyzje typu go/no-go oraz efektywność kapitałową poprzez umożliwienie wczesnej redukcji ryzyka biologicznego w procesie odkrywania.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko dzięki wiarygodnym danym dotyczącym odzysku, które informują kryteria dalszego rozwoju.
Uwagi dotyczące implementacji
- Wymagana jest wiedza w zakresie zasad mikrodializy, obsługi membran oraz technik wiązania adhezyjnego.
- Niezbędne jest instrumentarium do precyzyjnego cięcia (skalpel, szczypce), przygotowania powierzchni (papier ścierny) oraz utwardzania (epoksyd overnight/klej na gorąco).
- Konieczna jest międzyzespołowa standaryzacja wymiarów sond, długości wymiany oraz przygotowania membran w celu uzyskania powtarzalnych wyników.
- Wymaga uwzględnienia adaptacji do różnych progów odcięcia masy cząsteczkowej, materiałów membran i długości wymiany w różnych systemach modelowych.
- Obejmuje ograniczenia praktyczne, takie jak czas ręcznego montażu, powtarzalność zależna od umiejętności oraz potrzeba walidacji in vitro każdej partii.
