Name: Immunofluorescencja w celu monitorowania wychwytu komórkowego ludzkiej laktoferyny i związanej z nią aktywności przeciwwirusowej przeciwko wirusowi zapalenia wątroby typu C (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-01T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 28 s
Description: Poznaj metodę immunofluorescencji do monitorowania wychwytu ludzkiej laktoferyny w hepatocytach HUH7 i oceny jej aktywności przeciwwirusowej przeciwko HCV. Technika ta pozwala wizualizować mechanizmy działania antywirusowego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca została sfinansowana zarówno przez Kanadyjskie Instytuty Badań nad Zdrowiem i Naukami Przyrodniczymi, jak i Kanadyjską Radę Badań Inżynieryjnych. M. Bisaillon jest Chercheur Boursier Senior z Fonds de Recherche en Santé du Québec, a także członkiem Centre de Recherche Clinique du Centre Hospitalier Universitaire de Sherbrooke. Dziękujemy dr Ralfowi Bartenschlagerowi za hojny dar w postaci systemu replikacji HCV. Dziękujemy również dr Charlesowi Rice'owi i dr Danielowi Lamarre za uprzejme udostępnienie linii komórek wątroby. Chcemy również podziękować Guillaume'owi Tremblayowi za pomoc techniczną.

1. Przygotowanie i leczenie komórek
<ol>
	<li>W 24-dołkowej płytce umieść szklaną pokrywę na dnie studzienek. Umyj każdą studzienkę solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS).</li>
	<li>Nasiona komórek Huh-7 wspierających subgenomową replikę HCV w każdym dołku do gęstości 5 × 104 komórek / studzienkę. Jeśli nie ma do wykonania leczenia, komórki można wysiać w większej gęstości. Pożywką hodowlaną jest zmodyfikowana pożywka Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco uzupełniona 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 2 mM L-glutaminy, 1 mM pirogronianu sodu i 250 mg/ml G-418 (w celu utrzymania replikonu).</li>
	<li>Inkubować w temperaturze 37 °C i 5 % CO2 . Następnego dnia potraktuj komórki 3 μM hLF oczyszczonym z mleka ludzkiego.</li>
</ol>
2. Preparat paraformaldehydu/sacharozy (12% PAF i 12% sacharozy)
<ol>
	<li>Umieścić 500 ml PBS w zlewce i podgrzać w temperaturze od 20 °C do 30 °C. Rozpuścić 60 g sacharozy w PBS. Rozpuścić 60 g paraformaldehydu (PAF) w roztworze PBS/sacharozy. Powoli dodawać NaOH 2N (3 do 7 ml) aż do uzyskania klarownego roztworu.</li>
	<li>Doprowadzić pH do 7,4 za pomocą HCl. Całkowitą objętość do 500 ml za pomocą PBS. Filtruj według grawitacji w filtrze Whatman. Przed użyciem rozcieńczyć roztwór PBS do końcowego stężenia 4% PAF i 4% sacharozy (przechowywanie w temperaturze 4 °C maksymalnie przez 1 tydzień).</li>
</ol>
3. Immunofluorescencja
<ol>
	<li>W żądanym czasie (0 godzin, 2 godziny lub 24 godziny leczenia) przemyj komórki dwukrotnie (1 min) PBS i utrwal PBS / 4% PAF / 4% sacharozy przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Komórki są zwykle zbieżne w 30-40% i używane są komórki 1,5X105.</li>
	<li>Przepuszczalność komórek za pomocą 0,15% trytonu X-100 w PBS przez 5 minut w RT i zablokowanie 10% normalnej surowicy koziej (NGS) w PBS przez 20 minut.</li>
	<li>Rozcieńczyć pierwszorzędowe przeciwciało białka będącego przedmiotem zainteresowania w 10% NGS (przykład: pierwszorzędowe mysie przeciwciało anty-hLF rozcieńczone w stosunku 1:1,000). Nałóż przeciwciało pierwszorzędowe na komórki.</li>
	<li>Po 4 godzinach w temperaturze pokojowej lub O/N w temperaturze 4 °C przemyć komórki trzykrotnie przez 5 minut roztworem 10% NGS. Wybarwić komórki przeciwciałem drugorzędowym znakowanym fluorochromem rozcieńczonym w 10% NGS (przykład: fluorochrom o długości fali wzbudzenia 488 nm połączony z przeciwciałem anty-mysim 1: 1,000) przez 1 godzinę w RT w ciemności.</li>
	<li>Umyj komórki raz przez 5 minut PBS i zabarwić komórki 4',6-diamidino-2-fenyloindolem (DAPI) (1 μg/ml) przez 15 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.</li>
	<li>Umyj komórki dwukrotnie przez 5 minut PBS. Zamontuj okulary nakrywkowe na podłożu montażowym SlowFade przed wizualizacją za pomocą mikroskopii. Komórki są teraz gotowe do analizy za pomocą mikroskopii epifluorescencyjnej lub konfokalnej.</li>
	<li>Użyj różnych kontrolek, aby zapewnić swoistość wykrywania. Na przykład wszystkie przeciwciała można pominąć w celu wykrycia autofluorescencji. Przeciwciało pierwszorzędowe można pominąć w celu określenia nieswoistego barwienia przez przeciwciało drugorzędowe. Wreszcie, jeśli to możliwe, można również użyć komórek kontrolnych lub tkanek, które nie wyrażają interesującej cząsteczki.</li>
	<li>Wizualizację próbek należy wykonać za pomocą odpowiedniego mikroskopu fluorescencyjnego (epifluorescencyjnego lub konfokalnego) oraz zestawów filtrów odpowiednich dla zastosowanej etykiety fluorescencyjnej. Szkiełka można również przechowywać w pudełku na szkiełka w temperaturze < -20 °C do późniejszego zbadania.</li>
</ol>
4. Mikroskopia fluorescencyjna
<ol>
	<li>Próbki należy przechowywać w ciemności, aby zapobiec fotowybielaniu. Włącz źródło światła wybranego mikroskopu (epifluorescencyjne lub konfokalne).</li>
	<li>Włącz mikroskop. Włącz kamerę mikroskopu. Umieść szkiełko na mikroskopie w celu wizualizacji. Dodaj olejek immersyjny na szkiełko, aby zwiększyć aperturę numeryczną soczewki obiektywu.</li>
	<li>Wybierz odpowiednie filtry. Dostosuj ostrość i odpowiedni obiektyw. Wyreguluj migawki, aby wykryć odpowiedni fluorochrom, ale zapobiec fotowybielaniu. Wyłącz górne światła, aby zminimalizować światło tła podczas patrzenia na próbkę.</li>
	<li>Zmień filtry, aby uwidocznić różne fluorochromy (na przykład DAPI i dla długości fali wzbudzenia 488 nm). Rób zdjęcia aparatem.</li>
</ol>

<ol><li>Odell, I. D., Cook, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunofluorescence+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Derm%22%5BJournal%5D)">Immunofluorescence techniques.</a> J Invest Derm. 133 (1), e4(2013).</li>
<li>Portugal, J., Waring, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assignment+of+DNA+binding+sites+for+4%E2%80%99%2C6-diamidine-2-phenylindole+and+bisbenzimide+%28Hoechst+33258%29.+A+comparative+footprinting+study%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Assignment of DNA binding sites for 4’,6-diamidine-2-phenylindole and bisbenzimide (Hoechst 33258). A comparative footprinting study.</a> Biochim Biophys Acta. 949 (2), 158-168 (1988).</li>
<li>Lichtman, J. W., Conchello, J. -A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescence microscopy.</a> Nat Methods. 2 (12), 910-919 (2005).</li>
<li>St Croix, C. M., Shand, S. H., Watkins, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confocal+microscopy%3A+comparisons%2C+applications%2C+and+problems%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Confocal microscopy: comparisons, applications, and problems.</a> BioTechniques. 39, Suppl 6. S2-S5 (2005).</li>
<li>Yi, M., Kaneko, S., Yu, D. Y., Murakami, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatitis+C+virus+envelope+proteins+bind+lactoferrin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+virology%22%5BJournal%5D)">Hepatitis C virus envelope proteins bind lactoferrin.</a> Journal of virology. 71, 5997-6002 (1997).</li>
<li>Wakabayashi, H., Oda, H., Yamauchi, K., Abe, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lactoferrin+for+prevention+of+common+viral+infections%5BTitle%5D)+AND+%22J+Inf+Chem%22%5BJournal%5D)">Lactoferrin for prevention of common viral infections.</a> J Inf Chem. 20 (11), 666-671 (2014).</li>
<li>Picard-Jean, F., Bouchard, S., Larivée, G., Bisaillon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+intracellular+inhibition+of+HCV+replication+represents+a+novel+mechanism+of+action+by+the+innate+immune+Lactoferrin+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+research%22%5BJournal%5D)">The intracellular inhibition of HCV replication represents a novel mechanism of action by the innate immune Lactoferrin protein.</a> Antiviral research. 111, 13-22 (2014).</li>
<li>Johnson, G. D., Davidson, R. S., McNamee, K. C., Russell, G., Goodwin, D., Holborow, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fading+of+immunofluorescence+during+microscopy%3A+a+study+of+the+phenomenon+and+its+remedy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Fading of immunofluorescence during microscopy: a study of the phenomenon and its remedy.</a> J Immunol Methods. 55 (2), 231-242 (1982).</li>
<li>Green Remington, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((fluorescent+protein%3A+a+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">fluorescent protein: a perspective.</a> Protein Sci. 20 (9), 1509-1519 (2011).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Epidemia HCV pozostaje globalnym zagrożeniem, a u 80% nowo zakażonych pacjentów rozwija się przewlekła infekcja, która naraża ich na ryzyko marskości wątroby, niewydolności wątroby lub raka wątrobowokomórkowego. Bezpośrednio działające leki przeciwwirusowe ukierunkowane na replikację i dojrzewanie HCV są głównymi środkami anty-HCV, jak wykazano niedawno w wyniku zatwierdzenia przez organy regulacyjne dwóch inhibitorów proteazy N-końcowej NS3 (Boceprewir i Telaprewir). Obecnie uważa się, że aktywność anty-HCV hLF zachowuj...

Immunofluorescencja to technika, która wykorzystuje mikroskop fluorescencyjny do wizualizacji rozmieszczenia i/lub lokalizacji docelowej cząsteczki w próbce biologicznej. Immunofluorescencja opiera się na swoistości przeciwciał znakowanych fluorescencyjnie przeciwko odpowiadającym im antygenom w komórce1. Jest zwykle stosowany na skrawkach tkanek i hodowanych liniach komórkowych w celu analizy dystrybucji/lokalizacji różnych cząsteczek biologicznych, takich jak białka, kwasy nukleinowe i glikany. Należy zauważyć, że immunofluorescencja jest często stosowana w połączeniu z innymi metodami barwienia fluorescencyjnego nieopartymi na przeciwciałach, takimi jak barwienie 4',6-diamidino-2-fenyloindolem (DAPI), które są zwykle używane do znakowania DNA2. Co więcej, technika ta polega na utrwaleniu komórek, co pozwala na analizę komórek w określonym czasie.
Do analizy próbek immunofluorescencyjnych można używać różnych typów mikroskopów. Najprostszy jest mikroskop epifluorescencyjny (ryc. 1), dla którego wzbudzenie fluorochromu i detekcja fluorescencji odbywa się za pomocą tej samej ścieżki światła3. Ponieważ większość światła wzbudzonego jest przekazywana przez próbkę, tylko odbite światło wzbudzające może dotrzeć do celu wraz z wyemitowanym światłem. Takie podejście niestety prowadzi do częstego wysokiego stosunku sygnału do szumu. W przeciwieństwie do tego, mikroskopia konfokalna (ryc. 2) oferuje wyraźną zaletę w zakresie zwiększania rozdzielczości optycznej i kontrastu poprzez dodanie przestrzennego otworu umieszczonego w płaszczyźnie konfokalnej soczewki w celu wyeliminowania nieostrego światła4. Takie podejście pozwala na rekonstrukcję trójwymiarowych struktur na podstawie uzyskanych obrazów. Ponieważ jednak znaczna część światła z próbki jest blokowana w otworze otworkowym, często wymagane są długie ekspozycje.
Istnieją dwie klasy technik immunofluorescencji, pierwotna (lub bezpośrednia) i wtórna (lub pośrednia). Immunofluorescencja bezpośrednia obejmuje pierwszorzędowe przeciwciało połączone z fluorochromem (ryc. 3). Ta metoda jest rzadziej stosowana, ponieważ zapewnia niższy sygnał, wiąże się z wyższymi kosztami i mniejszą elastycznością1. Co więcej, takie przeciwciała są na ogół trudniejsze do znalezienia na rynku. Z drugiej strony, bezpośrednie przyłączenie fluorochromu do przeciwciała znacznie zmniejsza liczbę etapów procedury, oszczędzając czas i często redukując niespecyficzny sygnał tła. Ogranicza to również możliwość reaktywacji krzyżowej przeciwciał.
Immunofluorescencja pośrednia obejmuje pierwotne nieznakowane przeciwciało, które jest specyficzne dla epitopu będącego przedmiotem zainteresowania1. Przeciwciało drugorzędowe, które przenosi fluorochrom, rozpoznaje następnie przeciwciało pierwszorzędowe i wiąże się z nim (ryc. 3). Chociaż immunofluorescencja pośrednia jest bardziej złożona i czasochłonna niż immunofluorescencja bezpośrednia, jest często stosowana ze względu na wysoką czułość, a także zapewnia wzmocniony sygnał, ponieważ więcej niż jedno przeciwciało drugorzędowe może przyłączać się do każdego przeciwciała pierwszorzędowego. Ponadto dostępna jest szeroka gama komercyjnych przeciwciał drugorzędowych w przystępnych cenach.
Wirus zapalenia wątroby typu C (HCV) jest poważnym problemem zdrowia publicznego, na którym na całym świecie przewlekle zarażonych jest 130-170 milionów osób. Aby powstrzymać epidemię, terapia przeciwko HCV będzie musiała być zarówno skuteczna, jak i powszechnie dostępna. Badania koncentrujące się na bezpiecznym i niedrogim naturalnym produkcie aktywnym przeciwko HCV wykazały aktywność przeciwwirusową ludzkiego białka laktoferyny (hLF), które wiąże i neutralizuje krążący wirion5. W obecnym badaniu badanie aktywności hLF w subgenomowym systemie replikonów HCV, który jest niezależny od wnikania i wydalania wirusa, ujawniło wyraźną aktywność antyreplikacyjną hLF przeciwko HCV. Niniejszy manuskrypt przedstawia badanie, w którym przeprowadzono testy immunofluorescencyjne w celu monitorowania internalizacji hLF, ważnego składnika układu odpornościowego6, do komórek wątroby. Ponadto monitorowaliśmy potencjał hamujący hLF na wewnątrzkomórkową replikację wirusa zapalenia wątroby typu C (HCV).

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Żubr</td><td>319-005-CL</td><td></td></tr><tr><td>PAF</td><td>BioShop</td><td>PAR070.1</td><td>Substancje stałe łatwopalne, działające drażniąco na skórę, płuca i oczy&nbsp;</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Żubr</td><td>311-425-CL</td><td>Bez Ca2+ & Mg2+</td></tr><tr><td>NGS</td><td>Żubel</td><td>053-150</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 488 znakowany anty-mysi</td><td>Invitrogen</td><td>A11017</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 568 znakowany anty-królikiem</td><td>Invitrogeb</td><td>A21069</td><td></td></tr><tr><td>Aglutynina z kiełków pszenicy Alexa Fluor 488 koniugat (WGA)</td><td>Invitrogen</td><td>W11261</td><td>Potencjalnie mutagenny</td></tr><tr><td>anty-NS5A królik</td><td>Abcam</td><td>ab2594</td><td></td></tr><tr><td>Mysz anty-hLF</td><td>Abcam</td><td>ab10110</td><td></td></tr><tr><td>SlowFade</td><td>Invitrogen</td><td>S36937</td><td></td></tr><tr><td>Bejca Hoechst</td><td>Life Techn.</td><td>H1399</td><td>Potencjalnie&nbsp; Mutagenne&nbsp;
i rakotwórczy</td></tr><tr><td>hLF</td><td>Sigma</td><td>L0520</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse mikroskop widzialny/epifluorescencyjny</td><td>Nikon</td><td>TE2000-E</td><td></td></tr> mikroskop <tr><td>epifluorescencyjny/konfokalny</td><td>Olympus</td><td>FV1000</td><td></td></tr></tbody></table>

immunofluorescencja w celu monitorowania wychwytu komórkowego ludzkiej laktoferyny i związanej z nią aktywności przeciwwirusowej przeciwko wirusowi zapalenia wątroby typu c

Immunofluorescence to Monitor the Cellular Uptake of Human Lactoferrin and its Associated Antiviral Activity Against the Hepatitis C Virus

Immunofluorescencja to technika laboratoryjna powszechnie używana do badania wielu aspektów biologii. Jest zwykle używany do wizualizacji rozmieszczenia i/lub lokalizacji cząsteczki docelowej w komórkach i tkankach. Immunofluorescencja opiera się na swoistości przeciwciał znakowanych fluorescencyjnie przeciwko odpowiadającym im antygenom w komórce. Można stosować zarówno metody immunofluorescencji bezpośredniej, jak i pośredniej, które opierają się na użyciu przeciwciał połączonych z fluorochromem. Immunofluorescencja bezpośrednia jest rzadziej stosowana, ponieważ zapewnia niższy sygnał, wiąże się z wyższymi kosztami i mniejszą elastycznością. Natomiast immunofluorescencja pośrednia jest częściej stosowana ze względu na jej wysoką czułość i zapewnia wzmocniony sygnał, ponieważ więcej niż jedno przeciwciało drugorzędowe może przyłączyć się do każdego przeciwciała pierwszorzędowego. W tym manuskrypcie wykorzystano zarówno mikroskopię epifluorescencyjną, jak i mikroskopię konfokalną do monitorowania internalizacji ludzkiej laktoferyny, ważnego składnika układu odpornościowego, do komórek wątroby. Ponadto monitorowaliśmy potencjał hamujący hLF na wewnątrzkomórkową replikację wirusa zapalenia wątroby typu C za pomocą immunofluorescencji. Omówiono zarówno zalety, jak i wady związane z tymi podejściami.

Zdolność linii komórek wątroby Huh-7 do internalizacji egzogennie podanego hLF monitorowano za pomocą immunofluorescencji z wykorzystaniem mikroskopu konfokalnego. hLF dodano do pożywki hodowlanej i pozostawiono na 24 h w celu internalizacji, po czym hLF z przestrzeni pozakomórkowej wypłukano PBS, a pozostały hLF związany z błoną zdegradowano 5-minutową inkubacją z trypsyną (1 ml). Komórki przesiano i pozostawiono na 18 h w celu ponownej adhezji przed barwieniem immunofluorescencyjnym. Aby wyznaczyć granice cytoplazmatyc...

Ludzka laktoferyna (hLF) jest składnikiem układu odpornościowego. W tym badaniu testy immunofluorescencyjne są stosowane w celu wykazania zarówno wychwytu hLF przez komórki wątrobowe, jak i jakościowego zmniejszenia replikacji wirusa zapalenia wątroby typu C po leczeniu hLF.

Immunofluorescencja w celu monitorowania wychwytu komórkowego ludzkiej laktoferyny i związanej z nią aktywności przeciwwirusowej przeciwko wirusowi zapalenia wątroby typu C

Immunofluorescence is a laboratory technique commonly used to study many aspects of biology. It is typically used to visualize the distribution and/or ...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest monitorowanie internalizacji ludzkiej laktoferyny do komórek wątroby przy użyciu mikroskopii epifluorescencyjnej oraz konfokalnej, a także ocena jej potencjału hamującego wewnątrzkomórkową replikację wirusa zapalenia wątroby typu C (HCV). Jest to realizowane poprzez hodowlę komórek HUH7, które wspierają subgenomowy replikon HCV. Następnie do rosnących komórek dodaje się ludzką laktoferynę, co umożliwia wniknięcie białka do wnętrza komórek.Następnie komórki są utrwalane i wizualizowane przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej. Wyniki pokazują, że hepatocyty mają zdolność do pobierania HLF z otoczenia pozakomórkowego, a barwienie subgenomowego replikonu HCV jest zredukowane w komórkach traktowanych HLF w badaniu mikroskopii fluorescencyjnej. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie wirusa HCV, takie jak molekularny mechanizm, poprzez który rine hamuje replikację wirusa.Aby rozpocząć, umieść okrągłe szkiełko nakrywkowe na dnie każdej studni płytki 24-dołkowej i użyj PBS do wypłukania studni, a następnie wysiej komórki HUH7 zawierające replikon HCV w gęstości 5×10⁴ komórek na studnię. W medium DMEM uzupełni

immunofluorescence-to-monitor-cellular-uptake-human-lactoferrin-its

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Opracowano metodę fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) w celu wizualnej detekcji wirusowego RNA genomowego przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej. Przygotowano sondę specyficzną dla wirusowego RNA, która może być następnie identyfikowana za pomocą kombinacji technik hybrydyzacji i immunofluorescencji. Technika ta daje możliwość określenia lokalizacji wirusowego RNA lub DNA w stanie stacjonarnym, dostarczając informacji o kontroli procesów wewnątrzkomórkowego transportu wirusa.

Wykrywanie wirusowego RNA za pomocą hybrydyzacji fluorescencyjnej in situ (FISH)

Opisujemy dwie metody warunkowej komplementacji trans w procesie składania wirusa zapalenia wątroby C (HCV) i dopełnienia pełnego cyklu życiowego wirusa, które opierają się na tworzeniu heterokaryonów. Techniki te są odpowiednie do przesiewania linii komórkowych wykazujących ekspresję dominujących czynników restrykcyjnych, które uniemożliwiają produkcję zakaźnego potomstwa HCV.

Dwie metody tworzenia heterokaryonów w celu wykrycia czynników restrykcyjnych HCV

Source: Allaire, A., et al. Immunofluorescence to Monitor the Cellular Uptake of Human Lactoferrin and its Associated Antiviral Activity Against the Hepatitis C Virus. J. Vis. Exp. (2015).The video demonstrates the procedure for preparing cells to assess the intracellular uptake and activity of an antiviral agent against the hepatitis C virus.

Preparing Cells to Analyze Intracellular Uptake and Activity of an Antiviral Agent

Źródło: Shah, R., et al. Single-Cell Multiplexed Fluorescence Imaging to Visualize Viral Nucleic Acids and Proteins and Monitor HIV, HTLV, HBV, HCV, Zika Virus, and Influenza Infection. J. Vis. Exp. (2020)W niniejszym materiale wideo zaprezentowano jednoczesną wizualizację DNA, RNA oraz białka kapsydu HIV-1 w zakażonych limfocytach ludzkich z wykorzystaniem hybrydyzacji rozgałęzionego DNA (bDNA) oraz immunofluorescencji, co umożliwia szczegółową analizę etapów replikacji wirusa w poszczególnych...

Multipleksowe obrazowanie fluorescencyjne kwasów nukleinowych i białek wirusowych w zakażonych limfocytach ludzkich

Source: Ren, S., et al. A Protocol for Analyzing Hepatitis C Virus Replication. J. Vis. Exp. (2014).This video demonstrates an immunofluorescence-based method to detect Hepatitis C virus replication in infected hepatoma cells. The protocol involves cell fixation, antibody staining for viral protein and double-stranded RNA, and visualization using fluorophore-tagged secondary antibodies. Dual signal detection under a fluorescence microscope confirms active viral replication within the host cells.

Immunofluorescence Assay to Detect Hepatitis C Virus Replication Complexes in Infected Cells

Źródło: Ren, S., et al. A Protocol for Analyzing Hepatitis C Virus Replication. J. Vis. Exp. (2014)Niniejszy film prezentuje test ognisk fluorescencyjnych stosowany do ilościowego oznaczania zakaźnego wirusa zapalenia wątroby typu C w hodowli komórkowej. Przedstawiono w nim seryjne rozcieńczanie supernatantu wirusowego, zakażanie komórek hepatomy oraz detekcję miejsc replikacji wirusa za pomocą fluorescencyjnej mikroskopii z wykorzystaniem przeciwciał.

Ilościowe oznaczenie zakaźnego wirusa zapalenia wątroby C za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Ten film demonstruje test przyczepiania wirusów do badania przesiewowego związków przeciwwirusowych. Wykorzystując genetycznie zmodyfikowany wirus zapalenia wątroby typu C i lucyferazy, ocenia hamujący wpływ na przyłączanie się wirusa, na co wskazuje niższe natężenie światła w studzienkach poddanych działaniu kooperacji w porównaniu ze studzienkami leczonymi samym wirusem.

Test przyłączania wirusa do badań przesiewowych związków przeciwwirusowych

Ten film demonstruje test do oceny środków przeciwwirusowych, które są ukierunkowane na określone etapy wnikania wirusa do komórek gospodarza i fuzji z endosomem. Komórki są inkubowane w niskiej temperaturze, a następnie zakażone HCV. Niska temperatura umożliwia wiązanie wirusa z komórkami gospodarza, ale hamuje internalizację poprzez endocytozę. Dodaje się testowy związek przeciwwirusowy, a komórki inkubuje się w temperaturze fizjologicznej. To przejście do wyższej temperatury ułatwia wnikanie...

Test do oceny wpływu badanych związków na wnikanie wirusa i fuzję w komórkach gospodarza

Ten film demonstruje test immunofluorescencyjny przeznaczony do pomiaru neutralizacji ludzkiego wirusa cytomegalii (HCMV). Przeciwciała specyficzne dla wirusa miesza się z wirusem i inkubuje z ludzkimi komórkami fibroblastów. Przeciwciała neutralizują wirusa, uniemożliwiając mu infekowanie komórek gospodarza, podczas gdy niezneutralizowane wirusy infekują komórki. Po inkubacji stopień neutralizacji określa się poprzez ilościowe oznaczanie komórek zakażonych wirusem za pomocą immunofluorescencji.

Metoda immunofluorescencyjna do pomiaru neutralizacji ludzkiego wirusa cytomegalii

Prezentowany tutaj jest protokół dla metody obrazowania fluorescencyjnego, multiplex immunofluorescencyjna metodawykrywania DNA, RNA i proteiny (MICDDRP), metoda zdolna do jednoczesnej fluorescencyjnej wizualizacji pojedynczych komórek białka wirusowego i kwasów nukleinowych o różnym typie i nici. Takie podejście można zastosować do różnych systemów.

Obrazowanie fluorescencyjne z multipleksem pojedynczych komórek w celu wizualizacji wirusowych kwasów nukleinowych i białek oraz monitorowania zakażeń HIV, HTLV, HBV, HCV, Zika i grypy

Poznaj metodę immunofluorescencji do monitorowania wychwytu ludzkiej laktoferyny w hepatocytach HUH7 i oceny jej aktywności przeciwwirusowej przeciwko HCV. Technika ta pozwala wizualizować mechanizmy działania antywirusowego.

Immunofluorescencja w celu monitorowania wychwytu komórkowego ludzkiej laktoferyny i związanej z nią aktywności przeciwwirusowej przeciwko wirusowi zapalenia wątroby typu C (Wideo) | JoVE Journal

Immunofluorescencja w celu monitorowania wychwytu komórkowego ludzkiej laktoferyny i związanej z nią aktywności przeciwwirusowej przeciwko wirusowi zapalenia wątroby typu C

Przeglądaj więcej filmów