Name: Rozprzestrzenianie się powierzchniowe i barwienie immunologiczne chromosomów drożdży (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 6 s
Description: Poznaj metodę rozprzestrzeniania chromosomów drożdży i ich barwienia immunologicznego. Technika ta umożliwia wizualizację białek związanych z chromosomami za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez grant NIH GM50936 dla DKB.

UWAGA: Niektóre kroki poniższego protokołu wymagają pracy w czystym dygestorium. Ponadto metoda wymaga mikroskopu tetradowego do rozwarstwiania drożdży wyposażonego w 10-krotnie długi obiektyw odległości roboczej do monitorowania sferoplastyki. Mikroskop należy wcześniej ustawić w okapie. Zdejmij ramię mikromanipulatora i uchwyt płytki z lunety i umieść te przedmioty w bezpiecznym miejscu, z dala od obszaru roboczego.
1. Przygotowanie sferoplastów
<ol>
	<li>Uprawiaj drożdże w pożądanych warunkach. Na każdą próbkę należy użyć około 2 x 108 komórek, np. 4 ml kultury o OD600 1,4 = 5 x 107 komórek/ml. Chociaż w niektórych przypadkach preferowane może być natychmiastowe przetwarzanie próbek, w większości zastosowań podwielokrotności komórek mogą być przechowywane na lodzie do 8 godzin przed przetworzeniem.</li>
	<li>Przenieść zawiesinę komórek do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i wirować w wirówce klinicznej przy ustawieniu 5 (2345 obr./min/857,5 x g) przez 3 minuty w celu osadzenia komórek.</li>
	<li>Zdekantować pożywkę, uważając, aby nie stracić komórek z osadu. Delikatnie zawiesić komórki w 1 ml buforze ZK, a następnie dodać 40 μl 1 M ditiotreitolu (DTT). Inkubować 2 minuty z delikatnym mieszaniem. Ogniwa osadkowe jak poprzednio (patrz krok 1.2).</li>
	<li>Zawiesić granulki w 1 ml buforze ZK. Dodać 5 μl świeżo przygotowanego roztworu zymoliazy 100T, który został dokładnie wymieszany. Inkubować przez 20-30 minut w temperaturze 30 °C w celu usunięcia ściany komórkowej i wytworzenia sferoplastów.</li>
	<li>Oznaczyć 10 μl kropli zawiesiny komórek na szkiełku mikroskopowym, aby określić, czy sferoplastyzacja jest kompletna. Komórki oglądane pod mikroskopem preparacyjnym bez szkiełka nakrywkowego. Komórki powinny wydawać się wzdęte i okrągłe, a nie lekko podłużne i powinny ulec lizie po dodaniu 20 μl wody. Jeśli komórki nie ulegną lizie, należy przywrócić próbkę do temperatury 30 °C i ponownie oznaczać co 10 minut, aż do momentu, gdy będzie można łatwo zaobserwować lizę wywołaną wodą. Ogniwa osadkowe jak poprzednio (patrz krok 1.2).</li>
	<li>Delikatnie zawiesić i przepłukać osad komórkowy w 2,5 ml zimnego buforu MES/sorbitol. Ogniwa osadkowe jak poprzednio (patrz krok 1.2). Delikatnie zawiesić osad komórkowy w 300-400 μl zimnego buforu MES/sorbitolu. Na tym etapie komórki można przechowywać na lodzie przez kilka godzin.</li>
</ol>
2. Rozprzestrzenianie się chromosomów 
UWAGA: Szklane powierzchnie, na których będą rozkładane chromosomy - czy to szkiełka, czy szkiełka nakrywkowe - powinny być przygotowane z wyprzedzeniem. Każde szkiełko lub szkiełko nakrywkowe należy zanurzyć w wodzie, następnie EtOH, następnie pozostawić do wyschnięcia i wypolerować papierem do soczewek. Jeśli chromosomy będą rozsiewane na szkiełkach nakrywkowych, szkiełko nakrywkowe powinno być przymocowane do szkiełka za pomocą taśmy klejącej lub cementu kauczukowego. O ile nie zaznaczono inaczej, pozostała część protokołu będzie opisywać rozprzestrzenianie się na szkiełku podstawowym lub nakrywkowym
<ol>
	<li>Za pomocą pipetora P20 odpipetować 20 μl zawiesiny komórek na powierzchnię czystego szkiełka.</li>
	<li>Za pomocą pipetora P200 dodaj 40 μl 3% roztworu PFA/sacharozy i delikatnie wymieszaj roztwór, "obracając" szkiełko ręką, aż znikną linie Schlièrena. Umieść szkiełko pod mikroskopem i upewnij się, że komórki są ostre. Roztwór PFA powinien być świeżo przygotowany w dygestoriach w dniu użycia. 
	UWAGA: Jeśli białko będące przedmiotem zainteresowania nie było wcześniej badane tą metodą, zaleca się przygotowanie dodatkowych szkiełek przy użyciu roztworów zawierających 2 i 4% PFA w celu określenia, czy retencja białka jest wrażliwa na warunki wiązania. 4% roztwór PFA/sacharozy stosuje się w przypadkach, gdy pożądane jest uwidocznienie powiązanych mikrotubul tubuliny. Wadą wyższego stężenia utrwalającego jest to, że chromosomy będą "niedostatecznie rozpowszechnione", 2% PFA ma również tendencję do tworzenia chromosomów "niedostatecznie rozpowszechnionych".</li>
	<li>Za pomocą pipetora P200 dodać 80 μl 1% Lipsolu, zamieszać jak poprzednio, aby jak najpełniej wymieszać roztwory, uruchomić timer. Jeśli produkt Lipsol nie jest dostępny, można zastąpić go 80 μl 1% NP40 lub 80 μl dH2O (patrz wyniki reprezentatywne, rysunek 2).</li>
	<li>Uważnie obserwuj komórki i delikatnie obracaj szkiełko co 15 sekund. Gdy około 80% komórek ulegnie lizie (zniknie), zatrzymaj timer, natychmiast wyjmij szkiełko z mikroskopu, dodaj 80 μl roztworu PFA/sacharozy i zamieszaj do wymieszania. Liza powinna nastąpić od 30 do 90 sekund po uruchomieniu timera. 
	UWAGA: Jeśli kilka szkiełek wykazuje lizę mniej więcej w tym samym czasie, można ostatecznie pominąć monitorowanie mikroskopowe dla pozostałej części szkiełek i po prostu dokładnie określić czas między dodaniem lipsolu a dodaniem ostatniej porcji utrwalacza. Jednak ten skrót jest niezawodny tylko w przypadku przygotowywania wielu preparatów z tej samej próbki. Najlepiej jest monitorować lizę każdej próbki pod mikroskopem, gdy z próbek pobranych w różnym czasie lub z różnych kultur przygotowywane są różne preparaty.</li>
	<li>Umieść szkiełko na czystej, płaskiej powierzchni i rozprowadź płyn na całej nieoszronionej powierzchni szkiełka za pomocą boku czystej, jednorazowej pipety pastwiskowej trzymanej poniżej menisku "kałuży", ale powyżej powierzchni samego szkiełka, tj. nie "grabić" powierzchni szkiełka pipetą. Nie należy ponownie używać pipet na różnych szkiełkach, aby uniknąć zanieczyszczenia próbek.</li>
	<li>Pozostaw szkiełka do wyschnięcia na noc w dygestorium. Nierozpuszczalne składniki jądrowe osiądą na powierzchni szkiełka i zwiążą się z nią. W przypadku dużych eksperymentów ważne jest zaplanowanie wykorzystania przestrzeni na etapie suszenia.</li>
	<li>Po wysuszeniu optymalne wyniki uzyskuje się poprzez przejście do etapu barwienia immunologicznego tego samego dnia. Jednak wysuszony roztwór sacharozy osadza rozproszone chromosomy w "miodzie", który umożliwia zamrażanie próbek: szkiełka można przenieść do plastikowego pudełka na szkiełka i przechowywać w temperaturze -20 °C przez lata.</li>
</ol>
3. Barwienie immunologiczne
<ol>
	<li>Zanurz szkiełka w 0,2% Photo-Flo na 30 sekund, aby usunąć miód. Oprzyj ślizgi na krawędzi, tak aby krawędź spoczywała na ręczniku papierowym, aby usunąć resztki Photo-Flo.</li>
	<li>Zanurz szkiełka w 1x TBS na 5 minut do umycia. Usuń nadmiar płynu, opierając szkiełka o krawędź, ale nie pozwól im wyschnąć.</li>
	<li>Ułóż szkiełka matową stroną do góry, odpipetuj 300 μl TBS/BSA na szkiełko w poprzek nieoszronionej części szkiełka.</li>
	<li>Inkubować w wilgotnej komorze w temperaturze pokojowej przez 15 minut (duży plastikowy pojemnik wyłożony nasączonymi wodą ręcznikami papierowymi pod perforowaną metalową płytką lub plastikowym pudełkom na suwak z nasyconymi ręcznikami papierowymi).</li>
	<li>Opróżnij szkiełka, opierając krótszą krawędź szkiełka na ręczniku papierowym i opierając szkiełko o odpowiednie podparcie (takie jak stojak na probówki). Nie dopuścić do wyschnięcia powierzchni.</li>
	<li>Natychmiast zastosować 80 μl buforu TBS/BSA zawierającego odpowiednie rozcieńczenie przeciwciała pierwszorzędowego. Jeśli przeciwciało jest ograniczone, należy użyć 40 μl i szkiełka nakrywkowego o wymiarach 22 x 22 mm. W przypadku surowej surowicy króliczej jest to zwykle rozcieńczenie od 1/50 do 1/500. 
	UWAGA: Wykonać miareczkowanie dla nowych preparatów przeciwciał. Wybiera się najbardziej rozcieńczony preparat, który daje wysoki sygnał powyżej tła. W celu kontroli poziomu zabarwienia tła, jądra powinny być przygotowane z odpowiedniego zmutowanego szczepu delecji i/lub zduplikowane preparaty powinny być wybarwione surowicą przedimmunologiczną.</li>
	<li>Umieść polerowane szkiełko nakrywkowe o wymiarach 22 x 50 mm na szkiełku, unikając pęcherzyków powietrza. W tym celu należy przytrzymać szkiełko nakrywkowe między kciukiem a palcem wskazującym wzdłuż długiej krawędzi w pobliżu jednej krótkiej krawędzi. Trzymając szkiełko nakrywkowe pod kątem 30° w stosunku do szkiełka, krótsza krawędź znajdująca się najdalej od palców jest opuszczana, aż spocznie na szkiełku tuż wewnątrz krawędzi "kałuży" znajdującej się najbliżej oszronionego obszaru szkiełka. Następnie powoli opuść szkiełko nakrywkowe płynnym ruchem, aż palce trzymające szkiełko dotkną ławki, a następnie zwolnij. Nie próbuj zmieniać położenia szkiełka nakrywkowego po jego wylądowaniu. 
	UWAGA: Jeśli spready chromosomowe zostały przygotowane na przymocowanych szkiełkach nakrywkowych (a nie bezpośrednio na powierzchni szkiełek), to szkiełko nakrywkowe z próbką pozostanie przymocowane do szkiełka przez cały okres barwienia i mycia. Dodatkowe szkiełko nakrywkowe zostanie umieszczone na wierzchu szkiełka nakrywkowego z próbką w celu równomiernego rozprowadzenia roztworu przeciwciała podczas barwienia, a następnie zostanie wyrzucone.</li>
	<li>Umieścić szkiełka w szczelnie zamkniętej komorze wilgotnej i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Trzymając matową krawędź, przenieś szkiełka do szklanego stojaka do barwienia szkiełek i zanurz w słoiku do barwienia zawierającym TBS.</li>
	<li>Delikatnie zanurz szkiełko w górę i w dół, aby zdjąć szkiełko nakrywkowe. Staraj się nie używać do tego zbyt dużej siły. Umyj szkiełka 2x 10 min, zanurzając je w TBS. Wyjmij szkiełka z rusztu i odcedź nadmiar płynu, dotykając krawędzią ręcznika papierowego. Nie dopuścić do wyschnięcia powierzchni.</li>
	<li>Pracując w przytłumionym świetle, natychmiast dodać 80 μl TBS/BSA zawierających 1/1,000 krotne rozcieńczenie drugorzędowego przeciwciała sprzężonego z fluorochromem (lub 40 μl z szkiełkiem nakrywkowym 22 x 22 mm). Dodać szkiełko nakrywkowe jak poprzednio i inkubować w temperaturze 4 °C przez 2 godziny w wilgotnej komorze w ciemności.</li>
	<li>Usuń szkiełka nakrywkowe jak poprzednio, odcedź szkiełka i pozostaw powierzchnię do wyschnięcia na powietrzu przez 1 do 2 godzin w ciemności. Oprzyj ślizgi na ręcznikach papierowych jak poprzednio. 
	UWAGA: Jeśli rozprowadzanie odbywało się na zamontowanym szkiełku nakrywkowym, należy je zdjąć z szkiełka przed wyschnięciem. Szkiełka nakrywkowe są następnie suszone zgodnie z opisem dla szkiełek w poprzednim kroku.</li>
	<li>Pracując przy przytłumionym świetle, dodać około 30 μl podłoża montażowego zawierającego DAPI (trzy krople po 10 μl), a następnie ostrożnie opuścić szkiełko nakrywkowe. Jeśli pasty do smarowania znajdują się na szkiełkach nakrywkowych, umieść kropelki podłoża montażowego na czystym szkiełku podstawowym i opuść szkiełko nakrywkowe, chromosomem do dołu, na szkiełko.</li>
	<li>Nadal przy przytłumionym świetle odczekaj 2 minuty, aż szkiełko nakrywkowe opadnie i uszczelnij krawędzie szkiełka nakrywkowego przezroczystym lakierem do paznokci. Umieść szkiełka w płaskim pudełku na slajdy. 
	UWAGA: W przypadku mikroskopii STED mocuj za pomocą ProLong Gold. Użyj 30 μl ProLong Gold bez DAPI i pozostaw do utwardzenia na noc. Uszczelnianie lakierem do paznokci nie jest konieczne.</li>
	<li>Przeglądaj slajdy za pomocą szerokokątnej mikroskopii epifluorescencyjnej z obiektywem 40 lub 100X przy użyciu zestawu filtrów odpowiedniego dla DAPI do ustawiania ostrości. Opcjonalnie szkiełko można przechowywać w ciemności w temperaturze 4 °C przez kilka tygodni. Nie zamrażać.</li>
</ol>

<ol><li>Loidl, J., Nairz, K., Klein, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meiotic+chromosome+synapsis+in+a+haploid+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">Meiotic chromosome synapsis in a haploid yeast.</a> Chromosoma. 100 (4), 221-228 (1991).</li>
<li>Loidl, J., Klein, F., Engebrecht, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+morphological+approaches+for+the+analysis+of+meiotic+chromosomes+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Genetic and morphological approaches for the analysis of meiotic chromosomes in yeast.</a> Methods in cell biology. 53, 257-285 (1998).</li>
<li>Lydall, D., Nikolsky, Y., Bishop, D. K., Weinert, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+meiotic+recombination+checkpoint+controlled+by+mitotic+checkpoint+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A meiotic recombination checkpoint controlled by mitotic checkpoint genes.</a> Nature. 383 (6603), 840-843 (1996).</li>
<li>Bishop, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RecA+homologs+Dmc1+and+Rad51+interact+to+form+multiple+nuclear+complexes+prior+to+meiotic+chromosome+synapsis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">RecA homologs Dmc1 and Rad51 interact to form multiple nuclear complexes prior to meiotic chromosome synapsis.</a> Cell. 79, 1081-1092 (1994).</li>
<li>Rabitsch, K. P., Galova, M., Schleiffer, A., Buonomo, S. B., Nasmyth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+genomics+identifies+Monopolin%3A+a+kinetochore+protein+required+for+segregation+of+homologs+during+meiosis+I%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Functional genomics identifies Monopolin: a kinetochore protein required for segregation of homologs during meiosis I.</a> Cell. 103 (7), 1155-1168 (2000).</li>
<li>Gasior, S. L., Olivares, H., Ear, U., Hari, D. M., Weichselbaum, R., Bishop, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+RecA-like+recombinases%3A+Distinct+roles+for+mediator+proteins+in+mitosis+and+meiosis%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Assembly of RecA-like recombinases: Distinct roles for mediator proteins in mitosis and meiosis.</a> PNAS. 98 (15), 8411-8418 (2001).</li>
<li>Biggins, S., Murray, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+budding+yeast+protein+kinase+Ipl1%2FAurora+allows+the+absence+of+tension+to+activate+the+spindle+checkpoint%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">The budding yeast protein kinase Ipl1/Aurora allows the absence of tension to activate the spindle checkpoint.</a> Genes & Development. 15 (23), 3118-3129 (2001).</li>
<li>Dresser, M. E., Giroux, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meiotic+chromosome+behavior+in+spread+preparations+of+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Meiotic chromosome behavior in spread preparations of yeast.</a> The Journal of Cell Biology. , (1988).</li>
<li>Lao, J. P., Cloud, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meiotic+crossover+control+by+concerted+action+of+Rad51-Dmc1+in+homolog+template+bias+and+robust+homeostatic+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Meiotic crossover control by concerted action of Rad51-Dmc1 in homolog template bias and robust homeostatic regulation.</a> PLOS Genetics. 9 (12), e1003978-e1003978 (2013).</li>
<li>Vonesch, C., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fast+thresholded+landweber+algorithm+for+wavelet-regularized+multidimensional+deconvolution.+IEEE+transactions+on+image+processing+%3A+a+publication+of+the%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Signal+Processing+Society%22%5BJournal%5D)">A fast thresholded landweber algorithm for wavelet-regularized multidimensional deconvolution. IEEE transactions on image processing : a publication of the.</a> IEEE Signal Processing Society. 17 (4), 539-549 (2008).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Pojawienie się rozsianych jąder zależy w decydującym stopniu od równowagi między utrwalaniem a obróbką lizą/detergentem. Jak wspomniano powyżej, zachowanie różnych struktur komórkowych wymaga stosowania różnych stężeń PFA. Dla większości białek optymalna jest zawartość 3% PFA. Jednak konserwacja wrzecion wymaga użycia 4% PFA. Nawet przy użyciu jednego zestawu odczynników, czas lizy w stosunku do utrwalenia może również wpływać na jakość rozprzestrzeniających się jąder. Aby uzyskać najbardziej spójne wyniki, czas lizy ...

Pączkujące drożdże Saccharomyces cerevisiae oferują wiele korzyści do badań nad molekularnymi mechanizmami procesów biologicznych, w tym do badania białek kontrolujących funkcję chromosomów. Chociaż istnieją dobrze znane zalety pączkujących drożdży w badaniach genetycznych, molekularnych i biochemicznych, badania cytologiczne rozmieszczenia białek w jądrze komórkowym są skomplikowane ze względu na ich niewielkie rozmiary. Typowe jądro drożdży ma średnicę mniejszą niż jeden mikron, czyli tylko około 5 razy większą od granicy rozdzielczości światła widzialnego. W związku z tym ilość informacji na temat rozmieszczenia białek jądrowych, które można uzyskać z konwencjonalnego barwienia immunologicznego lub przy użyciu fluorescencyjnych znaczników białkowych, takich jak białko zielonej fluorescencji (GFP), jest ograniczona. Użytecznym podejściem do scharakteryzowania subjądrowej dystrybucji białek jest rozprzestrzenianie się powierzchni chromosomów. Podejście to polega na usunięciu ściany komórkowej, rozerwaniu błon komórkowych i jądrowych oraz umożliwieniu nierozpuszczalnej zawartości jądra osadzenia się na powierzchni szkiełka mikroskopowego. Te nierozpuszczalne składniki obejmują macierz jądrową i chromosomy. Oprócz umożliwienia usunięcia rozpuszczalnej zawartości jądrowej, co zwiększa zdolność wykrywania białek związanych z chromatyną, metoda rozprzestrzeniania chromosomów powoduje znaczną dekompresję chromosomów, tak że rozproszone jądra mają średnicę około 3 do 5 μm (dla diploidalnych jąder mejotycznych) i od 2 do 3 μm dla diploidalnych jąder mitotycznych. Ta dekompresja pozwala na wykrycie podstruktury jądrowej, która jest stosunkowo trudna lub niemożliwa do rozdzielenia w nienaruszonych jądrach.
Oczywistym mankamentem rozprzestrzeniania chromosomów jest możliwość, że procedura rozprzestrzeniania się może częściowo lub całkowicie zakłócić strukturę zainteresowania. Szczególne zaniepokojenie budzi fakt, że w wyniku procedury rozprzestrzeniania się może dojść do utraty określonego białka związanego z chromosomem. O tej potencjalnej komplikacji należy pamiętać podczas interpretacji danych. Jednym z przykładów białka, które jest wrażliwe na procedurę rozprowadzania, jest beta-tubulina. W pewnych warunkach wrzeciono, które składa się głównie z tubuliny, jest zachowywane podczas rozprowadzania3. Wizualizacja wrzeciona jest często przydatna do etapowania jąder będących przedmiotem zainteresowania. Jednak wizualizacja tubuliny wymaga leczenia utrwalaczem o wysokim stężeniu; Wrzeciona są tracone w standardowych warunkach opisanych poniżej. Przykład ten ilustruje, że podczas analizy rozkładu wcześniej niescharakteryzowanego białka ważne jest, aby zmieniać stężenie utrwalacza, aby określić, jak wrażliwe jest białko na taką zmienność. Pomimo obaw związanych z wpływem warunków rozprzestrzeniania się na strukturę chromosomów, użyteczność i moc metody rozprzestrzeniania się została wykazana w wielu kontekstach i ma szerokie zastosowanie w charakterystyce komórek mitotycznych, a zwłaszcza mejotycznych4-7.
Dwie metody rozprzestrzeniania były szeroko stosowane. Pierwsza z tych metod, opracowana przez Dressera i Giroux8, pozwala uniknąć użycia detergentu i może dać preparaty do rozprzestrzeniania się, które wydają się mieć stosunkowo dobrze zachowaną morfologię chromosomów po wybarwieniu na obecność barwnika specyficznego dla DNA DAPI. Jednak metoda ta jest stosunkowo trudna do udoskonalenia, a jakość rozproszonych jąder różni się dramatycznie, gdy jeden obszar szkiełka jest porównywany z innymi regionami. Problem ten może komplikować podejścia ilościowe, które obejmują obrazowanie wielu niewybranych jąder z jednego szkiełka, aby uniknąć błędu systematycznego w pozyskiwaniu danych. Druga metoda rozprzestrzeniania chromosomów, opracowana przez Loidla iKleina1, polega na równoważeniu utrwalania przez paraformaldehyd z lizą i dekompresją chromatyny wspomaganą przez roztwór detergentu. Prawidłowo wykonana metoda daje bardzo powtarzalne wyniki z mniejszą zmiennością między regionami w porównaniu z metodą Dressera i Giroux. Niniejsza prezentacja skupia się na zmodyfikowanej wersji metody Loidla i Kleina, ze względu na jej niezawodność i prostotę.
Rozprzestrzenianie chromosomów nie jest skomplikowane ani czasochłonne; można przygotować do 100 preparatów do barwienia immunologicznego w ciągu jednego dnia. Co więcej, preparaty do rozprzestrzeniania się mogą być przechowywane w zamrażarce przez wiele lat przed barwieniem immunologicznym, a tym samym laboratoria mogą opracować repozytorium zamrożonych chromosomów, które można wykorzystać, gdy pojawią się nowe pytania biologiczne lub dostępne staną się nowe odczynniki barwiące.
Metoda rozprzestrzeniania chromosomów jest najczęściej stosowana w połączeniu z immunobarwieniem i szerokopolową mikroskopią fluorescencyjną, ale możliwe jest również przygotowanie preparatów do superrozdzielczych metod mikroskopii świetlnej, takich jak mikroskopia STED (Stimulated emission depletion).

<table><tbody><tr><td>Zymoliaza</td><td>USA Biologiczna&nbsp;</td><td>Z1004</td><td>Przygotować roztwór o stężeniu 20 mg/ml w 50 mM Tris pH 7,5 uzupełniony o 2% glukozy. Przygotuj świeży każdy eksperyment i przechowuj w temperaturze 4&deg; C, aż będzie gotowy do użycia.</td></tr><tr><td>Lipsol&nbsp;</td><td>L.I.P. Sp. z o.o.o.&nbsp;</td><td>Produkt nie jest już dostępny w sprzedaży</td><td>Przygotować 1% (v/v) roztwór w wodzie. Przechowywać na lodzie.</td></tr><tr><td>NP-40</td><td>USB</td><td>19628</td><td>Przygotować 1% (v/v) roztwór w wodzie. Przechowywać na lodzie.</td></tr><tr><td>Tleen 20</td><td>Sigma</td><td>P2287</td><td></td></tr><tr><td>Slajdy</td><td>Corning</td><td>2948-75x25</td><td></td></tr><tr><td>Standardowe szkiełko nakrywkowe</td><td>Fisher</td><td>12-544-E lub 12-540-B</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe o wysokiej rozdzielczości</td><td>Fisher</td><td>12-542-B</td><td></td></tr><tr><td>Photo-Flo 200 roztwór</td><td>Kodak</td><td>P-7417</td><td>Przygotuj 0,2% (v/v) roztwór w wodzie.</td></tr><tr><td>TBS</td><td></td><td></td><td>137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 24,7 mM Tris, pH 8</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td>Przygotować 1% (w/v) roztwór w TBS. Przechowywać w 4&deg; C przez okres do miesiąca.</td></tr><tr><td>Przeciwciało</td><td></td><td></td><td></td>pierwotne</tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit</td><td>Invitrogen</td><td>A-21206</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało IgG (H+L)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pożywka montażowa Vectashield z DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold</td><td>Invitrogen</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>Plastikowe pudełko na suwak</td><td>Fisher</td><td>03-448-1</td><td>Szkiełka z suszonymi pastami do smarowania należy przechowywać w szczelinach w temperaturze -20& stopni C. Używaj również jako mokrej komory.</td></tr><tr><td>Pudełko kartonowe na slajdy</td><td>Fisher</td><td>12-587-10</td><td>Służy do wygodnego transportu poplamionych/zapieczętowanych szkiełek lub przechowywania w temperaturze 4&deg;C.</td></tr><tr><td>Słoik Coplin</td><td>Fisher</td><td>08-816</td><td>Służy jako umywalka do zjeżdżalni.&nbsp;</td></tr></tbody></table>

rozprzestrzenianie się powierzchniowe i barwienie immunologiczne chromosomów drożdży

Surface Spreading and Immunostaining of Yeast Chromosomes

Mały rozmiar jąder pączkujących drożdży Saccharomyces cerevisiae ogranicza użyteczność mikroskopii świetlnej do analizy subjądrowej dystrybucji białek związanych z chromatyną. Rozprzestrzenianie się powierzchniowe jąder drożdży powoduje ekspansję chromatyny bez utraty związanych białek. Metoda rozprowadzania powierzchniowego równoważy utrwalanie białek związanych z DNA z obróbką detergentem. Przedstawiona metoda jest nieznacznie zmodyfikowana w stosunku do metody opisanej przez Josefa Loidla i Franza Kleina1,2. Metoda ta została wykorzystana do scharakteryzowania lokalizacji wielu białek związanych z chromatyną na różnych etapach mitotycznego cyklu komórkowego, ale jest szczególnie przydatna do badania mejotycznych struktur chromosomowych, takich jak rekombinsomy mejotyczne i kompleks synaptonemalny. Opisujemy również modyfikację, która nie wymaga użycia Lipsolu, zastrzeżonego detergentu, który był wymagany w pierwotnej procedurze, ale nie jest już dostępny na rynku. Opisano również protokół barwienia immunologicznego, który jest zgodny z metodą rozprzestrzeniania chromosomów.

Wygląd rozprzestrzenionych jąder krytycznie zależy od równowagi między fiksacją chromosomów a ich dekompaktacją. Nawet przy prawidłowo dobranych odczynnikach, w różnych obszarach tego samego preparatu i/lub pomiędzy różnymi preparatami mogą wystąpić różnice w stopniu dekompaktacji chromosomów. W związku z tym, przed interpretacją obrazów należy ocenić jakość rozprzestrzenienia w danym obszarze preparatu.
Efekty „nadmiernego rozciągnięcia” (overspreading) i „niewystarczającego rozciągnięcia” (u...

Przedstawiono metodę rozprzestrzeniania się chromosomów powierzchniowych z pączkujących drożdży. Metoda ta wywodzi się z metody opisanej wcześniej przez Loidla i Kleina. Ponadto demonstrujemy procedurę barwienia immunologicznego chromosomów rozsianych.

Rozprzestrzenianie się powierzchniowe i barwienie immunologiczne chromosomów drożdży

The small size of nuclei of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae limits the utility of light microscopy for analysis of the subnuclear distribution ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wizualizacja białek związanych z chromosomami za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Jest to osiągane poprzez uprzednie usunięcie ściany komórkowej za pomocą obróbki enzymatycznej. Jestem olis.Drugim krokiem jest lizowanie komórek do poziomu błon jądrowych poprzez szok osmotyczny, zazwyczaj przy użyciu detergentu. Proces ten przeprowadzany jest w obecności niskiego stężenia utrwalacza, aby zachować strukturę białek. Po lizie komórek stężenie utrwalacza jest zwiększane w celu dalszej stabilizacji struktur białkowych.Następnie lizowane komórki nanosi się na szkiełko przedmiotowe i pozwala jądrom osiąść na jego powierzchni. Ostatnim etapem jest immunobarwienie próbek. Przedstawiona tutaj metoda pośredniego immunobarwienia wykorzystuje przeciwciało pierwszorzędowe, które wiąże badane białko, oraz przeciwciało wtórne znakowane fluorescencyjnie, które wiąże przeciwciało pierwszorzędowe.Ostatecznie mikroskopia immunofluorescencyjna jest wykorzystywana do badania rozmieszczenia białek związanych z chromosomami. Przedstawione reprezentatywne obrazy ukazują rozprzestrzenione jądro mitotyczne, poddane immunobarwieniu na białka rekombinacyjne DMC1 oraz RAD51. Główną zaletą tej techniki w stosunku do drugiej powszechnie stosowanej metody, wprowadzonej przez Mike'a Dressera i Craiga Deru, jest fakt, że większość powierzchni szkiełka zawiera optymalnie rozprzestrzenione jądra, co ułatwia uzyskanie obrazów dużej liczby rozprzestrzenionych jąder z jednego preparatu.Niniejsza metoda może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w badaniach nad strukturami podjądrowymi, takie jak: czy dwa białka współlokalizują lub czy tworzenie się konkretnej podstruktury jądra zależy od funkcji danego genu zainteresowania? Podkreślamy, że metoda ta została pierwotnie opracowana przez Franza Kleina i Yosefa Lole. Mamy nadzieję, że ten film pomoże innym opanować naszą wersję tej techniki.Plamy (splats) przygotowuje się z komórek drożdży hodowanych w pożądanych warunkach. Dla każdej próbki należy użyć około 2 × 10⁸ komórek. Zawiesinę komórkową przenosi się do probówek do wirowania o pojemności 15 ml.Wirować probówki w wirówce klinicznej przy ustawieniu pięć przez trzy minuty w celu osadzenia komórek. Odlać medium, uważając, aby nie zgubić komórek z osadu. Delikatnie resuspender komórki w 1 mL buforu ZK, a następnie dodać 40 µL 1 M dihi.Inkubuj przez dwie minuty w temperaturze pokojowej przy delikatnym mieszaniu. Wirować w celu osadzenia komórek, jak wcześniej. Resuspenduj każdy osad w jednym mililitrze buforu ZK.Dodaj 5 µL świeżo przygotowanego, dokładnie wymieszanego roztworu zy liase 100 T. Inkubuj w temperaturze 30 °C przez 20 do 30 minut, aby usunąć ścianę komórkową i otrzymać sferoplasty. Przeanalizuj 10 µL zawiesiny komórkowej pod mikroskopem, aby sprawdzić, czy proces sferoplastyzacji został zakończony.Przed usunięciem ściany komórkowej komórki drożdży mają lekko podłużny kształt; komórki sferoplastyczne powinny wydawać się obrzękłe i okrągłe. Po dodaniu wody komórki sferoplastyczne powinny zostać delikatnie resuspendTime i przemyć osad komórkowy w 2,5 milliliters zimnego buforu MES orbital. Po wirowaniu komórki ponownie delikatnie resuspendTime osad komórkowy w 300 do 400 microliters zimnego buforu MES orbital; na tym etapie komórki można przechowywać na lodzie przez kilka godzin.Procedura ta wymaga zastosowania mikroskopu do tetrad drożdży wyposażonego w obiektyw 10x o dużej odległości roboczej, ustawionego w dygestorium; igła do mikrosekcji musi zostać usunięta. Powierzchnię szklaną, na której będą rozkładane chromosomy, należy przygotować z wyprzedzeniem: za pomocą pipety P 20 nanieść 20 µL zawiesiny komórkowej na powierzchnię czystego szkiełka, a następnie za pomocą pipety P 200 dodać 40 µL świeżo przygotowanego roztworu 3% paraformaldehydu i 3,4% sacharozy i delikatnie wymieszać roztwór, obracając szkiełko ręką, aż do zniknięcia linii Schliena. Umieścić szkiełko pod mikroskopem i upewnić się, że komórki znajdują się w ogniskowej.Za pomocą pipety P 200 należy dodać 80 µL 1% Lip Sal, a następnie zamieszać w sposób okrężny, tak jak wcześniej, aby jak najdokładniej zmieszać roztwory i uruchomić stoper. Jeśli Lip Sal jest niedostępny, można użyć takiej samej objętości 1% MP 40 lub wody destylowanej. W tym czasie należy uważnie obserwować komórki i delikatnie mieszać szkiełko w sposób okrężny co 15 sekund.Ten klip wideo przedstawia obraz, jaki powinien być widoczny, gdy ulegnie lizie około 80 do 90% komórek. Należy zatrzymać stoper i natychmiast wyjąć preparat z mikroskopu. Liza powinna nastąpić w czasie od 30 do 90 sekund.Po uruchomieniu stopera należy dodać 80 µL roztworu sacharozy z paraformaldehydem i zamieszać poprzez delikatne okrążanie. Położyć preparat na czystej, płaskiej powierzchni. Używając boku czystej jednorazowej pipety Pasteura trzymanej poniżej menisku kropli, ale powyżej powierzchni samego szkła, rozprowadzić ciecz po całej niezmrożonej powierzchni preparatu.Nie należy drapać powierzchni szkiełka pipetą. Aby uniknąć kontaminacji próbek, do każdego szkiełka należy użyć nowej pipety. Szkiełka należy pozostawić do wyschnięcia na noc w dygestorium; nierozpuszczalne komponenty jądrowe, w tym chromosomy, osiądą na powierzchni szkiełka i zwiążą się z nią po jego wyschnięciu.Optymalne wyniki uzyskuje się, przechodząc do barwienia immunocytochemicznego tego samego dnia. Zanurz preparaty w 0,2% Photo flow na 30 sekund. Aby usunąć wyschnięty roztwór sacharozy, oprzyj preparaty krawędzią o ręcznik papierowy, aby odprowadzić pozostałości Photo flow.Zanurz slajdy w jednym roztworze XTBS na pięć minut w celu przemycia. Usuń nadmiar cieczy, opierając slajdy o krawędź, ale nie dopuść do ich wyschnięcia. Następnie ułóż slajdy matową stroną do góry i nanieś pipetą 300 µl T-B-S-B-S-A na każdy slajd, rozprowadzając ciecz po niezmrożonej części slajdu.Inkubować preparaty w komorze wilgotnościowej w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Po 15 minutach odcedzić preparaty, opierając krótki brzeg każdego szkiełka na ręczniku papierowym i pochylając je o odpowiednie podparcie, np. statyw na probówki. Nie dopuszczać do natychmiastowego wyschnięcia powierzchni.Nanieś 80 µL buforu T-B-S-B-S-A zawierającego odpowiednie rozcieńczenie przeciwciała pierwszorzędowego dla surowicy króliczej. Zazwyczaj jest to rozcieńczenie od 1:50 do 1:500. Umieść wypolerowane szkiełko nakrywkowe o wymiarach 22 x 50 mm na preparasie, unikając powstawania pęcherzyków powietrza.Należy to zrobić, trzymając szkiełko nakrywkowe kciukiem i palcem wskazującym za dłuższą krawędź w pobliżu jednego z krótszych brzegów. Trzymając szkiełko nakrywkowe pod kątem 30 stopni względem szkiełka podstawowego, należy opuścić krótszą krawędź oddaloną od palców, aż spocznie ona na szkiełku podstawowym tuż wewnątrz krawędzi kropli cieczy znajdującej się najbliżej matowej części szkiełka.Powoli i płynnym ruchem opuść szkiełko nakrywkowe, aż palce dotkną szkiełka podstawnego, a następnie je puść. Nie należy próbować korygować położenia szkiełka nakrywkowego po jego opadnięciu. Umieść preparaty w szczelnej komorze wilgotnościowej i inkubuj przez noc w temperaturze 4 °C. Następnego dnia, trzymając szkiełka za matową krawędź, zanurz każde z nich w naczyniu do barwienia zawierającym TBS.Delikatnie przesuwaj zanurzone szkiełka w górę i w dół, aby usunąć szkiełka nakrywki. Staraj się nie używać przy tym zbyt dużej siły. Przemyj szkiełka, zanurzając je w TBS dwukrotnie po 10 minut za każdym razem.Wymień bufor po pierwszym przemyciu. Wyjmij slajdy z koszyka i usuń nadmiar cieczy, dotykając ich krawędzi ręcznikami papierowymi. Nie dopuść do natychmiastowego wyschnięcia powierzchni.Na każdy preparat nanieść 80 µL buforu T-B-S-B-S-A zawierającego przeciwciało wtórne sprzężone z fluorochromem w rozcieńczeniu 1:1000. Nałożyć szkiełko nakrywkowe w taki sam sposób jak wcześniej i inkubować w komorze wilgotnościowej w temperaturze 4 °C przez dwie godziny w ciemności. Po dwóch godzinach zdjąć szkiełka nakrywkowe, wypłukać w sposób opisany wcześniej i odlać nadmiar cieczy z preparatów.Odsącz je na ręcznikach papierowych. Pozostaw do wyschnięcia na powietrzu przez jedną do dwóch godzin w ciemności, pracując przy przygaszonym świetle, a następnie nanieś około 30 µL medium montażowego zawierającego dbi. Po czym ostrożnie nałóż szkiełko zakrywkowe.Odczekać dwie minuty wciąż przy przygaszonym świetle, aby szkiełko nakrywkowe osiadło, a następnie zabezpieczyć krawędzie szkiełka lakierem do paznokci bezbarwnym. Umieścić preparaty w płaskiej kasecie do szkiełek. Preparaty można przechowywać w ciemności w temperaturze 4 °C do momentu obserwacji.Nie zamrażać. Prezentowane na tym etapie preparaty to dwa przykłady optymalnie rozprzestrzenionych jąder miotycznych poddanych podwójnemu barwieniu immunocytochemicznemu na dwa eukariotyczne białka wymiany nici RAD 51 i DMC1 oraz barwieniu kontrastowemu DNA za pomocą DAPI. Dla komórek diploidalnych optymalnie rozprzestrzenione jądra miotyczne mają średnicę około 5 µm. W jądrze niedostatecznie rozprzestrzenionym rozdzielonych jest mniej ognisk RAD 51 i DMC1, a nie wszystkie struktury mogą być widoczne w jednej płaszczyźnie ogniskowania, ponieważ próbka nie jest wystarczająco płaska. W jądrach nadmiernie rozprzestrzenionych...Mniejsza liczba ognisk RAD 51 i DMC1 pozostaje ze względu na niewystarczającą fiksację i/lub nadmiar detergentu. Przeprowadzono również eksperymenty z traktowaniem, w których lip sal, który nie jest już dostępny w sprzedaży, zastąpiono MP 40; uzyskano satysfakcjonujące wyniki, co pokazano w barwieniu rozprzestrzenionych jąder mitotycznych dla RAD 51 i zip one, składnika regionu centralnego kompleksu synaptonemalnego. Zastąpienie lip sal wodą destylowaną również przyniosło satysfakcjonujące wyniki.W obu przypadkach kondensacja chromosomów zachodząca podczas przejścia komórek z fazy lepten NEA do PAA została w dużej mierze zachowana. Ta metoda rozprzestrzeniania jest odpowiednia do zastosowania w metodach mikroskopowych o wysokiej rozdzielczości (super-resolution). Na tym obrazie kompleksu synaptonemalnego jądro Paki INE wykazuje obecność zip one oraz red one.Komponenty kompleksu Synaptonemalnego zobrazowane za pomocą mikroskopii STED (stymulowanej emisji i wyczerpania). Należy zauważyć, że zastosowane tutaj przeciwciało przeciwko ZIP1, zaznaczone na zielono, wiąże się w pobliżu elementów bocznych, co potwierdza równoległy, liniowy wzór barwienia. Elementy boczne są oddalone od siebie o około 100 nanometrów i nie mogą zostać rozdzielone za pomocą konwencjonalnej mikroskopii.Po opanowaniu techniki wysiewu i rozcierania, procedura ta może zająć od dwóch do czterech godzin w zależności od liczby próbek; dzięki praktyce tą metodą można przygotować do 100 szkiełek. Zaleca się przygotowanie jednego lub więcej szkiełek powtórnych dla każdej próbki. Powtórki mogą być przechowywane do późniejszego wykorzystania w temperaturze -20 °C po etapie suszenia przez noc.Przechowując preparaty w ten sposób, zazwyczaj zachowują one trwałość przez lata.

surface-spreading-and-immunostaining-of-yeast-chromosomes

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Delecja genów oraz nadekspresja białek to powszechnie stosowane metody badania funkcji białek. W niniejszym artykule opisujemy protokół analizy rozwoju fenotypu w zależności od stężenia białka na poziomie populacyjnym i pojedynczych komórek u Saccharomyces cerevisiae.

Analiza rozwoju fenotypu morfologicznego w funkcji stężenia białka u drożdży pączkujących

Metoda zatapiania kolonii drożdży umożliwiająca wykonywanie przekrojów do mikroskopii świetlnej i elektronowej. Protokół ten pozwala na określenie rozmieszczenia komórek zsporulowanych i komórek pseudohifowych w obrębie kolonii, stanowiąc nowe narzędzie do zrozumienia organizacji typów komórek w obrębie społeczności grzybowej.

Metoda zatapiania kolonii drożdży

W niniejszym protokole ekspresja genów w drożdżach (Saccharomyces cerevisiae) ulega zmianie po narażeniu na stres oksydacyjny wywołany dodaniem nadtlenku wodoru (H2O2), który jest środkiem utleniającym.

Analiza mikromacierzy dla Saccharomyces cerevisiae

Ten protokół opisuje eksperymentalną procedurę przeprowadzania fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) do liczenia mRNA w pojedynczych komórkach w rozdzielczości pojedynczej cząsteczki.

Wizualizacja i analiza cząsteczek mRNA z wykorzystaniem fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ u Saccharomyces cerevisiae

Zapewniamy powtarzalną podstawową metodę długoterminowej mikroskopii cyklu życia płciowego drożdży rozszczepialnych. Z niewielkimi korektami, przedstawiony protokół pozwala na skupienie badań na różnych etapach procesu rozrodczego.

Mikroskopia płciowego cyklu życiowego drożdży rozszczepialnych

Tutaj prezentujemy obrazowanie żywych komórek, które jest nietoksyczną metodą mikroskopii, która pozwala badaczom badać zachowanie białek i dynamikę jądrową w żywych komórkach drożdży rozszczepialnych podczas mitozy i mejozy.

Badanie dynamiki jądrowej drożdży rozszczepienia mitotycznego i mejotycznego za pomocą fluorescencyjnej mikroskopii żywych komórek

Celem tego protokołu jest wizualizacja kształtu i lokalizacji komórek Candida albicans w przewodzie pokarmowym ssaków.

Wizualizacja Candida albicans w mysim przewodzie pokarmowym za pomocą fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ

Mikroskopia poklatkowa jest cennym narzędziem do badania mejozy u pączkujących drożdży. Protokół ten opisuje metodę, która łączy synchronizację cyklu komórkowego, mikroskopię poklatkową i warunkowe wyczerpanie białka docelowego, aby zademonstrować, jak badać funkcję określonego białka podczas segregacji chromosomów mejotycznych.

Zastosowanie mikroskopii poklatkowej i specyficznego dla etapu zubożenia komórek białek do badania mejozy u S. cerevisiae

Drożdże rozszczepienia są tutaj używane jako heterologiczne gospodarze do ekspresji bakteryjnych białek cytoszkieletu, takich jak FtsZ i MreB, jako translacyjnych białek fuzyjnych z GFP, aby uwidocznić ich polimeryzację. Również związki, które wpływają na polimeryzację, są identyfikowane przez obrazowanie za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.

Drożdże rozszczepieniowe jako platforma do badań przesiewowych leków przeciwbakteryjnych ukierunkowanych na białka cytoszkieletu bakteryjnego

Protokół ten opisuje dwie metody zatrzymania cyklu komórkowego drożdży oraz opcjonalnego uwalniania oraz rozwija zastosowanie mikroskopii fluorescencyjnej do badania procesów zależnych od cyklu komórkowego u S. cerevisiae.

Manipulacja i analiza procesów zależnych od cyklu komórkowego u drożdży pączkujących

Poznaj metodę rozprzestrzeniania chromosomów drożdży i ich barwienia immunologicznego. Technika ta umożliwia wizualizację białek związanych z chromosomami za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Rozprzestrzenianie się powierzchniowe i barwienie immunologiczne chromosomów drożdży

Przeglądaj więcej filmów