Odtwarzalna komputerowa metoda ilościowego oznaczania gęstości naczyń włosowatych za pomocą kapilaroskopii fałdów paznokciowych
27 października 2015
Kapilaroskopia to nieinwazyjna, wydajna, stosunkowo niedroga i łatwa do nauczenia metoda bezpośredniej wizualizacji naczyń włosowatych w mikrokrążeniu. Jednak do tej pory tylko jedna publikacja opisuje niezawodność złożonego oprogramowania dostępnego do ilościowego oznaczania danych kapilaroskopowych. Tutaj przedstawiamy prosty, niezawodny protokół ilościowego oznaczania naczyń włosowatych przy użyciu ustandaryzowanego algorytmu.
Ogólnym celem tej procedury jest ilościowe określenie liczby naczyń włosowatych na milimetr kwadratowy w obszarze skóry znajdującym się bezpośrednio pod skórkami okołopaznokciowymi. Jest to realizowane poprzez wykonanie w pierwszej kolejności monochromatycznego zdjęcia łoża paznokcia pod skórkami. Drugim krokiem jest zaimportowanie obrazu do programu do analizy obrazowej.
Następnie obrazy są poddawane obróbce. W celu lepszej wizualizacji naczyń włosowatych ostatnim krokiem jest identyfikacja i policzenie wszystkich naczyń włosowatych na jednym milimetrze kwadratowym. W rezultacie obróbka obrazu służy do przedstawienia ilości i morfologii naczyń włosowatych danej osoby. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z dziedziny kardiologii, takie jak wpływ nadciśnienia, cukrzycy i innych chorób na mikrokrążenie.
Używając monochromatycznej kamery cyfrowej, wykonaj obrazy naczyń kapilarnych zgodnie z wcześniej opisaną procedurą. Następnie wykonaj obrazy kalibracyjne wzorca z oznaczeniami milimetrowymi, korzystając z tej samej kamery i tych samych warunków powiększenia obrazu, które zostały zastosowane do uzyskania obrazów naczyń kapilarnych. Zaimportuj obraz wzorca do programu do przetwarzania obrazów i zmierz liczbę pikseli na linii o długości jednego milimetra na fotografii linijki.
Zapisz tę liczbę i oblicz liczbę pikseli znajdujących się w obszarze o wymiarach jeden milimetr na jeden milimetr. Następnie otwórz jeden z obrazów naczyń włosowatych, przyciemnij naczynia i rozjaśnij tło, dostosowując obraz za pomocą histogramu dopasowania (best fit histogram). Następnie użyj polecenia create ROI z menu rozwijanego, aby utworzyć obszar zainteresowania (region of interest) o wymiarach jeden milimetr na jeden milimetr w górnej części ekranu.
Przeciągnij i ustaw obszar zainteresowania w miejscu, w którym pętle kapilarne są najwyraźniejsze. Upewnij się, że obszar zainteresowania jest rozmieszczony tak, aby wierzchołki pętli kapilarnych znajdowały się na samej górze obszaru. Kluczem do powtarzalności i standaryzacji tego kroku protokołu jest prawidłowe rozmieszczenie pola obszaru zainteresowania o powierzchni jednego milimetra kwadratowego.
Dobrą zasadą w celu zachowania standaryzacji jest umieszczenie ramki na szczycie lub w wierzchołku pętli kapilarnych na obrazie. Po prawidłowym ustawieniu należy kliknąć ROI, a następnie wybrać opcję crop z pojawiającego się menu rozwijanego, a następnie wyrównać obraz (flatten), aby wszystkie przyszłe korekty obrazu były nakładane równomiernie. Następnie należy zwiększyć kontrast obrazu do 75, tak aby naczynia kapilarne były maksymalnie widoczne.
Należy również zastosować funkcję usuwania szumów (de-speckle) obrazu, aby wygładzić krawędzie naczyń włosowatych. Dostosować kontrast obrazu poprzez regulację histogramu do modelu najlepiej dopasowanego, tak aby naczynia włosowate były czarne, a tło białe. Na każdym obrazie należy ręcznie zaznaczyć fragment wyraźnie zarysowanego naczynia włosowatego, korzystając z funkcji obiektu docelowego, aby program rozpoznał go jako obiekt do zliczenia.
Następnie, korzystając z funkcji tła, zaznacz niewielki fragment tła jako punkt odniesienia dla obszarów, które powinny zostać pominięte przez algorytm zliczania. Ustaw minimalną średnicę zliczanych obiektów na pięć pikseli, aby uniknąć zliczania szumu tła jako naczyń włosowatych. Następnie użyj funkcji zliczania, aby natychmiastowo policzyć wszystkie naczynia włosowate na obrazie dla każdego osobnika.
Oblicz średnią z trzech lub czterech obrazów, aby uzyskać bardziej wiarygodną ocenę. Aby zaoszczędzić czas, utwórz makro, które automatycznie wykona określoną sekwencję procesów na jednym lub większej liczbie obrazów, wybierając najpierw opcję nagrywania makra i nazywając je na podstawie kroków i procesów wykonanych oraz opisanych w tym filmie. Następnie wykonaj kroki manipulacji obrazem podczas nagrywania makra.
Podczas stosowania makra do kolejnych zdjęć wystarczy kliknąć „uruchom makro”, a program automatycznie zastosuje zapisane ulepszenia do wybranych obrazów. Jedynym krokiem wymagającym interwencji użytkownika jest wybranie obszaru przycięcia obrazu. Optymalnie przetworzony obraz można policzyć w ciągu 30 sekund, co pozwala na wyraźne odróżnienie naczyń włosowatych od tła, a także poszczególnych naczyń włosowatych od siebie nawzajem.
Tutaj przedstawiono końcowy, ulepszony obraz. Całkowita liczba określona dla tego obrazu wyniosła 54 naczynia włosowate na milimetr kwadratowy. Po opanowaniu tej techniki można ilościowo ocenić i przetworzyć 12 obrazów w ciągu 20 minut.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Kapilaroskopia jest nieinwazyjną metodą wizualizacji naczyń włosowatych w mikrokrążeniu. Niniejszy artykuł przedstawia wiarygodny protokół ilościowego oznaczania naczyń włosowatych z wykorzystaniem ustandaryzowanego algorytmu.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Mikrokrążenie
- Wizualizacja kapilar
- Badania sercowo-naczyniowe
Wstęp
- Kapilaroskopia umożliwia bezpośrednią obserwację naczyń kapilarnych.
- Poprzednie badania dostarczyły ograniczonych danych dotyczących wiarygodności oprogramowania do ilościowego określania liczby kapilar.
- Metoda ta jest kluczowa dla zrozumienia mikrokrążenia w przebiegu różnych chorób.
- Ilościowe określanie liczby kapilar może dostarczyć cennych informacji o stanach takich jak nadciśnienie tętnicze i cukrzyca.
Cel badania
- Opracowanie prostego i niezawodnego protokołu ilościowej analizy naczyń włosowatych metodą kapilarną.
- Pogłębienie zrozumienia morfologii oraz liczby naczyń włosowatych.
- Uzupełnienie luk w istniejących metodologiach analizy naczyń włosowatych.
Zastosowane metody
- Wykonaj monochromatyczny obraz łożyska paznokcia poniżej skórki.
- Zaimportuj obraz do komputerowego programu do analizy obrazów.
- Przetwórz obraz w celu lepszej wizualizacji naczyń kapilarnych.
- Zidentyfikuj i policz naczynia kapilarne w określonym obszarze (1 mm²).
Główne wyniki
- Protokół umożliwia dokładne ilościowe oznaczenie naczyń włosowatych.
- Manipulacja obrazem poprawia widoczność morfologii naczyń włosowatych.
- Metodę tę można zastosować do badania wpływu chorób na mikrokrażenie.
- Wyniki mogą być wykorzystane w badaniach nad układem sercowo-naczyniowym oraz w praktyce klinicznej.
Wnioski
- Opracowany protokół jest niezawodny i łatwy do wdrożenia.
- Dostarcza on cennych danych dla zrozumienia mikrokrażenia.
- Metoda ta może pomóc w ocenie różnych schorzeń układu sercowo-naczyniowego.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Znormalizowane ilościowe oznaczanie gęstości kapilar za pomocą komputerowej kapilaroskopii fałdu paznokciowego odpowiada na krytyczną potrzebę powtarzalnej oceny mikronaczyniowej we wczesnych fazach odkrywania leków oraz w badaniach translacyjnych. Metoda ta ogranicza subiektywizm i zmęczenie operatora, umożliwiając wiarygodną, ilościową ocenę mikrokrążenia istotną dla modelowania chorób i walidacji celów terapeutycznych. Jej powtarzalność i efektywność wspierają podejmowanie trafnych decyzji w kluczowych punktach przełomowych w procesach rozwoju leków na choroby sercowo-naczyniowe i metaboliczne.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia obiektywne ilościowe określanie zmian mikronaczyniowych w celu weryfikacji hipotez w modelach chorobowych.
- Wspiera funkcjonalną walidację celów poprzez dostarczenie zestandaryzowanych wskaźników mikrokrążenia.
- Ułatwia ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez redukcję błędu operatora w ocenie gęstości naczyń włosowatych.
- Zwiększa pewność prognostyczną podczas wczesnej selekcji projektów w badaniach naczyniowych i metabolicznych.
Przesiewy i opracowanie testu
- Przygotowuje zwalidowane, powtarzalne testy obrazowe do późniejszego przesiewu związków.
- Standaryzuje pomiar gęstości naczyń włosowatych, zwiększając powtarzalność i skalowalność testu.
- Dostarcza ilościowe wyniki odpowiednie do porównań między badaniami i ośrodkami.
- Umożliwia szybką, półautomatyczną analizę w celu zapewnienia gotowości do wysokoprzepustowego przesiewu.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Usprawnia ilościowe określanie parametrów mikronaczyniowych w odniesieniu do punktów końcowych istotnych dla choroby w celu opracowania biomarkerów translacyjnych.
- Zapewnia ciągłość procesu od etapu odkryć po walidację przedkliniczną dzięki umożliwieniu stosowania spójnych protokołów pomiarowych.
- Wspiera decyzje o dalszym rozwoju projektu z uwzględnieniem analizy ryzyka w oparciu o rzetelne dane dotyczące mikrokrążenia.
- Zmniejsza niejednoznaczność translacyjną poprzez powiązanie ilościowych wskaźników kapilarnych z fenotypami chorób.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ta zkomputeryzowana metoda kapilaroskopii wpisuje się w kontinuum od odkrycia do badań przedklinicznych, wspierając zarówno wczesne testowanie hipotez, jak i translacyjne dopasowanie biomarkerów.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia odtwarzalne testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków w badaniach naczyniowych mikrokrążenia.
- Przesiewy: Dostarcza zestandaryzowanych, ilościowych wyników gęstości naczyń kapilarnych do opracowywania testów i oceny związków.
- Analityka: Pozwala na obiektywne, statystyczne porównanie zmian w mikrokrążeniu w różnych warunkach eksperymentalnych.
- Badania translacyjne: Wspiera dopasowanie biomarkerów i ciągłość między modelami in vitro a in vivo w przypadkach, gdy mikrokrążenie jest istotnym punktem końcowym.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje skalowalny, półautomatyczny proces roboczy, który można dostosować do różnych modeli chorób i zespołów badawczych.
Wpływ operacyjny i korporacyjny
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach mikronaczyniowych.
- Wartość operacyjna: Zapewnia zestandaryzowane, powtarzalne i szybkie ilościowanie przy minimalnych wymaganiach szkoleniowych.
- Wartość strategiczna: Poprawia decyzje typu go/no-go oraz efektywność kapitałową poprzez dostarczenie solidnych punktów końcowych o charakterze ilościowym.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój programów badań nad chorobami naczyniowymi i metabolicznymi.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest podstawowa wiedza z zakresu obrazowania cyfrowego i interpretacji kapilaroskopii.
- Wymagany jest dostęp do monochromatycznych aparatów cyfrowych oraz kompatybilnego oprogramowania do analizy obrazu.
- W celu zapewnienia powtarzalności niezbędna jest standaryzacja akwizycji obrazu i wyznaczania ROI pomiędzy zespołami.
- Metoda jest dostosowalna do różnych modeli chorobowych, w których mikrokrążenie stanowi istotny punkt końcowy.
- Ręczny wybór ROI pozostaje potencjalnym źródłem zmienności i wymaga ścisłego przestrzegania protokołu.
