Name: Podskórny wlew angiotensyny II za pomocą pomp osmotycznych indukuje tętniaki aorty u myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 21 s
Description: Poznaj metodę wlewu angiotensyny II za pomocą pomp osmotycznych do badania tętniaków aorty u myszy. Technika ta umożliwia ocenę patofizjologii naczyń krwionośnych in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca badawcza przedstawiona w tym manuskrypcie była wspierana przez grant (HL107319 dla Alana Daugherty'ego i HL107326 dla Lisy A. Cassis) z National Institutes of Health of the United States of America. Wyłączną odpowiedzialność za treść tego manuskryptu ponoszą autorzy i niekoniecznie reprezentują one oficjalne poglądy National Institutes of Health. Publikacja tego manuskryptu była sponsorowana przez DURECT Corporation.

Oświadczenie etyczne: Badania na myszach są przeprowadzane za zgodą Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Kentucky (numer protokołu IACUC: 2006-0009). Myszy są poddawane eutanazji po zakończeniu przy użyciu koktajlu przedawkowania ketaminy (~ 210 mg / kg) i ksylazyny (~ 30 mg / kg).
1. Obliczanie ilości AngII
UWAGA: Ten protokół wykorzystuje przykład infuzji AngII (1,000 ng/kg/min) przez 4 tygodnie u 4 samców myszy z receptorem LDL -/- karmionych dietą wzbogaconą w tłuszcze nasycone.
<ol>
	<li>Zważyć badane myszy przed obliczeniem ilości AngII potrzebnej do infuzji.</li>
	<li>Użyj szablonu (Tabela 1), aby obliczyć masę AngII potrzebną do eksperymentu. Użyj "Średniej szybkości pompowania" wskazanej w instrukcji pomp jako "Szybkość pompowania" w kroku 4 szablonu. W szablonie rejestruj kroki od 1 do 5 ręcznie, a kroki od 6 do 10 są obliczane automatycznie.
	<ol>
		<li>W szablonie załóżmy, że myszy przybiorą na wadze 1 g masy ciała podczas infuzji AngII 1,000 ng/kg/min przez 4 tygodnie. 
		UWAGA: Każda mysz może mieć bardzo różny przyrost masy ciała, który będzie zależał od wielu zmiennych, takich jak szczep myszy i dieta. Rutynowo używamy "0" lub "1 g" w oparciu o nasze własne doświadczenia z poprzednich badań.</li>
		<li>Oblicz całkowitą objętość roztworu AngII wynoszącą 300 μl dla każdej myszy, ponieważ każda pompa wymaga około 250 μl.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

2. Rozwiązanie AngII
<ol>
	<li>Przechowywać liofilizowane fiolki AngII w temperaturze -20 °C. Przed otwarciem należy zrównoważyć fiolki AngII z RT.</li>
	<li>Odważyć obliczoną masę AngII (7,3 mg, jak pokazano w tabeli 1) do sterylnej probówki z tworzywa sztucznego. 
	UWAGA: Zgodnie z indeksem Merck, nie należy używać szklanych probówek do rozpuszczania, ponieważ wodny roztwór AngII ma silne powinowactwo do wiązania się ze szkłem.</li>
	<li>Dodać obliczoną objętość sterylnego roztworu soli fizjologicznej (1 200 μl) do plastikowej probówki zawierającej liofilizowany AngII, nakrętkę i dokładnie wymieszać przez odwrócenie, aż roztwór będzie klarowny.</li>
	<li>Oznacz numery myszy #1, #2, #3 i #4 na pojedynczych sterylnych plastikowych probówkach z nakrętkami (0,5 - 1,5 ml). Przygotuj roztwór AngII pod osłoną laminarną dla każdej myszy w oparciu o masę ciała, jak obliczono w kroku 1.2 i tabeli 1.
	<ol>
		<li>Na przykład odpipetuj 3,6 μl sterylnego roztworu soli fizjologicznej do probówki #1, a następnie 296,4 μl roztworu AngII i dokładnie wymieszaj, delikatnie pipetując w górę i w dół.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oznacz numery myszy na plastikowych probówkach z nakrętkami (4 ml; sterylne). Będą one używane do pomp inkubacyjnych, jak opisano w kroku 3.13.</li>
</ol>
3. Napełnianie pompy osmotycznej
<ol>
	<li>Pompy należy wykonać w dwóch oddzielnych częściach: głównym korpusie pompy i moderatorze przepływu (rysunek 1). Każda skrzynka ma 10 korpusów pomp i moderatorów przepływu, które są pakowane pojedynczo. Zapisz numer partii. 
	UWAGA: Zawsze noś rękawice, ponieważ oleje przenoszone z rąk na zewnętrzną obudowę pomp niekorzystnie wpłyną na działanie pompy. Do przygotowania pomp należy używać sterylnych rękawiczek, gazy, probówek, igły do napełniania i łódek wagowych, aby uniknąć ryzyka zakażenia implantem.</li>
	<li>Otworzyć tylko tyle korpusów pomp i ile moderatorów przepływu jest potrzebnych do badania, ponieważ nie można ich przechowywać po otwarciu. Jeśli potrzebnych jest więcej niż 10 pomp, należy upewnić się, że numery partii pomp są takie same dla jednego badania, ponieważ pompy o różnych numerach partii mają różną średnią objętość napełnienia i szybkość pompowania.</li>
	<li>Zważ każdą pompę (w tym zarówno korpus główny, jak i moderator przepływu) i zanotuj wagę z dokładnością do 4 miejsc po przecinku (np. 1,1443 g myszy #1). Masa ta, oznaczona w szablonie jako "Pusta masa pompy" (tabela 1), zostanie wykorzystana do obliczenia napełnionego współczynnika.</li>
	<li>Przymocować igłę do napełniania pompki do sterylnej strzykawki o pojemności 1 ml i ostrożnie napełnić strzykawkę roztworem AngII z odpowiednio ponumerowanej plastikowej tubki. Ważne jest, aby unikać zasysania powietrza do strzykawki.</li>
	<li>Ostrożnie usunąć wszystkie pęcherzyki powietrza ze strzykawki, trzymając igłę skierowaną w dół. Utrzymać igłę/strzykawkę w tej pozycji, aby zapobiec wprowadzeniu pęcherzyków do pompy.</li>
	<li>Delikatnie włożyć igłę do napełniania do korpusu pompy. Wsuń końcówkę igły do pompy. Nie należy mocno opierać końcówki igły o dno pompy.</li>
	<li>Powoli naciskać tłok strzykawki, aby napełnić pompę roztworem AngII. Ciemny cień wewnątrz pompy wskazuje poziom napełnienia. Objętość napełniania wynosi około 246 μl, zgodnie z instrukcją.</li>
	<li>Przestań napełniać pompę i ostrożnie wyjmij igłę, gdy tylko kropla płynu wypłynie z pompy.</li>
	<li>Włóż regulator przepływu do pompy przez otwór w górnej części korpusu pompy, aż nie będzie widać przerwy między głowicą regulatora przepływu a górną częścią korpusu pompy (rysunek 1).</li>
	<li>Wprowadzenie moderatora do korpusu pompy prowadzi do wycieku płynu z otworu moderatora przepływu. Ostrożnie zetrzyj cały dodatkowy płyn, który mógł wycieknąć podczas umieszczania moderatorów.</li>
	<li>Zważyć napełnioną pompę. Zapisz masę w polu "Wypełniona masa pompy" w szablonie.</li>
	<li>Obliczać Współczynnik napełnienia (%) = (Masa pompy "napełniona" - "pusta") x 1,000/średnia objętość napełnienia x 100.
	<ol>
		<li>Obliczyć współczynnik napełnienia, jak wskazano w tabeli 1. Idealnie, współczynnik wypełnienia powinien być równy lub większy niż 100%. Napełnij pompę, jeśli stosunek napełnienia wynosi < 95% (co oznacza, że w pompie mogą znajdować się pęcherzyki powietrza).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieść napełnioną pompę w oznaczonej tubie o pojemności 4 ml (krok 2.5) z głowicą moderatora skierowaną do góry. Dodać wystarczającą ilość sterylnego roztworu soli fizjologicznej, aby przykryć pompę. Przechowywać pompę w probówce z solą fizjologiczną do czasu implantacji.</li>
	<li>Umieścić probówki w inkubatorze o temperaturze 37 ºC. Inkubuj pompy O/N (co najmniej 12 godzin), aby umożliwić częściowe zalewanie, a następnie wszczepij je myszom. Pompowanie AngII rozpoczyna się około 24 godziny po implantacji, co pozwala myszom na powrót do zdrowia po operacji przed potencjalnym stresem powstającym podczas infuzji AngII.</li>
</ol>
4. Przygotowanie do implantacji pompy
<ol>
	<li>Autoklaw (tryb grawitacyjny, cykl suchy, 15 min) gaza, waciki i narzędzia chirurgiczne, w tym nożyczki, hemostat, kleszcze, zszywki i zszywacz co najmniej 1 dzień przed zabiegiem.</li>
	<li>W gabinecie zabiegowym przygotuj waporyzator do znieczulenia za pomocą izofluranu. Otwórz sterylne zasłony w kapturze z przepływem laminarnym i umieść stożek nosowy do znieczulenia izofluranem. Umieść betadynę, 70% etanol, sterylną wodę, sterylizator perełkowy, antyseptyczny środek do dezynfekcji rąk, waciki, gazę i napełnione pompy w okapie laminarnym.</li>
	<li>Załóż maskę i fartuch, a następnie czystymi rękami otwórz zewnętrzną zasłonę w laminarnym kapturze. Załóż sterylne rękawiczki i otwórz sterylne wnętrze opakowania.</li>
</ol>
5. Zabieg chirurgiczny implantacji pompy
<ol>
	<li>Umieść mysz w komorze indukcyjnej z dopływem izofluranu o natężeniu przepływu 1,5 - 2%. Monitoruj mysz przez dodatkowe 2-3 minuty po leżeniu. Ogol obszar wielkości ćwiartki nad lewym lub prawym ramieniem.</li>
	<li>Umieść mysz w kapturze laminarnym, z nosem zlicowanym ze stożkiem połączonym z odpływem izofluranu (Rysunek 2A). Skieruj głowę myszy w stronę dominującej ręki chirurga. Użyj maści weterynaryjnej na oczy myszy, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia. Upewnij się, że mysz nie reaguje na stymulację bólu przed zabiegiem. Na przykład reakcja pedału jest dobrym wskaźnikiem bólu.</li>
	<li>Przetrzyj ogolony obszar betadyną, a następnie trzy chusteczki z 70% etanolem. Załóż lub zmień sterylne rękawiczki.</li>
	<li>Użyj skalpela chirurgicznego, aby wykonać ~ 1 cm nacięcie za uchem nad łopatką przedniej nogi. To nacięcie powinno być prostopadłe do ogona. Zachowaj ostrożność, aby ciąć tylko skórę, a nie tkanki znajdujące się pod nią.</li>
	<li>Przytrzymaj kleszcze jedną ręką, aby otworzyć nacięcie, a drugą ręką wykonaj podskórny tunel pod skórą za pomocą hemostatu (ryc. 2B).</li>
	<li>Przesuń końcówkę hemostatu w kierunku ogona i utwórz kieszeń na pompę. Osiąga się to poprzez ostrożne otwarcie szczęk hemostatu pod skórą, aby otworzyć woreczek. Wycofaj hemostat z nacięcia.</li>
	<li>Włóż pompę do nacięcia z głowicą moderatora umieszczoną z tyłu myszy (Rysunek 2C). Delikatnie wsuń pompkę całkowicie do kieszeni. Powinno być wystarczająco dużo wolnego miejsca, aby zamknąć ranę bez naprężeń i rozciągania skóry.</li>
	<li>Po włożeniu pompki mocno ściśnij obie strony nacięcia, prostując tak, aby krawędzie się spotkały, i umieść 1 lub 2 zwijane klipsy, aby je zamknęły (Rysunek 2D). Sprawdź miejsce nacięcia, aby upewnić się, że rana jest całkowicie zamknięta i że pompa nie naciska bezpośrednio na to miejsce.</li>
	<li>Nakładaj miejscowo krem z lidokainą (4% wag./wag.) za pomocą czystego bawełnianego wacika. Wyjmij mysz ze stożka nosowego i umieść ją na poduszce grzewczej, aż odzyska przytomność. Po wyzdrowieniu mysz wraca do klatki.</li>
	<li>Umieść narzędzia chirurgiczne w sterylizatorze koralików na 10 sekund między myszami. Poczekaj, aż instrumenty ostygną przed użyciem. Wyczyść rękawiczki środkiem antyseptycznym do rąk między myszami. Monitoruj wszystkie myszy, aż do osiągnięcia pełnego wyzdrowienia.</li>
	<li>Uważnie monitoruj myszy po operacji. Wstrzyknąć podskórnie bolus sterylnego roztworu soli fizjologicznej (0,2 - 0,3 ml), jeśli mysz wykazuje oznaki niepokoju, odwodnienia lub widocznej utraty wagi. Obserwuj myszy co najmniej dwa razy dziennie przez pierwsze 10 dni, a następnie co najmniej raz dziennie. Natychmiast wykonaj sekcję zwłok, jeśli jakiekolwiek myszy umrą podczas infuzji AngII. Klipsy do ran należy usunąć między 7 a 14 dniem po zabiegu.</li>
</ol>
6. Zbieranie, naprawianie, czyszczenie i obrazowanie aort
<ol>
	<li>Rozciąć brzusznie klatkę piersiową i jamę brzuszną myszy, rozciąć prawy przedsionek, przelać solą fizjologiczną przez lewą komorę serca, aby usunąć krew z aorty, a następnie pobrać aortę 27.</li>
	<li>Zebrane aorty należy umieścić w plastikowych probówkach zawierających co najmniej 3 ml 4% paraformaldehydu lub 10% neutralnie buforowanej formaliny przez 24 - 48 godzin 27.</li>
	<li>Ostrożnie usuń tkanki przybyszowe. Przypnij aortę do czarnego wosku za pomocą szpilek. Uzyskuj obrazy aorty w tym samym powiększeniu. Do każdego obrazu dołącz linijkę do kalibracji, jak pokazano na rysunku 3.</li>
</ol>
7. Obrazowanie aort en face
<ol>
	<li>Rozetnij aortę wzdłużnie przez zewnętrzną i wewnętrzną krzywiznę łuku aorty i rozetnij główne gałęzie, w tym nienominalną, lewą tętnicę szyjną i lewą tętnicę podobojczykową. Aorta szpilkowa płaska z zewnętrznym przybyszem przylegającym do czarnego wosku.</li>
	<li>Uzyskaj obraz en face wewnętrznej powierzchni aorty w tym samym powiększeniu. Do każdego obrazu dołącz linijkę do kalibracji, jak pokazano na rysunku 4.</li>
</ol>

<ol><li>Pyo, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+disruption+of+matrix+metalloproteinase-9+%28gelatinase+B%29+suppresses+development+of+experimental+abdominal+aortic+aneurysms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Targeted gene disruption of matrix metalloproteinase-9 (gelatinase B) suppresses development of experimental abdominal aortic aneurysms.</a> J Clin Invest. 105 (11), 1641-1649 (2000).</li>
<li>Chiou, A. C., Chiu, B., Pearce, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+aortic+aneurysm+produced+by+periarterial+application+of+calcium+chloride%5BTitle%5D)+AND+%22J+Surg+Res%22%5BJournal%5D)">Murine aortic aneurysm produced by periarterial application of calcium chloride.</a> J Surg Res. 99 (2), 371-376 (2001).</li>
<li>Daugherty, A., Cassis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+angiotensin+II+infusion+promotes+atherogenesis+in+low+density+lipoprotein+receptor+-%2F-+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+NY+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Chronic angiotensin II infusion promotes atherogenesis in low density lipoprotein receptor -/- mice.</a> Ann NY Acad Sci. 892 (1), 108-118 (1999).</li>
<li>Daugherty, A., Manning, M. W., Cassis, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiotensin+II+promotes+atherosclerotic+lesions+and+aneurysms+in+apolipoprotein+E-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Angiotensin II promotes atherosclerotic lesions and aneurysms in apolipoprotein E-deficient mice.</a> J Clin Invest. 105 (11), 1605-1612 (2000).</li>
<li>Deng, G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urokinase-type+plasminogen+activator+plays+a+critical+role+in+angiotensin+II-induced+abdominal+aortic+aneurysm%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Urokinase-type plasminogen activator plays a critical role in angiotensin II-induced abdominal aortic aneurysm.</a> Circ Res. 92 (5), 510-517 (2003).</li>
<li>King, V. L., Trivedi, D., Gitlin, J. M., Loftin, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+cyclooxygenase-2+inhibition+with+celecoxib+decreases+angiotensin+II-induced+abdominal+aortic+aneurysm+formation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Selective cyclooxygenase-2 inhibition with celecoxib decreases angiotensin II-induced abdominal aortic aneurysm formation in mice.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 26 (5), 1137-1143 (2006).</li>
<li>Uchida, H. A., Poduri, A., Subramanian, V., Cassis, L. A., Daugherty, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urokinase-type+plasminogen+activator+deficiency+in+bone+marrow-derived+cells+augments+rupture+of+angiotensin+II-induced+abdominal+aortic+aneurysms%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Urokinase-type plasminogen activator deficiency in bone marrow-derived cells augments rupture of angiotensin II-induced abdominal aortic aneurysms.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 31 (12), 2845-2852 (2011).</li>
<li>Wang, Y. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiotensin+II+increases+urokinase-type+plasminogen+activator+expression+and+induces+aneurysm+in+the+abdominal+aorta+of+apolipoprotein+E-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Angiotensin II increases urokinase-type plasminogen activator expression and induces aneurysm in the abdominal aorta of apolipoprotein E-deficient mice.</a> Am J Pathol. 159 (4), 1455-1464 (2001).</li>
<li>Bruemmer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiotensin+II-accelerated+atherosclerosis+and+aneurysm+formation+is+attenuated+in+osteopontin-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Angiotensin II-accelerated atherosclerosis and aneurysm formation is attenuated in osteopontin-deficient mice.</a> J Clin Invest. 112 (9), 1318-1331 (2003).</li>
<li>Gavrila, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitamin+E+inhibits+abdominal+aortic+aneurysm+formation+in+angiotensin+II-infused+apolipoprotein+E-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Vitamin E inhibits abdominal aortic aneurysm formation in angiotensin II-infused apolipoprotein E-deficient mice.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 25 (8), 1671-1677 (2005).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IgE+actions+on+CD4%2B+T+cells%2C+mast+cells%2C+and+macrophages+participate+in+the+pathogenesis+of+experimental+abdominal+aortic+aneurysms%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">IgE actions on CD4+ T cells, mast cells, and macrophages participate in the pathogenesis of experimental abdominal aortic aneurysms.</a> EMBO Mol Med. 6 (7), 952-969 (2014).</li>
<li>Yoshimura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regression+of+abdominal+aortic+aneurysm+by+inhibition+of+c-Jun+N-terminal+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Regression of abdominal aortic aneurysm by inhibition of c-Jun N-terminal kinase.</a> Nat Med. 11 (12), 1330-1338 (2005).</li>
<li>Usui, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammasome+activation+by+mitochondrial+oxidative+stress+in+macrophages+leads+to+the+development+of+angiotensin+II-induced+aortic+aneurysm%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Inflammasome activation by mitochondrial oxidative stress in macrophages leads to the development of angiotensin II-induced aortic aneurysm.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 35 (1), 127-136 (2015).</li>
<li>Mellak, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiotensin+II+mobilizes+spleen+monocytes+to+promote+the+development+of+abdominal+aortic+aneurysm+in+apoe-%2F-+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Angiotensin II mobilizes spleen monocytes to promote the development of abdominal aortic aneurysm in apoe-/- mice.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 35 (2), 378-388 (2015).</li>
<li>Krishna, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide+antagonist+of+thrombospondin-1+promotes+abdominal+aortic+aneurysm+progression+in+the+angiotensin+II-infused+apolipoprotein-E-deficient+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Peptide antagonist of thrombospondin-1 promotes abdominal aortic aneurysm progression in the angiotensin II-infused apolipoprotein-E-deficient mouse.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 35 (2), 389-398 (2015).</li>
<li>Norman, P. E., Curci, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+effects+of+tobacco+smoke+on+the+pathogenesis+of+aortic+aneurysm%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Understanding the effects of tobacco smoke on the pathogenesis of aortic aneurysm.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 33 (7), 1473-1477 (2013).</li>
<li>Daugherty, A., Powell, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+highlights+of+ATVB%3A+aneurysms%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Recent highlights of ATVB: aneurysms.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 34 (4), 691-694 (2014).</li>
<li>Liu, J., Daugherty, A., Lu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiotensin+II+and+abdominal+aortic+aneurysms%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Pharm+Design%22%5BJournal%5D)">Angiotensin II and abdominal aortic aneurysms: an update.</a> Curr Pharm Design. , (2015).</li>
<li>Rateri, D. L., Howatt, D. A., Moorleghen, J. J., Charnigo, R., Cassis, L. A., Daugherty, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prolonged+infusion+of+angiotensin+II+in+apoE%28-%2F-%29+mice+promotes+macrophage+recruitment+with+continued+expansion+of+abdominal+aortic+aneurysm%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Prolonged infusion of angiotensin II in apoE(-/-) mice promotes macrophage recruitment with continued expansion of abdominal aortic aneurysm.</a> Am J Pathol. 179 (3), 1542-1548 (2011).</li>
<li>Saraff, K., Babamusta, F., Cassis, L. A., Daugherty, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aortic+dissection+precedes+formation+of+aneurysms+and+atherosclerosis+in+angiotensin+II-infused%2C+apolipoprotein+E-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Aortic dissection precedes formation of aneurysms and atherosclerosis in angiotensin II-infused, apolipoprotein E-deficient mice.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 23 (9), 1621-1626 (2003).</li>
<li>Daugherty, A., Cassis, L. A., Lu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+pathologies+of+angiotensin+II-induced+abdominal+aortic+aneurysms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Zhejiang+Univ+Sci+B%22%5BJournal%5D)">Complex pathologies of angiotensin II-induced abdominal aortic aneurysms.</a> J Zhejiang Univ Sci B. 12 (8), 624-628 (2011).</li>
<li>Daugherty, A., Rateri, D. L., Charo, I. F., Owens, A. P., Howatt, D. A., Cassis, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiotensin+II+infusion+promotes+ascending+aortic+aneurysms%3A+attenuation+by+CCR2+deficiency+in+apoE-%2F-+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Sci+%28Lond%29%22%5BJournal%5D)">Angiotensin II infusion promotes ascending aortic aneurysms: attenuation by CCR2 deficiency in apoE-/- mice.</a> Clin Sci (Lond). 118 (11), 681-689 (2010).</li>
<li>Rateri, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cell-specific+deficiency+of+Ang+II+type+1a+receptors+attenuates+Ang+II-induced+ascending+aortic+aneurysms+in+LDL+receptor-%2F-+mice%29%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Endothelial cell-specific deficiency of Ang II type 1a receptors attenuates Ang II-induced ascending aortic aneurysms in LDL receptor-/- mice).</a> Circ Res. 108 (5), 574-581 (2011).</li>
<li>Rateri, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depletion+of+endothelial+or+smooth+muscle+cell-specific+angiotensin+II+type+1a+receptors+does+not+influence+aortic+aneurysms+or+atherosclerosis+in+LDL+receptor+deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Depletion of endothelial or smooth muscle cell-specific angiotensin II type 1a receptors does not influence aortic aneurysms or atherosclerosis in LDL receptor deficient mice.</a> PLoS One. 7 (12), 10-1371 (2012).</li>
<li>Rateri, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiotensin+II+induces+region-specific+medial+disruption+during+evolution+of+ascending+aortic+aneurysms%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Angiotensin II induces region-specific medial disruption during evolution of ascending aortic aneurysms.</a> Am J Pathol. 184 (9), 2586-2595 (2014).</li>
<li>Davis, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smooth+muscle+cell+deletion+of+low-density+lipoprotein+receptor-related+protein+1+augments+angiotensin+II-induced+superior+mesenteric+arterial+and+ascending+aortic+aneurysms%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Smooth muscle cell deletion of low-density lipoprotein receptor-related protein 1 augments angiotensin II-induced superior mesenteric arterial and ascending aortic aneurysms.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 35 (1), 155-162 (2015).</li>
<li>Daugherty, A., Rateri, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+experimental+designs+for+atherosclerosis+studies+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Development of experimental designs for atherosclerosis studies in mice.</a> Methods. 36 (2), 129-138 (2005).</li>
<li>Henriques, T. A., Huang, J., D'Souza, S. S., Daugherty, A., Cassis, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orchidectomy%2C+but+not+ovariectomy%2C+regulates+angiotensin+II-induced+vascular+diseases+in+apolipoprotein+E-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Orchidectomy, but not ovariectomy, regulates angiotensin II-induced vascular diseases in apolipoprotein E-deficient mice.</a> Endocrinology. 145 (8), 3866-3872 (2004).</li>
<li>Daugherty, A., Manning, M. W., Cassis, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antagonism+of+AT2+receptors+augments+angiotensin+II-induced+abdominal+aortic+aneurysms+and+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Antagonism of AT2 receptors augments angiotensin II-induced abdominal aortic aneurysms and atherosclerosis.</a> Br J Pharmacol. 134 (4), 865-870 (2001).</li>
<li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deficiency+of+receptor-associated+protein+attenuates+angiotensin+II-induced+atherosclerosis+in+hypercholesterolemic+mice+without+influencing+abdominal+aortic+aneurysms%5BTitle%5D)+AND+%22Atherosclerosis%22%5BJournal%5D)">Deficiency of receptor-associated protein attenuates angiotensin II-induced atherosclerosis in hypercholesterolemic mice without influencing abdominal aortic aneurysms.</a> Atherosclerosis. 220 (2), 375-380 (2011).</li>
<li>Daugherty, A., Rateri, D., Lu, H., Balakrishnan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+blood+pressure+in+mice+using+volume+pressure+recording%2C+a+tail-cuff+method%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Measuring blood pressure in mice using volume pressure recording, a tail-cuff method.</a> J Vis Exp. (27), e1291(2009).</li>
</ol>

Publikacja tego artykułu jest sponsorowana przez Alzet.

Pompy osmotyczne dostarczające AngII podskórnie to rutynowe podejście do wywoływania tętniaków aorty u myszy. Na podstawie danych z wielu laboratoriów stwierdzono, że jest to wiarygodna i powtarzalna metoda badania zarówno AAA3,4 , jak i TAA22-26 u myszy. Dlatego ten mysi model jest uważany za model, który podsumowuje kilka cech ludzkich tętniaków aorty i zapewnia mechanistyczny wgląd w te wyniszczające choroby.
Chociaż starzenie się jest czynnikiem ryzyka AAA u ludzi, nie było systematycznie badane pod kątem AAA indukowanych przez AngII u myszy. Wydaje się jednak, że częstość występowania i nasilenie AAA indukowanych przez AngII są podobne u myszy w wieku 8 - 48 tygodni4,5,7. Obecnie istnieje tylko kilka badań opisujących TAA indukowane przez AngII u myszy w wieku 8 - 24 tygodni22-26, które nie wykazały widocznych różnic związanych z wiekiem w tworzeniu TAA.
Samice myszy mają znacznie mniejszą częstość występowania AAA niż samce myszy z infuzją AngII4,28. Warto również zauważyć, że częstość występowania AAA indukowanych przez AngII jest znacznie wyższa u myszy z hipercholesterolem niż u myszy z normocholesterolemią, która wynosi odpowiednio ponad 50% i mniej niż 30%. Ponadto pęknięcie aorty jest częste (około 10 - 30%) zarówno u myszy z normo-, jak i hipercholesterolemią podczas infuzji AngII. Wlew AngII w ilości 1000 ng / kg / min u myszy z hipercholesterolemią, takich jak myszy z receptorem LDL -/- karmione dietą zachodnią lub myszy z apolipoproteiną (apoE) -/- karmione normalną lub zachodnią dietą, ma maksymalny wpływ na rozwój AAA3,4,29. Ta szybkość infuzji jest optymalna dla badania, w którym oczekuje się, że manipulowanie genem będącym przedmiotem zainteresowania u myszy z hipercholesterolemią zmniejszy AAA. Jeśli oczekuje się, że manipulacja u myszy z hipercholesterolemią zwiększy AAA, zaleca się podawanie AngII w ilości 500 ng / kg / min lub niższejniż 30. W przeciwieństwie do AAA, nie wykazano związku między płcią męską lub hipercholesterolemią a TAA indukowanymi przez AngII25. Jednakże, podobnie jak w przypadku AAA, jeśli oczekuje się, że manipulacja genem będącym przedmiotem zainteresowania zwiększy TAA, zalecamy niższą szybkość infuzji niż 1000 ng / kg / min w przypadku infuzji AngII.
Ważne jest również, aby wiedzieć, że częstość występowania i nasilenie tętniaków aorty wywołanych przez AngII różni się u poszczególnych myszy i między badaniami. Jeśli u myszy nie rozwiną się tętniaki aorty, jedną z potencjalnych możliwości jest to, że AngII mógł nie zostać pomyślnie dostarczony myszom. W celu walidacji wysokiej szybkości infuzji AngII, takiej jak 1 000 ng/kg/min, zaleca się pomiar ciśnienia krwi przed i w trakcie infuzji AngII przy użyciu nieinwazyjnej metody mankietu ogonowego31. Wlew leku AngII w dawce 1 000 ng/kg/min zwiększa skurczowe ciśnienie krwi u myszy. Również stężenie reniny w osoczu może być mierzone podczas infuzji AngII lub po jej zakończeniu, ponieważ AngII ma ujemne sprzężenie zwrotne dotyczące wydzielania reniny. W związku z tym infuzja AngII prowadzi do zmniejszenia stężenia reniny w osoczu. Jeśli mysz z infuzją AngII nie ma widocznych patologii aorty, nie ma wzrostu ciśnienia krwi i nie ma spadku stężenia reniny w osoczu, oznaczałoby to, że AngII nie została skutecznie dostarczona przez wszczepioną mini pompę osmotyczną. Zalecamy usunięcie tej myszy z badania. Ważne jest również, aby pamiętać, że u niektórych myszy nie rozwijają się tętniaki aorty pomimo podwyższonego skurczowego ciśnienia krwi i obniżonego stężenia reniny w osoczu. Myszy te powinny pozostać w badaniu.
Podsumowując, infuzję AngII uzyskuje się poprzez implantację podskórną za pomocą pomp osmotycznych w celu wywołania tętniaków aorty u myszy. Ta metoda dostarcza AngII w sposób ciągły z określoną szybkością przez wyznaczony czas trwania, który jest używany do badania zarówno AAA, jak i TAA.

Tętniaki aorty wykazują stałą ekspansję świetlną aorty, która zwiastuje pęknięcie i zwykle prowadzi do śmierci. Choroba ta występuje zarówno w okolicy aorty brzusznej, jak i piersiowej, które są określane odpowiednio jako tętniaki aorty brzusznej (AAA) i tętniaki aorty piersiowej (TAA). Ze względu na niepełne zrozumienie mechanizmów molekularnych i procesów patofizjologicznych, nie ma udowodnionej terapii medycznej, która mogłaby zapobiec rozszerzaniu się lub pękaniu któregokolwiek z typów tętniaków aorty. Ponieważ trudno jest pozyskać próbki od pacjentów i przeprowadzić eksperymenty bezpośrednio na ludziach, badania koncentrujące się na zdefiniowaniu mechanizmów AAA były często ekstrapolowane na podstawie modeli zwierzęcych. Powszechnie stosowanym modelem zwierzęcym jest podskórna infuzja angiotensyny II (AngII) myszom. W porównaniu z innymi metodami chirurgicznymi do indukowania AAA u myszy, takimi jak wewnątrzaortalna perfuzja elastazy lub okołoaortalne zastosowanie chlorku wapnia, które wymagają laparotomii1,2, metoda ta nie wymaga wejścia do jamy ciała i wymaga minimalnej wiedzy chirurgicznej3,4.
Podskórny wlew AngII za pomocą pomp osmotycznych w celu wywołania AAA był początkowo zgłaszany u myszy o niskiej gęstości receptora lipoprotein (LDL) -/- karmionychdietą wzbogaconą w tłuszcze nasycone3, a następnie u myszy apoE -/- karmionych normalną dietą laboratoryjną4. Wiele ostatnich badań wykazało również, że AngII indukuje AAA u myszy normolipidemicznych5-7. Podejście polegające na podawaniu AngII zostało zastosowane do indukcji AAA i badania mechanizmów molekularnych, a także rozwoju potencjalnych strategii terapeutycznych (np. 5-15), ponieważ model ten podsumowuje wiele cech obserwowanych u ludzkich AAA. Na przykład czynniki ryzyka ludzkich AAA, takie jak palenie tytoniu, starzenie się i płeć męska, również zwiększają AAA indukowane przez AngII u myszy16,17. Związek hipercholesterolemii z AAA u ludzi wymaga wyjaśnienia. Jednak jest spójne, że hipercholesterolemia zwiększa AAA wywołane przez AngII u myszy18. Patologie AAA indukowane przez AngII u myszy są wysoce heterogenne i charakteryzują się głęboką infiltracją makrofagów, degradacją kolagenu, tworzeniem i ustępowaniem zakrzepicy oraz neowaskularyzacją19-21. W przeciwieństwie do najczęstszej lokalizacji podnerkowej aorty AAA u ludzi, AAA indukowane przez AngII u myszy występują w okolicy aorty nadnerczowej. Inną wszechobecną cechą tętniaków płuc wywołanych przez AngII jest przezścienne pęknięcie przyśrodkowe, prowadzące do przezściennej zakrzepicy. Nie jest jasne, czy przezścienne pęknięcie elastyny występuje u ludzi, ponieważ patologiczny rozwój AAA u ludzi nie był badany wyłącznie z powodu braku tkanek tętniaków we wcześniejszych stadiach.
Infuzja AngII u myszy prowadzi również do głębokiej ekspansji obszaru aorty piersiowej, która jest głównie ograniczona do aorty wstępującej, która jest najczęstszym regionem dla TAA u ludzi19,22-26. Podobnie jak AAA indukowane przez AngII, TAA indukowane podczas infuzji AngII również podsumowują wiele cech ludzkich TAA25. Jednak w przeciwieństwie do AAA indukowanych przez AngII, TAA indukowane przez AngII nie są związane z hipercholesterolemią i nie mają różnic między płciami.
Ogólnym celem podskórnej infuzji AngII u myszy jest zbadanie cech patologicznych i mechanizmów molekularnych AAA i TAA.

<table><tbody><tr><td>Angiotensyna II</td><td>Bachem</td><td>H-1705</td><td>związek stosowany do indukcji tętniaków aorty</td></tr><tr><td>Pompy osmotyczne Alzet</td><td>Corporation DURECT Corporation</td><td>Alzet Model 2004</td><td>możliwy do 28-dniowej infuzji u myszy o wadze > 20 g</td></tr><tr><td>Dieta wzbogacona w tłuszcze nasycone</td><td>Harlan Teklad</td><td>TD.88137</td><td>42% kalorii/kalorii w celu stymulacji hipercholesterolemii u myszy z receptorem LDL -/-</td></tr></tbody></table>

podskórny wlew angiotensyny ii za pomocą pomp osmotycznych indukuje tętniaki aorty u myszy

Subcutaneous Angiotensin II Infusion using Osmotic Pumps Induces Aortic Aneurysms in Mice

Pompy osmotyczne nieustannie dostarczają związki ze stałą prędkością do małych zwierząt. W artykule przedstawiono standardowy protokół stosowany do indukcji tętniaków aorty poprzez podskórną infuzję angiotensyny II (AngII) z wszczepionych pomp osmotycznych. Protokół ten obejmuje obliczenie ilości i rozpuszczenia AngII, napełnianie pompy osmotycznej, implantację pomp osmotycznych podskórnie, obserwację po implantacji pompy oraz pobranie aort w celu uwidocznienia tętniaków aorty u myszy. Podskórna infuzja AngII za pomocą pomp osmotycznych zgodnie z tym protokołem jest niezawodną i powtarzalną techniką wywoływania tętniaków aorty brzusznej i piersiowej u myszy. Czas trwania infuzji waha się od kilku dni do kilku miesięcy w zależności od celu badania. AngII 1,000 ng / kg / min jest wystarczające, aby zapewnić maksymalny wpływ na tworzenie się tętniaków aorty brzusznej w męskich modelach myszy z hipercholesterolemią, takich jak myszy z niedoborem apolipoproteiny E lub receptorem lipoprotein o niskiej gęstości. Częstość występowania tętniaków aorty brzusznej wywołanych infuzją AngII za pośrednictwem pomp osmotycznych jest 5 - 10 razy niższa u samic myszy z hipercholesterolemią, a także niższa u obu płci myszy z normocholesterolemią. Natomiast tętniaki aorty piersiowej wywołane przez AngII u myszy nie są hipercholesterolemią ani nie są zależne od płci. Co ważne, wiele cech tego mysiego modelu podsumowuje cechy ludzkich tętniaków aorty.

Opisane w sekcji Protokół 4 samce myszy LDL receptor -/- poddano eutanazji po 4 tygodniach infuzji AngII. Aorty zostały pobrane, oczyszczone i poddane obrazowaniu w celu wizualizacji poszerzeń aorty. Jak pokazano na Rysunku 3, aortą wykazują kilka różnych cech, w tym poszerzenie obszaru nadnerkowego (tętniaki brzuszne aortv, AAAs; Rysunek 3A), poszerzenie odcinka wstępującego (tętniaki piersiowe aorty, TAAs; Rysunek 3B) lub poszerzenie obu obszarów (obecność zarówno AAAs, jak i TAAs; Rysunek 3C), natomiast morfologia u jednej myszy była w dużym stopniu prawidłowa (Rysunek 3D). Poszerzenie aorty brzusznej ilościowo określono poprzez pomiar maksymalnej szerokości obszaru nadnerkowego ex vivo, co zilustrowano czerwoną linią na Rysunku 3A. Aby zmierzyć poszerzenie aorty wstępującej, aortą zostały przecięte i rozpięte, jak pokazano na Rysunku 4. Powierzchnię błony wewnętrznej zmierzono w obszarze aorty wstępującej (obszar otoczony czerwonymi liniami na Rysunku 4A), aby ilościowo ocenić TAAs. Na każdym zdjęciu umieszczono linijkę w celu standaryzacji pomiarów, co pokazano na Rysunkach 3 i 4.
<img alt="Moderator przepływu w systemie chromatograficznym, schemat z opisami, ilustrujący komponenty kontroli płynów." src="/files/ftp_upload/53191/53191fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Reprezentatywne zdjęcie napełnionej pompy osmotycznej. Każda pompa składa się z dwóch oddzielnych części: korpusu głównego oraz moderatora przepływu. Po napełnieniu korpusu pompy AngII, wprowadza się moderator przepływu w celu uszczelnienia pompy.
<img alt="Kroki procedury chirurgicznej u myszy z znieczuleniem, narzędziami chirurgicznymi i opieką pooperacyjną." src="/files/ftp_upload/53191/53191fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Proces chirurgicznej implantacji pompy. (A) Myszy umieszczono w komorze z laminarnym przepływem powietrza z maską nosową, przez którą stale uwalniany jest izofluran i tlen; (B) Prosty zacisk hemostatyczny wprowadzono do nacięcia skóry, aby utworzyć tunel podskórny; (C) Pompa została delikatnie wprowadzona przez nacięcie skóry; (D) Nacięcie skóry zszyto zszywkami po implantacji pompy.
<img alt="Schemat sekcji; przekroje tętnic AAA i TAA; porównanie anatomiczne; badanie nad układem naczyniowym." src="/files/ftp_upload/53191/53191fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Obrazy aorty (ex vivo) myszy poddanych infuzji AngII. AngII w dawce 1 000 ng/kg/min wlewano samcom myszy z knock-outem receptora LDL (-/-) przez 28 dni. (A) AAA z towarzyszącą zakrzepicą; czerwona linia (2,05 mm) wskazuje pomiar maksymalnej szerokości aorty w obszarze nadnerkowym. (B) Rozszerzenie aorty wstępującej (TAA) przy makroskopowo prawidłowej aorcie brzusznej; (C) Głębokie rozszerzenia zarówno w obszarze aorty wstępującej, jak i nadnerkowym (TAA oraz AAA); (D) makroskopowo prawidłowa aorta bez widocznego rozszerzenia w obszarze aorty wstępującej lub nadnerkowej.
<img alt="Eksperyment regeneracji nerwów: podzielona tkanka nerwowa przytwierdzona szpilkami z odnośnikiem skali, oznaczone A-D." src="/files/ftp_upload/53191/53191fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Obrazy en face obszarów aorty piersiowej u myszy z infuzją AngII. AngII w dawce 1,000 ng/kg/min podawano w infuzji samcom myszy z knockoutem receptora LDL (-/-) przez 28 dni. Powierzchnia obryzowana czerwoną linią reprezentuje obszar aorty wstępującej, w tym część łuku aorty.
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td colspan="2">Wymagana dawka</td>
			<td></td>
			<td>1,000</td>
			<td colspan="2">ng/kg/min</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td colspan="3">Masa ciała początkowa (największa mysz)</td>
			<td>24.8</td>
			<td>g</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td colspan="3">Całkowity szacowany przyrost masy ciała</td>
			<td>1</td>
			<td>g</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4</td>
			<td>Szybkość pompowania</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.25</td>
			<td>µl/hr</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5</td>
			<td colspan="2">Liczba myszy</td>
			<td></td>
			<td>4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6</td>
			<td colspan="2">Dawka na godzinę dla zwierzęcia</td>
			<td></td>
			<td>1518</td>
			<td>ng</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7</td>
			<td>Wymagane stężenie</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>6072</td>
			<td>ng/μl</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8</td>
			<td colspan="2">Dla 300 µl roztworu</td>
			<td></td>
			<td>1.82</td>
			<td colspan="2">mg/300 μl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td colspan="2">WYMAGANE ROZWIĄZANIE</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9</td>
			<td colspan="2">Całkowita ilość AngII (mg)</td>
			<td></td>
			<td>7.3</td>
			<td>mg </td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10</td>
			<td colspan="2">Rozpuszczone w soli fizjologicznej </td>
			<td></td>
			<td>1,200</td>
			<td>μl </td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td colspan="2"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mysz</td>
			<td>Masa ciała</td>
			<td>Współczynnik rozcieńczenia</td>
			<td colspan="2">Objętość (μl)</td>
			<td colspan="2">Masa pompy (g)</td>
			<td>Współczynnik wypełnienia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#</td>
			<td>(g)</td>
			<td></td>
			<td>AngII</td>
			<td>Sól fizjologiczna</td>
			<td>Puste</td>
			<td>Wypełniony</td>
			<td>(%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>24.5</td>
			<td>1.0</td>
			<td>296.4</td>
			<td>3.6</td>
			<td>1.1443</td>
			<td>1.3877</td>
			<td>99</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td>23.0</td>
			<td>0.9</td>
			<td>278.2</td>
			<td>21.8</td>
			<td>1.1677</td>
			<td>1.4145</td>
			<td>100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td>24.8</td>
			<td>1.0</td>
			<td>300.0</td>
			<td>0.0</td>
			<td>1.1438</td>
			<td>1.3904</td>
			<td>100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4</td>
			<td>21.8</td>
			<td>0.9</td>
			<td>263.7</td>
			<td>36.3</td>
			<td>1.1438</td>
			<td>1.3904</td>
			<td>100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="7">Współczynnik rozcieńczenia = masa ciała myszy/masa ciała największej myszy</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Mysz</td>
			<td>Masa ciała</td>
			<td>Współczynnik rozcieńczenia</td>
			<td colspan="2">Objętość (μl)</td>
			<td colspan="2">Masa pompy (g)</td>
			<td>Stopień wypełnienia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#</td>
			<td>(g)</td>
			<td></td>
			<td>AngII</td>
			<td>Sól fizjologiczna</td>
			<td>Pusty</td>
			<td>Wypełniony</td>
			<td>(%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>24.5</td>
			<td>1.0</td>
			<td>296.4</td>
			<td>3.6</td>
			<td>1.1443</td>
			<td>1.3877</td>
			<td>99</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td>23.0</td>
			<td>0.9</td>
			<td>278.2</td>
			<td>21.8</td>
			<td>1.1677</td>
			<td>1.4145</td>
			<td>100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td>24.8</td>
			<td>1.0</td>
			<td>300.0</td>
			<td>0.0</td>
			<td>1.1438</td>
			<td>1.3904</td>
			<td>100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4</td>
			<td>21.8</td>
			<td>0.9</td>
			<td>263.7</td>
			<td>36.3</td>
			<td>1.1438</td>
			<td>1.3904</td>
			<td>100</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Obliczenia dla 28-dniowej infuzji za pomocą pomp osmotycznych.

Podskórne wszczepianie pomp osmotycznych zapewnia wygodne podejście do długotrwałego i konsekwentnego dostarczania związków. Podejście to było szeroko stosowane do badania tętniaków aorty brzusznej i piersiowej u myszy.

Podskórny wlew angiotensyny II za pomocą pomp osmotycznych indukuje tętniaki aorty u myszy

Osmotic pumps continuously deliver compounds at a constant rate into small animals.  This article introduces a standard protocol used to induce aortic ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zbadanie cech patologicznych i mechanizmów molekularnych tętniaków aorty u myszy. Jest to realizowane poprzez przygotowanie pompy osmotycznej z roztworem angiotensyny II, a następnie wykonanie w skórze grzbietu zwierzęcia kieszonki, do której wprowadzana jest pompa.Ostatecznie rozszerzenie aorty w obszarach klatki piersiowej i jamy brzusznej można ocenić za pomocą obrazowania ex vivo. Wprowadziliśmy tę technikę w pierwszej kolejności, ponieważ chcieliśmy precyzyjnie określić rolę ciśnienia krwi podczas infuzji angiotensyny w celu stymulacji rozwoju miażdżycy. Procedurę napełniania pomp osmotycznych zaprezentują Deborah Hart i Angio banan, oboje członkowie Soha Cardiovascular Research Center.Zacznij od zapisania numeru partii pomp oraz moderatorów przepływu dołączonych do głównego korpusu pompy i przepływu. Podczas obsługi moderatorów załóż rękawice, aby uniknąć przeniesienia tłuszczu z dłoni na zewnętrzną obudowę pompy. Następnie otwórz tylko taką liczbę pomp i moderatorów przepływu, jaka jest niezbędna do przeprowadzenia badania.Następnie zważ każdą pompę, wliczając w to zarówno korpus główny, jak i moderator przepływu, odczytując wagę z dokładnością do czterech miejsc po przecinku. Waga ta, określona w szablonie jako waga pustej pompy, zostanie wykorzystana do obliczenia stopnia wypełnienia po zważeniu wszystkich pomp. Przymocuj igłę do napełniania pompy do sterylnej strzykawki o pojemności 1 cc i ostrożnie napełnij strzykawkę świeżo przygotowanym roztworem angiotensyny II z odpowiednio ponumerowanej plastikowej probówki.Ostrożnie usuń wszystkie pęcherzyki powietrza ze strzykawki, trzymając igłę skierowaną w dół. Następnie zachowaj strzykawkę w tej pozycji, aby zapobiec przedostaniu się pęcherzyków powietrza do pompy. Delikatnie wprowadź igłę napełniającą do korpusu pompy.Gdy igła znajdzie się na miejscu, wprowadź jej końcówkę do pompy, aż dotknie ona jej dna. Następnie powoli naciśnij tłok, aby podać około 246 µL roztworu. Ciemny cień wewnątrz pompy może służyć do monitorowania poziomu napełnienia.Pompa jest pełna. Gdy z pompy zacznie wypływać kropla cieczy, ostrożnie wyjmij igłę i włóż moderator przepływu do pompy przez otwór w górnej części korpusu pompy, aż między główką moderatora przepływu a górą korpusu pompy nie będzie widoczna żadna szczelina. Ostrożnie odsącz wszelkie nadmiary cieczy, które wyciekły w wyniku wkładania.Następnie zważ wypełnioną pompę i zapisz wynik w odpowiedniej komórce „weight filled” (waga wypełnionej) przy danej pompie w szablonie. Stopień wypełnienia można następnie obliczyć za pomocą wzoru, a uzyskane dane wpisać do komórki „filled ratio” (stopień wypełnienia) w szablonie. W idealnym przypadku stopień wypełnienia powinien wynosić 95% lub więcej. Po wypełnieniu pompy umieść ją w odpowiedniej sterylnej plastikowej probówce o pojemności 4 ml, głowicą moderatora skierowaną do góry, a następnie dodaj wystarczającą objętość sterylnej soli fizjologicznej, aby całkowicie zakryć pompę.Następnie, gdy wszystkie pompy zostaną zmagazynowane, należy umieścić probówki w inkubatorze w temperaturze 37°C na co najmniej 12 godzin, aby umożliwić częściowe przygotowanie pomp do pracy w dniu implantacji. Ubrani w fartuchy, maski i rękawiczki, należy ogolić obszar o wielkości ćwiartki monety nad łopatką znieczulzonej myszy i przenieść zwierzę do komory z laminarnym przepływem powietrza. Po nałożeniu maści do oczu zwierzęcia i potwierdzeniu braku reakcji na uszczypnięcie palca, należy przemyć i przetrzeć ogolony obszar Betadyną, a następnie trzykrotnie przetrzeć 70%etanolem.Następnie, używając wysterylizowanego w autoklawie skalpela chirurgicznego, wykonaj nacięcie skóry o długości jednego centymetra, prostopadle do ogona i za uchem, nad łopatką przedniej kończyny. Następnie, trzymając w jednej ręce pęsetę, rozszerz nacięcie za pomocą kleszczyków hemostatycznych. Drugą ręką wykonaj tunel podskórny, przesuwając końcówkę kleszczyków hemostatycznych w kierunku ogona.Ostrożnie rozchyl szczęki hemostatu, aby utworzyć przestrzeń dla pompy. Następnie zastąp hemostat odpowiednią pompą, pozycjonując głowicę moderatora z tyłu myszy, i delikatnie wsuń pompę całkowicie do otworu. Powinno pozostać wystarczająco dużo wolnej przestrzeni, aby zamknąć ranę bez napinania lub rozciągania skóry.Po umieszczeniu pompy na miejscu, mocno ściśnij i wyprostuj obie strony nacięcia, aby brzegi się zetknęły, a następnie zamknij skórę za pomocą jednego lub dwóch klipsów chirurgicznych. Sprawdź miejsce nacięcia, aby upewnić się, że rana jest całkowicie zamknięta i że pompa nie uciska bezpośrednio nacięcia. Następnie za pomocą czystego patyczka higienicznego nałóż na ten obszar miejscowy krem z lidokainą.Na koniec przenieś mysz na podkładkę grzewczą, aż odzyska przytomność, a następnie zwróć zwierzę do klatki. W tym eksperymencie, po czterech tygodniach infuzji angiotensyny II z pomp wszczepionych w sposób zaprezentowany powyżej, aorty pobrano od myszy z nokautem receptora lipoprotein o niskiej gęstości w celu wizualizacji poszerzeń aorty. Jak widać na obrazach, aorty wykazywały kilka różnych charakterystyk, w tym poszerzenie obszaru nadnerkowego, poszerzenie odcinka wstępującego lub poszerzenie obu tych obszarów, przy czym u jednej myszy stwierdzono morfologię w granicach normy.Następnie ilościowo określono poszerzenie aorty brzusznej, mierząc ex vivo maksymalną szerokość regionu senal, co zilustrowano czerwoną linią służącą do pomiaru poszerzenia aorty wstępującej. Aortę następnie otwarto i przypięto, jak pokazano na zdjęciu. Powierzchnię błony wewnętrznej zmierzono w obrębie aorty wstępującej za pomocą linijek widocznych na tym i kolejnych obrazach, aby zapewnić standaryzację pomiarów po opanowaniu techniki.Wykonanie tej procedury dla każdej próbki masy nie powinno zająć więcej niż pięć minut.

subcutaneous-angiotensin-ii-infusion-using-osmotic-pumps-induces

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Obrazowanie ultradźwiękowe stało się powszechną metodą określania wymiarów światła tętniaków aorty piersiowej i brzusznej u myszy. Protokół ten opisuje procedurę uzyskiwania wiarygodnych i powtarzalnych dwuwymiarowych obrazów ultrasonograficznych aorty wstępującej i brzusznej u myszy.

Obrazowanie ultrasonograficzne aorty piersiowej i brzusznej u myszy w celu określenia wymiarów tętniaka

Opisujemy protokół chirurgiczny mający na celu konsekwentne wywoływanie silnych tętniaków aorty piersiowej u myszy. Zabieg polega na tym, że torakotomia lewa strona, odsłonięcie aorty piersiowej i umieszczenie gąbki nasączonej elastazą trzustkową świni na ścianie aorty.

Mysi model chirurgiczny miejscowego tętniaka aorty piersiowej wywołanego elastazą

Ten nowatorski model tworzy silne tętniaki aorty podnerkowej u świń za pomocą kombinacji angioplastyki balonowej, perfuzji elastazy/kolagenazy, miejscowego stosowania elastazy i doustnego podawania związków β-aminopropionitrylu, które zakłócają sieciowanie kolagenu.

Świński model tętniaka aorty brzusznej

Obecny protokół opisuje ustandaryzowaną metodę chirurgiczną dla modelu AAA wywołanego elastazą poprzez bezpośrednie zastosowanie elastazy do przydanki podnerkowej aorty brzusznej u myszy.

Mysi model tętniaka aorty brzusznej indukowany przez okołonaczyniowe zastosowanie elastazy

Ten protokół opisuje kolejne wszczepianie pompy osmotycznej w celu wywołania tętniaka aorty brzusznej poprzez uwalnianie angiotensyny II u myszy z niedoborem apolipoproteiny E (ApoE) oraz portu dostępu naczyniowego z cewnikiem do żyły szyjnej w celu wielokrotnego leczenia farmakologicznego. Monitorowanie rozwoju tętniaka za pomocą ultrasonografii 3D jest skutecznie prowadzone pomimo implantów grzbietowych.

Leczenie farmakologiczne za pomocą cewnika do żyły centralnej w mysim modelu tętniaka aorty brzusznej indukowanego angiotensyną II i monitorowanie za pomocą ultradźwięków 3D

Ten protokół opisuje mysi model tętniaka aorty brzusznej (AAA) wywołanego fosforanem wapnia w celu zbadania cech patologicznych i mechanizmów molekularnych AAA.

Model tętniaka aorty brzusznej myszy wywołany fosforanem wapnia

Ten manuskrypt przedstawia protokół tworzenia mysiego modelu tętniaka aorty brzusznej myszy przy użyciu chlorku wapnia i elastazy, łącząc zalety poprzednich metod modelowania. Model ten można wykorzystać do badania mechanizmów patofizjologicznych leżących u podstaw tętniaków aorty brzusznej.

Mysi model tętniaka aorty brzusznej za pomocą okołoprzybytkowego nacieku chlorku wapnia i elastazy

Ten protokół opisuje metodyczne podejście chirurgiczne do modelowania zaawansowanych tętniaków aorty brzusznej u myszy poprzez kombinację bezpośredniego stosowania elastazy do aorty podnerkowej i podawania ß-aminopropionitrylu przez wodę pitną.

Zaawansowane modelowanie tętniaka aorty brzusznej u myszy poprzez połączenie miejscowej elastazy i doustnego ß-aminopropionitrylu

Protokół ten zapewnia szczegółową, krok po kroku procedurę indukcji rozwarstwienia aorty piersiowej u myszy. W szczególności obejmuje dokładne obliczenie wymaganych dawek β-aminopropionitrylu i angiotensyny II, procedurę napełniania pompy osmotycznej oraz technikę implantacji pompy osmotycznej.

Mysi model rozwarstwienia aorty piersiowej wywołanego doustną infuzją β-aminopropionitrylu i podskórnej angiotensyny II

Ten protokół zapewnia powtarzalną i niezawodną metodę wywoływania tętniaków tętnicy brzusznej (TTB) u myszy C57BL/6 przy użyciu uczulenia elastyny i przynaczynowego stosowania elastazy, jako model TTB, który obejmuje komponent uczulenia immunologicznego.

Wiarygodne stworzenie modelu tętniaka tętnicy brzusznej u myszy przy użyciu uczulenia na elastynę i peryvaskularnej elastazy

Poznaj metodę wlewu angiotensyny II za pomocą pomp osmotycznych do badania tętniaków aorty u myszy. Technika ta umożliwia ocenę patofizjologii naczyń krwionośnych in vivo.

Podskórny wlew angiotensyny II za pomocą pomp osmotycznych indukuje tętniaki aorty u myszy

Przeglądaj więcej filmów