Name: Różnicowanie ludzkiej linii komórkowej nerwiaka zarodkowego SH-SY5Y (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 7 s
Description: Poznaj metodę różnicowania komórek SH-SY5Y w neurony do zastosowań in vitro w neurobiologii i neurobiologii zakażeń. Protokół zapewnia powtarzalne uzyskiwanie jednorodnych kultur zdrowych neuronów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Jesteśmy wdzięczni za wkład Yolandy Tafuri w optymalizację warunków różnicowania SH-SY5Y oraz za wsparcie dr Lynn Enquist, w której laboratorium rozpoczęto tę pracę. Y. Tafuri przyczynił się do powstania obrazów pokazanych na rysunku 3. Prace te były wspierane przez NIH-NIAID Virus Pathogens Resource (ViPR), Bioinformatics Resource Center (MLS i L. Enquist) oraz K22 AI095384 (MLS).

1. Uwagi ogólne
<ol>
	<li>Zapoznaj się z Tabelą materiałów/wyposażenia, aby uzyskać listę niezbędnych odczynników. Wszystkie czynności należy wykonywać w ściśle określonych warunkach aseptycznych.</li>
	<li>Stosować inaktywowaną termicznie płodową surowicę bydlęcą (hiFBS) do wszystkich preparatów zawierających FBS. W celu inaktywacji termicznej należy ogrzać 50 ml porcji FBS w temperaturze 56 °C przez 30 minut, odwracając co 10 minut (patrz również Tabela 1). 
	Uwaga: Gdy FBS jest używany bez inaktywacji cieplnej, fenotyp podobny do nabłonka postępuje szybciej w kulturach komórek SH-SY5Y.</li>
	<li>Przed użyciem należy odczekać, aż podłoże ogrzeje się i zrównoważy w inkubatorze, aby ustalić odpowiednią równowagę pH przed każdym krokiem. Na przykład pełne zrównoważenie 50 ml pożywki zajmuje około godziny (pH 7, 37 °C, 5% CO2). 
	Uwaga: Ten protokół wykorzystuje dwuetapową procedurę podziału, która wymaga trypsynizacji i ponownego platerowania częściowo zróżnicowanych komórek SH-SY5Y. Jest to stresujący proces dla tych wyjątkowo delikatnych komórek. Dlatego ważne jest, aby inkubować komórki w trypsynie przez minimalny czas. Pozwoli to na preferencyjne uniesienie neuronów, pozostawiając komórki podobne do nabłonka nadal przyczepione do naczynia.</li>
	<li>Przeprowadzić powolne rozcieranie zróżnicowanych komórek za pomocą plastikowej pipety o pojemności 10 ml z końcówką przylegającą do dna stożkowej rurki zawierającej komórki. Wykonuj rozcieranie z małą prędkością, w górę iw dół nie więcej niż pięć razy.</li>
</ol>
2. Przejście kultur konserwacyjnych SH-SY5Y
<ol>
	<li>Podziel kultury podtrzymujące, gdy komórki osiągną 70-80% zbiegu i nie przekraczają 10 do 15 pasaży. Kultury zazwyczaj muszą być pasażowane co 3-5 dni (zakładając, że kultury nie są rozcieńczane więcej niż 5-krotnie podczas podziału).</li>
	<li>Aby przepuścić komórki z kolby T-75, odessać pożywkę, a następnie przepłukać około 10 ml 1x PBS. 
	Uwaga: Nie zalecamy dzielenia kultur konserwacyjnych SH-SY5Y dalej niż 1:5 podczas pasażu, ponieważ może to spowodować śmierć komórek z powodu niskiej konfluencji.</li>
	<li>Odessać PBS, a następnie dodać 2,5 ml 0,05% trypsyny-EDTA (1x).</li>
	<li>Inkubować w inkubatorze przez 2-3 minuty i delikatnie przechylić, aby uwolnić komórki z powierzchni kolby.</li>
	<li>Dodać 10 ml podstawowej pożywki wzrostowej (patrz Tabela 2) i rozcierać 1-2 razy.</li>
	<li>Wirować przez 2 minuty przy 1,000 x g, odessać pożywkę, a następnie ponownie zawiesić granulki w 5 ml podstawowej pożywki wzrostowej.</li>
	<li>Rozcieńczyć komórki w stosunku 1:3 do 1:5 w całkowitej objętości 20 ml w celu normalnego posiewu w kolbie T-75 lub policzenia i płytki w celu różnicowania (sekcja 5).</li>
</ol>
3. Zamrażanie komórek SH-SY5Y
<ol>
	<li>Zamroź wczesne pasaże komórek nerwiaka zarodkowego SH-SY5Y w podstawowych pożywkach wzrostowych uzupełnionych 5% (v/v) DMSO.</li>
	<li>Początkowo zamrozić podwielokrotności w temperaturze -80 °C przez 24 godziny, a następnie przenieść do ciekłego azotu w celu długotrwałego przechowywania. 
	Uwaga: Dla porównania, zlewająca się (75-85%) kolba T-75 da pięć 1 ml porcji komórek SH-SY5Y do zamrożenia. Każda z tych porcji powinna zawierać łącznie od 2 do 5 milionów komórek.</li>
</ol>
4. Rozmrażanie i hodowla niezróżnicowanych komórek nerwiaka zarodkowego SH-SY5Y
<ol>
	<li>Przygotuj podstawowe podłoża wzrostowe.</li>
	<li>Szybko rozmrozić zamrożone komórki w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C (około 2 min).</li>
	<li>Zawiesić komórki w 9 ml podstawowej pożywki wzrostowej w stożkowej probówce o pojemności 15 ml, a następnie odwirować przez 2 minuty przy 1 000 x g.</li>
	<li>Odessać supernatant, uważając, aby nie naruszyć granulowanych komórek, a następnie delikatnie zawiesić komórki w 10 ml podstawowej pożywki wzrostowej.</li>
	<li>Umieścić komórki w kolbie T-25 lub szalce o średnicy 60mm2.</li>
	<li>Następnego dnia wymień pożywkę, aby usunąć martwe komórki.</li>
</ol>
5. Dzień 0: Posiewanie komórek do różnicowania
<ol>
	<li>Rysunek 1 przedstawia schemat różnicowania.</li>
	<li>Przepłukać niezróżnicowane komórki 1x PBS, aspiratem, a następnie trypsynizować za pomocą 1-2 ml podgrzanego 1x 0,05% Trypsyny-EDTA.</li>
	<li>Gdy komórki znajdują się w trypszynie, inkubuj przez około 3 minuty w inkubatorze.</li>
	<li>Ugasić trypsynę, dodając 10 ml podstawowej pożywki wzrostowej, opłukać boki kolby lub naczynia i delikatnie rozcierać 1-3 razy. Przenieść zawartość do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Wirować przez 2 minuty przy 1,000 x g i zasysać pożywkę, uważając, aby nie naruszyć osadu.</li>
	<li>Zawiesić osad w 5 ml podstawowej pożywki wzrostowej i rozcierać 1-3 razy.</li>
	<li>Policz komórki za pomocą hemocytometru, a następnie rozcieńcz za pomocą podstawowej pożywki wzrostowej do 50 000 komórek/ml.</li>
	<li>Umieść na płytce 2 ml komórek na szalkę o średnicy 35 mm2, co daje łącznie 100 000 komórek na szalkę i umieść z powrotem w inkubatorze.</li>
</ol>
6. Dzień 1: Zmień media (Differentiation Media #1)
<ol>
	<li>Podać 50 ml pożywki różnicującej #1 (patrz Tabela 2) i inkubować w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Po podgrzaniu podłoża należy pozostawić je do zrównoważenia w inkubatorze (37 °C, 5% CO2 ) przez co najmniej jedną godzinę, aby ustalić właściwą równowagę pH przed użyciem.</li>
	<li>Dodaj kwas retinowy (RA) (patrz Tabela 1) do podgrzanych i zrównoważonych pożywek bezpośrednio przed dodaniem pożywki do potraw. 
	Uwaga: Kwas retinowy jest wrażliwy na światło i powinien być przechowywany w ciemnych butelkach w temperaturze 4 °C</li>
	<li>Delikatnie odessać stare podłoże i wyrzucić.</li>
	<li>Dodać 2 ml pożywki różnicującej #1 z RA na szalkę 35mm2 i ponownie umieścić w inkubatorze.</li>
</ol>
7. Dzień 3: Zmień media (Differentiation Media #1)
<ol>
	<li>Powtórz sekcję 6 (kroki 1-5)</li>
</ol>
8. Dzień 5: Zmień media (Differentiation Media #1)
<ol>
	<li>Powtórz sekcję 6 (kroki 1-5)</li>
</ol>
9. Dzień 7: Podział komórek 1:1
<ol>
	<li>Dodaj RA do podgrzanej i zrównoważonej pożywki różnicującej #1 bezpośrednio przed dodaniem pożywki do potraw.</li>
	<li>Delikatnie odessać stare podłoże i wyrzucić.</li>
	<li>Dodać 200 μl podgrzanego 0,05% 1x Trypsyna EDTA na 35 mm2 naczynie i ogrzać w inkubatorze około 2-3 minuty lub do momentu, gdy komórki zostaną wyraźnie podniesione z płytki, jak zaobserwowano pod mikroskopem.</li>
	<li>Ugasić trypsynę, dodając 2 ml pożywki różnicującej #1 z RA na 35 mm2 naczynie i użyć pożywki do wypłukania pozostałych komórek nerwowych z płytki. Następnie przenieść zawartość do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. 
	Uwaga: Podczas etapów trypsynizacji nie próbuj zbyt wielu potraw jednocześnie. Pomaga to zapewnić, że kultury neuronalne nie są zbyt długo inkubowane w trypszynie, która może być cytotoksyczna.</li>
	<li>Połącz zawartość z maksymalnie 10 szalek w stożkowej tubie o pojemności 50 ml i delikatnie rozcieraj powoli w górę i w dół nie więcej niż pięć razy za pomocą plastikowej pipety o pojemności 10 ml.</li>
	<li>Podwielokrotność 2 ml zawiesiny komórek przelać na świeże szalki o średnicy 35 mm2 i ponownie umieścić w inkubatorze.</li>
</ol>
10. Dzień 8: Zmień media (Differentiation Media #2)
<ol>
	<li>Dodać RA (patrz Tabela 1) do podgrzanych i zrównoważonych pożywek bezpośrednio przed dodaniem pożywki do potraw.</li>
	<li>Delikatnie odessać stare podłoże i wyrzucić.</li>
	<li>Powoli dodawać 2 ml pożywki różnicującej #2 (patrz Tabela 2) z RA na szalkę 35mm2 i wrócić do inkubatora. Nie pozwól, aby neurony były wystawione na działanie powietrza przez dłuższy czas, ponieważ mogą szybko wyschnąć.</li>
</ol>
11. Dzień 9: Przygotuj potrawy pokryte matrycą zewnątrzkomórkową (ECM)
<ol>
	<li>Rozmrozić jedną fiolkę roztworu ECM na lodzie i rozcieńczyć w stosunku 1:100 do zimnego DMEM.</li>
	<li>Dozuj 2 ml mieszanki do każdej naczynia o średnicy 35 mm2 i upewnij się, że cała podstawa naczynia jest przykryta.</li>
	<li>Umieścić w inkubatorze (37 °C, 5% CO2 ) na 1 godzinę lub na noc.</li>
	<li>Odessać mieszaninę i pozostawić do wyschnięcia na powietrzu przez około 1 godzinę w kapturze. Przechowywać w temperaturze pokojowej do 2 miesięcy.</li>
</ol>
12. Dzień 10: Przenieś komórki na płytki powlekane ECM 1:1
<ol>
	<li>Dodać RA (patrz Tabela 1) do podgrzanych i zrównoważonych pożywek bezpośrednio przed dodaniem pożywki do potraw.</li>
	<li>Delikatnie odessać podłoże i wyrzucić.</li>
	<li>Dodaj 200 μl podgrzanej trypsyny do każdej płytki o średnicy 35mm2 i pozostaw do inkubacji w temperaturze pokojowej przez około 1-2 minuty lub do momentu, gdy neurony zostaną widocznie wyjęte z naczynia, jak obserwowano pod mikroskopem. 
	Uwaga: Wykonaj ten etap trypsynizacji w temperaturze pokojowej, aby nie inkubować nadmiernie neuronów trypsyną i nie powodować uszkodzeń. Na tym etapie neurony uwalniają się z płytek znacznie szybciej niż komórki podobne do nabłonka.</li>
	<li>Ugasić trypsynę, dodając 2 ml pożywki różnicującej #2 na naczynie o średnicy 35mm2 i użyć pożywki do wypłukania pozostałych komórek nerwowych z płytki. Następnie przenieść zawartość do stożkowej probówki o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Połącz zawartość z maksymalnie 10 szalek w stożkowej tubie o pojemności 50 ml i delikatnie rozcieraj powoli w górę i w dół nie więcej niż pięć razy za pomocą plastikowej pipety o pojemności 10 ml.</li>
	<li>Dozować 2 ml zawiesiny komórkowej do szalek 35 mm2 z powłoką ECM i ponownie umieścić w inkubatorze.</li>
</ol>
13. Dzień 11: Zmień media (Differentiation Media #3)
<ol>
	<li>Dodać RA (patrz Tabela 1) do podgrzanych i zrównoważonych pożywek bezpośrednio przed dodaniem pożywki do potraw.</li>
	<li>Delikatnie odessać stare podłoże i wyrzucić.</li>
	<li>Powoli dodawać 2 ml pożywki różnicującej #3 (patrz Tabela 2) z RA na szalkę 35mm2 i ponownie umieścić w inkubatorze. Nie pozwól, aby neurony były wystawione na działanie powietrza przez dłuższy czas.</li>
</ol>
14. Dzień 14: Zmień media (Differentiation Media #3)
<ol>
	<li>Powtórz sekcję 13 (kroki 1-3)</li>
</ol>
15. Dzień 17: Ostatnia zmiana mediów (Media różnicujące #3)
<ol>
	<li>Powtórz sekcję 13 (kroki 1-3)</li>
</ol>
16. Dzień 18: Kultury neuronalne gotowe do użycia
<ol>
	<li>Zmieniaj pożywkę na nową Pożywkę różnicującą #3 z RZS co 3 dni, aby utrzymać zdrowie neuronów. 
	Uwaga: Komórki powinny być zróżnicowane w neurony i wykazywać fenotyp neuronalny. Hodowle są zazwyczaj stabilne do 14 dni po końcowym różnicowaniu, jednak czas żywotności neuronów zależy od liczby pasaży niezróżnicowanych komórek na początku różnicowania. Wyższa liczba pasaży daje zróżnicowane neurony o krótszym czasie użytkowania.</li>
</ol>

<ol><li>Christensen, J., Steain, M., Slobedman, B., Abendroth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiated+Neuroblastoma+Cells+Provide+a+Highly+Efficient+Model+for+Studies+of+Productive+Varicella-Zoster+Virus+Infection+of+Neuronal+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Differentiated Neuroblastoma Cells Provide a Highly Efficient Model for Studies of Productive Varicella-Zoster Virus Infection of Neuronal Cells.</a> Journal of Virology. 85 (16), 8436-8442 (2011).</li>
<li>Gimenez-Cassina, A., Lim, F., Diaz-Nido, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+a+human+neuroblastoma+into+neuron-like+cells+increases+their+susceptibility+to+transduction+by+herpesviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">Differentiation of a human neuroblastoma into neuron-like cells increases their susceptibility to transduction by herpesviral vectors.</a> Journal of Neuroscience Research. 84 (4), 755-767 (2006).</li>
<li>Biedler, J. L., Roffler-Tarlov, S., Schachner, M., Freedman, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+Neurotransmitter+Synthesis+by+Human+Neuroblastoma+Cell+Lines+and+Clones%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Multiple Neurotransmitter Synthesis by Human Neuroblastoma Cell Lines and Clones.</a> Cancer Research. 38 (11 Pt 1), 3751-3757 (1978).</li>
<li>Encinas, M., Iglesias, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+Treatment+of+SH-SY5Y+Cells+with+Retinoic+Acid+and+Brain-Derived+Neurotrophic+Factor+Gives+Rise+to+Fully+Differentiated%2C+Neurotrophic+Factor-Dependent%2C+Human+Neuron-Like+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Sequential Treatment of SH-SY5Y Cells with Retinoic Acid and Brain-Derived Neurotrophic Factor Gives Rise to Fully Differentiated, Neurotrophic Factor-Dependent, Human Neuron-Like Cells.</a> Journal of Neurochemistry. 75 (3), 991-1003 (2000).</li>
<li>Otey, C. A., Boukhelifa, M., Maness, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B35+neuroblastoma+cells%3A+an+easily+transfected%2C+cultured+cell+model+of+central+nervous+system+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">B35 neuroblastoma cells: an easily transfected, cultured cell model of central nervous system neurons.</a> Methods in Cell Biology. 71, 287-304 (2003).</li>
<li>LePage, K. T., Dickey, R. W., Gerwick, W. H., Jester, E. L., Murray, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+use+of+neuro-2a+neuroblastoma+cells+versus+intact+neurons+in+primary+culture+for+neurotoxicity+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">On the use of neuro-2a neuroblastoma cells versus intact neurons in primary culture for neurotoxicity studies.</a> Critical Reviews in Neurobiology. 17 (1), 27-50 (2005).</li>
<li>Shafer, T. J., Atchison, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmitter%2C+ion+channel+and+receptor+properties+of+pheochromocytoma+%28PC12%29+cells%3A+a+model+for+neurotoxicological+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicology%22%5BJournal%5D)">Transmitter, ion channel and receptor properties of pheochromocytoma (PC12) cells: a model for neurotoxicological studies.</a> Neurotoxicology. 12 (3), 473-492 (1991).</li>
<li>Yue, F., Cheng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+encyclopedia+of+DNA+elements+in+the+mouse+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A comparative encyclopedia of DNA elements in the mouse genome.</a> Nature. 515 (7527), 355-364 (2014).</li>
<li>Cheng, Y., Ma, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+regulatory+information+conservation+between+mouse+and+conservation+between+mouse+and+human%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Principles of regulatory information conservation between mouse and conservation between mouse and human.</a> Nature. 515 (7527), 371-375 (2014).</li>
<li>Stergachis, A. B., Neph, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conservation+of+trans-acting+circuitry+during+mammalian+regulatory+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Conservation of trans-acting circuitry during mammalian regulatory evolution.</a> Nature. 515 (7527), 365-370 (2014).</li>
<li>Lin, S., Lin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+transcriptional+landscapes+between+human+and+mouse+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Comparison of the transcriptional landscapes between human and mouse tissues.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (48), 17224-17229 (2014).</li>
<li>Coyle, D. E., Li, J., Baccei, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regional+Differentiation+of+Retinoic+Acid-Induced+Human+Pluripotent+Embryonic+Carcinoma+Stem+Cell+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Regional Differentiation of Retinoic Acid-Induced Human Pluripotent Embryonic Carcinoma Stem Cell Neurons.</a> PLoS ONE. 6 (1), e16174(2011).</li>
<li>Mostert, M. M., van de Pol, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+in+situ+hybridization-based+approaches+for+detection+of+12p+overrepresentation%2C+in+particular+i%2812p%29%2C+in+cell+lines+of+human+testicular+germ+cell+tumors+of+adults%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Genetics+and+Cytogenetics%22%5BJournal%5D)">Fluorescence in situ hybridization-based approaches for detection of 12p overrepresentation, in particular i(12p), in cell lines of human testicular germ cell tumors of adults.</a> Cancer Genetics and Cytogenetics. 87 (2), 95-102 (1996).</li>
<li>Hu, B. -Y., Weick, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+differentiation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+follows+developmental+principles+but+with+variable+potency%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Neural differentiation of human induced pluripotent stem cells follows developmental principles but with variable potency.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (9), 4335-4340 (2010).</li>
<li>Biedler, J. L., Helson, L., Spengler, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphology+and+growth%2C+tumorigenicity%2C+and+cytogenetics+of+human+neuroblastoma+cells+in+continuous+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Morphology and growth, tumorigenicity, and cytogenetics of human neuroblastoma cells in continuous culture.</a> Cancer Research. 33 (11), 2643-2652 (1973).</li>
<li>Påhlman, S., Ruusala, A. I., Abrahamsson, L., Mattsson, M. E., Esscher, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+acid-induced+differentiation+of+cultured+human+neuroblastoma+cells%3A+a+comparison+with+phorbolester-induced+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Retinoic acid-induced differentiation of cultured human neuroblastoma cells: a comparison with phorbolester-induced differentiation.</a> Cell Differentiation. 14 (2), 135-144 (1984).</li>
<li>Xie, H., Hu, L., Li, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SH-SY5Y+human+neuroblastoma+cell+line%3A+in+vitro+cell+model+of+dopaminergic+neurons+in+Parkinson%E2%80%99s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Chinese+Medical+Journal%22%5BJournal%5D)">SH-SY5Y human neuroblastoma cell line: in vitro cell model of dopaminergic neurons in Parkinson’s disease.</a> Chinese Medical Journal. 123 (8), 1086-1092 (2010).</li>
<li>Kovalevich, J., Langford, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Considerations+for+the+use+of+SH-SY5Y+neuroblastoma+cells+in+neurobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Considerations for the use of SH-SY5Y neuroblastoma cells in neurobiology.</a> Methods in Molecular Biology. 1078, Clifton, N.J. 9-21 (2013).</li>
<li>Påhlman, S., Hoehner, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+and+survival+influences+of+growth+factors+in+human+neuroblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Differentiation and survival influences of growth factors in human neuroblastoma.</a> European Journal of Cancer. 31 (4), 453-458 (1995).</li>
<li>Cheung, Y. -T., Lau, W. K. -W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+all-trans-retinoic+acid+on+human+SH-SY5Y+neuroblastoma+as+in+vitro+model+in+neurotoxicity+research%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicology%22%5BJournal%5D)">Effects of all-trans-retinoic acid on human SH-SY5Y neuroblastoma as in vitro model in neurotoxicity research.</a> Neurotoxicology. 30 (1), 127-135 (2009).</li>
<li>Agholme, L., Lindström, T., Kågedal, K., Marcusson, J., Hallbeck, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+model+for+neuroscience%3A+differentiation+of+SH-SY5Y+cells+into+cells+with+morphological+and+biochemical+characteristics+of+mature+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Alzheimer%27s+disease%3A+JAD%22%5BJournal%5D)">An in vitro model for neuroscience: differentiation of SH-SY5Y cells into cells with morphological and biochemical characteristics of mature neurons.</a> Journal of Alzheimer's disease: JAD. 20 (4), 1069-1082 (2010).</li>
<li>La Monica, N., Racaniello, V. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+replication+of+attenuated+and+neurovirulent+polioviruses+in+human+neuroblastoma+cell+line+SH-SY5Y%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Differences in replication of attenuated and neurovirulent polioviruses in human neuroblastoma cell line SH-SY5Y.</a> Journal of Virology. 63 (5), 2357-2360 (1989).</li>
<li>Cordey, S., Petty, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Site-Specific+Adaptations+Conferring+Increased+Neural+Cell+Tropism+during+Human+Enterovirus+71+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Identification of Site-Specific Adaptations Conferring Increased Neural Cell Tropism during Human Enterovirus 71 Infection.</a> PLoS Pathog. 8 (7), e1002826(2012).</li>
<li>Xu, L. -J., Jiang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+Transcriptomic+Analysis+of+Human+Neuroblastoma+Cells+in+Response+to+Enterovirus+Type+71+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Global Transcriptomic Analysis of Human Neuroblastoma Cells in Response to Enterovirus Type 71 Infection.</a> PLoS ONE. 8 (7), e65948(2013).</li>
<li>Luo, M. H., Fortunato, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+infection+and+shedding+of+human+cytomegalovirus+in+T98G+glioblastoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Long-term infection and shedding of human cytomegalovirus in T98G glioblastoma cells.</a> Journal of Virology. 81 (19), 10424-10436 (2007).</li>
<li>Sun, Z., Yang, H., Shi, Y., Wei, M., Xian, J., Hu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+a+cell+model+system+of+herpes+simplex+virus+type+II+latent+infection+and+reactivation+in+SH-SY5Y+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Wei+Sheng+Wu+Xue+Bao+%3D+Acta+Microbiologica+Sinica%22%5BJournal%5D)">Establishment of a cell model system of herpes simplex virus type II latent infection and reactivation in SH-SY5Y cells.</a> Wei Sheng Wu Xue Bao = Acta Microbiologica Sinica. 50 (1), 98-106 (2010).</li>
<li>Yun, S. -I., Song, B. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+molecularly+cloned%2C+live-attenuated+japanese+encephalitis+vaccine+SA14-14-2+virus%3A+a+conserved+single+amino+acid+in+the+ij+Hairpin+of+the+Viral+E+glycoprotein+determines+neurovirulence+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+pathogens%22%5BJournal%5D)">A molecularly cloned, live-attenuated japanese encephalitis vaccine SA14-14-2 virus: a conserved single amino acid in the ij Hairpin of the Viral E glycoprotein determines neurovirulence in mice.</a> PLoS pathogens. 10 (7), e1004290(2014).</li>
<li>Garrity-Moses, M. E., Teng, Q., Liu, J., Tanase, D., Boulis, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroprotective+adeno-associated+virus+Bcl-xL+gene+transfer+in+models+of+motor+neuron+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+%26+Nerve%22%5BJournal%5D)">Neuroprotective adeno-associated virus Bcl-xL gene transfer in models of motor neuron disease.</a> Muscle & Nerve. 32 (6), 734-744 (2005).</li>
<li>Kalia, M., Khasa, R., Sharma, M., Nain, M., Vrati, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Japanese+Encephalitis+Virus+Infects+Neuronal+Cells+through+a+Clathrin-Independent+Endocytic+Mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Japanese Encephalitis Virus Infects Neuronal Cells through a Clathrin-Independent Endocytic Mechanism.</a> Journal of Virology. 87 (1), 148-162 (2013).</li>
<li>Haedicke, J., Brown, C., Naghavi, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+brain-specific+factor+FEZ1+is+a+determinant+of+neuronal+susceptibility+to+HIV-1+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">The brain-specific factor FEZ1 is a determinant of neuronal susceptibility to HIV-1 infection.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (33), 14040-14045 (2009).</li>
<li>Xu, K., Liu, X. -N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication-defective+HSV-1+effectively+targets+trigeminal+ganglion+and+inhibits+viral+pathopoiesis+by+mediating+interferon+gamma+expression+in+SH-SY5Y+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+molecular+neuroscience%3A+MN%22%5BJournal%5D)">Replication-defective HSV-1 effectively targets trigeminal ganglion and inhibits viral pathopoiesis by mediating interferon gamma expression in SH-SY5Y cells.</a> Journal of molecular neuroscience: MN. 53 (1), 78-86 (2014).</li>
<li>Oh, J., Fraser, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+association+of+the+herpes+simplex+virus+genome+with+histone+proteins+during+a+lytic+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Temporal association of the herpes simplex virus genome with histone proteins during a lytic infection.</a> Journal of Virology. 82 (7), 3530-3537 (2008).</li>
<li>Stiles, K. M., Milne, R. S. B., Cohen, G. H., Eisenberg, R. J., Krummenacher, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+herpes+simplex+virus+receptor+nectin-1+is+down-regulated+after+trans-interaction+with+glycoprotein+D%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">The herpes simplex virus receptor nectin-1 is down-regulated after trans-interaction with glycoprotein D.</a> Virology. 373 (1), 98-111 (2008).</li>
<li>Thomas, D. L., Lock, M., Zabolotny, J. M., Mohan, B. R., Fraser, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+2-kilobase+intron+of+the+herpes+simplex+virus+type+1+latency-associated+transcript+has+a+half-life+of+approximately+24+hours+in+SY5Y+and+COS-1+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">The 2-kilobase intron of the herpes simplex virus type 1 latency-associated transcript has a half-life of approximately 24 hours in SY5Y and COS-1 cells.</a> Journal of Virology. 76 (2), 532-540 (2002).</li>
<li>Handler, C. G., Cohen, G. H., Eisenberg, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-linking+of+glycoprotein+oligomers+during+herpes+simplex+virus+type+1+entry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Cross-linking of glycoprotein oligomers during herpes simplex virus type 1 entry.</a> Journal of Virology. 70 (9), 6076-6082 (1996).</li>
<li>Nicola, A. V., Hou, J., Major, E. O., Straus, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herpes+Simplex+Virus+Type+1+Enters+Human+Epidermal+Keratinocytes%2C+but+Not+Neurons%2C+via+a+pH-Dependent+Endocytic+Pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Herpes Simplex Virus Type 1 Enters Human Epidermal Keratinocytes, but Not Neurons, via a pH-Dependent Endocytic Pathway.</a> Journal of Virology. 79 (12), 7609-7616 (2005).</li>
<li>Korecka, J. A., van Kesteren, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+characterization+of+retinoic+acid+differentiated+SH-SY5Y+cells+by+transcriptional+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Phenotypic characterization of retinoic acid differentiated SH-SY5Y cells by transcriptional profiling.</a> PloS One. 8 (5), e63862(2013).</li>
<li>Presgraves, S. P., Ahmed, T., Borwege, S., Joyce, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Terminally+differentiated+SH-SY5Y+cells+provide+a+model+system+for+studying+neuroprotective+effects+of+dopamine+agonists%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicity+Research%22%5BJournal%5D)">Terminally differentiated SH-SY5Y cells provide a model system for studying neuroprotective effects of dopamine agonists.</a> Neurotoxicity Research. 5 (8), 579-598 (2004).</li>
<li>Qiao, J., Paul, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PI3K%2FAKT+and+ERK+regulate+retinoic+acid-induced+neuroblastoma+cellular+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">PI3K/AKT and ERK regulate retinoic acid-induced neuroblastoma cellular differentiation.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 424 (3), 421-426 (2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Powyższy protokół zapewnia prostą i powtarzalną metodę generowania jednorodnych i żywotnych kultur neuronów ludzkich. Protokół ten wykorzystuje techniki i praktyki, które integrują kilka wcześniej opublikowanych metod1-4 i mają na celu nakreślenie najlepszych praktyk każdej z nich. Różnicowanie komórek SH-SY5Y polega na stopniowym deprywacji surowicy; dodanie kwasu retinowego, czynników neurotroficznych i białek macierzy zewnątrzkomórkowej; i szeregowe dzielenie w celu wyselekcjonowania zróżnicowanych dojrzały...

Możliwość korzystania z systemów modelowych in vitro znacznie wzbogaciła dziedziny neurobiologii i neuronauk. Komórki w hodowli stanowią skuteczną platformę do charakteryzowania funkcjonalności białek i mechanizmów molekularnych leżących u podstaw określonych zjawisk, do zrozumienia patologii choroby i infekcji oraz do przeprowadzania wstępnych ocen testów leków. W neurobiologii główne typy modeli hodowli komórkowych obejmują pierwotne hodowle neuronów pochodzące od szczurów i myszy oraz linie komórkowe nerwiaka zarodkowego, takie jak komórki B35 szczura5, komórki myszy Neuro-2A6 i komórki PC12 szczura7. Chociaż zastosowanie takich linii komórkowych znacznie posunęło naprzód tę dziedzinę, istnieje kilka czynników zakłócających związanych z obchodzeniem się z komórkami i tkankami innymi niż ludzie. Obejmują one zrozumienie specyficznych dla gatunku różnic w procesach metabolicznych, fenotypach manifestacji choroby i patogenezie w porównaniu z ludźmi. Ważne jest również, aby zauważyć, że istnieją znaczące różnice między ekspresją genów myszy i ludzi a sygnalizacją czynnika transkrypcyjnego, co podkreśla ograniczenia modeli gryzoni i znaczenie zrozumienia, które szlaki są zachowane między gryzoniami a ludźmi8-11. Inne wykorzystały ludzkie linie komórek nerwowych, w tym ludzką linię komórkową N-Tera-2 (NT2) i indukowalne pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC). Te linie komórkowe stanowią dobre modele dla ludzkich systemów in vitro. Jednak różnicowanie komórek NT2 kwasem retinowym (RA) powoduje powstanie mieszanej populacji neuronów, astrocytów i promienistych komórek glejowych12, co wymaga dodatkowego etapu oczyszczania w celu uzyskania czystych populacji neuronów. Ponadto komórki NT2 wykazują bardzo zmienny kariotyp13, z ponad 60 chromosomami w 72% komórek. Komórki iPS wykazują zmienność w różnicowaniu między różnymi liniami komórkowymi i różnią się pod względem skuteczności różnicowania14. W związku z tym pożądane jest posiadanie spójnego i powtarzalnego modelu ludzkiej komórki neuronalnej, który uzupełni te alternatywy.
Komórki podobne do neuroblastów SH-SY5Y są subklonem rodzicielskiej linii komórkowej neuroblastoma SK-N-SH. Rodzicielska linia komórkowa została wygenerowana w 1970 roku z biopsji szpiku kostnego, która zawiera zarówno komórki podobne do neuroblastów, jak i nabłonka15. Komórki SH-SY5Y mają stabilny kariotyp składający się z 47 chromosomów i mogą być różnicowane ze stanu podobnego do neuroblastów do dojrzałych ludzkich neuronów za pomocą wielu różnych mechanizmów, w tym użycia RZS, estrów forbolu i specyficznych neurotrofin, takich jak neurotroficzny czynnik pochodzenia mózgowego (BDNF). Wcześniejsze dowody sugerują, że zastosowanie różnych metod może selekcjonować określone podtypy neuronów, takie jak neurony adrenergiczne, cholinergiczne i dopaminergiczne16,17. Ten ostatni aspekt sprawia, że komórki SH-SY5Y są przydatne w wielu eksperymentach neurobiologicznych.
Kilka badań wykazało istotne różnice między komórkami SH-SY5Y w ich niezróżnicowanym i zróżnicowanym stanie. Kiedy komórki SH-SY5Y są niezróżnicowane, szybko się namnażają i wydają się być niespolaryzowane, z bardzo nielicznymi, krótkimi procesami. Często rosną w kępkach i wyrażają markery wskazujące na niedojrzałe neurony18,19. Po różnicowaniu komórki te wydłużają długie, rozgałęzione procesy, zmniejszają proliferację, a w niektórych przypadkach polaryzują2,18. Wcześniej wykazano, że w pełni zróżnicowane komórki SH-SY5Y wyrażają wiele różnych markerów dojrzałych neuronów, w tym białko związane ze wzrostem (GAP-43), jądra neuronalne (NeuN), synaptofizynę (SYN), białko pęcherzyków synaptycznych II (SV2), enolazę specyficzną dla neuronów (NSE) i białko związane z mikrotubulami (MAP)2,16,17,20 oraz brak ekspresji markerów glejowych, takich jak kwaśne białko fibrylarne gleju (GFAP)4. Na poparcie tezy, że zróżnicowane komórki SH-SY5Y reprezentują jednorodną populację neuronów, usunięcie BDNF powoduje apoptozę komórkową4. Sugeruje to, że przeżycie zróżnicowanych komórek SH-SY5Y zależy od czynników troficznych, podobnie jak w przypadku dojrzałych neuronów.
Użycie komórek SH-SY5Y wzrosło od czasu powstania subklonu w 1978 roku3. Niektóre przykłady ich zastosowania obejmują badanie choroby Parkinsona17, choroby Alzheimera21 oraz patogenezy infekcji wirusowych, w tym wirusa polio22, enterowirusa 71 (EV71)23,24, wirusa ospy wietrznej i półpaśca (VZV)1, ludzkiego wirusa cytomegalii25 i wirusa opryszczki pospolitej (HSV)2,26. Należy zauważyć, że w kilku badaniach z wykorzystaniem komórek SH-SY5Y wykorzystano te komórki w ich niezróżnicowanej formie, zwłaszcza w dziedzinie neurowirusologii27-36. Różnica w obserwowanym fenotypie niezróżnicowanych i zróżnicowanych komórek SH-SY5Y rodzi pytanie, czy obserwowany postęp infekcji byłby różny w dojrzałych zróżnicowanych neuronach. Na przykład zróżnicowane komórki SH-SY5Y mają wyższą skuteczność wychwytu HSV-1 w porównaniu z niezróżnicowanymi, proliferującymi komórkami SH-SY5Y, co może wynikać z braku receptorów powierzchniowych, które wiążą HSV i modulują wejście na niezróżnicowanych komórkach SH-SY5Y2. Dlatego tak ważne jest, aby podczas projektowania eksperymentu skoncentrowanego na testowaniu neuronów in vitro, komórki SH-SY5Y zostały zróżnicowane w celu uzyskania najdokładniejszych wyników translacji i porównania z modelami in vivo.
Opracowanie niezawodnej metody generowania kultur ludzkich neuronów jest niezbędne, aby umożliwić badaczom przeprowadzanie eksperymentów translacyjnych, które dokładnie modelują ludzki układ nerwowy. Przedstawiony tutaj protokół jest procedurą, która określa najlepsze praktyki wywodzące się z poprzednich metod1-4 w celu wzbogacenia ludzkich neuronów, które są różnicowane za pomocą kwasu retinowego.

<table><tbody><tr><td>B-27</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>17504-044</td><td>Zobacz Tabela 1 w celu przygotowania</td></tr><tr><td>czynnika neurotroficznego pochodzenia mózgowego (BDNF)</td><td>Sigma</td><td>SRP3014 (10 &mu; g)/B3795 (5 &mu; g)</td> <td>Patrz Tabela 1 dla przygotowania</td></tr><tr><td>cyklicznego AMP dibutyrylu (db-cAMP)</td><td>Sigma</td><td>D0627</td><td>Zobacz Tabela 1 dla przygotowania</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>ATCC</td><td>4-X-Minimum</td><td></td></tr> <tr><td>Essential Medium Eagle (EMEM)</td><td>Sigma</td><td>M5650-Płodowa</td><td></td></tr> <tr><td>surowica bydlęca (FBS)&nbsp;</td><td>Hyclon</td><td>SH30071.03</td><td>Patrz Tabela 1 Aby uzyskać informacje na temat przygotowania</td></tr><tr><td>GlutamaxI</td><td>Life Technologies</td><td>35050-061-Glutamina</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Hyclon</td><td>SH30034.01-Chlorek</td><td></td></tr> <tr><td>potasu (KCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP366-1</td><td>Patrz Tabela 1 w</td></tr><tr><td>celu przygotowania roztworu MaxGel Extracellular Matrix (ECM)</td><td>Sigma</td><td>E0282</td><td>Patrz krok 11 protokołu</td></tr><tr><td>Neurobasal</td><td>Life Technologies</td><td>21103-049-Penicylina</td><td></td></tr><tr><td>/Streptomycyna (Pen/Strep)</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122-Kwas</td><td></td></tr> <tr><td>retinowy (RA)</td><td>Sigma</td><td>R2625</td><td>Powinien być przechowywany w ciemności w temperaturze 4 & stopni; C, ponieważ ten odczynnik jest światłoczuły</td></tr><tr><td>Komórki SH-SY5Y</td><td>ATCC</td><td>CRL-2266-0,5</td><td></td></tr><tr><td>% Trypsyna + EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>15400-054-Falcon</td><td></td></tr> <tr><td>35 mm TC naczynia Falcon</td><td>(marka Corning)</td><td>353001</td><td>-</td></tr></tbody></table>

różnicowanie ludzkiej linii komórkowej nerwiaka zarodkowego sh-sy5y

Differentiation of the SH-SY5Y Human Neuroblastoma Cell Line

Posiadanie odpowiednich systemów in vivo i in vitro, które dostarczają modeli translacyjnych dla ludzkich chorób, jest integralnym aspektem badań w neurobiologii i neuronaukach. Tradycyjne modele eksperymentalne in vitro stosowane w neurobiologii obejmują pierwotne hodowle neuronów od szczurów i myszy, linie komórkowe nerwiaka zarodkowego, w tym szczurze komórki B35 i mysie komórki Neuro-2A, szczurze komórki PC12 i krótkoterminowe hodowle warstwowe. Chociaż wielu badaczy opiera się na tych modelach, brakuje w nich komponentu ludzkiego, a zaobserwowane efekty eksperymentalne mogą dotyczyć wyłącznie poszczególnych gatunków i mogą nie występować identycznie u ludzi. Dodatkowo, chociaż komórki te są neuronami, mogą mieć niestabilne kariotypy, co sprawia, że ich wykorzystanie jest problematyczne w badaniach ekspresji genów i odtwarzalnych badaniach sygnalizacji komórkowej. Dlatego ważne jest opracowanie bardziej spójnych modeli chorób neurologicznych u ludzi. 
Poniższa procedura opisuje łatwą do naśladowania, powtarzalną metodę uzyskiwania jednorodnych i żywotnych kultur ludzkich neuronów, poprzez różnicowanie chromosomalnie stabilnej ludzkiej linii komórkowej nerwiaka zarodkowego, SH-SY5Y. Metoda ta integruje kilka wcześniej opisanych metod1-4 i opiera się na sekwencyjnym usuwaniu surowicy z pożywki. Oś czasu obejmuje stopniowe głodzenie surowicy, z wprowadzeniem białek macierzy zewnątrzkomórkowej i czynników neurotroficznych. Pozwala to neuronom różnicować się, podczas gdy komórki nabłonkowe są selekcjonowane względem siebie, co skutkuje jednorodną kulturą neuronalną. Reprezentatywne wyniki wskazują na pomyślne różnicowanie komórek nerwiaka zarodkowego SH-SY5Y z początkowego fenotypu komórek podobnych do nabłonka w bardziej ekspansywny i rozgałęziony fenotyp neuronalny. Protokół ten oferuje niezawodny sposób generowania jednorodnych populacji kultur neuronalnych, które można wykorzystać do późniejszych analiz biochemicznych i molekularnych, co zapewnia naukowcom dokładniejszy model translacyjny infekcji i chorób u ludzi.

Obecnie w dziedzinie neurobiologii i neurovirologii istnieje wiele przypadków, w których niedróżnicowane komórki SH-SY5Y są wykorzystywane jako funkcjonalny model neuronów ludzkich27-36, przy czym istotne jest, że komórki niedróżnicowane mogą nie wykazywać takich fenotypów, jak optymalne pobieranie wirusów2, które są niezbędne do dokładnej interpretacji wyników. Jest niezwykle ważne, aby podczas stosowania komórek SH-SY5Y lub jakiegokolwiek innego systemu neuronalnego in vitro komórki zosta...

W neurobiologii i neurowirusologii kluczowe jest posiadanie niezawodnego, powtarzalnego systemu in vitro, który służy jako model translacyjny dla tego, co dzieje się in vivo w ludzkich neuronach. Protokół ten opisuje, jak hodować i różnicować ludzkie komórki nerwiaka zarodkowego SH-SY5Y w żywotne neurony do wykorzystania w zastosowaniach in vitro.

Różnicowanie ludzkiej linii komórkowej nerwiaka zarodkowego SH-SY5Y

Having appropriate in vivo and in vitro systems that provide translational models for human disease is an integral aspect of research in neurobiology and ...

Ogólnym celem niniejszego protokołu jest dostarczenie neurobiologom i neurovirologom prostego, powtarzalnego sposobu generowania zróżnicowanych ludzkich neuronów do wykorzystania w późniejszych badaniach in vitro. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w badaniach nad chorobami zakaźnymi, takich jak określenie reakcji neuronalnych na infekcję lub leczenie farmakologiczne. Może ona również służyć do oceny zmian proteomicznych lub genomicznych związanych z określonymi warunkami eksperymentalnymi.Główną zaletą tej techniki jest to, że zapewnia ona łatwy do naśladowania protokół, który w sposób powtarzalny pozwala uzyskać jednorodne kultury w pełni zróżnicowanych neuronów ludzkich. Zazwyczaj osoby początkujące w tej metodzie mogą napotkać trudności ze względu na wrażliwość tych komórek na zaburzenia, takie jak trypsynizacja, tytracja lub ekspozycja na nieoptymalne warunki środowiskowe. Aby rozpocząć tę procedurę, należy pozwolić pożywkom ogrzać się i wyrównać temperaturę w inkubatorze, aby przed użyciem ustalić odpowiedni poziom pH.Następnie przeprowadź pasaż kultur w fazie utrzymania, gdy komórki osiągną 70 do 80% konfluencji. Aby przenieść komórki z kolby T-

differentiation-of-the-sh-sy5y-human-neuroblastoma-cell-line

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Niniejszy protokół opisuje izolację, wzbogacanie i utrzymanie komórek macierzystych nowotworu medulloblastoma pochodzących od mutantowych myszy z ektopową aktywnością szlaku Sonic hedgehog.

Izolacja, namnażanie i utrzymanie komórek macierzystych medulloblastomy

Opracowaliśmy protokół indukcji neuroblastów bezpośrednio z pluripotencjalnych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych utrzymywanych w ściśle określonych warunkach z zastosowaniem małych cząsteczek, co umożliwia pozyskanie dużej ilości ludzkich progenitorów neuronalnych oraz typów komórek neuronalnych rozwijającego się OUN w celu regeneracji tkanki nerwowej.

Efektywne wyprowadzanie ludzkich progenitorów neuronalnych i neuronów z pluripotencjalnych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych z zastosowaniem indukcji małymi cząsteczkami

Niniejszy protokół wideo demonstruje nową metodę generowania i następnego oczyszczania neuronalnych komórek progenitorowych z odnawialnego źródła neuralnych komórek macierzystych (NSCs) w oparciu o ich właściwości fizyczne (rozmiar i ziarnistość wewnętrzną) oraz fluorescencyjne, z wykorzystaniem technologii cytometrii przepływowej.

Analiza neuroblastów: metoda generowania i wzbogacania populacji neuronalnych komórek progenitorowych z różnicujących się potomków neuronalnych komórek macierzystych z wykorzystaniem cytometrii przepływowej

W tym filmie przeprowadzamy test fagocytozy mikrogleju na nerwiaka zarodkowego przy użyciu indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych. Test pomaga ocenić upośledzenie funkcji mikrogleju w chorobach neurodegeneracyjnych.

Test fagocytozy mikrogleju: test in vitro w celu ustalenia modelu fagocytozy mikrogleju dla komórek nerwiaka zarodkowego przy użyciu makrofagów iPSC

Ten film demonstruje technikę przekształcania niezróżnicowanych komórek nerwiaka zarodkowego SH-SY5Y w pełni zróżnicowane dojrzałe neurony za pomocą techniki systematycznego pasażowania. Polega to na hodowli komórek w serii pożywek ze stopniowo zmniejszającymi się poziomami w surowicy w celu zahamowania proliferacji komórek podobnych do nabłonka, jednocześnie promując różnicowanie i proliferację komórek podobnych do neuronów. Dodatkowo pożywka jest uzupełniana kwasem retinowym i specyficznymi...

Różnicowanie ludzkiej linii komórkowej nerwiaka zarodkowego w dojrzałe neurony

Ten artykuł przedstawia metodę badania dynamiki pęcherzyków neuroprzekaźników w komórkach neuroblastoma, przy użyciu konstruktu synaptobrevin2-pHluorin i mikroskopii fluorescencyjnej całkowitego wewnętrznego odbicia. Przedstawiono również opracowaną strategię przetwarzania obrazów i analizy danych.

Sondy GFP TIRFM i pH do oceny dynamiki pęcherzyków neuroprzekaźników w komórkach nerwiaka zarodkowego SH-SY5Y: obrazowanie komórek i analiza danych

Z zamiarem scharakteryzowania zmian w miRNA na zróżnicowanych ludzkich nerwowych komórkach macierzystych (hNSC) opisujemy różnicowanie hNSC w systemie trójwymiarowym, ocenę zmian w ekspresji mikroRNA za pomocą macierzy miRNA PCR oraz analizę obliczeniową do przewidywania celu miRNA i jego walidacji za pomocą testu podwójnej lucyferazy.

Różnicowanie ludzkiej linii nerwowych komórek macierzystych w hodowlach trójwymiarowych, analiza mikroRNA i przypuszczalnych genów docelowych

To badanie przedstawia i opisuje protokoły do uzyskania dwóch specyficznych ludzkich organoidów nerwowych jako odpowiedniego i dokładnego modelu do badania: 1) rozwoju glejaka u człowieka w obrębie ludzkich organoidów nerwowych wyłącznie u ludzi oraz 2) różnicowania dopaminergicznego neuronów generującego trójwymiarowy organoid.

Ludzkie organoidy nerwowe do badania raka mózgu i chorób neurodegeneracyjnych

Przedstawiony tutaj jest protokół generowania jednokomórkowej hodowli ludzkich embrionalnych komórek macierzystych i ich późniejszego różnicowania w neuronalne komórki progenitorowe. Protokół jest prosty, solidny, skalowalny i odpowiedni do badań przesiewowych leków i zastosowań w medycynie regeneracyjnej.

Efektywne różnicowanie neuronalne przy użyciu hodowli jednokomórkowej ludzkich embrionalnych komórek macierzystych

W tym protokole opisujemy stabilną, wysoce efektywną strategię różnicowania do generowania postganglionowych neuronów współczulnych z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych. Model ten sprawi, że neurony będą dostępne do wykorzystania w badaniach nad wieloma zaburzeniami autonomicznymi.

Skuteczne różnicowanie zazwojowych neuronów współczulnych przy użyciu ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w warunkach hodowli bez karmienia i zdefiniowanych chemicznie

Choroby neurodegeneracyjne są związane z rozregulowanymi funkcjami mikrogleju. W artykule przedstawiono test in vitro fagocytozy komórek nerwiaka zarodkowego za pomocą makrofagów iPSC. Odczyty z mikroskopii ilościowej opisano zarówno dla obrazowania poklatkowego żywych komórek, jak i obrazowania o wysokiej zawartości komórek stałych.

Test obrazowania ilościowego in vitro na fagocytozę martwych komórek nerwiaka zarodkowego za pomocą makrofagów iPSC

Poznaj metodę różnicowania komórek SH-SY5Y w neurony do zastosowań in vitro w neurobiologii i neurobiologii zakażeń. Protokół zapewnia powtarzalne uzyskiwanie jednorodnych kultur zdrowych neuronów.

Różnicowanie ludzkiej linii komórkowej nerwiaka zarodkowego SH-SY5Y

Przeglądaj więcej filmów