Name: Klasyczne kondycjonowanie mrugnięcia oczami sygnalizowane wąsem u myszy z głową (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 14 s
Description: Poznaj metodę kondycjonowania mrugnięcia oczami sygnalizowanego wąsem u myszy z głową. Technika ta umożliwia badanie mechanizmów uczenia się i pamięci przy użyciu obrazowania wapnia i elektrofizjologii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została sfinansowana przez Departament Obrony (W81XWH-13-01-0243) i Narodowe Instytuty Zdrowia (R37 AG008796). Dziękujemy Alanowi Bakerowi z warsztatu mechanicznego Uniwersytetu Northwestern za zbudowanie aparatu z cylindrem mocowanym na głowicy. Dziękujemy dr Shoai Hattori za jego wskazówki w zakresie MATLAB i Solidworks. Dziękujemy dr Johnowi Powerowi za oprogramowanie LabView, które kontrolowało eksperyment.

Wszystkie procedury z udziałem myszy zostały przeprowadzone zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Northwestern na podstawie wytycznych wydanych przez National Institute of Health.
1. Cylinder (Rysunek 2A)
<ol>
	<li>Zbuduj cylinder zgodnie z opisem Chettiha i wsp. oraz Heineya i wsp. z długiego cylindra piankowego14-15. Wytnij cylinder o długości 10 cm i wywierć otwór w środku, aby pasował do osi, metalowego pręta o średnicy 12.7 mm (0.5 cala). Zamontuj cylinder osią na metalowej płytce stykowej optycznej, jak opisano przez Heineya i wsp., lub innym wsporniku (np. Plexi)15.</li>
	<li>Postaw dwa pionowe metalowe pręty o średnicy 12,7 mm po obu stronach cylindra.</li>
	<li>Przymocuj dwa mocowania pod kątem prostym do metalowych prętów.</li>
	<li>Zamocuj dwa dodatkowe pręty (5 cm długości, 12,7 mm średnicy) przez mocowania pod kątem prostym. Ukosuj końce tych prętów i wypoziomuj ich końce powyżej środka cylindra (rysunek 2G).</li>
	<li>Wywierć i nagwintuj otwór w wypoziomowanych końcach prętów, aby dopasować dwie maszynowe 4-40, które utrzymają skrzydełka łącznika na miejscu (Rysunek 2G).</li>
</ol>
2. Montaż systemu stymulacji wąsów (Rysunek 2B)
<ol>
	<li>Wytnij 10-zębowy segment grzebienia ze zwykłego grzebienia do włosów.</li>
	<li>Wytnij szczelinę o szerokości około 2-3 mm i głębokości około 5 mm w górnej części grzebienia, aby przyjąć 2-warstwowy prostokątny siłownik gięcia.</li>
	<li>po jednym przewodzie do każdej powierzchni siłownika gnącego. Użyj lutu i topnika dostarczonego przez producenta. Zakryj siłownik i taśmą izolacyjną, aby chronić mysz i użytkownika przed prądem elektrycznym.</li>
	<li>Wsuń listwę uruchamiającą w szczelinę wyciętą w grzebieniu tak, aby listwa siłownika gięcia była prostopadła do płaszczyzny grzebienia. Ustaw grzebień pod takim kątem, aby był przechylony pod kątem 45° i bardziej naturalnie podążał za krzywizną twarzy myszy.</li>
	<li>Przymocuj koniec listwy aktywatora do górnej części grzebienia za pomocą szybkowiążącej żywicy epoksydowej. 
	Uwaga: Przewody przylutowane do listwy siłownika gnącego powinny być podłączone do reostatu, który dostarcza 40 woltów do siłownika. Poprzednie eksperymenty wykazały, że 40 woltów jest skuteczne w kondycjonowaniu, ale nie wywołuje żadnych reakcji zaskoczenia.</li>
	<li>Umieść siłownik gnący i grzebień na ruchomym uchwycie. Dobrze sprawdza się uchwyt na pipety przymocowany do podstawy magnetycznej, jak zwykle używany w urządzeniach do elektrofizjologii in vitro.</li>
</ol>
3. Montaż łącznika, który montuje się do prętów nad cylindrem (Rysunek 2C, 2E)
Uwaga: Łącznik jest wydrukowanym w 3D 7-otworowym paskiem wzorowanym na nylonowym pasku serii Amphenol 221 używanym do wiązania przez Weissa i Disterhofta oraz Galveza i innych.10,17
<ol>
	<li>Stuknij w pierwszy otwór w pasku na maszynową 0-80 x-1". Będzie to służyć jako śruba blokująca do zakotwiczenia głowicy do złącza. Przymocuj nakrętkę 0-80 do łba blokującej za pomocą kleju cyjanoakrylowego, aby ułatwić ręczne obracanie.</li>
	<li>Pozostaw jeden otwór pusty za gwintowanym otworem (aby zrobić miejsce na nakrętkę maszynową 0-80) i wepchnij pięć pozłacanych nasadek relia-tac przez pozostałe pięć otworów.</li>
	<li>Zdejmij powłokę z pięciu długich drutów (przewodów uzyskanych z Ethernet) i do końców gniazd. 
	Uwaga: Pierwsze dwa przewody będą używane do rejestrowania sygnałów elektromiograficznych (EMG), które wykryją reakcję mrugnięcia okiem po filtrowaniu sygnału i wzmocnieniu ze wzmacniacza. Kolejne dwa dostarczą sygnał uderzeniowy z izolatora bodźców. Ostatni przewód będzie służył jako uziemienie. Przewody te zostaną podłączone do systemów używanych do czasowej dostawy CS-US.</li>
	<li>Zapewnij łączność elektryczną między przewodami a gniazdami za pomocą multimetru. Ustaw multimetr na ustawieniu ciągłości i przytrzymaj jedną z sond do kołka, a drugą sondę do odizolowanych końców drutu. Styki i przewody są połączone elektrycznie, gdy rezystancja jest niska, a multimetr emituje dźwięk.
	<ol>
		<li>Alternatywnie, jeśli multimetr nie ma ustawienia ciągłości, zmierz rezystancję między stykami a przewodami. Ciągłość elektryczna występuje, jeśli mierzona jest bardzo mała rezystancja.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj skrzydełka złącza z dwóch tranzystorów typu TO-220. Odetnij przewody emitera, podstawy i kolektora tranzystora i wypoziomuj powierzchnię, aby można było ją przymocować do złącza.</li>
	<li>Przytnij krawędź zaczepu montażowego, aby przebić się przez otwór, aby wypustka mogła wsunąć się pod.</li>
	<li>Epoksydowe tranzystory do złącza. Otwór w zaczepie montażowym posłuży do przymocowania łącznika do prętów nad cylindrem.</li>
	<li>Nałóż żywicę epoksydową na podstawę drutów wystających z gniazd i pozostaw żywicę epoksydową do wyschnięcia. Żywica epoksydowa zaizoluje i ochroni połączenia.</li>
</ol>
4. Przygotowanie nakrycia głowy (Rysunek 2D, 2E)
Uwaga: Pasek na głowę to wydrukowany w 3D 7-otworowy pasek wzorowany na nylonowym pasku serii Amphenol 221, używanym do nakrycia głowy przez Weissa i Disterhofta oraz Galveza i innych.10,17. Ten element nie jest już produkowany komercyjnie. Plik drukarki można pobrać ze strony internetowej tego czasopisma.
<ol>
	<li>Stuknij w pierwszy otwór w pasku na maszynową 0-80 x 1" i pozostaw jeden otwór pusty po pierwszym otworze.</li>
	<li>Wciśnij pięć pozłacanych szpilek przez spód pozostałych pięciu otworów (przez węższe końce). Użyj imadła, aby ułatwić równomierne wciskanie kołków w pasek.</li>
	<li>Za pomocą ściągacza izolacji termicznej usuń około 0,5 cm powłoki poliimidowej z końca drutu ze stali nierdzewnej (średnica 0,005 cala), odizolowany koniec drutu do otworu jednego z kołków i przytnij drut na 0,6-0,7 cm.</li>
	<li>Odizoluj się około 0,2 cm od końca przewodu, aby umożliwić przepływ prądu do zwierzęcia.</li>
	<li>Powtórz kroki 4.3-4.4 dla pozostałych trzech przewodów. 
	Uwaga: Pierwsze dwa przewody będą rejestrować odpowiedzi EMG, podczas gdy drugie dwa będą służyć do dostarczenia wstrząsu zwierzęciu.</li>
	<li>Ponieważ ostatni (piąty) przewód będzie służył jako przewód uziemiający, przytnij około 5 cm niepowlekanego drutu ze stali nierdzewnej (średnica 0.005 cala) i do pozostałego kołka.</li>
	<li>Zapewnij ciągłość między przewodami a stykami za pomocą multimetru. (W przypadku przewodu uziemiającego, który nie jest powlekany, sondę multimetru można umieścić w dowolnym miejscu wzdłuż przewodu.)</li>
</ol>
5. Przygotowanie chirurgiczne (Rysunek 2F)
<ol>
	<li>Wysterylizuj wszystkie narzędzia chirurgiczne, w tym nakrycie głowy. Wysterylizuj nakrycie głowy, mocząc je w alkoholu, a następnie spłukując sterylnym roztworem soli fizjologicznej.</li>
	<li>Znieczulij mysz w komorze indukcyjnej z 3-4% odparowanym izofluranem zmieszanym z natężeniem przepływu 1-2 l tlenu na minutę.</li>
	<li>Upewnij się, że zwierzę jest w pełni znieczulone za pomocą uszczypnięcia palca u nogi. Mysz jest w pełni znieczulona, gdy nie reaguje odruchowo na uszczypnięcie palca.</li>
	<li>Gdy zwierzę zostanie w pełni znieczulone, wstrzyknąć dawkę chlorowodorku buprenorfiny jako środek przeciwbólowy (0,05–2 mg/kg mc., sc), ogolić czubek głowy zwierzęcia, umieścić go na przykrytej poduszce grzewczej na podstawie ramy stereotaktycznej, upewnić się, że zwierzę jest w pełni znieczulone i przymocować głowę do ramy. Utrzymać przepływ odparowanego izofluranu do zwierzęcia, przejście na 2% przy natężeniu przepływu 1-2 l tlenu na minutę. Nałóż niewielką ilość maści okulistycznej na rogówkę.</li>
	<li>Zdezynfekuj skórę głowy jodonem i alkoholem po trzy razy, naprzemiennie.</li>
	<li>Za pomocą ostrza skalpela numer 10 lub 15 wykonaj nacięcie wzdłuż linii środkowej skóry głowy, odsłaniając czaszkę od przodu oczu do poza kość międzyciemieniową (~1,5-2 cm).</li>
	<li>Przytrzymaj płaty skóry za pomocą mikroklipsów. Umieść jeden klips nad okiem, jeden wzdłuż środka osi rostralno-ogonowej i jeden z tyłu czaszki obustronnie (tj. użyj w sumie sześciu klipsów). Aby zapobiec zwichnięciu nakrycia głowy, odsłoń jak największą część czaszki, w tym boki i tył. Zwiększy to powierzchnię do nakładania kleju cementowego.</li>
	<li>Za pomocą skalpela zeskrob górną część czaszki, aby usunąć okostną i zapewnić czystą i suchą powierzchnię roboczą. Oczyść górną część czaszki trzykrotnie 3% nadtlenkiem wodoru.</li>
	<li>Wywierć dwa otwory w czaszce za pomocą zadziorów w kształcie odwróconego stożka w rozmiarze 34 lub wiertła do grawerowania 1.6 mm, aby pomieścić 00-90 (0.0625 cala długości). zapewnią połączenie uziemienia elektrycznego. Umieść jeden otwór przed Bregmą, a drugi przed Lambdą, na lewo od linii środkowej podczas kondycjonowania prawego oka. Umieść po jednej w każdym otworze. Opuść o 0,28 mm do czaszki na każdy pełny obrót; Wystarczą dwa pełne obroty.</li>
	<li>Na czaszce należy wykonać kilka małych wgłębień o średnicy około 0,75 mm, aby zwiększyć powierzchnię i siłę chwytu cementu.</li>
	<li>Weź gotową głowicę i nawiń przewód uziemiający w konfiguracji ósemki wokół dwóch. Pozostaw trochę luzu (~1.5 cm między głowicą a śrubą) w przewodzie uziemiającym, aby można było później prawidłowo ustawić głowicę. 
	Uwaga: Ósemka zwykle zapewnia dobre połączenie elektryczne między przewodem a uziemiającymi. Drut można również do, aby zapewnić połączenie elektryczne.</li>
	<li>Nałożyć klej cementowy cementowy. Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi mieszania kleju cementowego lub wymieszaj 4 miarki mieszanki L-Powder, 8 kropli bazy i 2 krople katalizatora w zimnym ceramicznym naczyniu do mieszania (upewnij się, że pasek temperatury na naczyniu do mieszania jest całkowicie). Niska temperatura wydłuża czas pracy cementu.
	<ol>
		<li>Pokryj obficie czaszkę i cementem cementowym i pozostaw cement do wyschnięcia. Powinno to zająć tylko kilka minut.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po wyschnięciu cementu ustaw nakrycie głowy pionowo, ze szpilkami stojącymi do góry, nad czaszką. Przytrzymaj głowicę na miejscu za pomocą uchwytu podobnego do złącza 
	Uwaga: Zobacz "3. Montaż złącza"-Uchwyt musi być tylko pięciootworowym paskiem z pozłacanymi gniazdami, aby otrzymać kołki głowicy. Uchwyt jest przymocowany do ramienia na ramie stereotaktycznej. Zastosowanie uchwytu i ramienia ułatwia pozycjonowanie głowicy i przewodów.</li>
	<li>Po umieszczeniu nakrycia głowy zdejmij skórę wokół obszaru okołooczodołowego i ustaw dwa druty uderzeniowe tak, aby 0,2 cm odizolowany koniec spoczywał pod skórą i około 2-4 mm bezpośrednio doogonowo do oka. Nie pozwól, aby końce dwóch przewodów stykały się ze sobą. Umieść dwa przewody EMG na mięśniu okrężnym oka nad oczodołem.
	<ol>
		<li>W razie potrzeby odetnij końce przewodów, jeśli są zbyt długie i sprawiają wrażenie, jakby mogły bezpośrednio porysować orbitę i spowodować infekcję. Jeśli odcinasz końce drutu, upewnij się, że odsłonięty jest wystarczający poziom gołego drutu. Alternatywnie, jeśli druty wydają się zbyt długie, zegnij drut z powrotem u podstawy, gdzie wystają z głowicy.</li>
		<li>Zacementuj podstawę drutów (tj. koniec w pobliżu głowicy) na miejscu na czaszce za pomocą niewielkiej ilości kleju cementowego i pozostaw do wyschnięcia (użyj połowy opisanej wcześniej porcji).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Usuń mikroklipsy i delikatnie złóż płaty skóry z powrotem na cemencie. Pozwól, aby skóra naturalnie się uspokoiła, aby zapobiec napięciu jakiejkolwiek części skóry, aby uniknąć zniekształcenia powieki, zapobiegania reakcji mrugania oczami i niepokoju zwierzęcia.</li>
	<li>Uszczelnij odsłonięty obszar cementem dentystycznym, pokrywając cementem wszystko, od naciętej skóry po krawędź górnej części nakrycia głowy. Zachowaj szczególną ostrożność, aby uniknąć kapania cementu na oczy lub szpilki nakrycia głowy. Częściowo utwardzony cement można wygładzić i manipulować nim za pomocą bawełnianego wacika, który jest zwilżony rozpuszczalnikiem do cementu dentystycznego. Poczekaj, aż cement całkowicie wyschnie przed wyjęciem uchwytu głowicy.</li>
	<li>Pozwól zwierzęciu dojść do siebie po znieczuleniu na rozgrzanej powierzchni przed ponownym umieszczeniem zwierzęcia w klatce. Podać mu Metacam (1 mg/kg mc., SQ), a następnie umieścić zwierzę z powrotem w klatce.</li>
	<li>Pozwól zwierzęciu na 5-7 dni na regenerację przed testami lub treningiem. Utrzymuj standardową opiekę pooperacyjną nad zwierzęciem zgodnie z wytycznymi Twojej instytucji. Zwierzę powinno być badane co najmniej raz dziennie po powrocie do zdrowia po operacji. Zwróć uwagę na oznaki złego jedzenia i/lub picia oraz apatycznego zachowania. W przypadku podejrzenia bólu należy podawać Metacam co 24 godziny (taka sama dawka, jak pod koniec leczenia pooperacyjnego) aż do ustąpienia. Lidokainę można miejscowo nakładać na ranę, jeśli zwierzę drapie się lub wykazuje oznaki dyskomfortu.</li>
</ol>
6. Umieszczanie myszy na cylindrze i trening (Rysunek 2G)
<ol>
	<li>Aby umieścić mysz na cylindrze, przytrzymaj ją na chwilę ręką, trzymając ją jedną ręką za ogon, a następnie chwytając mysz za ramiona palcem wskazującym, a drugą kciukiem. Owiń pozostałe palce wokół brzucha i tułowia myszy.</li>
	<li>Gdy ręka nie przytrzymuje myszy, przymocuj łącznik do głowicy na główce myszy i przekręć blokującą.</li>
	<li>Delikatnie umieść mysz na cylindrze i przytrzymaj ją na miejscu, jednocześnie mocując łącznik do ramy. Użyj dwóch, aby przymocować łącznik do prętów nad cylindrem.</li>
	<li>Po zamocowaniu łącznika do ramy cylindra zwolnij uchwyt myszy. Daj myszy jeden dzień z dwóch sesji przyzwyczajenia się do cylindra. Pozwól, aby każda sesja habituacji trwała tak samo, jak każda sesja kondycjonująca.
	<ol>
		<li>Rejestruj częstotliwość spontanicznego mrugania podczas habituacji i wstępnie wystaw myszy na wibracje wąsów CS, aby zminimalizować występowanie reakcji zaskoczenia. Zastosuj CS tak, jak podczas rzeczywistej sesji kondycyjnej, ale bez porażenia prądem US.</li>
		<li>Zastosuj stymulację wąsów CS, umieszczając system piezoelektryczny blisko (około 0,5 cm) kondycjonowanej strony (prawej strony) myszy, jednocześnie wsuwając zęby grzebienia na poszczególne wąsy. Upewnij się, że te same wąsy są stymulowane z dnia na dzień, umieszczając system piezoelektryczny w tej samej pozycji z dnia na dzień.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozpocznij trening myszy na klasycznym warunkowaniu. Prowadź dwie sesje treningowe dziennie przez pięć dni. Pozostaw około dwóch godzin między każdą sesją treningową.
	<ol>
		<li>Do grupy kondycjonowanej należy dostarczyć trzydzieści prób na sesję wibracji CS (60 Hz) o długości 250 ms w połączeniu z impulsem elektrycznym US o długości 100 ms (0,3 mA - 3 mA, dostarczanym z izolatora bodźca WPI A385R). Oddziel CS i US za pomocą 250 ms długiego interwału śledzenia wolnego od bodźców, aby zadanie było zależne od hipokampa (Rysunek 1)23.</li>
		<li>Dostosuj intensywność porażenia prądem dla każdego zwierzęcia tak, aby wywołało to mrugnięcie. Oddzielne badania z losowym interwałem międzypróbnym wynoszącym 30-60 sekund (średnio 45 sekund, łączny czas trwania 30 minut na sesję).</li>
		<li>Dostarczyć trzydzieści niesparowanych prób CS w monoterapii i samych USG (w sumie sześćdziesiąt prób) do grupy pseudowarunkowanej, używając tych samych parametrów bodźca, jakie podano dla grupy uwarunkowanej. Należy upewnić się, że badania kliniczne prowadzone wyłącznie w badaniu CS i w samych badaniach klinicznych w USA są pseudorandomizowane, tak aby żaden bodziec nie był prezentowany częściej niż dwa razy z rzędu. Oddziel każdą próbę ze średnim interwałem międzypróbnym wynoszącym 22,5 sekundy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dostarczaj hałas tła o natężeniu 65 dB przez cały czas habituacji i treningu, aby zamaskować wszelkie dźwięki wibracji generowanych przez stymulator wąsów.</li>
</ol>

<ol><li>Clark, R. E., Squire, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Classical+conditioning+and+brain+systems%3A+the+role+of+awareness%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Classical conditioning and brain systems: the role of awareness.</a> Science. 280 (5360), 77-81 (1998).</li>
<li>Thompson, R. F., Kim, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Memory+systems+in+the+brain+and+localization+of+a+memory%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Memory systems in the brain and localization of a memory.</a> PNAS. 93 (24), 13438-13444 (1996).</li>
<li>Solomon, P. R., Vander Schaaf, E. R., Thompson, R. F., Weisz, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hippocampus+and+trace+conditioning+of+the+rabbit%27s+classically+conditioned+nictitating+membrane+response%5BTitle%5D)+AND+%22Behav+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Hippocampus and trace conditioning of the rabbit's classically conditioned nictitating membrane response.</a> Behav Neurosci. 100 (5), 729-744 (1986).</li>
<li>Moyer, J. R., Deyo, R. A., Disterhoft, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hippocampectomy+disrupts+trace+eye-blink+conditioning+in+rabbits%5BTitle%5D)+AND+%22Behav+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Hippocampectomy disrupts trace eye-blink conditioning in rabbits.</a> Behav Neurosci. 104 (2), 243-252 (1990).</li>
<li>Weiss, C., Bouwmeester, H., Power, J. M., Disterhoft, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hippocampal+lesions+prevent+trace+eyeblink+conditioning+in+the+freely+moving+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Behav+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Hippocampal lesions prevent trace eyeblink conditioning in the freely moving rat.</a> Behav Brain Res. 99 (2), 123-132 (1999).</li>
<li>Weiss, C., Disterhoft, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+prefrontal+cortical+memory+mechanisms+with+eyeblink+conditioning%5BTitle%5D)+AND+%22Behav+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Exploring prefrontal cortical memory mechanisms with eyeblink conditioning.</a> Behav Neurosci. 125 (3), 318-326 (2011).</li>
<li>Aiba, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deficient+cerebellar+long-term+depression+and+impaired+motor+learning+in+mGluR1+mutant+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Deficient cerebellar long-term depression and impaired motor learning in mGluR1 mutant mice.</a> Cell. 79 (2), 377-388 (1994).</li>
<li>Skelton, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bilateral+cerebellar+lesions+disrupt+conditioned+eyelid+responses+in+unrestrained+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Behav+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Bilateral cerebellar lesions disrupt conditioned eyelid responses in unrestrained rats.</a> Behav Neurosci. 102 (4), 586-590 (1988).</li>
<li>Takehara, K., Kawahara, S., Takatsuki, K., Kirino, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-limited+role+of+the+hippocampus+in+the+memory+for+trace+eyeblink+conditioning+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Time-limited role of the hippocampus in the memory for trace eyeblink conditioning in mice.</a> Brain Res. 951 (2), 183-190 (2002).</li>
<li>Weiss, C., Disterhoft, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evoking+blinks+with+natural+stimulation+and+detecting+them+with+a+noninvasive+optical+device%3A+A+simple%2C+inexpensive+method+for+use+with+freely+moving+animals%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Meth%22%5BJournal%5D)">Evoking blinks with natural stimulation and detecting them with a noninvasive optical device: A simple, inexpensive method for use with freely moving animals.</a> J Neurosci Meth. 173, 108-113 (2008).</li>
<li>Royer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+timing%2C+rate+and+bursts+of+hippocampal+place+cells+by+dendritic+and+somatic+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Control of timing, rate and bursts of hippocampal place cells by dendritic and somatic inhibition.</a> Nature. 15 (5), 769-775 (2012).</li>
<li>Goldey, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Removable+cranial+windows+for+long-term+imaging+in+awake+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protoc%22%5BJournal%5D)">Removable cranial windows for long-term imaging in awake mice.</a> Nature Protoc. 9 (11), 2515-2538 (2014).</li>
<li>Lovett-Barron, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+inhibition+in+the+hippocampus+supports+fear+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Dendritic inhibition in the hippocampus supports fear learning.</a> Science. 343 (6173), 857-863 (2014).</li>
<li>Chettih, S. N., McDougle, S. D., Ruffolo, L. I., Medina, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptive+timing+of+motor+output+in+the+mouse%3A+the+role+of+movement+oscillations+in+eyelid+conditioning%5BTitle%5D)+AND+%22Front+in+Integ+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Adaptive timing of motor output in the mouse: the role of movement oscillations in eyelid conditioning.</a> Front in Integ Neurosci. 5 (72), (2011).</li>
<li>Heiney, S. A., Wohl, M. P., Chettih, S. N., Ruffolo, L. I., Medina, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebellar-Dependent+Expression+of+Motor+Learning+during+Eyeblink+Conditioning+in+Head-Fixed+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cerebellar-Dependent Expression of Motor Learning during Eyeblink Conditioning in Head-Fixed Mice.</a> J Neurosci. 34 (45), 14845-14853 (2014).</li>
<li>Siegel, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trace+Eyeblink+Conditioning+in+Mice+is+Dependent+upon+the+Dorsal+Medial+Prefrontal+Cortex%2C+Cerebellum%2C+and+Amygdala%3A+Behavioral+Characterization+and+Functional+Circuity%5BTitle%5D)+AND+%22eNeuro%22%5BJournal%5D)">Trace Eyeblink Conditioning in Mice is Dependent upon the Dorsal Medial Prefrontal Cortex, Cerebellum, and Amygdala: Behavioral Characterization and Functional Circuity.</a> eNeuro. , (2015).</li>
<li>Galvez, R., Weiss, C., Cua, S., Disterhoft, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+for+precisely+timed+stimulation+of+mouse+whiskers+in+a+freely+moving+preparation%3A+application+for+delivery+of+the+conditioned+stimulus+in+trace+eyeblink+conditioning%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Meth%22%5BJournal%5D)">A novel method for precisely timed stimulation of mouse whiskers in a freely moving preparation: application for delivery of the conditioned stimulus in trace eyeblink conditioning.</a> J Neurosci Meth. 177 (2), 434-439 (2009).</li>
<li>Gruart, A., Sánchez-Campusano, R., Fernández-Guizán, A., Delgado-Garcìa, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Differential+and+Timed+Contribution+of+Identified+Hippocampal+Synapses+to+Associative+Learning+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cereb+Cortex%22%5BJournal%5D)">A Differential and Timed Contribution of Identified Hippocampal Synapses to Associative Learning in Mice.</a> Cereb Cortex. , (2014).</li>
<li>Weiss, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+Eyeblink+Conditioning+and+Decreased+Hippocampal+Volume+in+PDAPP+V717F+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">Impaired Eyeblink Conditioning and Decreased Hippocampal Volume in PDAPP V717F Mice.</a> Neurobiol Dis. 11 (3), 425-433 (2002).</li>
<li>Galvez, R., Weiss, C., Weible, A. P., Disterhoft, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vibrissa-signaled+eyeblink+conditioning+induces+somatosensory+cortical+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Vibrissa-signaled eyeblink conditioning induces somatosensory cortical plasticity.</a> J Neurosci. 26 (22), 6062-6068 (2006).</li>
<li>Galvez, R., Weible, A. P., Disterhoft, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+barrel+lesions+impair+whisker-CS+trace+eyeblink+conditioning%5BTitle%5D)+AND+%22Learn+%26+Memory%22%5BJournal%5D)">Cortical barrel lesions impair whisker-CS trace eyeblink conditioning.</a> Learn & Memory. 14 (1), 94-100 (2007).</li>
<li>Johnson, K. R., Zheng, Q. Y., Erway, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Major+Gene+Affecting+Age-Related+Hearing+Loss+Is+Common+to+at+Least+Ten+Inbred+Strains+of+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">A Major Gene Affecting Age-Related Hearing Loss Is Common to at Least Ten Inbred Strains of Mice.</a> Genomics. 70 (2), 171-180 (2000).</li>
<li>Tseng, W., Guan, R., Disterhoft, J. F., Weiss, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trace+eyeblink+conditioning+is+hippocampally+dependent+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hippocampus%22%5BJournal%5D)">Trace eyeblink conditioning is hippocampally dependent in mice.</a> Hippocampus. 14 (1), 58-65 (2004).</li>
<li>Joachimsthaler, B., Brugger, D., Skodras, A., Schwarz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spine+loss+in+primary+somatosensory+cortex+during+trace+eyeblink+conditioning%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Spine loss in primary somatosensory cortex during trace eyeblink conditioning.</a> J Neurosci. 35 (9), 3772-3781 (2015).</li>
<li>Boele, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebellar+and+extracerebellar+involvement+in+mouse+eyeblink+conditioning%3A+the+ACDC+model%5BTitle%5D)+AND+%22Front+in+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cerebellar and extracerebellar involvement in mouse eyeblink conditioning: the ACDC model.</a> Front in Cell Neurosci. 3 (19), (2010).</li>
<li>Koekkoek, S. K. E., Den Ouden, W. L., Perry, G., Highstein, S. M., De Zeeuw, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+kinetic+and+frequency-domain+properties+of+eyelid+responses+in+mice+with+magnetic+distance+measurement+technique%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Monitoring kinetic and frequency-domain properties of eyelid responses in mice with magnetic distance measurement technique.</a> J Neurophysiol. 88 (4), 2124-2133 (2002).</li>
<li>Ward, R. L., Flores, L. C., Disterhoft, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infragranular+barrel+cortex+activity+is+enhanced+with+learning%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Infragranular barrel cortex activity is enhanced with learning.</a> J Neurophysiol. 108 (5), 1278-1287 (2012).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Klasyczne warunkowanie mrugania oczami jest formą uczenia się asocjacyjnego, które jest użytecznym narzędziem do zrozumienia substratów neuronalnych leżących u podstaw uczenia się i pamięci. Poprzednie metody stosowane do kondycjonowania mrugania oczami u gryzoni, takich jak myszy, obejmowały komorę, która pozwalała zwierzęciu na swobodne poruszanie się. Utrwalony na głowie preparat do kondycjonowania mrugania oczami u myszy, przy użyciu aparatury opisanej przez Chettiha i wsp. oraz Heineya i wsp., a os...

Warunkowanie mrugnięcia oczami jest formą warunkowania Pawłowa i modelowym systemem do badania mechanizmów neuronalnych asocjacyjnego uczenia się i pamięci. Badano go u różnych gatunków, w tym ludzi, królików, kotów, szczurów i myszy. Paradygmat polega na prezentacji dwóch sparowanych bodźców: neutralnego bodźca warunkowego (CS; np. ton, błysk światła lub stymulacja wąsów) i istotny bodziec bezwarunkowy (US; np. zaciągnięcie się powietrzem do oka lub wstrząs okołooczodołowy). Stany Zjednoczone wywołują bezwarunkową, odruchową reakcję mrugnięcia oczami (tj. UR). W końcu, po kilku prezentacjach sparowanego CS-US, podmiot uczy się kojarzyć CS z USA. To uczenie się przejawia się w formie warunkowej odpowiedzi (CR), mrugnięcia oka wywołanego przez sam CS, które poprzedza prezentację USA.
Kondycjonowanie mrugnięcia oczami w postaci śladowej obejmuje kilkusetmilisekundowy interwał bez bodźców, który oddziela CS od USA (Rysunek 1). Warunkowanie śladowe jest formą uczenia się deklaratywnego, ponieważ wymaga świadomości nieprzewidzianych bodźców1. Przerwa skroniowa wymaga, aby zwierzę utrzymywało neuronalny "ślad" CS w obszarach przodomózgowia, takich jak hipokamp, aby US i CS zostały powiązane1-6. Wraz z obszarami przodomózgowia, kondycjonowanie śladowe jest również zależne od móżdżku7.
Warunkowanie mrugnięcia oczami jest zatem użytecznym paradygmatem do badania wielu aspektów pamięci, w tym nabywania, konsolidacji i odzyskiwania. Podczas warunkowania mrugania oczami grupie kontrolnej zwierząt przedstawia się niesparowane bodźce w losowej kolejności, aby przetestować pseudowarunkowanie lub uwrażliwione reakcje na CS, które mogą być spowodowane samą prezentacją USG, a nie wyuczonym skojarzeniem CS-US.
Powszechnie używanym urządzeniem do badania kondycji mrugania oczami u gryzoni jest komora, w której gryzonie mogą się swobodnie poruszać podczas procesu treningu8-10. W przypadku tego typu aparatów uwięź jest zwykle przymocowana do nakrycia głowy, które jest przymocowane do czaszki gryzonia. Uwięź pozwala na dostarczenie USG (a czasem CS) i przekazanie reakcji zwierzęcia na te bodźce (tj. reakcji mrugnięcia okiem)10. Sama pęta może być modyfikowana w zależności od rodzaju dostarczanych bodźców i sposobu rejestrowania reakcji mrugnięcia.
Powodem używania "swobodnie poruszających się" myszy na uwięzi do kondycjonowania mrugania oczami jest to, że myszy mają problemy z ograniczeniami. Chociaż inne gatunki mogą być bardziej podatne na ograniczenia, główną zaletą wykorzystania myszy w eksperymentach z kondycjonowaniem mrugnięć jest to, że większość dostępnych genetycznie zmodyfikowanych zmutowanych szczepów to szczepy myszy. Oprócz zmagania się, całkowite unieruchomienie myszy powoduje ostry niepokój. Preparat na mysz z głową, który minimalizuje stres, zwiększyłby ilość informacji fizjologicznych, które można uzyskać podczas kondycjonowania mrugnięcia. Na przykład system ten umożliwiłby obrazowanie neuronów korowych za pomocą mikroskopii 2-fotonowej11.
Preparaty do utrwalenia głowy były używane w poprzednich eksperymentach do optycznego obrazowania kory za pomocą ruchomych implantów czaszkowych, elektrofizjologicznych zapisów in vivo mózgu gryzoni za pomocą matryc tetrodowych, dwufotonowego obrazowania wapnia, a także jako platforma do warunkowania mrugania oczami u myszy11-16.
W systemie head-fixed zapewniona jest niezawodna stymulacja i zapisy bez całkowitego ograniczenia myszy (Rysunek 2). Nakrycie głowy, takie jak to, które jest używane w systemie swobodnie poruszającym się, jest przymocowane do czaszki myszy. Podczas treningu nakrycie głowy jest przymocowane do łącznika, który jest przymocowany do prętów nad cylindryczną bieżnią w celu ustabilizowania głowy gryzonia (rysunek 2A). Cylindryczna bieżnia pozwala myszce wygodnie odpocząć, ale jeśli mysz sobie tego życzy, pozwala jej również biegać lub chodzić. Za pomocą tego systemu myszy mogą być trenowane z wibracjami wąsów, takimi jak CS, i łagodnymi okołooczodołowymi wstrząsami elektrycznymi, takimi jak USA (ryc. 1). USG jest dostarczany przez druty chirurgicznie umieszczone pod skórą po stronie oka. CS jest dostarczany za pomocą grzebienia, który jest przymocowany do 2-warstwowego prostokątnego siłownika gnącego (rysunek 2B). Grzebień i siłownik zginający są następnie przymocowane do podstawy magnetycznej, która podczas treningu jest przesuwana do właściwej pozycji i jest dostosowywana w celu optymalnego podania dla każdego zwierzęcia. Grzebień jest umieszczony tak, aby przylegał do wybranych wąsów. Podczas dostarczania CS do siłownika gnącego wysyłany jest sygnał, który przemieszcza grzebień i prowadzi do wibracji wąsów17.
Inne bodźce, takie jak ton lub błysk światła, były używane jako skuteczne bodźce warunkowe u myszy w ciągu ostatnich16,18,19. Powodem, dla którego stymulacja wąsów została wybrana dla CS w tym eksperymentalnym paradygmacie, jest zależność mysich zwierząt od ich wibrysów w zakresie wprowadzania informacji somatosensorycznych podczas eksploracji. Wykazano, że stymulacja wąsów jest niezawodnym i skutecznym CS20. Ponadto, biorąc pod uwagę dobrze ugruntowane i zorganizowane podłoże korowe systemu wibrysów (tj. Korę beczkowatą), stymulacja wąsów jako CS stanowi eleganckie narzędzie do mapowania zmian korowych i plastyczności związanych z nauką warunkowania mrugania oczami20,21. System head-fix pozwala na precyzyjną stymulację wybranych wąsów w celu porównania odpowiedzi między stymulowanymi neuronami a neuronami odbierającymi dane wejściowe od niestymulowanych wąsów. Wreszcie, wiele szczepów myszy wykazuje ubytek słuchu związany z wiekiem jako stosunkowo młodzi dorośli22, a zamknięcie powieki podczas warunkowego mrugania zmienia wizualny CS (chociaż wizualny CS łagodzi problemy z reakcjami zaskoczenia16). Żadne z tych powikłań nie ma wpływu na stymulację wąsów.
Przedstawione tutaj są unikalne i ważne modyfikacje innych preparatów do kondycjonowania mrugnięcia oczami, w tym metody dostarczania CS i US oraz nabywanie odpowiedzi na mrugnięcie oczami. Niezawodność tego aparatu i paradygmatu treningowego w warunkowaniu mrugania oczami wykazano za pomocą krzywych uczenia się od uwarunkowanych myszy i stosunkowo płaskiej krzywej uczenia się od pseudowarunkowanych zwierząt kontrolnych (Figura 7A).

<table><tbody><tr><td>Wałek piankowy Exervo TeraNova 36" x 6"&nbsp;</td><td>Amazonka</td><td>B002ONUM0E</td><td>Do cylindra</td></tr><tr><td></td><td></td><td>z pleksi</td><td>Wykonane na zamówienie; Pręty metalowe o grubości 1 cm</td></tr><tr><td>(12,7&nbsp; mm średnicy)</td><td></td><td></td> <td>Wykonana na zamówienie</td></tr><tr><td>śruba maszynowa 4-40 (.25&nbsp; w. długie)</td> <td>Amazon Supply</td><td>B00F33Q8QO</td><td>Do cylindra</td></tr><tr><td>Klasyczny grzebień do włosów</td><td>Conair</td><td>93505WG-320</td><td>Do stymulacji wąsów</td></tr><tr><td>2-warstwowy prostokątny siłownik do gięcia</td><td>Systemy piezoelektryczne</td><td>T220-A4-303X&nbsp;</td><td>Do stymulacji wąsów</td></tr><tr><td>Zestaw lutowniczy i topnika</td><td>Systemy piezoelektryczne</td><td>MSF-003-NI</td><td>Do stymulacji wąsów</td></tr><tr><td>Podstawa magnetyczna</td><td>Thor Labs</td><td>MB175</td><td>Do stymulacji wąsów</td></tr><tr><td>Pręt gwintowany do podstawy</td><td></td><td></td> magnetycznej <td>Wykonane na zamówienie</td></tr><tr><td>Paski oparte na nylonowych łącznikach paskowych serii 221 firmy Electronic Connector Corp.</td><td></td><td></td><td>Wykonany na zamówienie, na podstawie Weiss i Disterhoft, 2008</td></tr><tr><td>Tranzystor w stylu TO-220</td><td>Amazon Supply</td><td>B0002ZPZYO&nbsp;</td><td>Do łącznika, do skrzydeł</td></tr><tr><td>Złącze elektroniczne Relia-Tac Sockets</td><td>Corp.</td><td>220-S02</td><td>Do złącza</td></tr><tr><td>Relia-Tac Pins</td><td>Electronic Connector Corp.</td><td>220-P02</td><td>Do głowicy</td></tr><tr><td>śruba maszynowa ze stali nierdzewnej 0-80 (długość 1 cala)</td><td>Śruba blokująca</td> <td>Amazon Supply</td><td>B000FN68EE</td></tr><tr><td>Nakrętka sześciokątna maszynowej ze stali nierdzewnej 0-80 (grubość 5/32 cala)</td><td>Amazon Supply</td><td>B000N2TK7Y</td><td>Śruba blokująca z</td></tr><tr><td>Loctite Super Glue-Liquid</td><td>Loctite</td><td>1365896</td><td>Klej cyjanoakrylowy; do blokującej</td></tr><tr><td>Szybkowiążąca żywica epoksydowa Ace</td><td> Sprzęt</td><td>18613</td><td>Do złącza i systemu stymulacji wąsów</td></tr><tr><td>Przewody</td><td></td><td></td> <td>Ethernet Ethernet można rozebrać, aby użyć poszczególnych przewodów do złącza</td></tr><tr><td>Druty ze stali nierdzewnej pokryte poliimidem (2&nbsp; w. długi, .005 cala średnica)</td><td>PlasticsOne</td><td>005sw/2.0 37365 S-S&nbsp;</td><td>Do nakryć głowy, przewodów EMG i wstrząsowych</td></tr><tr><td>Drut niepowlekany ze stali nierdzewnej (.005&nbsp; w. średnica)</td><td>AM Systems</td><td>792800</td><td>Do głowicy, przewodów uziemiających</td></tr><tr><td>Zmienny autotransformator Tenma Tenma</td><td></td><td>72-110</td><td>Do stymulacji wąsów; reostat do regulacji prądu do siłownika zginającego</td></tr><tr><td>Wzmacniacz A-M</td><td>Systems</td><td>1700</td><td>Wzmacniacz do filtrowania i wzmacniania sygnałów EMG</td></tr><tr><td>Izolator bodźca WPI A385R</td><td>World Precision Instruments</td><td>31405</td><td>Dla porażenie prądem</td></tr><tr><td>elektrycznym Isothesia (Isoflurane)</td><td>Henry Schein: Zdrowie zwierząt</td><td>50031</td><td>Do operacji; znieczulenie</td></tr><tr><td>Buprenex Iniekcyjne CIII</td><td>Reckett Benckiser Pharmaceuticals Inc</td><td>NDC 12496-0757-1</td><td>Do operacji; przeciwbólowe</td></tr><tr><td>Akwa Tears: Lubrykant Maść okulmiczna&nbsp;</td><td>Akorn</td><td>NDC 17478-062-35</td><td>Maść na sztuczne łzy zapobiegająca suchości oczu podczas znieczulenia</td></tr><tr><td>Płatki przygotowawcze Povidine-Jodine</td><td>PDI</td><td>NDC 10819-3883-1</td><td>Do operacji; antyseptyczne</td></tr><tr><td>Podkładki</td><td></td><td></td> nasączone alkoholem <td>Można kupić w każdej standardowej aptece</td></tr><tr><td>Rękojeści do skalpela chirurgicznego ze stali nierdzewnej (nr 3)</td><td>Integra Miltex&nbsp;</td><td>4-7.</td> <td>Do operacji</td></tr><tr><td>Ostrza skalpela chirurgicznego ze stali nierdzewnej</td><td>Integra Miltex</td><td>4-310 lub 4-315</td><td>Do operacji; ostrze skalpela numer 10 lub 15</td></tr><tr><td>3% Nadtlenek</td><td></td><td></td> wodoru <td>Można kupić w każdej standardowej aptece</td></tr><tr><td>Micro Clip</td><td>Roboz</td><td>RS-5459</td><td>Do operacji, do powstrzymywania skóry</td></tr><tr><td>00-90 śruba maszynowa ze stali nierdzewnej (0,0625&nbsp; w. długie)</td><td>Dostawa Amazon</td><td>B002SG89X4&nbsp;</td><td>Do zabiegów chirurgicznych, aby owinąć przewód uziemiający</td></tr><tr><td>Profesjonalne narzędzie obrotowe Walnut</td><td>Hollow</td><td>29637</td><td>Wiertarka ręczna do chirurgii, do wiercenia otworów w czaszce</td></tr><tr><td>Zadziory w kształcie odwróconego stożka</td><td>Roboz</td><td>RS-6282C-34</td><td>Frez z odwróconym stożkiem rozmiar 34; do chirurgii, do wiercenia otworów w czaszce</td></tr><tr><td>Frez do grawerowania</td><td>Dremel</td><td>106</td><td>Frez do grawerowania; Wiertło 1,6 mm; do chirurgii, do wiercenia otworów w czaszce</td></tr><tr><td>C& B Metabond - szybko! System cementowy "B" Quick Base</td><td>Parkell</td><td>S398</td><td>Do zabiegów chirurgicznych; adhezyjny system cementowy cementowy; ważne, aby zapobiec zwichnięciu głowicy</td></tr><tr><td>C& B Metabond - szybko! System cementowy Clear L-Powder</td><td>Parkell</td><td>S399</td><td>Do zabiegów chirurgicznych; adhezyjny system cementowy cementowy; ważne, aby zapobiec zwichnięciu głowicy</td></tr><tr><td>C& B Metabond - szybko! Cement System "C" Uniwersalny katalizator TBB 0,7 ml</td><td>Parkell</td><td>S371</td><td>Do zabiegów chirurgicznych; adhezyjny system cementu cementowego; ważne, aby zapobiec zwichnięciu</td></tr><tr><td>główki C& B Metabond - szybko! Ceramiczne naczynie do mieszania Cement System z paskiem temperaturowym</td><td>Parkell</td><td>S387</td><td>Do operacji; adhezyjny system cementowy; ważne, aby zapobiec zwichnięciu głowicy</td></tr><tr><td>Pęseta szwajcarska, styl #5</td><td>Światowe instrumenty precyzyjne</td><td>504506</td><td>Do operacji</td></tr><tr><td>Purytańskie aplikatory z bawełnianą końcówką</td><td>VWR International</td><td>10806-005&nbsp;</td><td>Do zabiegu chirurgicznego</td></tr><tr><td>Zestaw cementu do uszczelniania zębów</td><td>Dentsply</td><td>675570</td><td>Do zabiegów chirurgicznych; cement dentystyczny</td></tr></tbody></table>

klasyczne kondycjonowanie mrugnięcia oczami sygnalizowane wąsem u myszy z głową

Whisker-signaled Eyeblink Classical Conditioning in Head-fixed Mice

Warunkowanie mrugnięcia oczami jest powszechnym paradygmatem do badania mechanizmów neuronalnych leżących u podstaw uczenia się i pamięci. Aby lepiej wykorzystać szeroki repertuar technik naukowych dostępnych do badania uczenia się i pamięci na poziomie komórkowym, idealnie jest mieć stabilną platformę czaszkową. Ponieważ myszy niełatwo tolerują ograniczenia, zwykle są szkolone podczas swobodnego poruszania się w komorze. Informacje o bodźcu warunkowym (CS) i bodźcu bezwarunkowym (US) są dostarczane, a reakcje mrugania oczami rejestrowane są za pomocą linki podłączonej do głowy myszy. W prezentowanym tutaj aparacie unieruchomionym na głowie myszom pozwala się biegać tak, jak chcą, podczas gdy ich głowy są zabezpieczone, aby ułatwić eksperymenty. Za pomocą tego aparatu treningowego uzyskuje się wiarygodne warunkowanie reakcji na mruganie, które pozwala na przeprowadzenie stymulacji wąsów jako CS, okołooczodołowego wstrząsu elektrycznego jak US oraz analizę aktywności elektromiograficznej (EMG) z powieki w celu wykrycia reakcji mrugnięcia.

Samce myszy C57Bl6/J w wieku 8-10 tygodni były trenowane w warunkowaniu mrugania o charakterze śladowym na aparacie z cylindryczną bieżnią z mocowaniem głowy. 8 myszy trenowano przy sparowanych prezentacjach CS-US (grupa warunkowana), a 9 myszy trenowano przy niesparowanych prezentacjach CS i US (grupa pseudowarunkowana).
Przykładowe zapisy EMG odpowiedzi warunkowej u myszy uwarunkowanej przedstawiono na Rysunku 3</stron...

Prezentowany tutaj preparat do kondycjonowania mrugania oczami sygnalizowanego przez wąsy u myszy z głową precyzyjnie stymuluje określone wąsy, jednocześnie pozwalając myszom poruszać się na cylindrycznym bieżni. Bodziec warunkowy stymulacją wąsów (CS) w połączeniu z bodźcem bezwarunkowym wstrząsu okołooczodołowego (US) skutkuje niezawodnym uczeniem się asocjacyjnym na tym aparacie.

Klasyczne kondycjonowanie mrugnięcia oczami sygnalizowane wąsem u myszy z głową

Eyeblink conditioning is a common paradigm for investigating the neural mechanisms underlying learning and memory. To better utilize the extensive ...

Ogólnym celem niniejszego protokołu jest wykorzystanie postępów w genetyce myszy oraz naszej wiedzy na temat systemu wibrysów do zbadania neurobiologicznych podstaw warunkowania mrugania powieką, będącego translacyjnym paradygmatem badania uczenia się i pamięci. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na pytania mechanistyczne dotyczące uczenia się i pamięci poprzez zastosowanie obrazowania wapnia oraz elektrofizjologii u myszy z modyfikacjami genetycznymi podczas stymulacji konkretnych wibrysów w trakcie warunkowania. Główną zaletą tej techniki jest możliwość unieruchomienia głów myszy przy jednoczesnym zminimalizowaniu stresu, dzięki umożliwieniu zwierzętom poruszania się we własnym tempie na cylindrycznej bieżni.Implikacje tej techniki rozciągają się na potencjalne metody leczenia zaburzeń pamięci, w tym tych związanych z naturalnym procesem starzenia oraz chorobą Alzheimera. Przygotowanie cylindra oraz systemu stymulacji wibrysów zostały opisane w protokole tekstowym. Niniejsza sekcja dotyczy przygotowania uchwytu głowy.Pasek uchwytu głowicy to wydrukowany w technologii 3D pasek z siedmioma otworami, zamodelowany na podstawie nylonowego paska serii Amphenol 221, który nie jest już produkowany komercyjnie. W wydrukowanym elemencie należy gwintować pierwszy otwór paska pod śrubę maszynową 0-80 o długości jednej cala, pozostawiając jeden otwór pusty za pierwszym otworem. Następnie, używając imadła, należy umieścić pięć pozłacanych pinów w pozostałych pięciu otworach.Wsuń piny przez węższe otwory w plastiku. Następnie, używając ściągacza termicznego, usuń pół centymetra powłoki poliimidowej. Po tym przylutuj odsłonięty koniec do jednego z pinów w miejscu, w którym pin posiada otwór.Odetnij przylutowany drut do długości od sześciu do siedmiu milimetrów i zdejmij izolację z około dwóch milimetrów drutu. Powtórz ten proces, aby przymocować łącznie cztery druty do pięciu pinów. Pierwsze dwa druty będą rejestrować odpowiedzi EMG powieki, natomiast pozostałe dwa będą dostarczać stymulację elektryczną do obszaru okołogałkowego.Do piątego pinu przylutuj nieizolowany, pięciocentymetrowy drut ze stali nierdzewnej, który będzie pełnił funkcję uziemienia elektrycznego. Po wykonaniu wszystkich połączeń sprawdź każde z nich za pomocą multimetru, aby upewnić się co do ich ciągłości elektrycznej. Rozpocznij procedurę od w pełni znieczulonego zwierzęcia, co należy potwierdzić testem ucisku palca.Wstrzyknij dawkę chlorowodorku buprenorfiny jako lek przeciwbólowy. Następnie nałóż niewielką ilość maści oftalmicznej na rogówki i ogól górną część głowy zwierzęcia. Następnie unieruchom głowę zwierzęcia w aparacie stereotaktycznym i zdezynfekuj skórę głowy, wykonując trzy naprzemienne przemycia jodopowidonom i alkoholem.Za pomocą ostrza skalpela nr 10 lub 15 wykonaj nacięcie wzdłuż linii środkowej skóry głowy, odsłaniając czaszkę od przedniej części oczu aż poza kość międzyciemieniową. Odchyl płaty skóry za pomocą sześciu mikroklipsów, odsłaniając jak największą powierzchnię czaszki, w tym jej boki i tylną część. Następnie za pomocą skalpela zeskrob okostną z czaszki.Następnie trzykrotnie oczyść górną część czaszki 3% nadtlenkiem wodoru. Po wyschnięciu czaszki wywierć dwa otwory za pomocą wiertła stożkowego odwróconego w rozmiarze 34, uważając, aby nie uszkodzić mózgu. Jeden otwór umieść przed bregma, a drugi przed lambda, po lewej stronie linii środkowej podczas przygotowania prawego oka lub odwrotnie.Otwory te należy wywiercić ostrożnie, tak aby pasowały do śrub, dokładając wszelkich starań, aby nie uszkodzić mózgu. W otworach należy umieścić śruby do połączeń elektrycznych. Każdy pełny obrót obniży śrubę o 0.28 milimetrów, zatem dwa pełne obroty są wystarczające.Następnie należy wykonać w czaszce kilka małych wgłębień, aby zwiększyć powierzchnię przyczepności cementu. W gotowej części nagłownej owiń przewód uziemiający wokół dwóch śrub w kształcie ósemki. Pozostaw pewien luz w przewodzie uziemiającym, aby nagłówek można było odpowiednio ustawić.Następnie nanieś zimny cement lutujący. Obficie pokryj czaszkę oraz śruby i poczekaj, aż cement wyschnie. Po wyschnięciu cementu ustaw element nagłowny pionowo, tak aby piny wystawały ponad czaszką.Zabezpiecz nakładkę głowową za pomocą uchwytu przymocowanego do ramienia stelaża. Uchwyt musi posiadać pięć pozłacanych gniazd przeznaczonych dla pinów nakładki głowowej. Umieść dwa przewody EMG na mięśniu okrężnym oka powyżej oczodołu.Następnie umieść dwa druty stymulujące. Wprowadź odizolowane końce pod skórę w odległości od dwóch do czterech milimetrów bezpośrednio za okiem (strona ogonowa). Dopilnuj, aby ich końce nie stykały się ze sobą.Jeśli druty są na tyle długie, że mogłyby podrażnić oko zwierzęcia, należy je przyciąć lub odgiąć. Część gołego drutu musi pozostać odsłonięta. Następnie należy przymocować podstawy drutów do czaszki, używając niewielkiej ilości cementu lutingowego, i pozostawić do wyschnięcia.Użyć około połowy wcześniej stosowanej objętości. Aby kontynuować, należy zdjąć mikroklempy i ponownie ułożyć skórę. Pozostawić skórę do naturalnego osiadania, aby zapobiec jej napięciu, które mogłoby zniekształcić powiekę, hamując mruganie i tym samym niszcząc eksperyment.Po ułożeniu skóry należy zdjąć uchwyt nakładki na głowę i uszczelnić odsłonięty obszar cementem dentystycznym. Należy unikać skapywania cementu na oczy lub piny nakładki. Następnie należy użyć patyczka higienicznego zwilżonego rozpuszczalnikiem do cementu dentystycznego, aby w razie potrzeby wygładzić i uformować częściowo utwardzony cement.Po całkowitym wyschnięciu cementu należy wyjąć zwierzę z aparatu stereotaksycznego i pozostawić je do regeneracji na ciepłej powierzchni przed powrotem do klatki domowej. Habituację myszy należy rozpocząć po upływie co najmniej pięciu dni czasu regeneracji. Aby unieruchomić mysz, należy ją krótko przytrzymać za ogon i chwycić za kark za łopatkami.Następnie podnieś mysz, chwytając ją pod brzuchem i tułowiem. Dalej, przymocuj łącznik do uchwytu głowy i przekręć śrubę blokującą. Następnie ostrożnie umieść mysz na cylindrze i przytrzymaj ją nieruchomo, używając dwóch śrub do przymocowania łącznika do prętów znajdujących się nad cylindrem.Następnie wypuść mysz. Podczas dwóch pierwszych sesji pozwól myszy na habituację do cylindra przez taki sam czas, jak trwa sesja warunkowania. W trakcie habituacji zarejestruj częstotliwość spontanicznego mrugania.Ponadto należy poddać myszy wstępnej ekspozycji na stymulator wibracji wibrys, bez stosowania stymulacji elektrycznej. Umieściwszy system piezoelektryczny blisko strony warunkowanej, należy nasunąć zęby grzebienia na poszczególne wibrysy. Na każdą sesję należy wybierać te same wibrysy.Następnie przeprowadzono trening warunkowania klasycznego zgodnie z opisem w tekście. Samce myszy C57 Black 6J w wieku od ośmiu do dziesięciu tygodni były poddawane warunkowaniu mrugnięcia oka z odstępem czasowym (trace eyeblink conditioning) w cylindrycznej bieżni z unieruchomieniem głowy. Dla każdej próby wykonano pomiary EMG.Sygnały EMG zostały sprostowane i zintegrowane z stałą czasową 10 ms, a następnie uśrednione dla wszystkich prób. Ewolucja odruchów warunkowych w ciągu 10 sesji treningowych pokazuje, że amplituda odpowiedzi stopniowo rosła, a latencja odpowiedzi ulegała skróceniu. Ewolucja ta nie jest widoczna w odpowiedziach myszy pseudowarunkowanych, u których bodźce były prezentowane w losowej kolejności.Ewolucję odpowiednio zsynchronizowanych, a tym samym dobrze wyuczonych reakcji uwarunkowanych można również zaobserwować na histogramach czasu do wystąpienia szczytu odpowiedzi po rozpoczęciu bodźca warunkowego (CS). Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat przygotowania uchwytu głowowego, chirurgicznego implantowania uchwytu głowowego u myszy oraz umieszczania myszy na cylindrycznej bieżni w celu przeprowadzenia uwarunkowania mrugania z unieruchomioną głową. Myszy powinny wykazywać korzystną krzywą uczenia się w kolejnych dniach w miarę nabywania odruchu uwarunkowanego.Po opanowaniu techniki, w przypadku prawidłowego wykonania, procedura ta może zająć jedną godzinę. Podczas przeprowadzania tego procesu ważne jest zachowanie czujności i obserwowanie wszelkich oznak stresu u zwierząt. Należy podjąć odpowiednie kroki w celu zminimalizowania stresu zwierząt.

whisker-signaled-eyeblink-classical-conditioning-in-head-fixed-mice

Research

JoVE Journal

Behavior

Zachowanie

Ten protokół opisuje, jak tymczasowo i zdalnie wyciszyć aktywność neuronalną w dyskretnych obszarach mózgu, podczas gdy szczury są zaangażowane w zadania związane z uczeniem się i pamięcią. Podejście to łączy farmakogenetykę (Designer-Receptors-Exclusively-Activated-by-Designer-Drugs) z paradygmatem behawioralnym (sensoryczne warunkowanie wstępne), które ma na celu rozróżnienie różnych elementów uczenia się.

Metoda zdalnego wyciszania aktywności neuronalnej u gryzoni podczas dyskretnych faz uczenia się

Klasyczne warunkowanie (ECC) zostało użyte do oceny zależnego od hipokampa uczenia się asocjacyjnego u dorosłych szczurów, którym podawano wysokie stężenie (11,9% v/v) alkoholu podczas wczesnego rozwoju mózgu noworodka. Ogólnie rzecz biorąc, procedury ECC są solidnymi narzędziami diagnostycznymi do wykrywania dysfunkcji mózgu w wielu środowiskach psychologicznych i biomedycznych.

Zastosowanie klasycznego warunkowania śladowego mrugnięcia okiem do oceny dysfunkcji hipokampa w szczurzym modelu zaburzeń ze spektrum alkoholowych płodów

Opracowanie nowych strategii udoskonalania dla myszy laboratoryjnych jest trudnym zadaniem, które przyczynia się do spełnienia zasady 3R. Protokół ten wprowadza trening klikerowy jako program wzbogacający funkcje poznawcze dla myszy laboratoryjnych.

Wprowadzenie treningu klikerowego jako wzbogacenia poznawczego dla myszy laboratoryjnych

Ten protokół opisuje paradygmat warunkowania mrugania oczami odpowiedni dla eksperymentów z rocznymi niemowlętami. Do dostarczania bodźców można użyć komercyjnego lub wykonanego na zamówienie sprzętu, a gromadzenie i analiza danych powinny być przeprowadzane na nagraniach wideo.

Klasyczna kondycjonowanie mrugania z krótkim opóźnieniem u dzieci rocznych

Opisany tutaj jest nowatorski zautomatyzowany system eksperymentalny, który stanowi alternatywę dla testu trzykomorowego, a także rozwiązuje kilka zastrzeżeń. System ten dostarcza wielu parametrów behawioralnych, które umożliwiają rygorystyczną analizę dynamiki zachowania małych gryzoni podczas testów preferencji społecznych i preferencji nowości społecznych.

System do śledzenia dynamiki zachowań preferencji społecznych u małych gryzoni

Opracowaliśmy pojedynczą platformę do śledzenia zachowań zwierząt podczas dwóch zadań związanych z nauką asocjacyjną zależnych od włókien wspinaczkowych. Niedroga konstrukcja umożliwia integrację z eksperymentami optogenetycznymi lub obrazowymi ukierunkowanymi na aktywność móżdżku związaną ze wspinaniem się włókien.

Elastyczna platforma do monitorowania sensorycznego uczenia się asocjacyjnego zależnego od móżdżku

Aby badać zachowania związane z lotem w kontekście strachu, wprowadzamy zmodyfikowany protokół warunkowania strachu. Protokół ten zapewnia, że myszy konsekwentnie wykazują zachowania związane z lotem podczas prezentacji wskazówek w warunkowaniu strachu.

Zmodyfikowane warunkowanie strachu w celu wywołania zachowań związanych z lotem u myszy

Paradygmat strachu obserwacyjnego ocenia zastępcze zamrożenie u gryzoni jako model empatii afektywnej. Procedura ta polega na wystawieniu gryzoni-obserwatorów na działanie demonstrantów tego samego gatunku, którzy otrzymują awersyjne wstrząsy stopami w celu wywołania empatycznych reakcji zamrożenia. Stosując obserwacyjne testy strachu, naukowcy mogą zbadać mechanizmy neuronalne leżące u podstaw empatii afektywnej.

Strach obserwacyjny jako model empatii afektywnej u myszy

Ten protokół zapewnia metodę śledzenia automatycznego mrużenia oczu u gryzoni w czasie w sposób zgodny z blokowaniem czasu na pomiary neurofizjologiczne. Oczekuje się, że protokół ten będzie przydatny dla naukowców badających mechanizmy zaburzeń bólowych, takich jak migrena.

Zautomatyzowana metoda mrużenia oczu dla zachowania synchronizacji czasu i dynamiki mózgu w badaniach bólu myszy

Protokół opisuje, jak zmierzyć odpowiedź optomotoryczną u wiewiórek ziemnych z 13 rzędami, gatunkiem z dominacją stożków z cechami siatkówki przypominającymi ludzką plamkę żółtą. Konstrukcja platformy usprawnia obsługę i zmniejsza niepokój, poprawiając zdolność zwierzęcia do pozostawania na podniesionej platformie, umożliwiając nieinwazyjną ocenę zmian w funkcjach wzrokowych.

Nieawersyjne unieruchomienie zwierząt umożliwiające rejestrację odruchu optomotorycznego u wiewiórek ziemnych

Poznaj metodę kondycjonowania mrugnięcia oczami sygnalizowanego wąsem u myszy z głową. Technika ta umożliwia badanie mechanizmów uczenia się i pamięci przy użyciu obrazowania wapnia i elektrofizjologii.

Klasyczne kondycjonowanie mrugnięcia oczami sygnalizowane wąsem u myszy z głową

Przeglądaj więcej filmów