Klasyczne kondycjonowanie mrugnięcia oczami sygnalizowane wąsem u myszy z głową
30 marca 2016
Prezentowany tutaj preparat do kondycjonowania mrugania oczami sygnalizowanego przez wąsy u myszy z głową precyzyjnie stymuluje określone wąsy, jednocześnie pozwalając myszom poruszać się na cylindrycznym bieżni. Bodziec warunkowy stymulacją wąsów (CS) w połączeniu z bodźcem bezwarunkowym wstrząsu okołooczodołowego (US) skutkuje niezawodnym uczeniem się asocjacyjnym na tym aparacie.
Ogólnym celem tego protokołu jest wykorzystanie postępów genetycznych u myszy i naszego zrozumienia systemu wąsów do zbadania neurobiologicznych podstaw warunkowania mrugania oczami, tłumaczalnego paradygmatu do badania uczenia się i pamięci. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na pytania mechanistyczne w uczeniu się i pamięci, wykorzystując obrazowanie wapnia i elektrofizjologię u genetycznie manipulowanych myszy, jednocześnie stymulując określone wąsy podczas kondycjonowania. Główną zaletą tej techniki jest możliwość zabezpieczenia głów myszy przy jednoczesnej minimalizacji stresu, poprzez umożliwienie myszom poruszania się we własnym tempie na cylindrycznej bieżni.
Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku potencjalnych metod leczenia zaburzeń pamięci, w tym tych związanych z normalnym starzeniem się i chorobą Alzheimera. Przygotowanie cylindra i systemu stymulacji wąsów jest omówione w protokole tekstowym. W tej części omówiono przygotowanie nakrycia głowy.
Pasek na głowę to wydrukowany w 3D siedmiootworowy pasek wzorowany na nylonowym pasku z serii Amphenol 221, który nie jest już produkowany komercyjnie. Z elementu wydrukowanego w 3D dotknij pierwszego otworu w pasku na maszynową 0-80 na jeden cal i pozostaw jeden otwór pusty po pierwszym otworze. Następnie za pomocą imadła umieść pięć pozłacanych szpilek w pozostałych pięciu otworach.
Wciśnij kołki przez węższe otwory w plastiku. Następnie za pomocą środka do usuwania izolacji termicznej usuń pół centymetra powłoki poliimidowej. Następnie odizolowany koniec do jednego z pinów, w którym kołek ma otwór.
Przytnij przylutowany drut na odległość od sześciu do siedmiu milimetrów i zdejmij około dwóch milimetrów z drutu. Teraz powtórz ten proces, aby podłączyć w sumie cztery przewody do pięciu pinów. Pierwsze dwa przewody będą rejestrować odpowiedzi EMG powieki, podczas gdy kolejne dwa będą dostarczać stymulację elektryczną do obszaru okołooczodołowego.
Do piątego pinu nieizolowany pięciocentymetrowy drut ze stali nierdzewnej, który będzie służył jako uziemienie elektryczne. Po wykonaniu wszystkich połączeń sprawdź każde z nich za pomocą multimetru, aby zapewnić ich ciągłość elektryczną. Zacznij od w pełni znieczulonego zwierzęcia, potwierdzonego uszczypnięciem palca u nogi.
Należy wstrzyknąć dawkę chlorowodorku buprenorfiny jako środek przeciwbólowy. Następnie nałóż niewielką ilość maści okulistycznej na rogówkę i ogol czubek głowy zwierzęcia. Następnie przymocuj głowę zwierzęcia do ramy stereotaktycznej i zdezynfekuj skórę głowy trzema naprzemiennymi peelingami jodu powidonu i alkoholu.
Za pomocą ostrza skalpela numer 10 lub 15 wykonaj nacięcie wzdłuż linii środkowej skóry głowy, odsłaniając czaszkę od przodu oczu do kości międzyciemieniowej. Cofnij płaty skóry za pomocą sześciu mikroklipsów, odsłaniając jak największą część czaszki, w tym boki i tył. Następnie użyj skalpela, aby zeskrobać okostną z czaszki.
Następnie trzykrotnie oczyść górną część czaszki 3% nadtlenkiem wodoru. Gdy czaszka wyschnie, wywierć dwa otwory za pomocą wiertła z odwróconym stożkiem w rozmiarze 34, uważając, aby nie uszkodzić mózgu. Umieść jeden otwór przed bregmą, a drugi otwór umieść przed lambdą, na lewo od linii środkowej podczas kondycjonowania prawego oka lub odwrotnie.
Otwory te powinny być starannie wywiercone, aby pasowały do, i należy dołożyć wszelkich starań, aby nie uszkodzić mózgu. W otworach wkręć do połączeń elektrycznych. Każdy pełny obrót obniży o 0,28 milimetra, więc wystarczą dwa pełne obroty.
Następnie utwórz kilka małych wgłębień na czaszce, aby zwiększyć powierzchnię cementu. Z gotowej głowicy nawiń przewód uziemiający w konfiguracji ósemki wokół dwóch. Pozostaw trochę luzu w przewodzie uziemiającym, aby głowica mogła być prawidłowo ustawiona.
Teraz nałóż zimny cement cementujący. Obficie pokryj czaszkę i i pozwól cementowi wyschnąć. Po wyschnięciu cementu ustaw nakrycie głowy pionowo, tak aby szpilki wystawały ponad czaszkę.
Zabezpiecz głowicę za pomocą uchwytu przymocowanego do ramienia z ramy. Uchwyt musi mieć pięć pozłacanych gniazd, aby pomieścić kołki głowicy. Umieść dwa przewody EMG na mięśniu okrężnym oka nad oczodołem.
Następnie ustaw dwa przewody stymulujące. Umieść obnażone końce pod skórą od dwóch do czterech milimetrów bezpośrednio doogonowo do oka. Nie pozwól, aby ich końce stykały się ze sobą.
Jeśli druty są tak długie, że mogą porysować oko zwierzęcia, przytnij je do tyłu lub zegnij z powrotem. Niektóre gołe druty muszą pozostać odsłonięte. Teraz przyklej podstawę drutów do czaszki nieco większą ilością cementu cementowego i pozostaw do wyschnięcia.
Użyj około połowy wcześniej używanej objętości. Aby kontynuować, usuń mikroklipsy i zmień położenie skóry. Pozwól, aby skóra naturalnie się uspokoiła, aby zapobiec napięciu na skórze, które zniekształciłoby powiekę, hamując mruganie, a tym samym rujnując eksperyment.
Po ustabilizowaniu się skóry zdejmij uchwyt nakrycia głowy i uszczelnij odsłonięty obszar cementem dentystycznym. Unikaj kapania cementu na oczy lub szpilki nakrycia głowy. Następnie użyj bawełnianego wacika zwilżonego rozpuszczalnikiem do cementu dentystycznego, aby w razie potrzeby wygładzić i manipulować częściowo utwardzonym cementem.
Gdy cement całkowicie wyschnie, wyjmij zwierzę z ramy stereotaktycznej i pozwól mu dojść do siebie na ciepłej powierzchni przed powrotem do klatki domowej. Zacznij przyzwyczajać myszy po co najmniej pięciu dniach rekonwalescencji. Aby zabezpieczyć mysz, krótko przytrzymaj ją za ogon, aby uszczypnąć ją za ramionami.
Następnie podnieś mysz spod brzucha i tułowia. Następnie przymocuj łącznik do głowicy i przekręć blokującą. Następnie delikatnie przyłóż mysz do cylindra i przytrzymaj ją nieruchomo, używając dwóch, aby przymocować łącznik do prętów nad cylindrem.
Następnie zwolnij przycisk myszy. W pierwszych dwóch sesjach pozwól myszy przyzwyczaić się do cylindra przez taki sam czas, jak podczas sesji kondycjonowania. Podczas habituacji zapisuj częstotliwość spontanicznego mrugania.
Należy również wstępnie wystawić myszy na działanie stymulatora wibracji wąsów bez stosowania stymulacji elektrycznej. Gdy system piezoelektryczny znajduje się blisko kondycjonowanej strony, wsuń zęby grzebienia na poszczególne wąsy. Wybierz te same wąsy dla każdej sesji.
Następnie przejdź do klasycznego treningu kondycyjnego, tak jak jest to przedstawione w tekście. Ośmio- do dziesięciotygodniowych samców myszy C57 Black 6J trenowano z kondycjonowaniem śladowym mrugania oczami na cylindrycznej bieżni z mocowaną głową. Wykonano zapisy EMG z każdej próby.
EMG zostały skorygowane i zintegrowane z 10-milisekundową stałą czasową, a następnie uśrednione we wszystkich próbach. Ewolucja odpowiedzi warunkowych w ciągu 10 sesji treningowych pokazuje, że stopniowo amplituda odpowiedzi stawała się większa, a opóźnienie odpowiedzi stawało się krótsze. Ta ewolucja nie jest widoczna w reakcjach myszy uwarunkowanych psuedo, gdzie bodźce są prezentowane w losowej kolejności.
Ewolucję dobrze zsynchronizowanych, a tym samym dobrze wyuczonych, uwarunkowanych reakcji można również zaobserwować w histogramach czasu do szczytu odpowiedzi po wystąpieniu CS. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przygotować nakrycie głowy, chirurgicznie wszczepić nakrycie głowy myszy i umieścić mysz na cylindrycznej bieżni, aby kondycjonować mrugnięcie głową. Twoje myszy powinny wykazywać dobrą krzywą uczenia się przez kilka dni, gdy nabywają kondycjonowania.
Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu godziny, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, aby zachować czujność i obserwować wszelkie dolegliwości ze strony zwierząt. Należy podjąć odpowiednie kroki w celu zminimalizowania stresu u zwierząt.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje metodę warunkowania mrugania powieką wyzwalanego sygnałem z wibrysów u myszy z unieruchomioną głową, co pozwala na precyzyjną stymulację wibrysów przy jednoczesnym umożliwieniu poruszania się na cylindrycznej bieżni. Podejście to ułatwia badanie neurobiologicznych podstaw uczenia się i pamięci z wykorzystaniem paradygmatów uczenia asocjacyjnego.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Warunkowanie behawioralne
- Uczenie się i pamięć
Wstęp
- Warunkowanie mrugania jest modelem służącym do badania uczenia się asocjacyjnego.
- Stymulacja wibrysów służy jako bodziec warunkowy w tym paradygmacie.
- Fixacja głowy minimalizuje stres, jednocześnie umożliwiając ruch.
- W celu uzyskania głębszych informacji można zastosować obrazowanie wapniowe oraz elektrofizjologię.
Cel badania
- Zbadanie mechanizmów neurobiologicznych leżących u podstaw warunkowania mrugnięcia okiem.
- Wykorzystanie postępów genetycznych u myszy w celu uzyskania lepszych wyników eksperymentalnych.
- Zbadanie potencjalnych metod leczenia upośledzeń pamięci.
Zastosowane metody
- Przygotowanie cylindrycznego urządzenia do bieżni.
- Implementacja stymulacji wibrysów podczas warunkowania.
- Wykorzystanie myszy modyfikowanych genetycznie do badań celowanych.
- Zastosowanie technik obrazowania wapniowego i elektrofizjologii.
Główne wyniki
- Niezawodne uczenie asocjacyjne osiągnięto przy użyciu opisanego modelu.
- Technika ta umożliwia badanie mechanizmów uczenia się i pamięci.
- Unieruchomienie głowy w połączeniu z chodzeniem na bieżni redukuje stres u badanych osobników.
- Zauważono potencjalne implikacje dla zrozumienia zaburzeń pamięci.
Wnioski
- Metoda ta zapewnia solidne ramy do badania uczenia się i pamięci.
- Otwiera ona możliwości prowadzenia badań nad metodami leczenia problemów z pamięcią związanych z wiekiem.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tym protokole, aby zgłębić różnorodne pytania neurobiologiczne.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Warunkowanie mrugnięcia powieką wyzwalane sygnałem z wibris w unieruchomionych głowowo myszach umożliwia precyzyjne badanie obwodów neuronalnych leżących u podstaw uczenia się asocjacyjnego i pamięci. Platforma ta pozwala na integrację narzędzi genetycznych, elektrofizjologicznych i obrazowania, co zwiększa pewność prognostyczną podczas wczesnej walidacji celów neurobiologicznych. Podejście to ułatwia stabilne i powtarzalne fenotypowanie behawioralne, które jest kluczowe dla translacyjnych portfeli neurobiologicznych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia mechaniczną analizę ścieżek uczenia się i pamięci z wykorzystaniem myszy modyfikowanych genetycznie.
- Wspiera funkcjonalną walidację celów poprzez kontrolowane dostarczanie bodźców sensorycznych i ilościowe odczyty EMG.
- Ułatwia biologiczną redukcję ryzyka poprzez izolację wpływu konkretnych obwodów neuronalnych na wyniki behawioralne.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Zapewnia standaryzowany, powtarzalny test behawioralny do oceny potencjalnych interwencji wpływających na uczenie się asocjacyjne.
- Generuje ilościowe dane EMG odpowiednie do porównań między warunkami i optymalizacji testu.
- Przygotowuje zwalidowane modele z unieruchomioną głową do dalszych procesów przesiewowych farmakologicznych lub genetycznych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodne z modelami zaburzeń pamięci istotnymi dla przebiegu choroby, co wspiera opracowywanie biomarkerów translacyjnych.
- Umożliwia zachowanie ciągłości od badań nad mechanizmami komórkowymi do przedklinicznej walidacji behawioralnej.
- Wspiera dostosowany do ryzyka rozwój kandydatów na leki neuroterapeutyczne ukierunkowane na deficyty uczenia się i pamięci.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta łączy wczesny etap odkryć z walidacją przedkliniczną, umożliwiając weryfikację hipotez dotyczących mechanizmów neuronalnych w kontrolowanym kontekście behawioralnym.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia testowanie hipotez zerowych i wyjaśnianie szlaków w obwodach uczenia się asocjacyjnego.
- Przesiewy: Dostarcza powtarzalnych, ilościowych wyników EMG w celu standaryzacji testów i oceny związków.
- Analityka: Wspiera statystyczne porównywanie amplitudy i latencji reakcji warunkowej w grupach eksperymentalnych.
- Badania translacyjne: Zapewnia platformę do dopasowania przedklinicznych punktów końcowych behawioralnych do klinicznych fenotypów zaburzeń pamięci.
- Zastosowania instytucjonalne: Oferuje wielokrotnego użytku system behawioralny z unieruchomioną głową, który można dostosować do różnych problemów neurobiologicznych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów oraz w minimalizowaniu ryzyka mechanistycznego w badaniach nad uczeniem się i pamięcią.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację, powtarzalność i skalowalność testów behawioralnych w modelach genetycznie podatnych na manipulacje.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji typu go/no-go oraz efektywność kapitałową poprzez redukcję biologicznego ryzyka na późnych etapach.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację programów neuroterapeutycznych ukierunkowanych na funkcje poznawcze z uwzględnieniem korekty o ryzyko.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna w zakresie implantacji chirurgicznej, rejestracji EMG oraz protokołów warunkowania behawioralnego.
- Niezbędny jest dostęp do aparatury do stabilizacji głowy, systemów akwizycji sygnału EMG oraz sprzętu do stymulacji wibrysów.
- Wymagana jest rygorystyczna standaryzacja dostarczania bodźców i potoków analizy danych pomiędzy zespołami.
- Metoda jest dostosowalna do różnych podłoży genetycznych i manipulacji eksperymentalnych u myszy.
- Staranne monitorowanie dobrostanu zwierząt i minimalizacja stresu są niezbędne dla zapewnienia integralności danych.
